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我国是全球最大的锰资源消耗和进口国，截至2020年，我国约有矿床230座，锰矿石探明储量约2.1×109 t[1]。自2017年以来，诸多中小锰矿区纷纷停产、停业，遗留了大量锰尾矿渣[2]，经侵蚀、风化和自然雨水淋溶后，尾矿渣中所含重金属元素进入周边的地表水、地下水、土壤等，造成大范围的植被破坏和水土流失，对矿区周边的生态环境和人畜健康造成严重的危害[3-4]。植物修复作为一种绿色原位土壤修复技术，通过植物根系吸收、挥发、转化、固定或降解重金属和有机污染物，具有成本低、效果好、生态学价值高等特点，已逐步成为修复重金属污染场地的重要手段之一[5-6]。
锰矿植物修复研究主要涉及两类植物，一类是以草本居多的超富集植物：如商陆(Phytolacca americana)[7]、莎草(Cyperus rotundus)[8]和铁杆蒿(Artemisia sacrorum)[9]等，另一类是以木本为主的耐性或抗性植物，这类植物对重金属的富集虽不及超富集植物，但对污染物具有很强的耐受性或抗性，代表植物有夹竹桃(Nerium oleander)、栾树(Koelreuteria paniculata)和泡桐(Paulownia tomentosa)等[10]。目前发现的锰的超富集植物大多数是草本植物，存在个体矮小、生物量小和生长周期短等缺陷，重金属富集的总量少，对水土的保持能力弱，在大规模工程应用中有较大的局限性。木本植物生物量大、生长速度快、生长周期长，并且具有发达的根系网络，能快速、高效地恢复地表的植被覆盖，减少水土流失，在吸收、积累重金属的同时还能在一定程度上钝化、固定重金属，尤其适用于较大矿区的重金属污染治理与生态恢复工程[11-12]。
锰矿渣颗粒较细、结构松散、透气性和持水性能差，养分也极易流失，普通植物很难在尾矿中生存[13-14]。本实验室前期进行了大量木本植物和改良剂的筛选工作，发现栾树和凹凸棒＋蘑菇渣复合改良剂用于修复锰尾矿重金属污染具有明显优势[15]。目前，对栾树等耐性植物的相关研究主要集中在植物自身对重金属的生理响应机制[16-18]，而对根际环境的影响机制研究很少。根际是植物-土壤-微生物进行物质交换和信息传递的热区，根际土壤性质和微生物是影响植物修复效果的2个重要因素[19]。土壤肥力和其他理化性质对于植物的生长起到决定性的作用，土壤微生物可通过自身的解毒机制降低重金属的毒性，一方面促进根系分泌物对重金属的生物固化，改善土壤微环境、优化植物根际并提高重金属的可利用度，另一方面微生物通过分泌铁载体、有机酸等物质促进植株的生长发育，提高金属耐受性和吸收量[20-21]。
鉴此，本研究以湖南省某锰尾矿区矿渣作为基质，以栾树(Koelreuteria paniculata)为供试植物，以有机蘑菇渣(spent mushroom compost, SMC)与无机凹凸棒粉(attapulgite, ATP)为改良材料，构建中试模拟矿山实验装置，探究改良矿渣下栾树对锰矿渣的植物修复效果和根际微环境响应，旨在为锰尾矿区的生态修复提供科学数据和技术经验。
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栾树(Koelreuteria paniculata)购自浏阳柏加苗木基地，均为高约80 cm的1 a生苗。蘑菇渣(金针菇)购自湖南省某农业基地，主要成分有米糠、麦麸和玉米芯，实验前测得其基本化学特征(表1)。凹凸棒矿粉购自甘肃省某凹凸棒矿区，主要成分为含水镁铝硅酸盐，pH在8左右。锰矿渣取自湘潭市某锰矿尾矿库，Mn、Pb、Zn、Cu、Cd含量较高，均值分别为10 425、3 324、5 861、135、38.21 mg·kg−1。
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模拟矿山玻璃中试装置定制于长沙市红星百货市场，内部长、宽、高为100、100和80 cm，上下均设置导流管，用以引导降雨后形成的表流和潜流，防止雨水在装置内的累积。将锰矿渣或其与改良剂充分混匀后，于2021年1月下旬加入装置，使基质高度达到80 cm。各装置均添加自来水30 L，用塑料薄膜掩盖，活化2个月后测得各装置中基质基本理化性质。设置1个对照组和2个实验组，CK：100%尾矿，无植物；S0：90%尾矿+5%蘑菇渣+5%凹凸棒，无植物；S1：90%尾矿＋5%蘑菇渣+5%凹凸棒，选取长势一致的栾树幼苗于21年3月下旬进行种植，每个装置6株。设置3个平行。
各装置模拟野外环境，只接受自然雨水，定期除草，不额外添加肥料。植物种植前定义为实验前期，前3个月为植物生长稳定期，第6个月定义为中期，第9个月定义为末期。在植物生长各周期，对土壤理化性质和植物生长指标等进行动态监测，实验末期收集植物和土壤基质，处理后进行数据的收集整理与分析。该中试实验于2021年1月至2021年12月在中南林业科技大学苗圃内开展，实验区属亚热带季风气候，气候温和，年平均降雨量约1 500 mm。实验期间，S1组各装置中栾树均正常存活和生长，其根系几乎深入了整个装置的各个土层，尤其是土壤中、上层中的根系十分发达。
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1)土壤理化性质及重金属测定。采用重铬酸钾氧化-分光光度法测定有机质含量；采用pH酸度计测定土壤pH；采用三氯化六氨合钴浸提-分光光度法测定阳离子交换量；土壤基质含水率和容重分别采用烘干法和环刀法测得。土壤全氮采用凯氏法测定，速效氮采用扩散皿法；土壤总磷采用碱溶-钼锑抗分光光度法，有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法；土壤总钾采用氢氧化钠熔融-火焰原子吸收分光光度法，速效钾采用浸提比色法。参照关松荫的方法[22]，采用3、5-二硝基水杨酸比色法测定土壤蔗糖酶活性，脲酶通过苯酚-次氯酸钠比色法测得；碱性磷酸酶使用试剂盒进行测定(索莱宝生物科技有限公司)；采用欧共体BCR四步法测定土壤重金属形态。
2)植物生长指标测定。用卷尺测量从土壤表面到植株顶端的距离；栾树根系生长状况用根系扫描仪测定(Win RHIZO PRO 2013, Canada)；采收的植物分为根、茎和叶3部分，在105 ℃下干燥30 min，然后在75 ℃下干燥至恒重，测定其生物量干重。
3)土壤微生物多样性测定。在实验末期采集各装置中土壤，土壤微生物多样性检测委托上海欧易生物医学科技有限公司进行。使用Trimmomatic软件进行去杂。采用Vsearch软件，根据序列相似性将其归为多个OTU，序列相似度大于或等于97%被归为一个OTU单元。使用QIIME软件包挑选出各个OTU的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。16S使用Silva(version138)数据库比对，ITS使用Unite数据库比对。物种比对注释使用BLAST软件。
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一般实验数据运用Excel 2021进行处理；数据方差分析和显著性检验利用SPSS 22.0软件完成，数据均为3次重复实验的平均值±标准差(n=3)；一般制图采用Origin 2019b软件完成，微生物数据绘图运用欧易云平台完成。
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从各基质基本理化性质差异(表2)来看，改良剂加入后锰矿渣pH从7.46显著提升到了7.62(P<0.05)。改良矿渣含水率比原矿渣高出约10%，孔隙度高出约9%，同时总氮、总磷、有机质含量和阳离子交换量均有提升，增幅分别为190%、36%、2.5%和43%。矿渣中总钾的含量较高，达到了10.07 g·kg−1，改良剂的加入略微降低了其含量。从各处理间基质主要营养元素有效态含量(图1)比较来看，改良剂的加入对基质有效磷、速效氮和速效钾提升较大，分别比CK提升了124.5%、271.2%和43.1%。从各处理间的基质酶活性(图1)来看，相较于CK组，S0和S1土壤蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的活性得到了极显著的提升(P<0.01)。实验的前期、中期和末期3个阶段中CK组3种土壤酶活性始终处于最低水平，显著低于S1组和S0组(P<0.05)，实验中期和末期呈现S1处理显著高于S0处理的变化趋势(P<0.05)。在3个实验阶段中，S1组和S0组土壤有效磷、速效氮和速效钾含量均在不同程度上高于CK处理组。由此可以看出，添加改良剂后锰矿渣理化性质与肥力条件得到优化。同时，栾树的生长一定程度增强了改良矿渣的水土保持能力，使得营养元素不易随径流流失，增强了其保肥和持水能力。
