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人粪污无害化处理对于疾病预防控制和农村人居环境整治具有重要意义。我国将推进人粪污无害化处理和资源化利用作为乡村振兴和美丽乡村战略的重要实施策略[1]。人粪污中含有大量有机物和营养元素[2]，每人每年产生的粪污中约含5.7 kg氮、0.6 kg磷和1.2 kg钾[3]，并且没有重金属污染的风险，可有效替代化肥[4]。我国自古一直有将人粪污堆沤还田农用的习惯，除了用作肥料，还可作为土壤改良剂，补充腐殖质[5]。但人粪污中含有大量病原体和大分子有机物质，为了避免粪口传播，在施入农田前必须充分腐熟以降低肠道疾病感染风险[6]。人粪污堆肥经过充分腐熟，可杀灭其中的病原菌以及寄生虫卵，形成含有高有机质以及氮磷钾等营养元素的农家肥，但若堆肥腐熟不充分，人粪污农用则会导致病原体的传播，造成二次污染。
不同地区不同的生活及如厕习惯，导致人粪污含水率差异较大[7-8]，在堆肥过程中物料含水率会影响堆体的氧气运输量，还可以调节发酵温度、物料孔隙率以及微生物活性等[9]，是影响堆肥进程及有机质降解率的主要因素[10]。一般认为，堆肥适宜的含水率是55%~65%[11]，较低的含水率不利于微生物生长繁殖，易导致堆肥产品未腐熟等问题。较高的含水率会使物料产生团聚，不利于通风，产生局部厌氧，延长堆肥周期。不同物料好氧堆肥的最佳含水率也存在差异。ZAVALA等[12]认为，人粪污和木屑共堆肥含水率大于64%会产生厌氧降解。而PETRICA等[13]研究表明，禽粪和麦秸联合堆肥时的最佳初始含水率为69%。此外，GUO等[9]通过正交实验研究通风量、C/N和含水率对猪粪和玉米秸秆堆肥影响时发现，65%、70%和75%的初始含水率间无显著性差异。
好氧堆肥过程是在不同微生物参与的条件下完成的，含水率会影响微生物生理和代谢活动所需的溶解性营养物质的运输，进而影响微生物生命活动[9]。LI等[14]在研究不同表面活性剂对牛粪和甘蔗渣堆肥有机质降解和微生物群落功能特性影响时发现，含水率是影响堆肥初期细菌群落结构的主要环境因子，并且在整个堆肥过程中，其对细菌群落的影响仅次于纤维素。GUO等[15]以锯末和玉米芯为主要堆肥原料的研究也证实含水率是堆肥初期影响细菌群落的主要因素，他们还发现含水率与真菌群落的相关性大于其他环境因子。GE等[16]在研究初始含水率和pH对牛粪与麦秸共堆肥影响时发现，总氮、pH和含水率对堆体中真菌和细菌群落演替均有显著影响，但含水率对微生物群落差异的贡献度低于总氮和pH。因此，堆肥物料不同，含水率对堆肥过程中微生物群落的影响也不尽相同。
目前，初始含水率对好氧堆肥腐熟及微生物群落结构影响的研究多以畜禽粪污为原料，以人粪污为原料的研究鲜见报道。本研究借鉴畜禽粪污堆肥工艺研究结果，以人粪污为原料，选择含水率作为好氧堆肥关键影响因子，从堆肥物料的基本理化性质、养分质量分数、无害化效果3方面对堆肥产品进行评价，并进行微生物群落结构变化分析，探究初始含水率对人粪污好氧堆肥腐熟及微生物群落结构的影响，了解初始含水率对人粪污堆肥进程的影响，为优化人粪污好氧堆肥工艺参数提供参考，促进人粪污无害化处理和资源化利用。
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本研究使用的人粪污取自北京市顺义区某农村旱厕，调理剂为2 cm长的玉米秸秆。原料性质见表1。本研究中使用的堆肥发酵装置参考文献[17]，该装置有效容积为60 L，由发酵罐罐体、通风控制系统、温度监测系统、空气泵等部分组成，可实时记录堆体温度，控制堆体通风量。罐体顶部设有1个通风口，侧面设有上、中、下3个取样口 (图1) 。
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以人粪污为原料，选择初始含水率为关键影响因子，设置含水率 (MC，Moisture Content) 为55% (MC55) 、60% (MC60) 和65% (MC65) 3个处理组，开展实验。用玉米秸秆调节含水率与碳氮比 (C/N) ，实验设计如表2所示。曝气方式采用间隔曝气，隔45 min曝气5 min，曝气量为0.7 L·min−1·kg−1[16]，实验周期为30 d。待堆体温度降至室温时进行翻堆。每2 d采集1次样本，每次在堆体的上、中、下均匀采样共500 g，并分为3部分，一部分储存在4 ℃冰箱用于测定MC、pH值、电导率 (EC，Electrical Conductivity) 、种子发芽指数 (GI，Germination Index) ；一部分晾干后用于测定总碳 (TC，Total Carbon) 、总氮 (TN，Total Nitrogen) 、总磷 (TP，Total phosphorus) 、总钾 (TK，Total potassium) ；另一部分储存在-80 ℃超低温冰箱用于粪大肠菌群数和微生物群落结构检测，取升温期、高温期和腐熟期-80 ℃保存样品进行微生物群落结构测定。
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堆体温度由发酵罐自带的PT100温度探头测定，每天上午9点，下午3点进行记录。MC、pH值、EC、GI测定方法参考文献[18]，TC、TN质量分数用元素分析仪 (Flash-2000，美国赛默飞世尔科技公司) 测定，TP、TK质量分数用电感耦合等离子体原子发射光谱仪 (Agilent 7800，美国安捷伦科技有限公司) 测定，粪大肠菌群数按照GB/T 19524.1-2004《肥料中粪大肠菌群的测定》[19]的方法测定。样品DNA提取及PCR扩增参照文献[20]的描述，委托第三方实验室在其Miseq平台进行16s rRNA和ITS深度测序。
