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厌氧氨氧化作为新型脱氮工艺，因其具有污泥产量少[1]、能耗低[2]以及不需要额外投加碳源[3]等优点，受到广泛关注。但厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidation bacteria，AnAOB)生长缓慢，对环境因素的变化异常敏感[4]。温度下降(≤15 ℃)[5]、pH的变化[6]、COD值均会对其产生不利影响[7]。这些因素导致厌氧氨氧化污泥难以富集培养，限制了该技术的大规模应用[8]。如何快速有效地富集AnAOB是推动该工艺大规模应用的关键，而接种污泥的选择被认为是影响Anammox反应器启动的重要因素之一[9]。
目前Anammox反应器的启动多采用厌氧颗粒污泥[10]、厌氧消化污泥[11]以及反硝化污泥[12]作为接种污泥。有大量研究表明，AnAOB广泛存在于江河湖海的底泥中[13-15]。赵折红等[16]在三峡库区香溪河不同季节的沉积物中均发现了AnAOB的存在，且在0~10 cm内AnAOB丰度随着沉积物深度的增长呈现先增加后减少的趋势。秦红益[17]在富营养湖泊太湖的不同断面的沉积物中也都发现了AnAOB的存在，并发现0~5 cm处的沉积物是AnAOB集中分布的区域，且氮素水平会强烈影响沉积物中AnAOB的丰度和垂直分布。沈李东[18]在各种类型的淡水湿地的表层沉积物中均监测到AnAOB的存在，并说明Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia属是淡水湿地系统中的优势AnAOB。虽然湿地系统广泛存在AnAOB，但截至目前，采用湿地底泥作为接种污泥启动Anammox工艺的研究鲜有报道。
基于上述研究结果，本研究采用UASB反应器，通过接种厌氧颗粒污泥、湿地底泥以及二者的混合物启动Anammox工艺，对各反应器在启动过程中的脱氮性能进行了监控，并利用高通量测序对污泥的微生物群落结构进行了分析，探讨了以湿地底泥为接种物启动Anammox反应器的可行性，以期为Anammox工艺的应用提供参考。
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实验设备为有机玻璃制成的UASB反应器(共3台)，反应器内径5 cm，高100 cm，有效容积约2 L，流量为0.083 L·h−1，装置外部包裹锡纸以避光，控制运行温度为32~35 ℃，实验装置如图1所示。由于仅靠低溶解氧难以抑制硝化菌的生长[19-20]，故运行72 d后提高进水基质浓度；为改善水力条件，使微生物与底物充分接触[21-22]，运行112 d后设置回流系统，具体运行策略见表1。
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反应器进水采用人工配水，NH4Cl和NaNO2分别提供
NH+4 -N和NO−2 -N，其余成分为1 000 mg·L−1 NaHCO3、20 mg·L−1 KH2PO4、5 mg·L−1 CaCl2·2H2O、300 mg·L−1 MgSO4·7H2O、微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ各1 ml·L−1。微量元素Ⅰ组分为5 g·L−1 EDTA、5 g·L−1 FeSO4·7H2O。微量元素Ⅱ组分为15 g·L−1 EDTA、0.99 g·L−1 MnCl2·4H2O、0.25 g·L−1 CuSO4·5H2O、0.19 g·L−1 NiCl2·6H2O、0.24 g·L−1 CoCl2·6H2O、0.22 g·L−1 NaMoO4·2H2O、0.43 g·L−1 ZnSO4·7H2O、0.014 g·L−1 H3BO3、0.05 g·L−1 NaWO4·2H2O。采用氮吹，对配水进行脱氧(DO<0.1 mg·L−1)后进水。 -
接种的厌氧颗粒污泥取自处理酶制剂生产废水的厌氧反应器，MLSS为38.0 g·L−1，MLVSS为18.0 g·L−1。湿地底泥取自无锡市太湖边某湿地表层底泥，MLSS为192.6 g·L−1，MLVSS为13.8 g·L−1。R1反应器接种10 g·L−1厌氧颗粒污泥；R2反应器接种10 g·L−1 湿地底泥；R3反应器接种5 g·L−1厌氧颗粒污泥和5 g·L−1湿地底泥。
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每2 d采集各反应器出水，水样经过0.45 μm滤膜过滤后根据《水和废水监测分析方法》测定各项水质指标，其中
NH+4 -N采用纳氏试剂分光光度法，NO−2 -N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，NO−3 -N采用紫外分光光度法，TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，COD采用快速消解分光光度法，MLSS和MLVSS采用重量法，pH采用在线式pH计(ST3100，奥豪斯)，温度和DO则采用在线式溶解氧仪(WTW，Multi 3610 IDS)。总氮去除率(TRE)和总氮容积负荷(NLR)分别根据式(1)和式(2)进行计算。式中：ηTRE为总氮去除率，%；C(TN)inf为进水总氮质量浓度，mg·L−1；C(TN)eff为出水总氮质量浓度，mg·L−1；NV为总氮容积负荷，kg·(m3·d)−1；Qs为进水流量，m3·d−1；V为有效容积，m3。
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采用16S rDNA高通量测序测定接种污泥和培养后污泥的微生物群落结构。污泥提取DNA后，选取通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'GGACTACCAGGGTATCTAAT-3')对V3~V4区进行PCR扩增。扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延展45 s)，最后72 ℃延展10 min。扩增产物利用Illumina公司Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)测序数据采用FLASH和Trimmomatic软件进行优化，后采用UPARSE软件进行OTU聚类分析。