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比较实验前、后各基质中重金属含量变化(表3)可以发现，改良剂的加入使得单位质量的矿渣中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd等重金属的含量呈不同程度的下降，同时各处理在实验后基质中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd的含量均显著下降(P<0.05)，但不同处理组之间的下降幅度有所差异。S1处理基质中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd含量下降幅度要显著低于S0处理(P<0.05)，同时，S1处理在实验前基质中Mn、Pb和Zn含量均低于CK处理的情况下，在实验后Mn、Pb和Zn的含量仍不同程度高于CK处理。
在实验后对栾树根、茎、叶各组织干样中重金属含量进行检测(表4)，可以发现栾树各组织中Mn和Zn的含量较高，在230~1 100 mg·kg−1，说明栾树对其有一定的富集能力，但远未达到超富集植物的标准。而栾树各组织中Pb、Cu和Cd含量较低，在0.5~160 mg·kg−1，表明栾树对这几种重金属的富集能力一般。
通过各处理基质中重金属的去向(表5)可以发现，栾树对基质中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd的吸收总量占比非常小，在0.001%~0.026%，而不同处理中几种重金属随径流的流失量比例差异明显，普遍在6%~23%，大量的重金属会随雨水径流流失。S1处理中Mn、Pb、Zn 3种重金属的径流流失量比例显著低于(P<0.05)锰矿渣(CK)和改良锰矿渣(S0)，较CK处理分别下降约6%、11%和13%，较S0处理分别下降约4%、13%和10%。各处理基质中Cu的径流流失量比例均无显著差异(P>0.05)。另外值得注意的是，改良剂的加入使得S0处理中Cd的径流流失量比例显著高于CK处理(P<0.05)。
在实验后对各处理基质中重金属形态进行分析(图2)，可以直观地看出，CK和S0处理之间Mn、Pb、Zn3种重金属各形态分布占比总体差异较小。S1处理与CK和S0处理对比，最显著的差异反映在重金属残渣态比例的提高上，S1处理中Mn、Pb、Zn重金属残渣态的比例比S0处理分别高出5.73%、13.52%和6.47%，比CK处理分别高出4.98%、12.81%和6.01%。同时可以发现，S1处理中Cd的残渣态和可还原态较CK处理均显著升高(P<0.05)。各基质中Cu绝大部分以残渣态和可氧化态存在，可交换态和可还原态比例不足5%。上述结果表明，栾树的种植和改良剂的添加在实验后可以显著提高锰矿渣中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd的残渣态比例(P<0.05)，减少矿渣中这几种重金属随雨水径流的流失量，对矿渣中重金属的流失达到了较好的拦截效果。
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3个处理组的9个土壤样本细菌和真菌分别注释得到了17 543个和1 563个可操作单元(OTUs)，样本生物覆盖率均在96%以上，测试结果能够反映样本真实情况，测序合理。主坐标轴分析(PC0A)(图3)中同组土壤样本均很好地聚类在一起，各样本组内相似性好，组间区分度高。各处理组基质细菌群落结构在门水平上差异不大，主要优势种群有变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、单芽孢菌门(Gemmatimonadota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)。各处理组基质中真菌门水平群落结构差异非常明显，3组土壤真菌主要由担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)和壶菌门(Chytridiomycota)组成。其中，担子菌门在3组间存在显著差异(P<0.01)，在CK、S0和S1处理中占比分别为9.06%、76.18%和51.66%。另外2个分布差异较大的是子囊菌门和接合菌门，子囊菌门在3组中占比分别为60.13%、18.71%和28.21%，接合菌门占比分别为23.10%、3.11%和2.00%。土壤微生物群落α多样性指数分析结果(表6)表明，细菌方面：对于chao1指数和observed-species指数，S0和S1处理群落物种数量无显著差异(P>0.05)，均显著多于CK处理(P<0.05)。由simpson指数可以看出，各处理间物种丰富度无显著差异(P>0.05)；真菌方面：CK和S1处理群落物种数量无显著差异(P>0.05)，均显著多于S0组(P<0.05)，且S0组物种丰富度显著低于其他2个处理(P<0.05)。S0和S1处理细菌群落α多样性无显著差异(P>0.05)，在真菌群落上差异显著(P<0.05)。
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由细菌优势属丰度热图(图4(a))可以看出，各处理间优势属差异较为明显。S1处理丰富度较高的属有变形菌门下的CCD24、Bacteriap25和Acidibacter属以及酸杆菌门下的Subgroup_7属。斯皮尔曼相关性分析((图4(b))显示，S1处理独有的优势属CCD24与bacteriap25聚类，与基质蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶和pH存在极显著正相关关系(P<0.01)。Acidibacter和Subgroup_7在S0与S1组中均为优势属。Subgroup_7与基质蔗糖酶、脲酶和pH显著正相关(P<0.05)，有研究表明，酸杆菌门下subgroup_7属丰度往往与土壤pH呈正相关关系[23]，这与本研究的结果是一致的。Acidibacter属被认为是具有分解蛋白质和摄取环境周围酸性物质的有益菌菌属[24]，其与基质碱性磷酸酶、有机质、总氮和pH呈显著正相关性(P<0.05)，Nitrospira(硝化螺旋菌属)是土壤中的潜在有益菌，可促进土壤化学循环，保持土壤肥力[25]，其与图中所有环境因子均呈正相关性，但不显著(P>0.05)。此外，CK处理中独有的优势属Sulfurifustis和S0134_terrestrial_group与基质酶活性和pH呈不同程度显著(P<0.05)或极显著负相关(P<0.01)。
在真菌 top15 优势属中(图5(a))，各处理间的差异十分明显，CK 处理中丰度较高的达到了 11 个，S0 处理丰富度较高的仅有子囊菌门下的 Thermomyces (嗜热真菌属)。斯伯尔曼相关性分析结果表明(图5(b))，S1组中丰富度较高的优势属分别为子囊菌门下 Neurospora (脉孢菌属)和 Thermomyces (嗜热真菌属)以及担子菌门下的 Guehomyces (低温酵母属)和 Coprinus (鬼伞属)，这 4 个优势属聚类在一起，与基质蔗糖酶、脲酶、碱性碱性和 pH 在 P<0.01 或P<0.05 水平上呈显著正相关，与基质总氮、总磷和有机质含量呈不同程度的正相关关系(P>0.05)。
为了进一步探究导致不同处理下装置系统对重金属的拦截效果产生差异的因素，我们对各处理下基质中 Mn、Pb、Zn、Cu、Cd 流失量的百分比与基质理化性质进行了皮尔逊(Pearson)相关性分析，结果如图6 所示。可以发现，Mn、Pb、Zn 随雨水径流的流失量与基质 pH、蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶活性呈不同程度显著负相关(P<0.05)和极显著负相关关系(P<0.01，P<0.001)，与基质总氮、总磷和有机质含量等呈负相关关系(P>0.05)。同时可以发现，Cu 的流失量与图中所有环境因子均无显著相关性(P>0.05)。Cd 的流失量与基质总氮显著正相关(P<0.05)，与有机质含量极显著正相关(P<0.01)，但与基质总磷量含量表现出显著的负相关性(P<0.05)。上述数据表明，pH 和土壤酶活性的提升能够显著减少锰矿渣中 Mn、Pb、Zn 随雨水径流的流失、Cd 的流失与基质不同营养元素含量表现出不同程度的正、负显著相关性，而基质理化性质的改变对 Cu的流失量影响不大。
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锰尾矿渣中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd等重金属含量均远超背景值，土壤易板结，保水能力差，可供植物利用的有效态的氮、磷、钾含量低，是限制植物在锰尾矿渣中正常生长的主要因素[26]。实验前，蘑菇渣和凹凸棒改良剂的加入使得矿渣的氮、磷、钾总量及其有效态含量、有机质、土壤阳离子交换量和含水率均得到不同程度的提升。本研究中蘑菇渣和凹凸棒改良剂的加入可改善锰矿渣的土壤结构和肥力。这与前人的研究结果一致[27-28]。土壤中蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的活性能够很好地反映土壤肥力和质量[29]，在实验的中期和末期，各处理下基质中3种土壤酶活性差异显著，表现出S1>S0>CK的趋势。同时，S1和S0处理的土壤氮、磷、钾有效态均能保持在明显高于CK处理的水平。不难看出，改良剂的加入和栾树的生长在整个实验阶段较好地维持了矿渣的肥力，提高了其持水能力。