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1) 基本理化性质。温度是反应堆肥过程的一个直观参数。3个处理组温度变化如图2所示。各处理温度变化趋势相似，均出现2个高温期 (>50 ℃) ，但每个高温期最高温度与维持时间有明显不同。堆肥初期，3个处理组温度均迅速攀升，在第2 d达到第1个高温期，MC55、MC60和MC65处理组高温期分别持续1、2和5 d，最高温度分别为54.0、67.2和67.1 ℃。这表明，较高的含水率更加适合堆肥初期微生物的生长繁殖，有助于人粪便好氧堆肥启动。随后堆体温度开始下降，降至室温后进行了翻堆，MC55和MC60处理第8天翻堆，MC65处理第14 d翻堆。由于翻堆增加了物料与氧气的接触面积[10]，进一步优化了微生物的生存环境[21]，各处理翻堆后迎来第2个高温期，MC55、MC60和MC65处理组第2个高温期分别持续4、1和0 d ，最高温度分别为61.0、50.1和35.9 ℃。MC55处理的温度变化与HASHEMI等[7]的研究存在差异，这可能是由于堆体含水率较低，不适合微生物生长繁殖。由于前期大部分有机质已被降解，MC60和MC65处理第2个高温期持续时间均较短。堆肥后期，随着可降解有机物质的不断消耗，微生物活性逐渐减弱，堆体温度逐渐降低至室温。整体而言，各处理高温期均大于2 d，均已达到《粪便无害化卫生要求》 (GB 7959-2012) [22]，MC65处理高温期持续时间最长，表明初始含水率65%更适合微生物的新陈代谢，有机质降解更充分[10]。
水分不仅参与微生物的生长繁殖，还影响着堆肥效果和理化性质的变化[23]。3个处理堆肥过程中MC变化如图3所示。3个处理组的MC均呈波动下降最终趋于稳定的趋势。3个处理在翻堆后MC均有所升高，由于在翻堆时观察到堆体表层有大约1 cm厚的物料明显比其他物料更加潮湿，因此推测MC的升高是翻堆造成的。MC65处理MC在前12 d下降幅度较大，这是因为该处理第1个高温期持续时间最长，蒸发带走了大量水分。由于MC55处理第2个高温期持续时间较长，其含水率在翻堆后才表现出明显下降。堆肥结束时，3个处理堆体MC均在45%左右，MC55、MC60和MC65处理组含水率较初始时分别下降了11.64%、12.9%和18.91%。
堆肥过程中微生物生长的最佳pH是6.7~9.0[24]。不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程pH变化如图4所示。3个处理组pH值在升温期和高温期有明显不同，MC55处理pH值呈先下降后波动上升的趋势，而MC60和MC65处理pH值呈先升高后降低的趋势。产生这种差异的原因可能是堆肥初期MC55处理可被微生物利用的有机物质量分数高于其他处理，微生物分解有机物产生有机酸的速率高于含氮有机物分解产生铵态氮 (ammonium nitrogen，AN) 的速率，造成了有机酸积累[25]，而MC60和MC65处理由于温度较高，加速了有机酸的分解和挥发，导致了pH的升高[26]。因为MC65处理高温期较长，NH3挥发较多，导致了MC65处理pH下降速率高于MC60处理[26]。堆肥后期，随着温度的下降，硝化作用增强，3个处理pH也出现不同程度的下降[16]。在堆肥反应结束时，3个处理的pH无显著性差异 (p>0.05)。
EC是反应堆体盐分的指标，与堆肥样品浸提液中离子总浓度呈正相关。不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程EC变化如图5所示。MC55和MC60处理EC均呈先升高后降低，最终趋于稳定的趋势。由于微生物将有机物分解为小分子物质，堆体的离子浓度升高，造成堆肥初期EC值升高。随着NH4+以NH3形式挥发和腐殖质的形成，EC值逐渐降低[27]。由于MC65处理堆肥初期高温加速了NH3挥发[10]，EC值呈现降低趋势，随着温度下降，NH3挥发减少，微生物的分解作用依然存在，EC值逐渐升高，并趋于稳定。堆肥结束时，3个处理组间EC值无显著差异 (p>0.05) ，MC55、MC60和MC65处理组的EC值分别为3.81、3.68和3.33 mS·cm−1，均低于4 mS·cm−1，作为肥料施入土壤不会对作物及土壤产生不利影响[28]。
2) 养分质量分数变化。不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程TP、TK变化如图6所示。3个处理组TP、TK质量分数随着堆肥反应的进行均呈增长趋势。这是因为，堆肥过程是微生物不断分解有机物的过程，随着有机物的降解，物料会产生浓缩效应[29]。李英凯等[30]的研究也得到了同样的结论。堆肥结束时，MC55、MC60和MC65处理组TP质量分数较初始时分别增长了44.18%、55.71%和51.33%，TK质量分数分别增长了44.88%、74.87%和69.37%。堆肥结束时，3个处理组TP质量分数无显著性差异 (p>0.05) ，MC60处理TK质量分数显著高于其他2个处理组 (p<0.01) ，MC55和MC65处理组TK质量分数无显著性差异。
不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程TC、TN变化如图7所示。由于前4 d微生物活性较高，有机质降解速度快，造成反应初期TC质量分数大幅下降。随着反应的进行，在堆肥后期，可被降解的有机物不断减少，微生物活性逐渐下降，TC质量分数下降幅度减缓，在腐熟期TC质量分数趋于稳定。堆肥结束时，MC55、MC60和MC65处理组TC质量分数较初始时分别下降了21.51%、18.42%和22.79%。这与袁京等[31]的研究结果一致。随着反应的进行，TN质量分数呈先上升后趋于稳定的趋势，反应结束时，3个处理组间TN质量分数无显著性差异 (p>0.05) 。在玉米秸秆堆肥[32]和蔬菜废弃物堆肥[29]的研究中都得到了这样的结果，这些研究认为这是物料浓缩效应造成的。另有研究结果表明，堆肥过程会造成氮损失，且初始含水率在60%~65%时，TN损失相对较高[31]，而本研究中随着初始含水率的增加，TN增长量也在增加。产生这种异同情况的原因需在以后的研究中进一步分析。
3) 无害化效果。GI是反应堆肥腐熟度和作物毒性的指标[9]。不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程GI变化如图8所示。初始时，3个处理组GI均低于30%，且初始MC越低，GI越低，表明未经发酵的人粪污具有较高的作物毒性。堆肥初期MC55处理GI缓慢上升， MC60和MC65处理GI升速较快。第4 d时MC60处理GI已经高于80%，达到无害化要求[10]。这表明，MC60更有助于堆肥对人粪污作物毒性的削减，进而提高堆肥腐熟效率[9]。在堆肥结束时，MC55、MC60和MC65处理组GI分别为115.52%、80.05%和92.14%，均达到《畜禽粪便堆肥技术规范》 (NY/T 3442-2019) [33]的要求。
