随着城镇污水厂氮、磷排放标准日趋严格，对于低碳氮比的城镇污水，脱氮工艺中碳源不足^[1]成为其深度脱氮的瓶颈，而通过厌氧氨氧化自养脱氮则无需碳源^[2]。单级自养脱氮工艺(single-stage nitrogen removal using anammox and partial nitritation, SNAP)集短程硝化与厌氧氨氧化过程于一体，工艺流程短、占地面积小、投资成本低，应用前景良好。目前，SNAP工艺主要用于处理污泥消化液和老龄化垃圾渗滤液^[3]等低碳氮比的高氨氮废水^[4]，而对于如城镇污水(${\rm{NH}}_4^{+}$-N 30~60 mg·L⁻¹ )等低氨氮废水，SNAP系统的构建及其稳定运行成为难点^[5]。

低氨氮废水SNAP系统的构建，通常通过接种厌氧氨氧化特种污泥来实现^[6-7]。HENDRICKX等^[8]通过在UASB反应器中接种厌氧氨氧化颗粒污泥，在进水${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度为69 mg·L⁻¹时，运行50 d后成功构建了SNAP系统；WANG等^[9]在加载蜂窝状填料的固定床反应器中，通过接种厌氧氨氧化和短程硝化污泥，亦成功构建了SNAP系统，在进水NH₄-N质量浓度为50 mg·L⁻¹时，${\rm{NH}}_4^{+}$-N、TN去除率分别为96.35%和 88.39%；顾书军等^[10]在膨胀颗粒污泥床反应器中接种了单级自养脱氮生物膜污泥，运行83 d后成功构建了低氨氮(60～100 mg·L⁻¹)废水SNAP系统，${\rm{NH}}_4^{+}$-N、TN去除率分别为99.4%和80.7%。在上述研究中，SNAP系统的构建均以厌氧氨氧化污泥或短程硝化污泥为种源，故其工程应用时通常面临接种污泥获取困难、成本高的问题^[11]。因此，研发简易、低成本的低氨氮废水SNAP系统的构建方法，十分迫切。

一方面，进水中有机碳源对厌氧氨氧菌有抑制作用；另一方面，由于SNAP工艺TN去除率存在上限(硝氮残留11%)^[12]，故在进水中适当引入碳源，对副产物硝氮进行反硝化脱氮或短程反硝化^[13]，可提高系统的脱氮效能。WANG等^[14]采用SNAP系统处理垃圾渗滤液(${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度为(2 004 ± 14.7) mg·L⁻¹)，当COD/TN比为0.42~0.55时，TN和COD去除率分别为94.9%和67.7%；JENNI等^[15]采用SNAP系统处理污泥消化液(${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度为740 mg·L⁻¹)，随着进水COD/TN逐级升高(0.27~1.4)，厌氧氨氧化菌活性降低，而反硝化菌活性增强；GÜVEN等^[16]认为，当COD/TN大于1时，厌氧氨氧化菌会失去与异养反硝化菌竞争的优势。目前，有关COD/TN对SNAP系统的影响的研究，主要针对高氨氮废水，而有关C/N对低氨氮废水(50 mg·L⁻¹)SNAP系统脱氮效能及脱氮路径的影响研究鲜有报道。

本研究针对低氨氮废水(模拟城镇污水)SNAP系统构建难度大、接种厌氧氨氧化污泥成本高、工程应用复杂以及进水中有机碳源对系统脱氮效能有影响等问题，利用天然椰丝纤维比表面积大、多孔、容积密度小、能为微生物提供更多的附着繁殖空间^[17]、生物相容性好、对底物传质性能及耐久性能良好等优点，将天然椰丝纤维作为SNAP系统的填料，开展低氨氮废水SNAP系统自然挂膜构建研究。在进水氨氮质量浓度递减(由(100±3) mg·L⁻¹降至(50±2) mg·L⁻¹)的条件下，重点探究了采用自然挂膜构建SNAP系统的方法；在成功构建SNAP系统的基础上，考察了进水COD/TN对低氨氮废水SNAP系统脱氮效能及脱氮路径的影响。此外，利用16SrRNA高通量测序技术，探究了各系统中的功能菌属及微生物作用机制，以期为低氨氮废水单级自养脱氮的工程应用提供参考。