值得注意的还有2点：第一，相较于有栾树生长的S1处理，实验过程中S0处理(改良锰矿渣)中氮、磷、钾元素和有机质的流失量偏大，表明单纯改良剂的加入能在短时间内提升矿渣肥力，但植物的生长是维系土壤肥力的重要因素，而栾树地下部发达的根系和地上部植被的覆盖能对矿渣水土的保持产生了积极作用，进而减少矿渣中水分和营养元素的流失；第二，锰矿渣和改良锰矿渣中的K元素极易流失，在长期的修复过程要注意钾肥的补充。
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凹凸棒是一种镁铝硅酸盐矿物，作为土壤修复改良剂被广泛使用[30]，有研究表明，其能显著提高土壤pH，降低Pb、Cd、Cr等重金属的生物有效性，减少植物对重金属的吸收[31]。有机菌肥在为植物提供养分外，还能通过固定、吸附、络合、氧化等作用降低植物根际环境中重金属的毒性[32]。重金属在土壤中的形态包括可交换态、可还原态、可氧化态和残渣态。可交换态和可还原态的重金属较易被植物吸收，具有生物有效性。可氧化态和残渣态相对更稳定，难以被植物吸收和利用[33]。栾树对锰矿渣中重金属的吸收量极为有限，相较于随雨水径流流失的量几乎可以忽略不计，而锰矿渣中Mn、Pb、Zn等重金属随径流的流失量非常高，单纯改良剂的加入在实验周期内无法有效抑制重金属的流失，甚至显著增加了改良矿渣中Cd的流失量比例。但栾树的种植能明显增加矿渣中重金属的可氧化态和残渣态比例，显著减少矿渣中Mn、Pb、Zn等重金属的流失，这与MUTHANNA[34]等的研究结果相似，说明短时间内植物对基质重金属的吸收量非常有限，通过减少矿渣中重金属的流失来治理矿渣中重金属的扩散和污染将更为有效。凹凸棒和蘑菇渣改良剂的加入在实验前显著提升了锰矿渣的pH，但实验后S0处理中pH有所下降，而S1处理pH显著提升。S0处理在实验后Mn、Pb、Zn等重金属的形态较CK处理无显著的变化，而S1处理中Mn、Pb、Zn重金属残渣态的比例显著高于CK和S0处理。相关性分析结果表明，基质pH、蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的升高能够显著降低矿渣中Mn、Pb和Zn的流失。这是由于提升锰矿渣的pH会增强土壤对重金属离子的吸附能力，有助于降低重金属在土壤和植物中的迁移能力[35]。土壤中蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的活性能够很好地反映土壤肥力和质量[29]，土壤酶活性的升高反映了改良矿渣肥力和土壤质量的提升，为栾树的生长提供了有利条件，栾树的生长所带来的水土保持作用进一步减少了矿渣中重金属随雨水的流失。
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土壤微生物对外界环境(植物种类、土壤结构、肥力、温度、湿度、酸碱度)的变化高度敏感。长期受重金属污染的土壤，根际微生物群落结构及多样性和丰度都会受到显著的影响[36-38]。不论是改良剂的加入还是栾树生长对锰矿渣微生物群落结构都有一定影响。改良剂的加入对锰矿渣中门水平下细菌物种群落结构的影响较小，但显著提升了细菌物种数量。在本研究中，纯矿渣和改良矿渣中变形菌门都是绝对的优势种群，这与BOUSKILL[39]等的研究结果一致。变形菌门是土壤中分布最广，最普遍的一个细菌门，在矿山径流、被重金属污染的水体及其沉积物和重金属污染土壤中都有丰富的存在[40]，改良剂加入后，细菌门水平上，拟杆菌门和酸杆菌门等腐生型细菌相对丰度也大大提升，拟杆菌门为富营养菌，相对丰度在高有机质水平下增加，且具有溶磷作用[41]，酸杆菌门被证明能够适应重金属污染等极端生存条件[42]。细菌属水平上，S1处理独有的优势属CCD24和bacteriap25与基质蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶和pH存在极显著正相关关系(P<0.01)，与总氮、总磷以及有机质含量等土壤肥力指标也存在正相关关系。这表明，改良剂的加入带来的丰富营养元素和对土壤结构的改善为上述细菌种群的生长提供了有利条件，促进了他们的生长和繁殖，增强它们的活动水平。
土壤真菌参与土壤有机矿化，分解土壤中植物残体和有机质，但多数真菌也能引起植物的病变[43]。改良剂加入后对锰矿渣真菌群落结构的影响巨大，门水平上锰矿渣(CK)中真菌群落绝对优势种群为子囊菌门，而改良矿渣(S0、S1)为担子菌门，子囊菌和担子菌是土壤中重要的分解者，子囊菌多营腐生，而担子菌对植物残体中的复杂的木质素和纤维素具有较强的分解能力[44]。蘑菇渣中主要成分米糠和麦麸等富含纤维素和木质素，充足的营养源使得担子菌门取代子囊菌门成为改良矿渣中绝对的优势种群。过多的子囊菌会引起植物根和茎的腐烂[43]，改良剂的加入显著降低了其在矿渣中的丰度从而减轻其对栾树根系的威胁。同时，无植物下的改良矿渣(S0)在实验后真菌丰富度和多样性显著降低，子囊菌门下Thermomyces(嗜热真菌属)大量繁殖，成为唯一的优势属，其在堆肥过程中对半纤维素的降解起到非常关键的作用，是堆肥中常见的真菌属[45]。这直接导致了改良锰矿渣中真菌群落结构平衡的破坏，营养元素在真菌的分解作用和雨水冲刷下大量流失。而栾树的生长有效避免了这一极端情形的发生，同时使得S1处理中子囊菌门丰度显著低于CK处理，并提高了如担子菌门和接合菌门(接合菌门对土壤中腐殖质分解起到重要作用[46])等有益菌的占比，有利于改良矿渣中有机质和营养元素的缓释，保持锰矿渣的肥力。
土壤微生物在维持土壤肥力、驱动土壤养分循环、稳定生态系统功能等方面发挥着重要作用，是维持土壤生产力的重要部分[47]。植物通过根系的分泌物影响微生物群落结构的组成，同时，土壤微生物群落的结构和多样性也影响了土壤生态系统的结构和功能[47]。总体来看，锰矿渣中Mn、Pb、Zn、Cu、Cd等重金属浓度非常高，且缺乏营养物质，改良剂的加入带来了丰富的营养物质，同时提升了矿渣的土壤质量。而土壤肥力和土壤质量的提升给原本处于弱势的微生物群落的生长和繁殖创造了条件，这是导致矿渣中微生物结构发生转变的主要原因。根际土壤中微生物群落结构的改变和栾树根系的作用使得矿渣的肥力达到了一种缓释的状态，栾树生长过程中植被和根系对矿渣水土的庇护和保持可巩固这一状况，从而形成一种良性循环。
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1)蘑菇渣和凹凸棒改良剂的加入显著增强了锰矿渣的肥力和持水性，促进了改良锰矿渣肥力的保持和缓释，增强了栾树的抗逆性。2)栾树地下部发达的根系和地上部植被的覆盖对锰矿渣水土的保持具有积极作用，改良剂的加入和栾树的生长能显著提升锰矿渣中Mn、Pb和Zn的残渣态比例，显著降低这3种重金属在锰矿渣中的流失，提高了修复效率。3)改良剂的加入提高了锰矿渣中微生物多样性，门水平和属水平上腐生和富养菌等有益菌丰度和多样性均显著提升，微生物群落结构的这种改变改善了土壤质量，促进了栾树生长，对植物修复效率的提升具有重要意义。
施用改良剂和种植栾树对锰矿渣微生物群落的影响
Effects of modifier application and Koelreuteria Paniculata planting on the microbial community of a manganese slag
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摘要: 施用改良剂可降低矿区重金属污染对植物的胁迫，但其对根际环境的影响机制尚不明晰。以栾树(Koelreuteria paniculata)为供试植物、以某锰尾矿区矿渣为基质，比较CK(100%矿渣)、S0(90%矿渣+5%蘑菇渣+5%凹凸棒)和S1(90%矿渣+5%蘑菇渣+5%凹凸棒，种植栾树)等3个处理重金属赋存状态和微生物多样性等的差异，探究施用改良剂和种植栾树等对矿渣中重金属拦截效果的影响。结果表明，施用改良剂(即蘑菇渣和凹凸棒)提高了矿渣pH，增强了其肥力和持水性；而种植栾树可降低重金属的生物有效性，Mn、Pb、Zn的残渣态比例显著提升，较S0分别提升了5.73%、13.5%和6.47%，较CK分别提升了4.98%、12.8%和6.01%。实验前、后各基质中Mn、Pb、Zn随雨水径流的流失量差异显著，表现为S1<S0<CK。种植栾树和施用改良剂对矿渣微生物群落结构影响巨大，其中S0和S1处理细菌α多样性差异较小，而真菌差异显著。与CK和S0相比，S1处理拟杆菌门(Bacteroidota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)的相对丰富显著增加，腐生和富养菌等有益菌的相对丰度和多样性提升明显，有利于保持土壤肥力和促进栾树生长，提高其抗逆性和修复效率。