粪大肠菌群是体现堆肥产物无害化程度的重要指标。3个处理组粪大肠菌群随时间变化趋势如图9所示。MC55处理粪大肠菌群呈先减少后增加又减少，从第18 d又大幅增长的趋势，堆肥结束时，粪大肠菌群数约为808 MPN·g−1；MC60处理粪大肠菌群呈先减少后波动增长，最后又减少的趋势，第30 d粪大肠菌群数降为93 MPN·g−1；MC65处理粪大肠菌群数呈先下降后增长，再下降再增长，最终趋于稳定的趋势，但最高未超过40 MPN·g−1。这表明，MC55和MC60处理降温期堆料适合粪大肠菌群生长，可能是由于粪大肠菌群是耐热菌，可在37~47 ℃的环境中生存[34]。在堆肥结束时，MC60和MC65处理均已达到无害化卫生要求[22]，而MC55处理未达到无害化卫生要求，且大肠菌群数高于初始时。SADEGHI等[35]的研究也发现堆肥腐熟期粪大肠菌群再生的现象，他们认为这是高温期持续时间较短造成的。
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1) 覆盖度和OUT聚类。本实验9个样本共检测出524 316个优质细菌序列，1085 401个优质真菌序列。经uparse聚类后，共产生1 357个细菌 operational taxonomic units (OTUs)和1 189个真菌OTUs，经过抽平处理剩余1 336个细菌OTUs和1 150个真菌OTUs。细菌和真菌分别观察到23和9门，46和35纲，130和92目，227和171科，456和274属。这表明，在人粪污与玉米秸秆堆肥过程中，细菌丰度明显高于真菌丰度。GUO等[15]的研究也得到了这样的结论，他们用桃木屑堆肥，共发现了1 538和383个细菌和真菌OTUs。
用稀释性曲线展现测序数据量合理性及各样本物种数量。如图10所示，各样本稀释性曲线都趋于平稳，表明更多的数据量只会产生少量的新OTUs，说明样本测序数据量合理。如图10 (a) 所示，MC60与MC65处理高温期细菌OTUs低于升温期和腐熟期。其中，MC60处理在腐熟期的细菌多样性高于升温期，而MC65处理腐熟期的细菌多样性低于升温期。这表明，在高温期细菌多样性减少，随着温度的下降，细菌多样性又有所增加，且MC60处理腐熟期样品细菌多样性高于升温期。MC55处理的OTUs数目随堆肥反应的进行呈下降趋势，表明随着反应的进行该处理细菌多样性逐渐降低。如图10 (b) 所示，随着堆肥的进行，MC55和MC65处理真菌OTUs数目逐渐减小，表明这2个处理真菌数量多样性随着反应的进行依次降低。MC60处理OTUs数目先增加后减少，表明在堆肥高温期其真菌多样性最高。WEI等[32]认为，堆肥过程OTUs的波动是堆体环境条件引起的。
2) 门和属水平上物种组成。堆体中优势细菌相对丰度如图11 (a)~图11 (b) 所示。从门水平上看 (图11 (a) ) ，几个样本细菌主要由厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门组成，这4个菌门是公认的堆肥过程的主要细菌菌门[36]，它们都参与纤维素和木质素的降解[15]。各样本间各细菌菌门相对丰度存在较大差异。在升温期，变形菌门是MC55处理优势菌门；厚壁菌门是MC60和MC65处理优势菌门。到高温期，MC55处理优势菌门演替为厚壁菌门；MC60处理优势菌门演替为变形菌门；MC65处理优势菌门仍为厚壁菌门，其相对丰度有所增加。厚壁菌门演替为优势菌门是由于其可形成耐热的内生孢子[37]，具有较强的热可塑性[38]。到腐熟期，MC55处理优势菌门仍为厚壁菌门；MC60和MC65处理优势菌门为变形菌门，同时，拟杆菌门相对丰度有所增加，MC65处理拟杆菌门相对丰度高于MC60处理。由于拟杆菌门是堆肥过程中木质纤维素的主要分解者[39]，因此，较高的含水率加速了腐熟期木质纤维素的分解。在属水平上(图11 (b) )，3个处理不同时期样本间差异很大，这可能是由于堆肥初始时堆体间细菌相对丰度就存在很大差异[40]。在高温期，MC55处理优势菌属为乳酸菌 (Lactobacillus) 、葡萄球菌 (Staphylococcus) 和肠球菌 (Enterococcus) ，这3类菌属主要分解糖类并广泛存在于肠道中[41]；MC60处理优势菌属由Carnobacterium演替为Psychrobacter，Psychrobacter能产生参与腐殖化过程的过氧化氢酶[42]，表明MC60 处理在堆肥第2 d已经开始腐殖化进程；MC65处理优势菌属由Atopostipes演替为Bacillus，Bacillus可降解纤维素和有害物质[16]。在腐熟期，Saccharomonospora和Bacillus成为MC55处理的优势菌属，2者均可降低腐熟产物的作物毒性[16]，这与MC55处理GI在腐熟期才达到无害化要求相吻合； MC60和MC65处理优势菌属均为uncultured和uncultured_bictureium，结合温度和无害化指标变化，推测uncultured和uncultured_bictureium可能是表征堆肥腐熟的菌属。由3个处理不同时期优势均属变化可以发现，高温期MC60和MC65优势菌属不同，并且分别以腐殖化和无害化进程为主，但在腐熟期2个处理微生物群落结构具有相似性。整个堆肥过程中，MC55处理优势菌属均不同于另外2个处理，且无害化进程主要发生在腐熟期。
真菌门和属水平相对丰度如图11 (c)~图11 (d) 所示，在门水平上 (图11 (c) ) ，不同处理不同时期的优势真菌门都是子囊菌门和担子菌门，这与GUO等[15]的研究结果一致。随着堆肥的进行，MC55和MC60处理子囊菌门相对丰度逐渐增加，MC65处理在高温期子囊菌门相对丰度也有所升高，这可能是因为子囊菌门和担子菌门都可以分泌多种纤维素和半纤维素降解酶[43-44]，但Basidiomycota对高温敏感，而Ascomycota能很好的适应温度和营养胁迫[15]。担子菌门演替为MC65处理腐熟期优势菌门，这可能是因为腐熟期以木质素等难降解有机物的降解主要发生在腐熟期[45]，担子菌门在木质素降解中起着关键作用[46]。在属水平上 (图11 (d) ) ，MC60处理各时期真菌相对丰度变化不大，其中曲霉 (Aspergillus) 相对丰度逐渐升高 (从37.63到42.67%) ，Thermomyces (从39.05%到32.98%) 相对丰度逐渐下降。Aspergillus和Thermomyces都能分解半纤维素[16]，Aspergillus可以加速堆肥进程，缩短腐熟期[47]。HERNÁNDEZ-LARA等[40]也认为曲霉是腐熟期的优势真菌。在高温期，MC55和MC65处理优势菌属均为Meyerozyma，Meyerozyma的菌株能分泌多种大分子有机物降解酶[48]，并且与富里酸的形成有关[49]。这表明，MC55和MC65处理在高温期有大量富里酸合成。在腐熟期，Melanocarpus成为MC55处理优势菌属；同时，在MC60和MC65处理中也观察到Melanocarpus相对丰度的增加。Melanocarpus可以产生纤维素酶和木聚糖酶，参与富里酸、胡敏素的降解和胡敏酸的形成[49]。因此，MC55处理在第30 d仍处于腐殖化进程。在腐熟期，MC65处理Coprinopsis相对丰度最高，车悦驰[50]在西藏地区污泥堆肥的研究中也发现Coprinopsis在堆肥腐熟期成为优势菌属，但其原因还需进一步研究。