1.   实验材料与方法

1.1   实验装置

如图1所示，实验装置采用好氧序批式生物膜反应器，反应器高40 cm，内径20 cm，有效容积为10 L，内设天然椰丝纤维作为填料，体积填充率为50%。采用曝气机通过砂头充氧，供气量由气体流量计计量；采用恒温箱控制反应器温度。

图 1  实验装置

Figure 1.  Schematic diagram

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1.2   实验水质

用于实验的模拟废水采用NH₄HCO₃、KH₂PO₄、CaCl₂、Fe₂(SO₄)₃、MgSO₄配制而成。模拟废水水质如下：实验阶段Ⅰ不加碳源，${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度为(100±3) mg·L⁻¹；实验阶段Ⅱ不加碳源，${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度为(50±2) mg·L⁻¹；实验阶段Ⅲ的${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度为(50±2) mg·L⁻¹，当COD/TN为0.2、0.5、1、2时，对应的COD值分别为(10±1)、(25±1)、(50±2)、(100±2) mg·L⁻¹。考虑到微生物生长代谢需要，向配水中加入了适量的微量元素。

1.3   实验方法

1)基于自然挂膜的低氨氮废水SNAP系统构建。在水温为(30±1) ℃的条件下，进水NH₄-N质量浓度采用由高至低的方式运行。实验第Ⅰ阶段：氮负荷为0.1 kg·(m³·d)⁻¹，进水${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度为(100±3) mg·L⁻¹，排水比为50%，反应器运行周期为12 h，运行工况为：进水10 min→曝气反应11.75 h→出水5 min。当TN去除率稳定在70%以上时，实验进入第Ⅱ阶段，此时，进水${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度降至(50±2) mg·L⁻¹，排水比为100%，氮负荷和运行周期不变。

2) COD/TN对系统脱氮效能的影响。第Ⅲ阶段，采用平行实验，考察COD/TN对低氨氮废水SNAP系统效能及微生物种群的影响。在水温为(30±1) ℃、氮负荷为0.1 kg·(m³·d)⁻¹、DO质量浓度为0.5~2.3 mg·L⁻¹的条件下，控制进水COD/TN分别为0、0.2、0.5、1、2。

实验期间在各反应器周期运行结束时采集水样，测试${\rm{NH}}_4^{+}$-N、${\rm{NO}}_2^{-}$-N、${\rm{NO}}_3^{-}$-N、COD等水质指标，并采集系统构建成功后以及不同C/N下的生物样品进行16SrRNA高通量测序。参照SOBOTKA等^[18]报道的方法，定性分析厌氧氨氧化活性(以${\rm{NH}}_4^{+}$-N计)。

2.   结果与讨论

2.1   系统构建及微生物种群

1)系统构建。基于自然挂膜的低氨氮废水SNAP系统构建过程中氮质量浓度逐日变化曲线如图2所示。在实验第Ⅰ阶段，在进水NH₄-N质量浓度为100 mg·L⁻¹时，反应器运行了80 d。反应器运行第1～7天，为了富集微生物，DO控制在3.51~5.17 mg·L⁻¹，系统出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度由94.47 mg·L⁻¹逐渐下降至75.67 mg·L⁻¹，该时段反应器在DO充足的条件下运行，天然椰丝纤维上自然依附的微生物菌群中的硝化菌逐渐表现出代谢活性。

图 2  系统构建过程中氮质量浓度逐日变化曲线

Figure 2.  Daily variation curve of nitrogen in the construction process of the system