Abstract: The application of amendments can reduce the stress of heavy metal pollution on plants in mining areas, but the mechanism of its impact on the rhizosphere environment is still unclear. In this study, Koelreuteria paniculata was taken as the test plant and a manganese tailings slag was taken as the substrate, the differences in the occurrence status and microbial diversity of heavy metals in CK (100% slag), S0 (90% slag+5% spent mushroom slag+5% attapulgite), and S1 (90% slag+5% mushroom slag+5% attapulgite, planting Koelreuteria paniculata trees) were compared, and the effects of application of modifiers and planting Luan tree on the interception of heavy metals in slag were explored. The results showed that the application of modifiers (i.e. mushroom residue and attapulgite) increased the pH of the slag, enhanced its fertility and water holding capacity. Planting Koelreuteria paniculata trees could reduce the bioavailability of heavy metals, and significantly increased the residual proportions of Mn, Pb, and Zn, which were 5.73%, 13.5%, and 6.47% higher than S0, and 4.98%, 12.8%, and 6.01% higher than CK, respectively. A significant difference occurred in the amount of Mn, Pb, and Zn loss with rainwater runoff in each substrate before and after the experiment, and the corresponding order was S1<S0<CK. PlantingKoelreuteria paniculata trees and applying amendments had a significant impact on the microbial community structure of slag, and slight difference occurred in bacteria between S0 and S1 treatments, while the significant differences appeared in fungal α diversity. Compared with CK and S0, S1 treatment significantly increased the relative abundance of Bacteroidota, Acidobacteria, Basidiomycota and Ascomycota, as well as the relative abundance and diversity of beneficial bacteria such as saprophytic and eutrophic bacteria, which was conducive to maintaining soil fertility and promoting the growth of Koelreuteria paniculata trees, improving their stress resistance and repair efficiency.
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Key words:
- woody plants /
- phytoremediation /
- modifiers /
- Mn slag /
- microbial diversity
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随着我国污水处理规模的迅速发展，污泥产量也逐年剧增。截至2015年底，我国脱水污泥年产量超过3×107 t，预计2020年污泥产量将再增加1倍[1-2]。因此，污泥的处置是我国目前面临的一大难题。污泥堆肥可以杀死有害细菌，增加和稳定其中的腐殖质，降低所含重金属的毒性效应[3-4]。因此，腐熟污泥农用是一种消纳污泥的有效途径[5-6]。我国颁布的土地改良泥质、农用泥质和园林绿化泥质标准规定了污泥使用量、污泥累计使用量、连续使用年限和施用频率的要求，但针对腐熟污泥在具体土壤类型上如何施用并没有相关要求[7]。石灰性土壤作为广泛分布在我国干旱和半干旱地区的土壤类型，其碱性特征使其容易和重金属形成难溶性氢氧化物等沉淀[8]。因此，该类土壤对重金属污染表现出“不敏感性”特征，该特征极易导致污泥过量施用而造成土壤质量的降低[9]。
土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的成分，污泥施用造成土壤pH，阳离子交换量，电导率和团聚体稳定性等理化性质发生变化[10-13]，这些变化又对土壤微生物活性、微生物种类、数量、分布等多样性产生影响[14-17]。其中需要关注的根际土壤微生物多样性是表征外源物质引起土壤质量变化的敏感指标[18]，该多样性的变化值得重视。
已有研究[19]表明，石灰性土壤中微生物学特征及其微生物群落结构对调节土壤养分供应有重要作用，污泥添加同样会对石灰性土壤微生物量以及碳、氮等微生物学性质产生影响[20]，且上述影响除与土壤性质和作物系统有关外[20-21]，不同污泥的施用量和施用时期长短也是影响土壤微生物性质及其多样性的重要因素[22-24]。目前，污泥施用对根际和非根际石灰性土壤中细菌多样性差异的研究还较少，尤其是过量施用污泥对土壤微生物特征变化的影响尚缺乏研究。因此，开展不同用量腐熟污泥对石灰性土壤细菌多样性特征影响研究，可为其在石灰性土壤中施用的生物学质量评价和合理施用策略提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验地点和材料
实验地点位于河南省洛阳市(北纬34°41′，东经112°27′)，该地区属于干旱半干旱气候，年均气温和降雨量分别为15.6 ℃和460 mm，土壤类型属于典型石灰性土壤，其基本理化性质和重金属含量如表1和表2所示。供试作物为夏玉米(夏玉米品种为郑丹958)，夏玉米在每年6月种植，10月收获。
表 1 土壤和腐熟污泥基本理化性质Table 1. Basic physic-chemical properties of soil and compost sludge供试材料 有机质/% 总氮/(g·kg−1) 总磷/(g·kg−1) 总钾/(g·kg−1) pH 碱解氮/(g·kg−1) 有效磷/(g·kg−1) 有效钾/(g·kg−1) 土壤 0.54±0.03 0.48±0.03 0.78±0.04 1.94±0.19 8.01±0.03 0.032±0.002 0.015±0.001 0.031±0.002 污泥 41.64±3.55 20.23±2.67 10.21±0.60 2.21±0.04 8.04±0.02 2.047±0.01 0.058±0.002 0.110±0.003 注：数据为平均数和标准差分析。 | Show Table
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表 2 污泥和土壤中重金属的含量Table 2. Heavy metals content of soil and compost sludge供试材料 Pb Zn Cu Cr Cd As Hg 土壤 2.35±0.36 53.98±2.46 52.79±1.89 76.43±0.82 0.49±0.01 28.05±1.12 0.029±0.001 污泥 5.53±0.23 269.08±9.33 206.39±9.01 173.99±10.5 1.19±0.16 48.08±2.23 0.035±0.001 注：数据为平均数和标准差分析。 | Show TableDownLoad:
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供试污泥取自洛阳市某污泥处理厂，该污泥配以秸秆等辅料，按照秸秆与污泥重量比1∶5均匀混合，通过好氧高温堆肥后制得腐熟污泥，其重金属含量与《农用污泥中污染物控制标准》(GB 4284-2018)所规定的值相比，除As符合B级污泥限值外，其余重金属符合A级污泥限值。
1.2 实验设计
根据污泥的施用量不同，实验设置5个处理，分别为0、3.75、7.5、37.5、75 t·hm−2等5个污泥施用量。其中，5个污泥施用量分别对应非根际土壤样品为A01，A03，A05，A07，A09；对应的根际土壤样品为A02，A04，A06，A08，A10。污泥的施用量参考我国污泥土地利用标准(GJ/T 309-2009)进行设计，每个小区面积30 m2，随机排列，并重复3次。实验从2015年10月开始，连续2 a种植冬小麦-夏玉米，并且在冬小麦季把污泥和180、90、90 kg·hm−2的N，P2O5，KO2肥作为底肥一次性施入土壤，采用人工撒施和多次翻耕的方式使污泥和土壤均匀混合。期间进行正常的灌溉和管理。2017年10月，夏玉米收获后，采集0~20 cm非根际土壤(没有作物生长的0~20 cm表层土壤)和根际土壤(根际土壤采用“抖根法”，先将玉米根系从土壤中挖出，抖掉与根系结合松散的土壤，收集与根际紧密结合在0~4 mm范围的土壤作为根际土壤)。采集的新鲜土样分成2份，其中一份放入50 mL灭菌的离心管后，于−80 ℃冰箱保存用于细菌多样性分析；另一份风干用于测定土壤其他参数。
1.3 总DNA提取建库测序
微生物多样性分析主要是在编码核糖体RNA的核酸序列保守区开展研究，其中细菌主要基于的是16S保守区。本研究采用细菌16S rDNA(V3+V4)扩增利用的引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，通过PCR扩增后形成测序文库，然后利用Illumina HiSeq 2500进行测序，上述测序结果覆盖了土壤样品中98%以上细菌的真实组成，而且OTUs丰度稀释曲线随着测序量增加趋向平坦，说明测序数量足够，能够反应出样品中物种组成特征。
1.4 数据处理分析
根据PE reads之间的Overlap关系，将Hiseq测序得到的双端序列数据拼接(Merge)成一条序列Tags，同时对Reads的质量和Merge的效果进行质控过滤。使用FLASHE. v1.27、Trimmomatic. v0.33和Uchime v4.2等软件进行质控过滤后，得到优化序列(Tags)；将优化序列进行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类；通过Alpha多样性分析研究样品内部的物种多样性，统计样品在97%相似度水平下的Ace、Chao、Shannon及Simpson指数；根据距离矩阵获得相应距离下的样品PCA(主成分分析)；利用16S功能基因和冗余分析(RDA)分别对样品功能基因丰度和细菌群落组成与土壤参数之间的相关关系进行分析。
1.5 污泥和土壤性质的测定
供试污泥和采集的土壤样品风干过筛后分析以下指标：全氮，全磷，全钾、有机质、pH、电导率。上述指标测定方法参考文献中的方法[25]。重金属测定：取0.500 g通过100目筛样品，置于聚氟坩埚中，加入10 mL HF，8 mL HNO3和3 mL HClO4后静置12 h，以除去有机质和硅酸，然后在加热板上加热，温度逐渐升高至200 ℃，稳定温度加热至白烟产生且坩埚中残存少量浅白色黏稠状物质为止。完全冷却后，加2%的HNO3 2~3 mL溶解残存物质，用25 mL容量瓶定容待用，空白和标准样品同时消化，样品中的Zn、Cu、Pb、Cr、Cd利用等离子发射光谱法(美国，PE optima5300DV)测定。As采用双道原子荧光光度计(北京，吉田AFS-9120)测定。每个样品重复3次，使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 污泥施用对石灰性土壤化学特征影响
石灰性土壤的主要理化性质受污泥施用的影响如表3所示。随着污泥用量的增加，根际和非根际土壤pH呈现降低趋势，但土壤中电导率、有机质、总氮和总磷有明显增加的趋势。与对照相比，当污泥施用量超过7.5 t·hm−2时，污泥施用对上述参数的影响会显著增加。污泥施用也增加了土壤中Pb、Zn、Cu、Cr、Cd、As等重金属的含量，当污泥施用量为75 t·hm−2时，土壤中Zn、Cu、Cd的含量与其他处理相比具有显著差异(P<0.05)，而土壤中As在7.5，37.5，75 t·hm−2的污泥施肥量条件下并没有显示出显著差异(P>0.05)。和非根际土壤相比，根际土壤中有机质、电导率、As含量高于对应样品中的非根际土壤含量。
表 3 污泥施用对非根际和根际土壤各参数影响Table 3. Effects of sludge application on parameters of non-rhizosphere and rhizosphere soil参数 非根际土壤 根际土壤 A01 A03 A05 A07 A09 A02 A04 A06 A08 A10 pH 8.18±0.02a 8.16±0.01a 8.13±0.01a 8.08±0.01b 7.96±0.02c 7.96±0.02a 7.95±0.01a 7.92±0.01ab 7.86±0.01b 7.76±0.02c EC/(μS·cm−1) 69.67±1.12d 74.00±1.00cd 76.67±1.15c 82.48±2.19b 92.33±2.31a 120.33±10.79c 124.67±3.06c 156±13.23b 175.33±13.05b 208.673±12.06a 有机质/(g·kg−1) 5.57±0.37b 5.80±0.02b 6.33±0.20b 9.54±0.41a 10.40±0.54a 8.48±0.32b 8.55±1.01b 10.00±0.69b 12.38±0.59a 14.11±1.36a 总氮/(g·kg−1) 0.49±0.02c 0.52±0.02c 0.64±0.01b 0.66±0.02b 0.83±0.03a 0.36±0.02c 0.40±0.02c 0.52±0.01b 0.55±0.04b 0.72±0.03a 总磷/(g·kg−1) 0.77±0.03d 0.79±0.02cd 0.88±0.04bc 0.90±0.02b 1.02±0.06a 0.64±0.03c 0.66±0.02c 0.73±0.04bc 0.76±0.02b 0.88±0.05a Pb/(mg·kg−1) 5.21±0.17c 5.51±0.12bc 5.67±0.16ab 5.89±0.14ab 6.00±0.16a 4.39±0.22c 4.65±0.14c 4.78±0.20bc 5.10±0.076ab 5.25±0.07a Zn/(mg·kg−1) 53.86±3.35d 57.95±2.97d 68.60±1.85c 83.73±3.26b 96.30±4.57a 50.67±2.7d 55.58±5.53d 65.85±2.28c 80.16±1.44b 93.83±2.61a Cu/(mg·kg−1) 54.19±4.03c 59.31±2.31c 84.03±4.58b 89.20±1.73b 115.77±4.51a 49.05±2.39c 52.96±2.96c 78.35±4.05b 81.72±3.17b 105.24±6.91a Cr/(mg·kg−1) 81.28±2.23c 86.83±1.54bc 91.86±2.66ab 92.15±2.24ab 94.96±4.48a 74.59±2.13b 78.93±1.44b 85.74±2.22a 88.14±1.82a 90.70±2.29a Cd/(mg·kg−1) 0.41±0.01d 0.43±0.01d 0.49±0.02c 0.60±0.02b 0.74±0.03a 0.36±0.01d 0.39±0.01cd 0.45±0.02c 0.56±0.03b 0.69±0.04a As/(mg·kg−1) 28.76±1.22c 32.37±1.65b 35.70±0.75a 36.17±0.39a 38.22±1.31a 33.73±5.83b 34.68±4.95b 41.05±3.76ab 43.42±2.89ab 46.94±1.76a Hg/(mg·kg−1) — — — — — — — — — — 注：数据为平均数和标准差分析，每行根际和非根际样品中不同小写字母表示各处理平均值具有显著差异(P<0.05)，“—”表示未检出。 | Show TableDownLoad:
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2.2 污泥施用对石灰性土壤细菌OTU丰度的影响