3) 微生物丰富度和群落多样性。Chao1指数是菌种丰富度指数，Shannon指数是用来估算样品中微生物多样性指数之一。不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程不同阶段细菌和真菌Chao1和Shannon指数如表3所示。MC55处理细菌和真菌的微生物丰富度与群落多样性都逐渐减少。MC60处理高温期细菌Chao1和Shannon指数低于另外2个时期。这表明，高温期细菌数量与种类都逐渐减少，随着温度的降低细菌数量逐渐恢复至初始水平，细菌群落多样性较堆肥初期还有所增加。随着反应的进行，MC60处理真菌丰富度逐渐减少，但真菌物种均匀度在高温期增加后又随着温度的降低而减小。MC65处理细菌丰富度和多样性变化与MC60处理相同，但真菌丰富度与均匀度都逐渐降低。GE等[16]在研究初始含水率和pH对牛粪堆肥过程微生物演替的影响时，也发现从高温期到腐熟期细菌多样性逐渐降低。总体来讲，MC65处理细菌丰富度高于其他处理，细菌多样性高于MC60处理，但升温期细菌多样性低于MC55处理。MC65处理真菌丰富度与MC60处理相当，低于MC55处理，真菌多样性低于MC60处理，高于MC55处理。这表明，MC65有助于提高堆肥过程中细菌丰富度与多样性，但MC60可提高真菌多样性。
4) 群落结构分析。主坐标分析(PCoA)可以了解不同处理间微生物群落差异性。PC1和PC2共解释了39.52%的细菌差异性和60.48%的真菌差异性 (图12) 。如图12 (a) 所示，3个处理不同时期样本细菌群落结构均有明显分离，表明堆肥时间对细菌分布有显著影响，DU 等[51]也得到了这样的结论。MC55和MC65处理在反应初期样本群落结构差异较小，与MC60处理在第二坐标轴上存在较大差异。MC60和MC65处理在高温期和腐熟期细菌群落结构具有相似性，而与MC55处理细菌群落有明显的分离。这表明，MC60和MC65处理细菌群落演替具有相似性，都与MC55处理细菌群落演替存在明显差异。如图12 (b) 所示，MC55和MC65处理不同时期样本真菌群落变化相似，升温期和高温期真菌群落结构在第一坐标轴上有明显的分离，腐熟期真菌群落与堆肥初期和高温期均有明显的分离。MC60处理不同时期样本间真菌群落差异性较小，且与MC55和MC65处理有明显的分离。这表明，MC55和MC65处理真菌群落随时间的变化具有相似性，但与MC60存在较大差异。
5) 冗余分析RDA。堆肥是微生物活动的过程，环境因子对微生物群落结构有很大影响。采用RDA分析方法，分析了环境因子 (MC、TC、TN、TK、TP、pH、EC、C/N、AN) 对人粪污堆肥系统中相对丰度前20的细菌属和真菌属的影响。如图13所示，RDA1和RDA2共解释了细菌群落结构和环境因子总变异的63.61%，RDA1和RDA2共解释了真菌群落结构和环境因子总变异的68.86%。RDA图中箭头的长度表示环境因子与样本分布的相关程度[40]。C/N是引起堆体中细菌群落变化的关键因素，C/N和MC是引起堆体中真菌群落变化的关键因素，此外，在引起细菌群落变化的环境因子中，C/N和MC具有很高的正相关性。这可能是因为，C、N是微生物代谢的主要营养物质[52]，而MC是可溶性营养物质运输的载体[9]。随着堆肥的进行，MC对的微生物群落结构的影响逐渐减小。这表明，MC对微生物群落结构的影响主要发生在堆肥初期。这与LI等[14]的研究结果一致。
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1) MC55、MC60和MC65处理，经30 d好氧堆肥，堆肥产品均可达到腐熟标准，堆肥产物没有作物毒性 (GI>80%) 。3个处理组堆体高温期 (>50 ℃) 持续天数为2~5 d，MC65处理高温持续时间最长。堆肥结束时，MC60和MC65处理堆肥产物均达到无害化卫生标准，MC55处理堆肥产物未达到无害化卫生标准。
2) 3个处理组细菌丰度均高于真菌。MC65处理有助于提高堆肥过程中细菌丰富度与多样性，但MC60处理可提高真菌多样性。MC65处理增加了腐熟期拟杆菌门、担子菌门和与腐熟相关的菌属的相对丰度，加速了木质纤维素的降解及堆肥腐熟进程。MC对微生物群落结构的影响主要发生在堆肥初期。
3) 综合考虑堆肥物料的基本理化性质、养分质量分数和无害化效果3方面因素，人粪污和玉米秸秆联合好氧堆肥的最佳初始含水率为65%。
初始含水率对人粪污好氧堆肥腐熟及微生物群落结构变化的影响
Effect of the initial moisture content on the maturity extent and the microbial community structure of the aerobic compost with human excrement
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摘要: 为探究人粪污好氧堆肥最佳工艺参数，探究初始含水率对人粪污好氧堆肥腐熟及微生物群落结构变化的影响。以人粪污为原料，玉米秸秆为调理剂，设置初始含水率55% (MC55) 、60% (MC60) 和65% (MC65) 3个处理组，在60 L的密闭发酵罐中堆肥30 d。结果表明，在不同初始含水率条件下，堆肥产品均可达到腐熟标准，堆肥产物没有作物毒性 (GI>80%) 。MC60和MC65处理堆肥产物均已达到无害化卫生标准，MC55处理堆肥产物未达到无害化卫生标准，其粪大肠菌群数依然高于102 MPN·g−1。3组处理中，细菌丰度均高于真菌，MC65有助于提高堆肥过程中细菌丰富度与多样性，但MC60可提高真菌多样性。3组处理间主要细菌门和真菌门组成一致，MC65处理增加了腐熟期拟杆菌门和担子菌门的相对丰度。升温期和高温期3个处理优势细菌属具有明显差异；腐熟期MC60和MC65处理细菌属组成具有相似性，MC55和MC65处理真菌属随时间的变化具有相似性。