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1)接种厌氧颗粒污泥的Anammox反应器启动。接种厌氧颗粒污泥的R1反应器运行期间进出水情况如图2所示。在反应器启动初期，出水氨氮及总氮质量浓度不降反升，高于进水。这是由于接种的厌氧颗粒污泥来自处理高浓度有机废水的反应器，其长期处于高COD废水环境中，存在大量异养菌，而进水中未添加有机碳源，异养菌因无法获得生长所需的足够底物而进行内源代谢，利用自身的贮藏物质，如酶等部分原生质的分解来获得营养物质，导致菌体自溶。在菌体自溶过程中，蛋白质等含氮有机物的分解导致了反应器中氨氮及总氮的升高。反应器运行至第13天，氨氮出水质量浓度开始低于进水，出水COD也由最初的425.55 mg·L−1降低至23.42 mg·L−1，标志着菌体自溶阶段结束。随着反应器继续运行，氨氮和亚硝氮去除率虽呈上升趋势，但在进水中残余溶解氧的影响下，氨氧化菌(AOB)和硝化菌(NOB)发挥了主要作用，大部分氮元素被转化为硝态氮，使出水硝态氮质量浓度不断增加。反应器中总氮去除率则呈现下降趋势，于第67天降低至6.51%。这主要是因为：随着菌体自溶现象减弱，水中COD下降，异养反硝化菌因缺少底物活性降低。
在第72天增加进水浓度后，出水硝态氮质量浓度依然上升明显，表明NOB活性抑制不明显，AnAOB在竞争过程中仍然处于劣势。在第112天增加回流后，出水氨氮质量浓度下降明显，基本保持在0.51 mg·L−1左右，出水亚硝氮质量浓度则先减后增，虽然出水硝态氮质量浓度呈现先增后减的趋势，但浓度依然较高，最高时达到131.56 mg·L−1；与此同时，总氮去除率也无明显上升，在2.20%~16.14%内波动。这些结果均表明，在R1中 AOB和NOB发挥主要作用，进水中几乎所有氮元素均在它们的共同作用下转化为硝态氮，反应器内无明显的厌氧氨氧化反应。
2)接种湿地底泥的Anammox反应器启动。接种湿地底泥的R2反应器运行期间进出水情况如图3所示。由于湿地水体中的COD和氮元素含量处于较低水平，底泥中的微生物能够较好地适应无机环境，故污泥接种进反应器后直接跳过了菌体自溶阶段而进入活性滞留阶段，总氮去除率维持在较低水平且无显著变化。在运行的前71 d，氨氮去除率逐步上升，出水亚硝氮质量浓度先减后增，出水硝态氮质量浓度持续增加，并于第63天达到最高值68.97 mg·L−1；而总氮去除率却无明显变化，一直维持在8.00%左右。可见，反应器内的氮元素大多通过AOB和NOB的作用转化为硝态氮，这与R1情况相似，
在第72天增加进水浓度后，氨氮和亚硝氮去除率均有所降低，出水硝态氮质量浓度也呈现下降趋势，AOB和NOB活性均受到了抑制。但从第95天开始，氨氮和亚硝态氮去除率升高，出水硝态氮质量浓度上升明显，而总氮去除率则无明显上升，表明AOB和NOB适应了环境的改变，受到的抑制效果减弱，AnAOB处于竞争劣势。设置回流系统后的前40 d内，出水氨氮和亚硝氮质量浓度逐渐降低，总氮去除率基本不变，在AOB和NOB的作用下出水硝态氮质量浓度增长迅速，最高时达到128.94 mg·L−1。运行至157 d开始，出水硝态氮质量浓度出现明显下降的趋势，并于第173天降低至65.48 mg·L−1，总氮去除率也迅速上升至50.19%，AnAOB开始展现活性且逐渐取代AOB和NOB成为R2内的优势菌种。由于从第167天起，出水中氨氮和亚硝态氮浓度较低，基本只含有硝态氮，故从第175天起逐步提高进水负荷。随着进水负荷的增加，氨氮和亚硝态氮去除率无明显降低，而出水硝态氮质量浓度却增长不明显，基本保持在70 mg·L−1左右。这是由于进水浓度的增加抑制了硝化菌的活性，同时刺激了AnAOB的增殖。随着负荷的提高，总氮去除率逐步上升，并于第219天开始在进水总氮质量浓度为275.55 mg·L−1，在氮负荷为0.275 kg·(m3·d)−1条件下，去除率稳定达到74.49%。
从R1和R2的启动结果来看，湿地底泥比处理高浓度有机废水的厌氧颗粒污泥更适合作为启动Anammox反应器的种泥。有研究[23]表明，长期较高负荷的有机物冲击会促进反硝化菌的生长，同时抑制AnAOB的生长。当COD>300 mg·L−1时，AnAOB将全部灭活，而酶制剂废水的COD值普遍高于300 mg·L−1，这也导致了接种的厌氧颗粒污泥中几乎不含AnAOB，从而致使反应器启动失败。而有大量研究[18,24]表明，湿地底泥中存在着AnAOB，且是湿地生态系统氮循环的重要组成部分，其产生的氮气可以占到湿地氮气产生总量的1.30%~42.70%，这也是采用湿地底泥为接种物成功启动Anammox反应器的重要原因。
3)接种混合污泥的Anammox反应器启动。接种混合污泥的R3反应器运行效果如图4所示。在反应器启动初期，由于微生物不能适应环境的改变而自溶，出水氨氮质量浓度高于进水；反应器运行至第7天时，出水氨氮质量浓度首次低于进水，出水COD由最初的307.12 mg·L−1降低至19.84 mg·L−1，表明反应器结束菌体自溶阶段。R3菌体自溶的时间要短于R1，这是因为反应器接种的是混合污泥，异养菌含量少于纯种厌氧颗粒污泥导致。与R1、R2运行初期情况相似，R3运行前71 d氨氮去除率逐步上升，出水亚硝氮质量浓度呈现先减后增的趋势，出水硝态氮质量浓度持续增加，最高时达到62.85 mg·L−1。由于反硝化菌逐渐被淘汰，总氮去除率下降明显，并于第71天下降至3.93%，这与R1的趋势相同。
在第72天增加进水浓度后，出水亚硝氮质量浓度缓慢上升，出水硝态氮质量浓度则呈现先增后减的趋势，但总氮去除率却无明显增长，最高也仅达到9.51%。这表明，虽然NOB的活性受到了一定的抑制，但AnAOB仍未展现明显活性。在第112天增加回流后，出水硝态氮质量浓度快速增加并于第129 天达到最高值后开始降低，总氮去除率则自第125天起呈现明显的上升趋势。这表明AnAOB开始展现活性，并逐渐成为优势菌种。由于从第155天开始，出水中几乎只有硝态氮，同时为了进一步提高反应器内的AnAOB丰度，自第165天起逐步提高进水负荷。提高进水负荷后，出水氨氮、亚硝态氮和硝态氮质量浓度均无明显变化，总氮去除率则上升明显，于第219天起在进水总氮质量浓度为275.55 mg·L−1，在氮负荷为0.275 kg·(m3·d)−1条件下，去除率稳定达到67.12%。