把序列之间相似性高于97%的Tags进行聚类，获得OTU。图1显示了各污泥施用水平下根际和非根际石灰性土壤OTU丰度(图1中不同小写字母表示各样品平均值具有显著差异(P<0.05))。非根际土壤样品中细菌的OTU丰度大小依次为A09 < A01 < A03 < A05 < A07。由此可见，当污泥施用量为3.75～37.5 t·hm−2时，非根际土壤中细菌OTU丰度随污泥施用量增加而增加；当污泥用量为75 t·hm−2时，样品A09中OTU的丰度与A03，A05，A07相比显著降低，并且低于A01丰度。根际土壤中细菌OTU的丰度大小顺序与非根际土壤有所不同，其OTU丰度依次为A10 < A08 < A02 < A04 < A06。由此可见，当污泥施用量在37.5 t·hm−2时，根际土壤中OTU丰度便开始降低，而且A10样品和其他各样品之间的OTU丰度相比具有显著差异。这说明污泥施用对根际土壤细菌OTU丰度的影响更加敏感，而且当污泥用量超过一定范围内会显著降低根际-非根际土壤细菌的OTU丰度。
图 1 污泥施用对非根际和根际土壤OTU丰度影响Figure 1. Effects of sludge application on OTU abundance in non-rhizosphere and rhizosphere soilVenn图可以表示不同样品之间共有、特有的OTU数目，直观地表现出个样品之间OTU的重合情况(图2)。结合OTU所代表的物种，可以找出不同样品中的共有微生物。不同样品用不同颜色表示，交叠部分数字为2个样品之间共有的OTU个数。非根际土壤样品A01、A03、A05、A07、A09中总OTU数量为1 896个，共有的数量为993个，占总数52.37%，各样品中特有OTU数量分别为4、11、11、9、12个。这说明污泥施用于石灰性土壤中，改变了非根际土壤中细菌OTU丰度，但随着污泥用量的增加其对土壤中特有微生物的数量影响不大。根际土壤中共有的OTU数量为882，占总共OTU数量1 895比例为46.54%，因此，污泥施用对根际土壤OTU的影响大于非根际土壤。其中A02、A04、A06、A08、A10样品中特有OTU数量分别为8、10、4、13、34个，除A08样品外，随着污泥用量的增加，根际土壤中各处理特有OTU的数量呈增加趋势。污泥用量在75 t·hm−2时，A10和A09样品中特有微生物数量多于其他样品，且根际土壤比非根际土壤增加了183%。
图 2 污泥施用后非根际和根际土壤细菌的Venn图Figure 2. Venn diagram of bacteria in non-rhizosphere and rhizosphere soil after sludge application2.3 污泥施用对石灰性土壤细菌Alpha多样性的影响
石灰性土壤施用不同量污泥后，对细菌多样性指数(Shannon、Simpson)和丰富度指数(Ace，Chao)的影响如表4所示。在污泥施用量为75 t·hm−2的条件下，根际和非根际土壤的Shannon指数与其他各处理相比有显著差异(P<0.05)，其他各处理之间无显著差异(P>0.05)。当污泥用量为3.2～37.5 t·hm−2时，同一污泥施用水平下，根际土壤的Shannon指数与非根际土壤无显著差异(P>0.05)。非根际和根际土壤的Simpson指数在污泥施用量为37.5 t·hm−2时最低，在污泥施用量为75 t·hm−2时最高，该指数值分别为0.004 2和0.003 2，0.009 4和0.009 8，说明37.5 t·hm−2的污泥施用量有利于细菌多样性指数的增加，当污泥用量达到75 t·hm−2时会显著降低细菌多样性。不同污泥施用量的Ace，Chao指数在非根际和根际土壤变化趋势一致，都是污泥施用量为75 t·hm−2时最小，说明75 t·hm−2的污泥施用量不但降低了细菌多样性指数，而且降低细菌的丰富度指数。此外，根际样品A02和A04的Ace，Chao指数比对应的非根际土壤高，但非根际样品A05，A07，A09的Ace，Chao指数大于对应的根际土壤，说明随着污泥施用量的增加会对根际细菌丰富度指数产生不利影响。
表 4 污泥施用对石灰性土壤细菌多样性和丰度影响Table 4. Effects of sludge application on bacterial diversity and abundance in calcareous soil污泥施用量/(t·hm−2) Shannon Simpson Ace Chao 非根际 根际 非根际 根际 非根际 根际 非根际 根际 0 (6.36±0.07)a (6.41±0.12)a (0.004 3±0.000 1)c (0.004 5±0.000 1)c (1 166.06±15.89)c (1 670.20±15.53)b (1 645.37±17.32)c (1 700.84±21.52)b 3.5 (6.38±0.04)a (6.39±0.07)a (0.005 1±0.000 1)b (0.004 8±0.000 2)c (1 727.57±17.55)b (1 754.11±18.59)a (1 750.75±21.00)b (1 759.19±20.59)a 7.5 (6.36±0.12)a (6.37±0.10)a (0.005 1±0.000 1)b (0.005 7±0.000 2)b (1 789.14±17.93)a (1 721.38±17.62)ab (1 785.98+18.95)ab (1 743.80±10.00)ab 37.5 (6.42±0.09)a (6.51± 0.09)a (0.004 2±0.000 1)c (0.003 2±0.000 1)d (1 825.15±26.45)a (1 758.09±29.94)a (1 822.54±9.85)a (1 779.62±22.39)a 75 (6.15±0.04)b (5.98±0.03)b (0.009 4±0.000 1)a (0.009 8±0.000 1)a (1 657.49±13.80)c (1 599.57±21.53)c (1 657.17±17.23)c (1 637.26±14.00)c 注：数据为平均数和标准差分析，每列中不同小写字母表示各处理平均值的显著性差异 (P<0.05)。 | Show TableDownLoad:
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2.4 污泥施用对石灰性土壤细菌群落结构影响
PCA主成分分析可将样品细菌多样性差异反映在二维坐标图上，主成分轴用来解释差异的综合信息，第1主成分轴解释最多的差异，第2主成分轴解释第2多的差异。污泥施用后对石灰性土壤中根际和非根际土壤细菌主成分分析表明，随着污泥施用量的增加，土壤中各处理细菌群落结构距离越远，说明对其群落组成造成的差异越大。对非根际土壤细菌群落结构而言，主成分1的贡献率为56.48%，主成分2的贡献率为24.08%，两者累计为80.56%(图3)。在第1主成分轴(PC1)上，污泥施用后非根际石灰性土壤上细菌群落结构差异较大，且随着污泥用量的增加土壤中细菌群落结构差异变大。在第2主成分轴(PC2)上，污泥用量较低的A01和A03样品细菌群落结构相近，随着污泥用量增加A05，A07，A09样品之间细菌群落结构相近。
图 3 非根际和根际土壤细菌的主成分分析Figure 3. Principal component analysis of bacteria in non-rhizosphere and rhizosphere soil根际土壤细菌群落结构多样性的主成分1占66.15%，主成分2占23.36%，二者累计贡献率为89.51%。在第1主成分轴上A02、A04、A06、A08之间的差异较小，但与A10之间的差异最大。在第2主成分轴上，A02与A04之间的差异最小，与A10之间的差异最大。当污泥施用量增加时，在主成分1对根际土壤细菌会产生较大的影响，在主成分2对非根际土壤产生较大影响。
2.5 污泥施用对石灰性土壤细菌相对丰度的影响
根际和非根际土壤细菌在门水平分类上排名前10丰度的物种如图4所示。非根际土壤中细菌门类群集中于变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)(相对丰度>5%)。土壤中变形菌门和酸杆菌门细菌是土壤微生物的重要成员，在土壤物质循环和生态环境构建过程其道非常重要作用。其中，各处理变形菌门的丰度都超过48%，因为变形菌门适合养分含量高的土壤环境，且与土壤有机质和全氮含量显著相关[26]。污泥施用增加了土壤中有机质和养分(表3)，使得变形菌门的丰度增量范围为1.63%～4.05%。污泥施用量在3.75～37.5 t·hm−2时拟杆菌门丰度增加明显，但污泥施用降低了酸杆菌门丰度(降低幅度为31.58%～34.59%)和放线菌门的丰度。同时，当污泥施用量为75 t·hm−2时，放线菌门的丰度降低达51.75%，这将不利于放线菌抵御病原菌和防治病害作用的发挥[27]。与非根际土壤相比较，根际土壤细菌在门水平上排名前10的种类相同，但其丰度有所变化，根际土壤中细菌门类群集中于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)。当污泥用量增加时，变形菌门丰度增加不明显。与对照相比，当污泥用量为75 t·hm−2时，拟杆菌门有明显的增加，丰度增加达1.45倍；酸杆菌门和放线菌门丰度降低49.74%和80.57%。其中酸杆菌门的降低不但与土壤pH的降低有关，还与污泥施用导致土壤氮素增加也有密切关系[28]。由此可见，随着污泥用量的增加，对根际和非根际土壤细菌门的丰度变化会产生不同影响。