MC65处理增加了高温期Bacillus和Meyerozyma的相对丰度，增加了腐熟期uncultured_bictureium和Coprinopsis的相对丰度。MC对真菌演替的影响大于细菌，随着堆肥的进行，MC对微生物群落结构的影响逐渐减小。MC65处理高温期持续时间最长，堆肥产物粪大肠菌群数最低，增加了腐熟期木质素降解菌的相对丰度，是人粪污好氧堆肥最佳初始含水率。本研究结果可为优化人粪污好氧堆肥工艺参数提供参考。Abstract: In order to study the optimal process parameter of the aerobic composting with the human excrement, the effect of the initial moisture content (MC) on the maturity extent of the aerobic composting and the microbial community structure of the human excrement were studied. Adopting the human excrement as the raw material and the corn straw as conditioner, three treatment groups were set up with initial moisture content of 55% (MC55), 60% (MC60) and 65% (MC65), respectively. The experiment was conducted in three 60 L closed fermenters with composting for 30 days. The results showed that the compost products could fulfill the maturity standard and had no crop toxicity (GI>80%) with different initial moisture contents. The compost products of MC60 and MC65 had satisfied the non-hazardous sanitary standard, while the compost products of MC55 could not, with the fecal coliforms which was higher than 102 MPN·g−1. The bacterial abundances were higher than those of fungi in all three treatments, which indicated that the treatment of MC65 could improve the richness and the diversity of the bacteria during the composting process, but MC60 could increase the diversity of the fungi. The compositions of the major bacterial phyla and fungal phyla were consistent among the three treatments. The treatment of MC65 increased the relative abundance of the Bacteroidetes and Basidiomycetes during the mature phase. The dominant bacterial generas among the three treatments were significantly different during the heating and the thermophilic phases. The bacterial genus was similar between MC60 and MC65 during the mature phase, and the variations of fungal genera during the compost period were similar for MC55 and MC65. The treatment of MC65 improved the relative abundances of Bacillus and Meyerozyma during the thermophilic phase, as well as uncultured_bictureium and Coprinopsis during the mature phase. The effect degree of MC on the fungal succession was greater than that of the bacteria, and the effect of MC on microbial community structure gradually decreased throughout the composting process. For compost products, MC65 has the longest thermophilic phase and the lowest number of fecal coliforms, and the relative abundance of lignin-degrading bacteria was increased in the mature phase, which illustrated that it was the best initial moisture content for the aerobic compost with human excrement. This research can provide the reference for optimizing the technological parameters for aerobic compost with human excrement and promote the resource utilization of human excrement.