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反应器运行至第8～13天时，为了抑制硝化菌，强化亚硝化菌富集，DO控制在0.75~1.20 mg·L⁻¹。系统硝化作用减弱，出水${\rm{NO}}_3^{-}$-N质量浓度逐渐降低，${\rm{NO}}_2^{-}$逐渐积累，亚硝化菌得到富集。在运行至第8天时，系统出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N和${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度分别为70.42 mg·L⁻¹和4.69 mg·L⁻¹；而运行至第13天时，系统出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度降至53.37 mg·L⁻¹，${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度升高至27.20 mg·L⁻¹，系统亚硝化稳定。

反应器运行至第14~36天时，系统DO控制为1.38~1.62 mg·L⁻¹，使得系统出水亚氮/氨氮值在1.3左右，为厌氧氨氧化菌的富集提供有利条件；运行至第36天时，出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N和${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度分别降低至45.15 mg·L⁻¹和1.85 mg·L⁻¹。系统TN去除率由8.57%逐渐提升至34.15%。可以认为，随着反应器中微生物的增殖，生物膜逐渐变厚，膜内部形成厌氧微环境，适宜于厌氧氨氧化菌生长；同时，由于前一阶段系统已实现稳定的亚硝化，可为厌氧氨氧化菌提供适宜的生长基质，厌氧氨氧化菌AnAOB逐渐增殖富集。

反应器运行至第37~70天时，该阶段反应器DO控制在1.03～1.32 mg·L⁻¹，期间出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度进一步下降，开始出现明显的TN去除现象。在该阶段开始和结束时，系统出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N、${\rm{NO}}_2^{-}$-N、${\rm{NO}}_3^{-}$-N、TN质量浓度分别由40.89、1.47、12.64、55.00 mg·L⁻¹降低至3.78、0.08、21.16、25.02 mg·L⁻¹，系统TN去除率由41.20%逐渐提升至73.18%。以上结果表明厌氧氨氧化菌得到进一步优势富集。

反应器运行至第71～80天时，该阶段系统DO控制为1.23～1.46 mg·L⁻¹，系统出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N和TN平均质量浓度分别为3.86 mg·L⁻¹和23.26 mg·L⁻¹，平均去除率分别为95.94%和75.74%。上述结果表明，反应器经过80 d的运行，亚硝化菌和厌氧氨氧化菌已成为优势菌属。第80天时系统厌氧氨氧化活性为(9.8±0.2) mg·(L·h)⁻¹，构建的SNAP系统脱氮效能有所提高。在较高氨氮质量浓度条件下完成单级自养脱氮功能菌优势富集后，实验进入第Ⅱ阶段，降低进水${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度至50 mg·L⁻¹，且氮负荷保持0.1 kg·(m³·d)⁻¹不变。

反应器运行至第81～84天时，系统DO控制为1.42～1.57 mg·L⁻¹，由于实验时DO偏高导致系统出现${\rm{NO}}_3^{-}$-N累积，且系统微生物未适应低质量浓度进水，故平均${\rm{NH}}_4^{+}$-N、TN去除率分别为80.46%、61.09%。反应器运行第85~140天时，降低系统DO为0.90～1.25 mg·L⁻¹，系统出水水质逐步稳定，出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N和TN平均质量浓度分别为2.69 mg·L⁻¹和14.84 mg·L⁻¹，去除率分别为94.58%、70.07%。反应器运行至第100和140天时，系统厌氧氨氧化活性分别为(10.3±0.3) mg·(L·h)⁻¹和(11.1±0.2) mg·(L·h)⁻¹。反应器运行至第85天时，系统已初步构建，并稳定运行至第140天。