图 4 门水平上非根际和根际土壤细菌的相对丰度Figure 4. Relative abundance of bacteria in non-rhizosphere and rhizosphere soil at phylum level2.6 污泥施用对石灰性土壤细菌功能影响
由上述研究结果可知，污泥施用量达75 t·hm−2时对根际和非根际土壤中细菌多样性产生较大影响。因此，通过KEGG(代谢途径分析数据库)分析空白对照和污泥施用量为75 t·hm−2的处理可知，污泥过量施用可造成根际和非根际土壤微生物群落功能基因在代谢途径上的差异。KEGG功能分析表明(见图5)，2个处理的前十大比例的代谢途径相同，但污泥施用为75 t·hm−2时，明显降低了A09样品中碳水化合物代谢、脂类代谢、氨基酸代谢以及膜运输代谢功能，说明过量的污泥施用已经抑制了土壤系统中C、N的循环过程，并显著增加了代谢途径有辅酶因子和维生素代谢、核苷酸代谢、翻译和信号传导功能，而这些功能的增加可能源于放线菌门数量减少所带来的环境胁迫响应。样品A10的碳水化合物代谢、脂类代谢、能量代谢、外源性物质的生物降解和代谢以及膜运输代谢显著降低，但辅酶因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、翻译功能显著增加。不施用污泥时，样品A02与A01相比只有异源生物降解代谢，翻译，膜运输，信号传导功能增加，其余功能降低。上述代谢差异为判断污泥添加对土壤功能质量影响提供了依据。
图 5 非根际和根际土壤细菌KEGG功能分析Figure 5. Analysis of KEGG function of bacteria in non-rhizosphere and rhizosphere soil2.7 石灰性土壤性质RDA分析及与多样性指数相关性
污泥施用不但对土壤理化性质变化产生影响，而且会造成重金属积累。因此，为了明确上述不同参数对细菌群落组成影响大小，本研究选择土壤pH、电导率(EC)、有机质(OM)、总氮(TN)、总磷(TP)以及污泥添加对重金属影响较为显著的Cd，Zn，Cu，Pb作为环境变量，通过冗余分析(RDA)探查上述参数与纲分类水平下非根际土样品(组1)和根际样品(组2)细菌群落组成的相关性(图6)。第1排序轴解释了细菌群落变化的34.03%，第2排序轴解释了细菌群落变化的20.73%，2个排序轴累积贡献率达54.76%。从图中可以看出，土壤TN、Cd、Cu、TP与细菌群落的相关性大，其中TN、Cd、Cu和土壤Shannon和Simpson多样性指数达到显著相关(表5)，EC、Pb、Zn与细菌群落的关系次之，而土壤中pH和OM对细菌群落组成影响较小。上述结果的原因在于，3.5～37.5 t·hm−2的污泥施用量并没有对土壤pH和OM造成显著影响，但已明显影响了土壤中TN、TP、Cd、Cu等含量。
图 6 土壤细菌群落与土壤性质的RDA分析Figure 6. RDA analysis of soil bacterial community and soil properties注：图中不同形状和颜色的符号表示污泥施用处理的细菌群落；箭头表示环境因子，箭头连线的长度带表某个环境因子与群落分布间相关程度的大小，箭头越长，说明相关性越大，反之越小；细菌群落与环境因子之间的夹角代表细菌群落与环境因子之间正负相关关系，锐角表示正相关，钝角表示负相关，直角表示不相关。表 5 土壤参数与微生物多样性指数之间的相关分析Table 5. Correlation coefficients between soil properties and microbial diversity index多样性指数 pH 有机质 总氮 总磷 EC Pb Zn Cu Cd Shannon 0.428 −0.457 −0.635* −0.550 −0.343 −0.277 −0.591 −0.630* −0.648* Simpson −0.470 0.469 0.642* 0.550 0.324 0.255 0.601 0.667* 0.654* Ace 0.268 −0.175 −0.081 −0.029 2 −0.265 0.198 −0.052 −0.061 7 −0.134 Chao 0.244 −0.164 −0.183 −0.142 −0.195 0.098 −0.124 −0.149 7 −0.223 注：*显著相关 (P<0.05)。 | Show TableDownLoad:
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3. 讨论
微生物多样性是土壤质量的重要参数，而且土壤微生物对其环境改变极为敏感，其多样性变化与土壤退化有密切关系[29]。适量地投放污泥有利于土壤质量的维持，但过量或长期施用污泥会导致土壤质量的降低。ANDRES等[30]通过向土壤中施用污泥，初始阶段均可增加土壤微生物生物量，但1 a以后污泥对土壤微生物活性已消失。长达30 a在大豆、生菜、芥菜上施用污泥的研究表明，污泥长期施用对土壤微生物有负面影响[31]。本研究连续2 a施用75 t·hm−2污泥后，根际和非根际土壤中细菌OTU丰度、多样性Shannon指数和丰富度Ace，Chao指数均会显著降低。因此，针对不同土壤类型开展污泥施用后的微生物多样性变化研究，并根据研究结果采取“隔年间歇式”污泥施用模式，可做到既利用了污泥养分，又能保证土壤质量。
有研究表明，土壤细菌群落多样性的变化与土壤pH、有机质、氮、磷有关，其中pH的变化被认为是影响土壤微生物多样性的主要因素[32-33]。和对照相比，研究中污泥用量为37.5 t·hm−2时，pH才有显著差异(表2)，但由于石灰性土壤上pH变幅较小，使得其不是影响细菌多样性变化的一个重要因素，本研究的RDA分析也印证了该结论。由于重金属对细菌的毒害作用，会显著降低其多样性[34]。较高含量的Cu，Pb，Zn重金属污泥，施入土壤会造成土壤中微生物种群由细菌向真菌转化[35]。富含Zn的污泥施用于沙壤土中会导致了所有微生物群落结构的变化(即细菌，真菌，古生菌，放线菌和根瘤菌)，其中真菌群落受其影响最大[36]。本研究污泥的施用虽然增加了土壤中重金属积累，但由于我国污泥重金属含量有降低趋势[37]，以及石灰性土壤对重金属的“不敏感性”等原因，使得除Cd，Cu外，其他重金属和与细菌群落的相关性并不大。
选择根际土壤进行微生物多样性研究，更能灵敏地反映出外源物质施用对土壤质量的影响[38]。石灰性土壤上通过对细菌OTU丰度和PCA主成分分析，也表明污泥施用对根际土壤细菌的影响更敏感。另外，上述结果只是污泥连续施用2 a后的结论。为了更加全面的准确了解污泥对该类施用对该类土壤微生物多样性的影响，选择多年根际土壤中细菌和真菌的变化研究，才能准确评价污泥农用对微生物多样性的影响，同时也为推荐污泥施用量提供依据。
4. 结论
1)污泥在石灰性土壤上施用会改变根际和非根际土壤中细菌丰富度和多样性指数，而且在2 a连续施用量为37.5 t·hm−2的条件下，不利于根际土壤中细菌多样性增加。当污泥施用量达到75 t·hm−2时，会显著降低根际和非根际土壤中细菌的多样性指数。因此，考虑到根际微生物对外源物质响应的灵敏性，此类土壤中连续2 a的污泥施用量宜控制在37.5 t·hm−2以下。
2)污泥施用造成土壤理化性质的变化是影响土壤细菌群落变化的一个主要因素，另外重金属种类对微生物群落组成的影响也存在差异。本研究在2 a连续施用污泥后，土壤中TN、Cd和Cu是影响细菌群落的主要参数。
3)污泥施用量超过75 t·hm−2时，将会抑制根际和非根际土壤中C、N的循环代谢功能，降低酸杆菌门和放线菌门丰度。这说明此污泥施用量下，土壤质量已经开始下降。
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图 1 不同阶段土壤酶活性和氮、磷、钾有效态含量
Figure 1. Changes in soil enzyme activity and available phosphorus, nitrogen and potassium content at three stages
图 2 各基质Mn、Pb、Zn、Cu和Cd不同形态分布
Figure 2. Distribution proportions of heavy metals Mn、Pb、Zn、Cu and Cd of each substrate
图 4 基质细菌群落在属水平上相对丰度差异及其与环境因子相关性分析
Figure 4. Difference in bacterial community at genus level and correlation analysis of environmental factors