从以往学者的研究结果来看，接种混合污泥的启动时间均短于接种单一类型污泥。张泽文等[25]分别接种反硝化颗粒污泥和反硝化颗粒污泥与好氧硝化污泥的混合污泥启动Anammox反应器，结果显示，接种混合污泥的启动时间短于接种反硝化颗粒污泥。于德爽等[26]采用好氧硝化污泥和厌氧氨氧化污泥的混合物(比例2∶1)作为接种污泥，较采用好氧硝化污泥作为接种污泥的反应器的启动时间缩短约1/2。在本研究中，R3出现明显厌氧氨氧化反应特性的时间(125 d)要短于R2(155 d)，表明混合污泥相较于单一的厌氧颗粒污泥或单一的湿地底泥更适合作为启动种泥，这与之前各学者研究的结果相类似。在本研究中出现这一结果的主要原因是，混合污泥中的厌氧颗粒污泥在启动过程中可以作为AnAOB依附的天然载体，又因其良好的沉降性能，使AnAOB不易流失，从而可缩短反应器的启动时间[27]。而对于混合污泥中2种污泥的最佳比例，还有待进一步研究。
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选取接种厌氧污泥(S1)、湿地底泥(S2)、R1183 d污泥(S3)、R2183 d污泥(S4)、R3183 d(S5)污泥、R2221 d污泥(S6)以及R3221 d污泥(S7)进行16S rDNA高通量测序检测微生物群落结构变化。各时期门分类水平上的微生物组成如图5所示。结果表明，S1中微生物所属的门主要为Chloroflexi(64.71%)、Actinobateriota(6.37%)、Synergistota(8.46%)、Bacteroidota(4.49%)、Nitrospirota(4.01%)等。S2中则是由Proteobacteria(41.05%)、Bacteroidota(10.66%)、Actinobateriota(9.44%)、Desulfobacterota(9.31%)、Firmicutes(8.49%)、Chloroflexi(5.75%)等组成，而AnAOB所属的Planctomycetes占比仅为0.07%。经过183 d的培养，S3中Chloroflexi门的丰度明显下降，由64.71%降低至7.12%，而Bacteroidota门和Proteobacteria门的丰度则分别上升至26.15% 和21.50%。有研究[28]表明，Proteobacteria门几乎涵盖了所有类型的AOB。这证实了AOB为R1中的优势菌种。NOB所属的Nitrospirota门在S3中的占比较S1中下降明显，但结合R1的运行状况可知，NOB依然发挥主要作用，氮元素在其和AOB的共同作用下转化为硝态氮。而在S3中未能检测出Planctomycetes门，这也说明R1中不存在厌氧氨氧化过程。S4和S6中Chloroflexi门的丰度相较于S2增长明显， Bacteroidota门的丰度则有一定程度降低，而二者在S4和S6中的丰度则无明显差异。据文献报道，Chloroflexi门常存在于Anammox系统中，其主要作用是作为AnAOB的骨架结构参与生物膜的形成[29]，同时还能降解AnAOB死亡后残留下的有机物等物质[30]；此外，Chloroflexi门和Bacteroidota门被认为在污泥颗粒化的过程中起着重要作用[31]。S6中Proteobacteria门的丰度相较于S4降低5.75%，而Planctomycetes门的丰度则从1.14%(S4)升高至10.80%(S6)，在R3中也有相似的微生物结构变化，S7中Proteobacteria门的丰度相较于S5也下降了5.64%， Planctomycetes门的丰度则从4.99%(S5)升高至11.00%(S7)。这些数据表明，随着反应器的运行，硝化菌逐渐被淘汰，AnAOB成为R2和R3中的优势菌种。
各时期属水平上的微生物组成如图6所示。结果显示，norank_f__norank_o__SBR1031在S1中处于显著地位，其丰度达到53.30%，据报道，该菌种属于厌氧微生物具有碳水化合物发酵的能力[32]。由于湿地底泥处于自然环境中，而厌氧颗粒污泥长期处于特定人工环境中，故S2中的微生物种类明显多于S1，其优势菌种为Dechloromonas。值得指出的是，在S1和S2中都未能检测出AnAOB相关菌属，表明AnAOB在接种污泥中的含量低于万分之一，甚至可能不存在AnAOB。S3中norank_f__norank_o__SBR1031的丰度下降至0.31%，这是由于进水中不含有机物，微生物缺少底物而被淘汰。经过183 d的培养，S3中未能检测出AnAOB相关菌属，优势菌种为norank_f__Bacteroidetes_vadinHA17和Limnobacter，其丰度分别达到7.45%和6.00%。其中，前者的主要作用是参与水解酸化[33]，而后者属于厌氧菌，据报道，该菌属可与AnAOB共存，可保护AnAOB免受外界干扰[34]。在S4-S7中，也都检测出一定丰度的Limnobacter。
有研究[35]表明，Candidatus Brocadia作为AnAOB的一种菌属经常出现在Anammox反应器中。如图5所示，S4~S7样品中均检测到了Candidatus Brocadia，且其丰度随着反应器的运行时间延长而增加，在R2中S6的丰度比S4增加了9.28%，达到了9.82%；而其在R3中的丰度也由5.07%(S5)增加至10.70%(S7)。这也进一步证明了反应器内的氮元素主要通过AnAOB的作用去除。
R2和R3中的Nitrosomonas的丰度随着反应器的运行逐渐减少，其在S4中的丰度为3.97%，而在S6中丰度仅为0.64%，在S7中更是未检测出该菌属。有研究[36]表明，该菌属为AOB细菌，这说明随着反应器的运行，AOB逐渐被淘汰。反应器内还存在着具有硝化作用的Nitrospira，虽然其丰度随着反应器的运行而增加，但仍处于较低水平。在S4~S7中，Nitrospira在S7中的丰度最高，但也仅为0.77%，这也从生物学角度解释了为何R3出水的硝态氮浓度要高于R2。在R2和R3启动的不同时期均检测到了硝化细菌，这可能是由反应器进水中残留的溶解氧造成的。以往学者也均在研究中发现了这一现象。例如，王晓曈等[37]在采用上流式生物滤池启动Anammox反应器的过程中发现反应器中微生物结构分层明显，底层污泥中主要以硝化菌和异养菌为主；吴珊等[38]在Anammox反应器运行过程中也发现体系中存在硝化细菌。与此同时，S4~S7中也均检测到了具有反硝化作用的Denitratisoma[39]，且随着反应器的运行呈现出增加的趋势，其丰度在S6和S7中分别达到0.94%和3.04%。这可能是由AOB等微生物死亡后残留的有机物所导致。总的来说，随着反应器的运行，AnAOB逐渐在R2和R3中富集，而不能适应环境的菌种逐渐被淘汰。