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Key words:
- moisture content /
- human excrement /
- aerobic composting /
- microbial community structure
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塑料制品的使用非常广泛，但在其给人们生活带来便利的同时，大量塑料废物也给环境带来很大压力。塑料废物是难物降解，会在环境中存留长达400~1 000年[1]。经过长时间的物理、化学和生物降解等作用，塑料在自然环境中断裂成塑料碎片或颗粒。当这些塑料碎片或颗粒的粒径小于5 mm时，被定义为微塑料[2]。除此之外，一些化妆品和清洁剂中也会添加微塑料[3]。微塑料广泛存在于生态环境中，与塑料相比，微塑料的化学性能更加稳定，更容易被生物吞食，并通过生物链发生传递、富集，甚至对人体产生危害[4]。因此，微塑料的污染问题逐渐成为研究热点和重点。
近年来，关于海洋环境中微塑料的研究日益增多。CORDOVA等[5]分析了印度尼西亚泗水海峡北岸微塑料的分布特征，发现聚苯乙烯为主要的微塑料类型。COLLIGNON等[6]发现，地中海北部水体中的微塑料丰度在强风事件前是强风事件后的5倍。内陆河流与湖泊环境与人类活动的关系更为密切，但是相关微塑料污染研究相对较少。JIANG等[7]分析了青藏高原河水和河流沉积物中微塑料的分布特征，发现在人类活动稀少的偏远地区微塑料污染程度小。WANG等[8]研究了浙江温瑞塘河沉积物中微塑料的分布特征，发现粒径小于300 μm的微塑料更容易积聚在河流沉积物中，从而使得进入海洋中的这类微塑料丰度减小。
白洋淀是我国华北平原最大的淡水湖泊，位于河北省东南部的保定市，地处太行山东麓、永定河冲积扇与滹沱河冲积扇之间的低洼地区，属海河流域大清河水系[9]。白洋淀淀区水域面积为366 km2，平均蓄水量13.2×108 m3，被称为“华北明珠”[10]。府河是白洋淀的最重要供水河流之一，全长62 km，流域面积781 km2[9]。府河沿岸居民众多，生活和农业生产中使用的塑料产品繁多。这些产品形成的塑料废物通过污水排放和地表径流等多种方式输送到府河，最终流入白洋淀或在河道中堆积。目前，还没有关于白洋淀地区微塑料污染状况的研究。本研究通过对府河入淀口段中沉积物进行采样并检测，分析沉积物中微塑料的污染现状及其来源，以期为白洋淀区域微塑料污染方面的治理提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验原料
在府河入淀口设置15个采样点采集沉积物样品。每个采样点间隔2 km左右。采样点分布如图1所示，同时采用GPS进行定位。采样点南刘庄(F1)、旧大桥(F2)、新大桥(F3)、东向阳(F5)、西向阳(F6)、际头(F7)、大寨(F8)、桥北(F9)、白庄(F11)、建昌(F12)和李庄(F13)均为村庄附近或者人流较为密集区域，F4、F10、F14、F15这4个采样点附近多为农田，少村庄。用不锈钢柱状采样器在以上采样点采集深度为5 cm处的沉积物样品，每个位点分别取3个平行样。将样品分别装入玻璃瓶中密封保存，送回实验室进行进一步分析。
图 1 府河入淀口段沉积物采样点分布图Figure 1. Sampling sites along Fuhe River estuary into the Baiyangdian Lake注：F1~F15表示15个采样点。1.2 实验装置
真空抽滤系统(SHZ-DIII，天津市予华仪器科技有限公司)；体视显微镜(XTD-7045A，北京世纪科信仪器有限公司)；傅里叶变换红外光谱仪(Vertex 70，德国布鲁克科技有限公司)。
1.3 实验方法
沉积物样品中微塑料提取采用密度浮选法[11-12]。取适量沉积物样品在50 ℃下烘干，至沉积物样品的质量恒定不再变化。称取50 g沉积物干样，加入1 L的饱和氯化钠溶液，摇晃均匀，室温下静置12 h。取上清液置于真空抽滤系统下抽滤，滤膜采用1 μm的混合纤维素滤膜。抽滤完成后，将滤膜置于干净的培养皿中进行下一步检测。将滤膜置于体视显微镜下观察，根据颗粒的外观、颜色等判断其是否为微塑料，拍照计数，测量微塑料的粒径。
1.4 分析方法
选取50个颗粒进行红外光谱分析，检测其成分及类型，统计分析微塑料的丰度、形状和粒径大小。每个实验样品设置3个平行。沉积物样品中微塑料丰度以每千克干重沉积物中微塑料的个数计算。府河沉积物中微塑料的平均丰度值用(平均值±标准偏差)表示。
2. 结果与讨论
2.1 府河沉积物中微塑料的丰度
经过对沉积物样品的检测分析发现，在所有采样点的沉积物样品中均发现微塑料。15个采样点的微塑料平均丰度为(558.4±233.3)个·kg−1，各采样点的丰度见图2。墨水河沉积物中微塑料的丰度范围为0~170 个·kg−1[13]；葡萄牙安图河沉积物样品中微塑料的丰度范围为100~629 个·kg−1[14]；安大略湖沉积物中微塑料的丰度范围为20~27 830 个·kg−1，平均丰度为760 个·kg−1[15]；乐安河沉积物中微塑料的平均丰度为1 366 个·kg−1[16]。与这些文献中报道河流中微塑料污染状况相比，府河入淀口沉积物中微塑料污染处于中等水平。
图 2 各采样点微塑料的丰度Figure 2. Microplastic abundance in sediments of different sampling sites位点F7处微塑料的丰度最大，为1 049 个·kg−1。这是由于采样点位于南际头和北际头2个村庄附近，人口较其他采样点更多，有2 694人，而且离河道比较近，因此，河岸周围的生活垃圾与废水也较多，使得这个区域沉积物中微塑料累积量更大。位点F2和F3处的沉积物样品中微塑料丰度也很高，分别为642 和769 个·kg−1。这可能是由于F2和F3附近餐饮店较多，人类活动比较密集，容易造成一次性塑料垃圾的堆积，如矿泉水瓶、一次性包装袋等。除此之外，在F2和F3附近还有2座桥，桥墩会拦截河中的塑料垃圾，导致沉积物中微塑料积聚。F15处沉积物中微塑料的丰度最小，丰度值为212 个·kg−1，其次是F11(241 个·kg−1)和F10(270 个·kg−1)。F15周围少村庄、多农田，F10和F11附近的白庄村人口为824人，而且这3个采样点周围的村庄离河道远，附近人类活动少。