图 5 基质真菌群落在属水平上相对丰度差异及其与环境因子相关性分析
Figure 5. Difference in fungal community at genus level and correlation analysis of environmental factors
图 6 基质重金属流失量与环境因子相关性分析
Figure 6. Correlation analysis of environmental factors and loss of heavy metals in substrate
表 1 蘑菇渣的化学特征
Table 1. Chemical characteristics of spent mushroom compost
pH 有机质/% TN/(g·kg−1) TP/(g·kg−1) TK/(g·kg−1) 重金属质量分数/(mg·kg−1) Mn Pb Zn Cu Cd 7.25±0.01 52.32±0.25 6.36±0.02 3.05±0.03 8.36±0.01 532±6.22 29±0.61 169±2.42 25±0.28 0.41±0.01
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表 2 实验前后各基质的基本理化性质差异
Table 2. Basic physicochemical properties of each substrate
处理组 pH 含水率/% 容重/(g·cm−3) 孔隙率/% TP/(g·kg−1) TN/(g·kg−1) TK/(g·kg−1) 有机质/% CEC/(cmol·kg−1) CKb 7.46±0.02a 25.33±1.22a 1.57±0.04a 40.82±1.26b 0.33±0.003a 0.16±0.01a 10.07±0.02a 2.03±0.01a 17.99±0.69a CKa 7.38±0.02b 15.55±0.54b 1.50±0.02b 43.23±0.49a 0.32±0.001a 0.14±0.01b 8.47±0.06b 1.99±0.01b 17.65±0.30a S0b 7.62±0.02a 35.02±1.23a 1.34±0.04a 49.66±1.49a 0.45±0.003a 0.47±0.01a 9.82±0.09a 4.58±0.06a 25.69±0.28a S0a 7.55±0.01b 21.06±1.14b 1.27±0.02a 52.00±0.66a 0.25±0.010b 0.33±0.01b 8.60±0.08b 4.33±0.07b 22.43±0.36b S1b 7.62±0.03b 34.68±1.15a 1.34±0.01a 49.33±0.34b 0.44±0.010a 0.47±0.01a 9.82±0.05a 4.52±0.03a 25.67±0.15b S1a 7.74±0.01a 28.40±1.32b 1.22±0.02b 54.01±0.60a 0.35±0.006b 0.30±0.01b 8.00±0.10b 3.87±0.07b 26.45±0.44a
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表 3 各基质重金属质量分数
Table 3. Content of heavy metal of each substrate
重金属 项目 重金属质量分数/(mg·kg−1) CK S0 S1 Mn 实验前 10 910±194.7a 9 448±34.2a 9 453±28.0a 实验后 8 422±12.1b 7 528±20.1b 8 849±34.0b Pb 实验前 3 340±39.2a 3 029±21.4a 3 053±28.5a 实验后 2 612±4.5b 2 320±5.0b 2 738±24.0b Zn 实验前 4 239±13.1a 3 822±6.8a 3 830±13.6a 实验后 3 247±35.6b 3 050±21.2b 3 428±33.4b Cu 实验前 143±3.2a 134±2.1a 135±1.1a 实验后 134±2.2b 124±1.4b 125±2.4b Cd 实验前 34.27±0.40a 30.07±0.15a 29.60±0.26a 实验后 30.50±1.28b 22.93±0.06b 25.27±0.04b 注：同种重金属实验前后不同字母表示不同处理下基质重金属质量分数显著差异(P<0.05)。
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表 4 栾树根、茎、叶中的重金属含量
Table 4. Heavy metal content in roots stems, and leaves of Koelreuteria Paniculata
重金属 重金属质量分数/(mg·kg−1) 根 茎 叶 Mn 922.3±16.8 357.5±33.7 1 116.5±2.8 Pb 10.3±0.1 1.3±0.1 163.4±9.8 Zn 295.7±20.2 237.5±6.5 234.6±0.6 Cu 27.0±1.5 7.4±0.4 16.9±0.3 Cd 0.55±0.13 0.61±0.04 0.81±0.03
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表 5 各处理基质中重金属占比
Table 5. Distribution of heavy metal of each substrate
重金属 处理组 重金属占比/% 基质留存量 植物吸收量 径流流失量 Mn CK 77.216±1.50c — 22.784±1.50a S0 79.686±0.50b — 20.314±0.50b S1 93.608±0.60a 0.004±0.00 16.495±0.59c Pb CK 78.213±1.01b — 21.786±1.01a S0 76.589±0.40b — 23.411±0.40a S1 89.691±1.62a 0.001±0.00 10.308±1.62b Zn CK 76.586±1.02c — 23.414±1.02a S0 79.814±0.69b — 20.186±0.69b S1 89.487±0.73a 0.003±0.00 10.510±0.73c Cu CK 93.503±1.35a — 6.497±1.35a S0 92.324±1.76a — 7.676±1.76a S1 92.809±1.93a 0.006±0.00 7.394±1.93a Cd CK 88.949±3.05a — 11.051±3.05b S0 76.331±0.60b — 23.669±0.60a S1 85.372±2.07a 0.026±0.00 14.625±2.07b 注：同列不同字母表示不同处理下该种重金属总量显著差异(P<0.05)；利用实验前、后各基质中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd的含量和基质容重分别求得实验前、后重金属的总量，相减得到各装置中损失的重金属的量(主要包括植物吸收量和径流流失量)，实验后装置中重金属总量记为基质留存量。S1处理中栾树对不同重金属的吸收总量由根、茎、叶各部分的干重及其重金属含量求得，径流流失量(重金属随表流和潜流雨水的流失总量)利用实验前基质重金属总量减去植物吸收量和基质留存量求得，所有数据均利用百分比进行归一化处理。
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表 6 土壤微生物群落α多样性指数
Table 6. α diversity index of soil bacterial community
微生物 处理组 chao1指数 goods_coverage指数 observed_species指数 Simpson指数 细菌 CK 3 890.44±561.08b 0.982 0±0.002 4a 2 860.30±468.34b 0.967±0.034 8a S0 6 353.55±458.40a 0.969 9±0.002 4b 4 816.40±387.44a 0.995±0.000 2a S1 6 845.26±372.30a 0.966 7±0.001 2b 5 057.53±486.56a 0.995±0.000 8a 真菌 CK 380.34±30.25b 0.999 39±0.000 22a 338.30±41.05a 0.88±0.06a S0 326.59±59.23b 0.998 84±0.000 23b 224.27±39.14b 0.67±0.12b S1 477.47±31.41a 0.99859±0.000 01b 392.03±37.15a 0.77±0.07a
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