根据不同时期的微生物群落结构并结合3台反应器的启动过程，可以看出，进水溶解氧对Anammox反应器的启动有着较大影响。由于AOB和NOB均为自养菌，且两者均能在低溶解氧条件下发挥作用[21]，这就导致即使进水中溶解氧浓度处于较低水平，氨氮和亚硝氮仍能在二者的作用下被转化为硝态氮，使得AnAOB缺少营养基质而难以生长，进而加长启动时间。对此，可通过适当提高进水基质浓度来抑制硝化菌的活性，故高基质暴露水平培养方式下更有利于AnAOB的快速富集培养[40]。而在高基质暴露水平下，AOB和NOB活性在较高的FA和低溶解氧的双重作用下受到抑制[19,41]，减少二者与AnAOB对基质的竞争，从而缩短启动时间。
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1)采用UASB反应器接种湿地底泥和混合污泥(厌氧颗粒污泥与湿地底泥的污泥浓度比值为1:1)成功启动了Anammox反应器，但采用厌氧颗粒污泥启动Anammox反应器则失败；接种混合污泥的反应器开始展现厌氧氨氧化反应特性的时间(125 d)明显短于接种湿地底泥的反应器(155 d)；反应器启动成功后逐步提高进水负荷，最终在进水NLR为0.275 kg·(m3·d)−1条件下，接种湿地底泥和混合污泥的Anammox反应器中的TN去除率分别达到74.49%和67.12%。
2)湿地底泥中的原生AnAOB含量高于处理高浓度有机废水的厌氧颗粒污泥；在接种混合污泥的反应器中，厌氧颗粒污泥可作为AnAOB的载体，又因其良好的沉降性能，故能够减少AnAOB流失，从而缩短Anammox反应器启动时间。
3)培养前后反应器内微生物群落结构发生了较大变化。接种湿地底泥和混合污泥的Anammox反应器中Planctomycetes门的丰度增长明显，Bacteroidota门的丰度则呈现下降趋势，反应器内的AnAOB为Candidatus_Brocadia，其丰度于第221天分别达到9.82%和10.70%。
接种湿地底泥的Anammox反应器启动特性
Start up characteristics of Anammox reactor inoculated with wetland sediment
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摘要: 在3台UASB反应器中分别以厌氧颗粒污泥、湿地底泥以及二者的混合物(污泥浓度比为1∶1)为接种污泥启动厌氧氨氧化(Anaerobic ammonium oxidation，Anammox)反应器，考察了以湿地底泥为接种物启动Anammox反应器的可行性。结果表明，接种厌氧颗粒污泥的反应器经过183 d启动运行，仍未出现明显厌氧氨氧化反应特性，接种混合污泥的反应器于第125天开始出现明显厌氧氨氧化反应特性，短于接种湿地底泥的155 d。Anammox反应器启动并稳定运行后，在进水总氮质量浓度为275 mg·L−1、负荷为0.275 kg·(m3·d)−1条件下，出水总氮质量浓度可降至90 mg·L−1以下，其中接种湿地底泥和混合污泥的Anammox反应器的TN去除率分别达到74.49%和67.12%。高通量结果表明，在接种湿地底泥和混合污泥的反应器中的厌氧氨氧化菌属为Candidatus Brocadia，其丰度分别达到9.82%和10.70%。Abstract: Anaerobic granular sludge, wetland sediment and their mixture (SS ratio of 1∶1) were used as inoculated sludge to start the Anammox reactor in three UASB tanks, and the feasibility of starting Anammox reactor with wetland sediment as inoculum was investigated. The results showed that the USAB inoculated with anaerobic granular sludge didn’t present the obvious Anammox reaction characteristics after 183 days of start-up operation. The USAB inoculated with mixed sludge began to show obvious Anammox reaction characteristics on day 125, which was shorter than USAB inoculated with wetland sediment on day 155. After the start-up and stable operation of the Anammox reactor, the total nitrogen concentration in the effluent could be reduced to less than 90 mg·L−1 under the conditions of the total nitrogen concentration in the influent of 275 mg·L−1 and the load of 0.275 kg·(m3·d)−1. The TN removal rates of the Anammox reactor inoculated with wetland sediments and mixed sludge reached 74.49% and 67.12%, respectively. The high-throughput results showed that the Anammox bacteria in the two reactors were Candidatus Brocadia, and their abundances reached 9.82% and 10.70%, respectively.