以上结果表明，河道沉积物中微塑料的丰度与周围人口密度和人类活动有关。在人口众多、工业发达的浙江温州温瑞塘河沉积物中，发现微塑料丰度高达(32 947±15 342)个·kg−1，而在人口稀少的西藏地区拉萨河流沉积物中，微塑料丰度仅为(180±42)个·kg−1[7-8]。一般来说，人口密度越大，人类活动越密集的地区，微塑料的丰度越大[5, 17-18]，与本研究观察的结果一致。
2.2 府河沉积物中微塑料的形状
府河沉积物中微塑料的形状主要为碎片、纤维、薄膜和球状4类，典型图像如图3所示。其中，碎片状微塑料占比最大，约为66.1%；其次为纤维状微塑料，占比为26.4%；薄膜状和球状2种微塑料占比最小，分别为5.5%和2.0%(图4)。球状微塑料仅在3个采样点的沉积物样品中出现，且数量最少。这与文献报道的其他区域微塑料状态不同：如鄱阳湖南矶山支入湖段沉积物中微塑料以发泡类为主，发泡类微塑料多为白色，密度小，组成成分为聚苯乙烯，主要来源于渔民用的发泡浮子、泡沫包装箱和一次性泡沫餐具[1]；墨河沉积物中微塑料以纤维状为主，主要来自周围纺织工业园和生活废水中的衣物纤维[13]；三峡水库沉积物中微塑料以纤维状为主，主要来自附近渔民使用的捕捞工具以及生活污水中的衣物纤维[19]；美国劳伦森大湖沉积物中微塑料以球状为主，主要来自清洁用品(如洗面奶)中的颗粒添加物[20]。这些都表明微塑料形状与研究区域周围环境及微塑料的来源有很大关系。府河周围多为居民村庄与农田，故府河沉积物中的微塑料污染主要来源于生活垃圾、生活污水和农田废物。
图 4 各采样点不同形状微塑料的丰度Figure 4. Abundance of microplastic with different shapes in sediments of different sampling sites府河入淀口段碎片状的微塑料多为硬质塑料碎片和块/条状的塑料编织袋碎片。这些碎片状塑料大多数为塑料制品在自然条件下裂解成的小碎片，故碎片状微塑料以次生微塑料为主[21]。纤维状微塑料主要呈细线型，府河沉积物中纤维状微塑料主要来源于生活污水中的衣物纤维。除此之外，在农业生产中使用的化肥编织袋容易老化，也可能会断裂形成纤维状微塑料；薄膜状微塑料多为无规则的片状，质地轻，府河入淀口沉积物样品中薄膜多来源于废弃塑料包装袋以及农用地膜。球状微塑料多为个人日常护理产品和某些类型清洁剂中的添加物[22]，在府河沉积物样品中的整体含量很少。大部分沉积物样品中碎片状微塑料占比最大，而在F7和F9处的沉积物中，纤维状微塑料的占比最大，其次是碎片状微塑料。这可能因为这2个采样点附近的村庄离河道比较近，生活污水大部分直接排入河中，造成衣物纤维的积累。
2.3 府河沉积物中微塑料的粒径分布
府河沉积物中微塑料粒径分布如图5所示。粒径为0.1~0.5 mm的微塑料占比最大，为44.7%；其次是0.5~1 mm 和1~5 mm的微塑料，占比分别为30.0%和18.5%；粒径小于0.1 mm的微塑料占比最小，为6.8%。府河沉积物中微塑料的粒径范围以0.1~1 mm为主，与大多数研究结果类似[23-26]，如湘江、太湖、长江口、黄海和渤海沉积物中，粒径小于1 mm的微塑料占大多数。亓会英等[13]认为，粒径较小的微塑料颗粒容易在水力作用下随水流迁移，而粒径较大的微塑料更容易下沉，并积聚在沉积物中。除此之外，显微镜下目测挑选微塑料的方法尚存在局限性，不易检测出粒径较小的微塑料，故测得丰度值可能比实际丰度较低。研究表明，水生生物的摄食与微塑料的粒径有关，粒径小于1 mm的微塑料可能更易被吞食，通过食物链积累在其他生物体内，造成更大的威胁，这部分微塑料或许将成为未来的研究重点[1]。
图 5 各采样点不同粒径微塑料的丰度Figure 5. Abundance of microplastic with different sizes in sediments of different sampling sites进一步分析发现，府河沉积物中纤维状和薄膜状微塑料的粒径比其他2种形状的微塑料大，一般大于1 mm；球状微塑料的粒径较小，一般小于0.1 mm。这可能与塑料的原始状态有关，纤维状和薄膜状微塑料一般由较大的塑料裂解而成，而球状微塑料一般是清洁剂和化妆品的微小添加剂，故纤维状和薄膜状的微塑料粒径大于球状微塑料。
2.4 府河沉积物中微塑料的类型
检测的50个颗粒中有43个是微塑料，并发现5种不同的类型。图6为5种微塑料的红外光谱特征图。占比最大的2种微塑料是聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)，分别为44.2%和32.6%，其次是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰胺(PA)和聚苯乙烯(PS)(图7)。PE和PP因价格低廉、化学性能稳定等优点，在日常生活中被大量使用，所以许多研究中微塑料类型都以PE和PP为主[18, 27-29]。虽然PP和PE的密度低于河水密度，但微塑料表面可能由于生物污染附着和积累有机物、杂质，使其密度增大，进而积聚到沉积物中[8]。推测府河入淀口段沉积物中PE主要来自塑料包装盒和一次性产品；PP主要来自塑料编织袋和塑料袋；PET主要来自矿泉水瓶的分解，除此之外还可能来自一些衣服纤维；PA主要来自洗衣废水中的衣物纤维；PS主要来自废弃的泡沫塑料制品和清洁用品。沉积物中微塑料的类型与其来源密切相关，除PE和PP等一些常见的微塑料类型外，RODRIGUES等[14]在葡萄牙安图河沉积物样品中检测到聚乙酸乙烯酯(PVA)，这类聚合物常用于水性涂料和胶粘剂中；罗雅丹等[30]在青岛海水浴场检测到丁二烯共聚物(SB)，这可能来源于钓鱼时使用的泡沫浮子。
3. 结论
1)府河入淀口段沉积物样品中微塑料的丰度最大为1 049 个·kg−1，平均丰度为(558.4±233.3) 个·kg−1，与其他河流沉积物中微塑料的丰度值相比，府河入淀口段的微塑料污染处于中等水平。
2)府河入淀口段沉积物中微塑料主要有4种形状，分别为碎片状、纤维状、薄膜状和球状。其中碎片状微塑料占比最高，约占总数的66.1%。微塑料的粒径以0.1~1 mm为主，占总数的74.7%。微塑料的类型主要是聚乙烯和聚丙烯2种。
3)微塑料的污染情况与人类活动密切相关，府河入淀口段沉积物中微塑料主要来源于生活污水中的衣物纤维、日常塑料用品以及废弃化肥袋和农用地膜的分解。因此，建议加强对府河周围，甚至整个白洋淀地区生活垃圾的治理，从源头上减少微塑料的产生。
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图 2 不同初始含水率对人粪污好氧堆肥过程温度变化的影响