采用自然挂膜成功构建低氨氮废水SNAP系统，采用天然椰丝纤维作为填料是重要原因。经BET测试，该填料孔隙率为6.007%，孔隙面积为514.5 m²·g⁻¹，中孔直径为54.212 9 nm，堆积密度为0.802 9 g⁻¹，较人工组合填料生物亲和性好(本研究同时还设置了一组以组合填料为对照组进行比对)。如表1所示：一方面，天然椰丝纤维自然富集了更多的微生物菌群，有利于微生物增殖，且天然椰丝纤维较组合填料对功能菌群富集能力更强；另一方面，进水氨氮质量浓度采用由高至低的梯度运行方式，在较高氨氮质量浓度条件下，强化了SNAP系统中功能菌群的优势富集。在本研究中，同时设置了进水${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度为50 mg·L⁻¹的对照组进行了平行实验，在该系统在运行第90~120天时，出水${\rm{NH}}_4^{+}$-N和TN平均质量浓度分别为3.45 mg·L⁻¹和23.30 mg·L⁻¹，去除率分别为93.47%和55.97 %，系统出现${\rm{NO}}_3^{-}$-N累积，导致构建的SNAP系统脱氮效能较低。

表 1  填料微生物多样性对比

Table 1.  Comparison microbial diversity in filler

填料种类	多样性指数	均匀度指数	丰富度指数
组合填料	2.972	0.948	23
天然椰丝纤维填料	3.048	0.947	25

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在低氨氮废水SNAP系统稳定运行后，监测了系统运行第110个周期内氮素、DO、pH的变化规律，结果如图3所示。系统周期运行过程中，${\rm{NH}}_4^{+}$-N和TN平均降解速率分别为3.75 mg·(L·h)⁻¹和2.92 mg·(L·h)⁻¹，${\rm{NO}}_2^{-}$-N和${\rm{NO}}_3^{-}$-N平均增长速率分别为0.08 mg·(L·h)⁻¹和0.75 mg·(L·h)⁻¹。周期运行第0~10 h为系统生物脱氮反应期，系统DO为1.26～0.89 mg·L⁻¹；第10～12 h，耗氧基质${\rm{NH}}_4^{+}$-N已降解完，系统DO逐渐升高至1.32 mg·L⁻¹。

图 3  系统运行第110个周期内氮素、DO、pH变化曲线

Figure 3.  Variation curve of nitrogen, DO and pH in the 110th cycle of the system

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2)构建系统的微生物种群。为探究构建过程系统生物种群的演替规律，分别取反应器构建过程中第30天(S1)和第140天(S2)的生物膜样品，进行了微生物种群结构分析。S1、S2样品测序覆盖率、OUT、多样性指数等结果见表2和图4。如表2所示，S1和S2的测试覆盖率分别为0.998 493、0.997 345。这说明测序结果能反映样本的真实情况。S1和S2的OTU值分别为425和428，数目差异很小，表明微生物菌群结构无明显变化。SI和S2的Ace指数、Chao指数逐渐增大，说明系统在第30~140天物种丰富度增加。Shannon和Simpson 指数降低，表明系统在第30~140天样本的生物多样性有所增加。

表 2  样品多样性指数

Table 2.  Alpha-diversity of the sample

样品	OTU	Ace	Chao	Shannon	Simpson
S1	425	449	449	4.72	0.018 6
S2	428	497	507	3.61	0.106 6

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图 4  S1、S2门水平下微生物群落组成

Figure 4.  Taxonomic composition of microbes at phylum level of S1 and S2

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S1、S2在门、属水平上微生物种群结构及相对丰度如图4和图5所示。系统构建过程中S1、S2系统中优势菌门类主要有Proteobacteria (47.8%、24.3%)、Planctomycetes (5.7%、36.5%)、Chlorobi (7.0%、8.7%)、Chloroflexi (1.9%、12.4%)、Nitrospirae (1.9%、3.8%)。有研究表明：系统脱氮功能菌亚硝化菌属于Proteobacteria门；厌氧氨氧化菌属于Planctomycetes门，随着运行时间的增加成为优势菌门；亚硝酸盐氧化菌属于Nitrospirae门。在本研究中，同时还设置了一组以组合填料为对照组的SNAP系统构建的平行实验，与天然椰丝纤维填料构建的生物系统进行对比。结果表明：组合填料中优势菌门类主要有Proteobacteria (34.9%)、Planctomycetes (23.7%)、Chlorobi (16%)、Chloroflexi (7.1%)、Nitrospirae (4.3%)；Proteobacteria、Planctomycetes菌门丰度低于椰丝纤维填料系统中的相对丰度较高，表明天然椰丝纤维填料富集功能菌能力更强。