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Key words:
- Anammox /
- wetland sediment /
- start process /
- microbial community
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近年来，随着人们生活水平的提高，我国餐厨垃圾产生量以每年10%的速度增长，截至2018年，餐厨垃圾产生量突破了1×108 t，占城市生活垃圾的57%左右。餐厨垃圾含有的大量有机物质容易腐烂变质并携带病原菌，不仅污染环境而且威胁人体健康。同时，餐厨垃圾又富含碳水化合物、蛋白质和油脂，营养价值高，是有机废物厌氧能源化的理想底物[1]。氢能被广泛认为是未来最具潜力的绿色可再生能源之一[2]，与传统的电解水、化石燃料制氢相比，暗发酵生物制氢具有运行成本低、能耗低、操作简单等特点，可实现餐厨垃圾等高浓度复杂有机废物的能源化利用，成为最具前景的氢能制备策略之一，符合我国绿色可再生能源的战略需求。
暗发酵制氢是产氢微生物利用氢酶的催化作用将有机物降解产生氢气，同时生成挥发性脂肪酸(VFA)、乙醇等代谢产物的过程。当末端产物为乙酸时，葡萄糖的理论产氢量为4 mol·mol−1，但实际产氢量不足2 mol·mol−1，底物的氢能转化效率不足50%[3]。有研究[4-7]表明，暗发酵制氢与[2Fe-2S]铁氧化还原蛋白和[4Fe-4S]氢酶的活性密切相关，铁氧还原蛋白可作为氢化酶的电子载体参与氢分子的产生过程，其中，铁是其重要组成部分，能够影响微生物的产氢潜力[8]。此外，铁离子的种类和含量也会影响微生物的产氢功能基因表达，进而影响复杂底物的产氢性能[9]。因此，如何克服高浓度有机废物暗发酵制氢过程的代谢障碍，提高复杂底物的利用效率和产氢潜力是制约暗发酵生物制氢技术的瓶颈问题。
有研究[10-12]发现，投加纳米零价铁(NZVI)和零价铁(ZVI)可以提高暗发酵制氢过程中的微生物活性，进而提高暗发酵制氢潜力和底物的利用效率。ZVI以其低成本成为氢发酵中最具吸引力的添加剂，能够降低发酵系统中的氧化还原电位(ORP)，可以为发酵菌提供更有利的环境[13]。ZHANG等[14]研究了ZVI对葡萄糖发酵产氢量的影响，当ZVI浓度为400 mg·L−1时，最大产氢量为1.22 mol·mol−1，比对照组高出了37.1%。ZHU等[15]发现，ZVI的浓度为16 g·L−1时，产氢量从3.8 mol·mol−1提高到8.7 mol·mol−1。NZVI具有较高的催化活性和较大的表面积，从而提高了暗发酵制氢过程的效率[16]。NATH等[17]采用NZVI强化葡萄糖间歇暗发酵产氢，发现当NZVI为100 mg·L−1时，最大产氢量可达到1.9 mol·mol−1，比未加NZVI的对照组高出1倍。ZADA等[18]发现，在加入250 mg·L−1 NZVI条件下，水葫芦的产氢量从31.7 mL·g−1增加到57 mL·g−1。可见，投加NZVI和ZVI添加剂均可提高产氢性能，且具有操作简单、能耗低的优点。目前，研究主要集中在投加NZVI与ZVI对以葡萄糖、蔗糖等单一底物暗发酵制氢性能的影响，而以餐厨垃圾等复杂有机废物为底物，深入研究暗发酵制氢过程中铁离子转化规律和产氢酶活性的影响还鲜有报道。本研究通过投加不同浓度的NZVI和ZVI，研究了其对餐厨垃圾在(55±1) ℃高温条件下的暗发酵制氢潜力、末端代谢产物变化规律的影响，通过分析发酵前后铁离子组成及浓度变化、氢化酶和脱氢酶活性表达，探究了NZVI与ZVI强化餐厨垃圾暗发酵制氢的作用机制，以期为餐厨垃圾等复杂有机废物的绿色能源化提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验原料
本实验所用的餐厨垃圾取自北京市某大学食堂，分拣出餐厨垃圾中骨头、塑料袋等杂质后破碎至5 mm，经90 ℃水热预处理30 min，离心去油(去油可提高餐厨垃圾的水解效果,利于提高产气潜力[19])，置于4 ℃冰箱备用[20]。接种污泥取自北京某生活垃圾综合处理厂的干式厌氧发酵剩余污泥。实验材料的基本理化指标如表1所示。
表 1 实验材料基本理化指标Table 1. Basic physical and chemical indexes of experimental materials分析项目 TS/% VS/% VS/TS/% 含水率/% pH COD/(mg·L−1) C/% N/% 餐厨垃圾(水热后) 22.55 20.59 91.31 77.45 6.07 107 100 53.10 3.94 接种污泥 15.13 7.59 50.15 84.87 7.20 7 600 22.13 2.27 | Show Table
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1.2 实验设计
将11.65 g经水热去油预处理的餐厨垃圾与50 g接种污泥混合放入500 mL广口瓶中，接种比为0.63∶1(VS∶VS)，分别加入不同浓度(0、100、200和300 mg·L−1)的NZVI和ZVI，实验反应器情况记为：NZVI-0、NZVI-1、NZVI-3和ZVI-0、ZVI-1、ZVI-2、ZVI-3。加去离子水定容至200 mL，有机负荷为6 g·(L·d)−1(以VS计)，采用1 mol·L−1 HCl与1 mol·L−1 NaOH调节初始pH为6，通氮气10 min排除反应装置内空气。在(55±1) ℃的高温条件下进行暗发酵制氢，搅拌速度为120 r·min−1，采用排水法收集产生的气体。实验编号如表2所示。