Figure 2. Changes of temperature during human excrement composting with different initial moisture content
图 3 不同初始含水率对人粪污好氧堆肥过程含水率变化的影响
Figure 3. Changes of moisture during human excrement composting with different initial moisture content
图 4 不同初始含水率对人粪污好氧堆肥过程pH变化的影响
Figure 4. Changes of pH during human excrement composting with different initial moisture content
图 5 不同初始含水率对人粪污好氧堆肥过程EC变化的影响
Figure 5. Changes of EC during human excrement composting with different initial moisture content
图 6 不同初始含水率对人粪污好氧堆肥过程TP、TK变化的影响
Figure 6. Changes of TP and TK during human excrement composting with different initial moisture content
图 7 不同初始含水率对人粪污好氧堆肥过程TC、TN变化的影响
Figure 7. Changes of TC and TN during human excrement composting with different initial moisture content
图 8 不同初始含水率对人粪污好氧堆肥过程GI变化的影响
Figure 8. Changes of GI during human excrement composting with different initial moisture content
图 9 不同初始含水率对人粪污好氧堆肥过程粪大肠菌群数变化的影响
Figure 9. Changes of the number of fecal coliform during human excrement composting with different initial moisture content
图 10 不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程不同阶段稀释性曲线
Figure 10. Rarefaction curve at the different phases of composting process with different initial moisture content
图 11 不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程不同阶段细菌和真菌门、属水平相对丰度
Figure 11. Relative abundances of phylum and genus of bacteria and fungi at different phases of human excrement composting with different initial moisture content
图 12 不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程不同阶段细菌和真菌主坐标分析PCoA
Figure 12. Principal coordinate analysis (PCoA) of bacteria and fungi at different phases of human excrement composting with different initial moisture content
图 13 环境因子与细菌、真菌间的冗余分析 (RDA)
Figure 13. Redundancy Analysis (RDA) between Environmental Factors and Bacteria and Fungi
表 1 原料性质
Table 1. Characteristics of raw materials
原料 含水率/% pH TC/% TN/% C/N 沙门氏菌 蛔虫卵死亡率/% 人粪污 89.69 7.39 43.69 3.48 12.55 未检出 100 玉米秸秆 5.47 7.1 45.02 1.53 29.42 - - 注：“-”代表未检测。 
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表 2 不同处理组实验设计方案
Table 2. Experimental design schemes for different treatments
编号 人粪污/kg 玉米秸秆/kg MC/% MC55 14 10 55 MC60 14 7.5 60 MC65 14 5.8 65
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表 3 不同初始含水率人粪污好氧堆肥过程不同阶段细菌和真菌Chao1和Shannon指数
Table 3. Bacteria and fungi Chao1 and Shannonindex at different phases of human excrement composting with different initial moisture content
样品编号 细菌 真菌 Chao1 Shannon Chao1 Shannon MC55-0 676.51 6.71 698.1 4.78 MC55-2 399.49 3.39 566.77 2.67 MC55-30 264.36 3.39 513.8 1.06 MC60-0 637.00 3.51 382.69 3.89 MC60-2 450.14 3.02 371.06 4.26 MC60-30 621.63 5.88 274.28 4.04 MC65-0 769.51 6.16 453.28 6.08 MC65-2 508.12 4.36 365.94 2.99 MC65-30 602.15 6.13 272.94 2.78
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