图 5  S1、S2属水平下微生物群落组成

Figure 5.  Taxonomic composition of microbes at genus level of S1 and S2

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由图5可知，在属水平上，S1、S2系统中脱氮优势功能菌属主要有Candidatu sBrocadia (2.1%、32.4%)、Nitrosomonas (8.8%、5.1%)、Nitrospira (5.6%、3.8%)。其中，Candidatus Brocadia为厌氧氨氧化菌^[19]，反应器运行至第30天时出现厌氧氨氧化菌，运行至第140天时相对丰度显著增加，成为优势菌属；Nitrosomonas为亚硝化单胞菌属^[20]，相对丰度由第30天的降为第140天时的5.1%；Nitrospira为硝化菌属，第140天时相对丰度降至3.8%，表明系统中硝化菌被抑制。此外，采用组合填料的对照组中，优势功能菌属主要有Candidatus Brocadia (18.2%)、Nitrosomonas (3.3%)、Nitrospira (2.9%)，其相对丰度均低于椰丝纤维填料系统。上述实验结果表明，低氨氮废水SNAP系统构建过程中，系统的主要脱氮功能菌为亚硝化菌Nitrosomonas和厌氧氨氧化菌Candidatus Brocadia，通过天然椰丝纤维填料自然挂膜可以强化功能菌群的富集，构建出SNAP系统。

2.2   COD/TN对系统脱氮效能及微生物种群的影响

1)COD/TN对系统脱氮效能的影响。由图6可看出，随着进水C/N增加，系统中厌氧氨氧化菌活性逐渐下降，TN去除率先增加后降低。当COD/TN为0、0.2、0.5、1、2时，系统${\rm{NH}}_4^{+}$-N平均去除率分别为94.58%、96.18%、96.33%、98.62%、70.37%，TN平均去除率分别为70.07%、72.09%、75.18%、82.19%、62.19%；当COD/TN为1时，系统${\rm{NH}}_4^{+}$-N、TN去除率最高。在反应器稳定运行第50天时，COD/TN为0、0.2、0.5、1、2系统的厌氧氨氧化活性分别为(11.1±0.2)、(8.3±0.1)、(5.3±0.3)、(4.1±0.2)、(4.0±0.2) mg·(L·h)⁻¹。

图 6  COD/TN对系统NH₄⁺-N、TN、COD去除和厌氧氨氧化活性的影响

Figure 6.  Effects of COD/TN on nitrogen, COD removal and anammox activity

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当COD/TN≤0.2时，系统以厌氧氨氧化自养脱氮路径为主，异养反硝化菌脱氮为辅；当COD/TN为0.5~1.5时，厌氧氨氧化菌属丰度和活性逐渐下降，反硝化菌属相对丰度增加，此时，系统脱氮路径以短程硝化反硝化为主，以厌氧氨氧化自养脱氮为辅。当COD/TN>2 时，系统中亚硝化菌、厌氧氨氧化功能菌群丰度进一步降低，系统通过短程硝化反硝化、厌氧氨氧化路径的脱氮能力进一步降低。上述结果表明，为了保证低质量浓度氨氮废水SNAP系统稳定高效运行，需要在SNAP系统前需要设置废水有机物去除工艺单元。