表 2 暗发酵产氢动力学分析Table 2. Dynamic analysis of dark fermentation hydrogen production实验组 Pmax/mL Rmax/(mL·h−1) λ/h R2 NZVI-0 220.72 38.41 1.95 0.999 55 NZVI-1 259.25 49.43 3.27 0.999 35 NZVI-2 224.87 47.04 2.66 0.999 85 NZVI-3 248.70 76.48 6.02 0.996 37 ZVI-0 308.51 216.07 5.72 0.998 48 ZVI-1 425.72 66.32 4.59 0.998 44 ZVI-2 350.91 70.96 5.58 0.998 90 ZVI-3 459.24 77.67 4.72 0.989 22 注：Pmax代表最大产氢量潜力，Rmax代表最大产氢速率，λ表示反应启动时间。 | Show TableDownLoad:
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1.3 分析方法
铁离子浓度采用GB/T 12496.19-2015邻菲啰啉分光光度计法测定；氢化酶、脱氢酶活性采用辛红梅等[21]方法测定。VFA和乙醇浓度测定采用9790II气相色谱仪分析测定，色谱条件为：色谱柱采用CP-Wax(FFAP)25 m×0.32 mm×0.2 μm毛细管柱，FID氢火焰离子检测器，进样量1 μL，柱温箱初始温度为80 ℃，保持5 min，以10 ℃·min−1速率升温至190 ℃；进样口和检测器温度为250 ℃；高纯氮气为载气，流速为1.5 mL·min−1。气体成分测定采用上海天美公司GC7900气相色谱仪分析发酵气相产物和含量，色谱条件为：色谱柱采用填充柱，TCD热导检测器，分析柱1为2 m hayesep Q，分析柱2为5 A分子筛3 m；柱温箱120 ℃，进样口和检测器温度为150 ℃，电流为30 mV，载气为高纯氩气，进样量为1 mL。以峰面积定量，校正归一法计算气体含量。
2. 结果与讨论
2.1 NZVI和ZVI对餐厨垃圾暗发酵制氢性能的影响
1) NZVI和ZVI对暗发酵制氢性能的影响。图1为不同浓度NZVI和ZVI对餐厨垃圾高温暗发酵累积产气量和氢气百分含量的影响结果。结果表明，所有实验组在暗发酵前18 h累积产气量显著提高，之后累积产气量增加趋势变缓直至趋于稳定。在暗发酵产氢的过程中，氢气百分含量呈现先升高后降低的趋势。在投加NZVI添加剂时，浓度为100 mg·L−1的NZVI-1组的暗发酵制氢性能最好，累积产气量和氢气百分含量在12 h和30 h达到最大值，分别为676 mL(单位VS产气量为281.68 mL)和83.76%，是未投加NZVI实验组的1.08倍和1.1倍。其次为NZVI-0实验组，累积产气量和氢气百分含量分别为625 mL(单位VS产气量为260.43 mL)和79.16%。由此可见，与未投加NZVI相比，NZVI-1组最多可提高产气量51 mL(单位VS产气量为21.25 mL)，提高氢气百分含量8.53%。
图 1 NZVI和ZVI对餐厨垃圾暗发酵累积产气量和氢气百分含量的影响Figure 1. Influence of NZVI and ZVI on the cumulative hydrogen production and biohydrogen proportion in dark fermentation在投加ZVI添加剂时，暗发酵产氢性能较好的实验组为投加浓度300 mg·L−1的ZVI-3组和浓度100 mg·L−1的ZVI-1组，获得累积产气量分别为798 mL和732 mL(单位VS产气量分别为332.51 mL和305.01 mL)，最大氢气百分含量分别为72.79%和81.95%，从节省添加剂的角度考虑，暗发酵产氢性能最好的是添加ZVI浓度为100 mg·L−1的ZVI-1组。由此可见，与未投加ZVI相比，投加100 mg·L−1 ZVI最多可提高产气量90 mL(单位VS产气量为37.50 mL)，提高氢气百分含量2.74%。
2)NZVI和ZVI产氢动力学分析。在累积产气量和氢气百分含量分析基础上，利用修正过的Gompertz模型对暗发酵产氢过程的累积产氢量进行动力学拟合，产氢动力学分析结果如图2和表2所示。由图2可知，除NZVI-3实验组外，投加NZVI实验组的启动时间均比投加ZVI实验组短，但ZVI组的最大产氢潜力和最大产氢速率均比NZVI组高。在投加NZVI实验组中，NZVI-0实验组启动时间最短，为1.95 h，但最大产氢潜力和最大产氢速率均为最低，分别为220.72 mL和38.41 mL·h−1。浓度为100 mg·L−1的NZVI-1组最大产氢潜力最高为259.25 mL，浓度为300 mg·L−1的NZVI-3实验组的最大产氢速率最高，为76.48 mL·h−1。虽然NZVI-3实验组的最大产氢速率值最高，但其启动时间(6.02 h)是NZVI-1实验组(3.27 h)的1.84倍。NZVI-3实验组的最大产氢潜力(248.70 mL)也小于NZVI-1实验组(259.25 mL)。由此可见，投加NZVI可以提高最大产氢速率和最大产氢潜力，且投加浓度为100 mg·L−1时达到的效果最好。
图 2 在不同浓度NZVI和ZVI条件下的累积产氢量变化Figure 2. Changes of cumulative hydrogen production at different concentrations of NZVI and ZVI投加ZVI的实验组的产氢潜力均高于未投加ZVI的ZVI-0实验组(308.51 mL)。其中，ZVI-3实验组的最大产氢潜力最高，为459.24 mL，ZVI-1实验组次之，为425.72 mg·L−1。此外，ZVI-1实验组的启动时间最短，为4.59 h。当ZVI投加量为100 mg·L−1时，餐厨垃圾最大产氢潜力是投加NZVI实验组的1.64倍。可见投加ZVI可有效提高产氢微生物对底物的利用效率和产氢潜力。
2.2 NZVI和ZVI对餐厨垃圾暗发酵制氢发酵途径的影响
乙醇和VFAs是暗发酵制氢的重要末端代谢产物，根据其浓度和组成可将暗发酵制氢的代谢类型分为乙醇型发酵、丁酸型发酵、丙酸型发酵和混合酸发酵[22]。投加不同浓度的NZVI和ZVI后，餐厨垃圾暗发酵制氢末端乙醇和VFAs各组分占比如图3所示。结果表明，末端代谢产物中以乙醇、乙酸和丁酸为主，其中乙醇占比最高(53.71%~77.09%)，发酵类型是以乙醇型发酵为主的混合型发酵。与未投加ZVI的实验组相比，投加浓度为300 mg·L−1的ZVI-3实验组中的乙醇浓度提高了7.04%。
图 3 投加NZVI和ZVI对乙醇和VFAs各组分占比的影响Figure 3. Effect of NZVI and ZVI addition on the proportions of ethanol and VFAs components在投加NZVI的实验组中，乙酸在NZVI-1、NZVI-2、NZVI-3组中末端代谢产物中的占比分别为18.04%、16.89%、14.22%，均高于NZVI-0对照组(9.42%)。而对于投加ZVI的实验组，ZVI-1、ZVI-2、ZVI-3实验组中乙酸在末端代谢产物中的占比分别为6.44%、7.70%、6.62%，均低于ZVI-0对照组(8.18%)。由此可见，与投加ZVI相比，投加NZVI更有利于乙酸的转化，但产氢潜力和速率有所较低。可能由于发酵过程中产生的乙酸使体系pH降低，产生过剩的NADH+H+，未能被氧化为NAD+，影响微生物酶活或酶合成，进而抑制NADH/NAD+平衡产氢[23]。
投加NZVI的实验组相比未投加NZVI的实验组(67.7%)，其中乙醇的占比均有所降低。对应投加NZVI的实验组，随着NZVI投加量的增加，乙醇占比由53.71%逐渐升高至63.50%，同时累积产气量和氢气百分含量有所下降，这说明NZVI在一定程度上改变了产氢细菌的代谢产氢途径，产生了更多的乙醇副产物和更少的乙酸副产物，投加低浓度的NZVI有利于产氢，浓度过高可能对微生物活性产生了抑制作用。投加ZVI的实验组相比未投加ZVI的实验组(70.05%)，其中乙醇的占比略有提高。随着ZVI投加量的增加，乙醇占比由72.65%升高至77.09%，同时在ZVI-3实验组中的累积产气量大于ZVI-1实验组。发酵过程中所产生的乙醇可以氧化过多的NADH+H+，有利于产氢潜力的提高[23]。对于投加NZVI和ZVI的实验组，暗发酵末端代谢产物中乙醇的占比均有所升高，但累积产气量的变化趋势却相反，这可能是由于2种添加剂对与产氢相关的关键酶影响有所不同。
2.3 NZVI和ZVI对餐厨垃圾暗发酵制氢ORP的影响
在发酵过程中，ORP是控制微生物代谢和增殖的重要参数之一[24-25]。其可以通过还原/氧化NAD(NADH/NAD+)来改变细胞内外的ORP，从而调控微生物代谢。一般认为，厌氧微生物所需ORP的最适范围为-180~-260 mV[26]。
暗发酵产氢前后体系中的ORP变化结果如图4所示。结果表明，投加与未投加NZVI和ZVI的实验组在反应结束后ORP均有所下降，其中投加NZVI与ZVI的实验组中ORP下降更为显著。投加NZVI的实验组，NZVI-3实验组ORP下降最大，由反应前的−199.6 mV下降至−260.1 mV，是未投加NZVI实验组的1.24倍。其次是NZVI-1实验组，由反应前的−198.5 mV下降至−253 mV，是未投加NZVI实验组的1.20倍。对于投加ZVI的实验组，ZVI-2实验组的ORP下降最大，由反应前的−199.4 mV下降至−292.2 mV，是未投加ZVI实验组的1.39倍。其次是ZVI-1实验组，由反应前的−198.8 mV下降至−254.3 mV，是未投加ZVI实验组的1.21倍。
结合产氢潜力结果分析可知，产氢效果好的NZVI-1实验组(−253 mV)与ZVI-1实验组(−254.3 mV)ORP值相近，均在厌氧微生物最适ORP的范围内，从而有利于产氢性能的提高。分析原因可能是：反应器内的ORP迅速降低，说明分子氧等氧化剂被消耗掉，这可能由于投加的NZVI和ZVI被用作电子供体，铁可作为底物诱导因子，作用于细菌代谢途径中，既能参与细菌的生物氧化过程，又能使反应器内的ORP迅速降低，使ORP维持在产氢的最适范围内，从而提供更好的还原条件[27-29]；另一方面，氢化酶活性和NAD+/NADH平衡产氢均需要较低的ORP[30]。
2.4 NZVI和ZVI对餐厨垃圾暗发酵制氢过程中铁离子浓度的影响
图5表示投加NZVI和ZVI进行暗发酵制氢前后，各实验组发酵液中Fe2+和Fe3+浓度的变化情况。由图5可知，在餐厨垃圾暗发酵制氢前，体系中Fe2+和Fe3+的浓度较低，分别为23.74 mg·L−1和28.52 mg·L−1。反应结束后，未投加NZVI与ZVI的实验组中Fe2+和Fe3+的浓度有所下降，投加NZVI与ZVI的实验组中Fe2+浓度显著上升，而Fe3+浓度略有提升，这证明了NZVI和ZVI是作为电子供体而存在的。铁在产氢细菌的代谢机制中起着至关重要的作用，是形成氢化酶和铁氧还蛋白的重要成分[31]。Fe2+可以促进了生物量的增长和功能基因的表达，从而促进氢气的产生。对于投加NZVI的实验组，NZVI-3实验组中的Fe2+浓度最高，为43.78 mg·L−1，是未投加NZVI实验组的2倍，NZVI-2的Fe2+浓度次之，为42.47 mg·L−1，是未投加NZVI实验组的1.96倍。在投加ZVI的实验组，ZVI-1实验组的Fe2+浓度最高，为38.21 mg·L−1，是未投加ZVI实验组的1.96倍，ZVI-3的Fe2+浓度次高，为36.51 mg·L−1，是未投加ZVI实验组的1.87倍。