2) COD/TN对系统微生物种群的影响。分别取COD/TN为0、0.2、0.5、1、2时反应器运行稳定后的生物膜样品，进行16S rRNA高通量测序，门、属水平上微生物种群结构及相对丰度如图7和图8所示。当COD/TN为0、0.2、0.5、1、2时，系统优势功能菌门类主要有Proteobacteria (27.3%、40.3%、39.2%、42.7%、61.5%)、Planctomycetes (38.6%、35.6%、15.7%、8.7%、6.3%)、Nitrospirae (1.3%、0.5%、1.8%、6.7%、1.8%)。其中，厌氧氨氧化菌属于Planctomycetes门，随着COD/TN增加，该菌门丰度显著降低；大部分异养反硝化菌属于Proteobacteria菌门，随着COD/TN增加，Proteobacteria门相对丰度增加。

图 7  不同COD/TN系统门水平下微生物群落组成

Figure 7.  Taxonomic composition of microbes in different COD/TN system at phylum level

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在COD/TN为0、0.2、0.5、1、2的系统中，优势脱氮功能菌属主要有亚硝化菌Nitrosomonas (3.4%、3.7%、5.3%、8.7%、1.3%)； 厌氧氨氧化菌Candidatus Brocadia (37.6%、32.2%、8.4%、3.7%、1.0%)；在COD/TN为0.2、0.5、1、2的系统中，异养反硝化菌属主要有Thauera (1.8%、3.0%、9.8%、3.4%)、Denitratisoma (0.5%、1.0%、2.2%、9.4%)、Pseudomonas (0.4%、0.8%、2.5%、9.0%)，Bdellovibrio (0.2%、0.5%、0.5%、1.1%)，反硝化菌属总丰度分别为2.9%、5.3%、15.0%、22.9%。当COD/TN为0.2、0.5、1时，系统内亚硝化菌属相对丰度增加，进水中COD消耗部分溶解氧，使反应器中DO维持在较低水平，因而有利于亚硝化菌富集；但当COD/TN为2时，由于有机物质量浓度增加导致溶解氧质量浓度降低，对亚硝化菌属形成抑制，系统脱氮效能显著降低；随着COD/TN增加，厌氧氨氧化菌属的相对丰度显著下降。上述结果表明：对于低氨氮废水，当COD/TN≤0.2时，系统主要脱氮路径为厌氧氨氧化；当COD/TN为0.5~1.5时，系统脱氮路径以短程硝化反硝化为主，厌氧氨氧化为辅；当COD/TN≥2 时，系统中亚硝化菌、厌氧氨氧化功能菌群丰度进一步降低，系统通过短程硝化反硝化、厌氧氨氧化路径脱氮能力进一步降低。

图 8  不同COD/TN系统属水平下微生物群落组成

Figure 8.  Taxonomic composition of microbes in different COD/TN system at genus level

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3.   结论

1)在温度为(30±1) ℃、氮负荷为0.1 kg·(m³·d)⁻¹、进水NH₄⁺-N质量浓度梯度降低的条件下，以天然椰丝纤维为填料的低氨氮废水SNAP系统采用自然挂膜方式，反应器运行85 d时系统初步构建成功，并稳定运行至第140天，NH₄⁺-N、TN去除率分别为94.58%、70.07%；所构建的SNAP系统中，脱氮功能菌属主要有Nitrosomonas(5.1%)、Candidatus Brocadia(32.4%)。

2)进水COD/TN对低氨氮废水SNAP系统的脱氮效能影响显著。当COD/TN为0、0.2、0.5、1、2时，TN平均去除率分别为70.07%、72.09%、75.18%、82.19%、62.19%。随着进水COD/TN增加，厌氧氨氧化活性逐渐下降。

3)进水COD/TN对低氨氮废水SNAP系统脱氮路径影响显著。当COD/TN≤0.2时，系统以厌氧氨氧化自养脱氮路径为主；当COD/TN为0.5~1.5时，系统脱氮路径以短程硝化反硝化为主，厌氧氨氧化自养脱氮为辅；当COD/TN≥2 时，系统通过短程硝化反硝化、厌氧氨氧化路径脱氮能力进一步降低。系统中优势脱氮功能菌属主要有Nitrosomonas、Candidatus Brocadia、Thauera、Denitratisoma 、Pseudomonas、Bdellovibrio。