图 5 投加NZVI和ZVI对铁离子浓度的影响Figure 5. Effect of adding NZVI and ZVI on the concentrations of iron ion厌氧微生物可以将Fe3+还原为生物利用性更高的Fe2+。在投加NZVI的实验组中，NZVI-2实验组的Fe3+浓度最高，为15.99 mg·L−1，是未投加NZVI实验组的1.72倍，NZVI-1的Fe3+浓度次之，为14.21 mg·L−1, 是未投加NZVI实验组的1.53倍。在投加ZVI的实验组中，ZVI-3实验组的Fe3+浓度最高，为12.12 mg·L−1，是未投加ZVI实验组的1.30倍，ZVI-1的Fe3+浓度次之，为10.34 mg·L−1，是未投加ZVI实验组的1.28倍。
综上所述，在暗发酵制氢体系中投加NZVI和ZVI，可使Fe2+浓度升高，Fe3+浓度略有升高。一方面，这是由于投加的NZVI和ZVI有部分转化为了Fe2+；另一方面是由于微生物对Fe3+的利用将Fe3+还原成Fe2+。但投加NZVI与ZVI浓度过高，铁离子会与蛋白质结合生成难以被生物降解的螯合物，故使产氢潜力下降[32]。
2.5 NZVI和ZVI对餐厨垃圾暗发酵制氢过程pH的影响
反应结束时pH的变化情况如图6所示。由图6可知，NZVI和ZVI对反应器的pH的影响作用并不明显。在暗发酵制氢反应结束时，投加NZVI和ZVI的实验组的pH均在5.5~6.0。在投加NZVI实验组中，pH最高的实验组为NZVI-3实验组(5.71)，最低的为NZVI-1实验组(5.51)。投加ZVI的实验组中，pH最高的为ZVI-3实验组(5.94)，最低的为ZVI-1实验组(5.8)。随着投加NZVI和ZVI浓度的增加，pH也随升高。这可能是由于投加的NZVI和ZVI作为诱导因子作用于细菌代谢途径中，参与了产氢细菌的生物氧化过程，发酵类型为以乙醇型发酵为主的混合型发酵[33]。末端代谢产物中乙醇的占比随着NZVI和ZVI投加量的增加而增大，从而导致了pH的升高。投加NZVI的实验组在反应结束时pH低于未投加NZVI的实验组(5.75)，投加ZVI的实验组在反应结束时pH高于未投加ZVI实验组，这说明与投加ZVI相比，投加NZVI更有利于乙酸的转化，产生的乙酸可使体系pH降低。
2.6 NZVI和ZVI对餐厨垃圾暗发酵制氢过程中酶活性的影响
有机物的暗发酵制氢过程是在一系列酶和辅酶以及中间传递体的作用下完成的一种生物氧化过程。其中，氢化酶是一类能够高效可逆地催化产生氢气的酶，含有双核铁原子的铁氢化酶具有很高的催化活性。脱氢酶中的电子载体铁氧还蛋白是暗发酵生物氧化过程产生氢分子的重要功能蛋白。可见，铁是决定餐厨垃圾暗发酵制氢过程氢化酶和脱氢酶活性的重要物质，对产氢微生物的生长代谢有着重要的影响。
投加不同浓度的NZVI和ZVI对氢化酶和脱氢酶活性的影响结果如图7所示。结果表明，对于未投加NZVI与ZVI的实验组，氢化酶活性分别为2.49 mL·(g·min)−1和2.76 mL·(g·min)−1(以VSS计)。在投加NZVI后，氢化酶活性有所提高，其中，NZVI-3组的氢化酶活性最高，为2.56 mL·(g·min)−1，是未投加NZVI实验组的1.02倍，NZVI-1实验组氢化酶活性次高，为2.55 mL·(g·min)−1。在投加ZVI后，氢化酶活性有显著提高。ZVI-3实验组氢化酶活性(3.96 mL·(g·min)−1)最高，是ZVI-0实验组的1.43倍。ZVI-1实验组次之，为3.54 mL·(g·min)−1。有研究[5]表明，NZVI可以降低培养基中溶解氧的水平，从而提高氢化酶的活性。李永峰等[33]提出金属元素在微生物生命活动中具有重要作用，其对酶的作用主要有2方面：一是作为酶的辅助因子，在酶促反应中运输转移电子、原子或某些功能基团参与氧化还原或运载酰基团作用；二是作为激活剂来提高酶的活性。铁作为铁氧还蛋白及氢化酶重要的组成成分，投加NZVI和ZVI可以提高铁氧还蛋白和氢化酶的活性，促进电子的转移，进而提高产氢效能。
图 7 投加NZVI和ZVI对氢化酶和脱氢酶活性的影响Figure 7. Effect of adding NZVI and ZVI on hydrogenase and dehydrogenase activity对于NZVI-0和ZVI-0实验组，脱氢酶活性分别为128.32 μg·(g·min)−1和140.53 μg·(g·min)−1(以VSS计)。然而，投加NZVI的实验组脱氢酶活性出现了显著下降，由NZVI-0实验组的128.32 μg·(g·min)−1下降到NZVI-1实验组的34.37 μg·(g·min)−1，下降了73.2%。且随着投加NZVI浓度增加，脱氢酶活性继续下降，NZVI-3实验组中脱氢酶活性下降到最低，为8.40 μg·(g·min)−1。在投加ZVI的实验组中，脱氢酶活性有显著的提高。脱氢酶活性在ZVI浓度小于300 mg·L−1时，随着投加ZVI浓度的增加，其由140.53 μg·(g·min)−1提高到150.84 μg·(g·min)−1，提高了7.3%，但当ZVI浓度为300 mg·L−1时，脱氢酶活性下降到80.96 μg·(g·min)−1。这说明过高的ZVI浓度抑制了脱氢酶的活性。结合相关文献，其原因可能是因为铁的投加量过高超出了体系中产氢微生物的所需，而过剩的铁形成了铁盐或亚铁盐，从而使系统的渗透压升高，导致脱氢酶活性的降低[21]。
有研究[34]表明，当金属元素浓度维持在较低水平时，对微生物可以起到激活作用，但当浓度过高时，便会对微生物的酶活性产生抑制作用。由此可见，投加ZVI的同时提高了氢化酶和脱氢酶的活性。结合铁离子浓度变化趋势可知，投加的NZVI和ZVI会向系统环境中释放铁离子，为微生物提供生长代谢过程中所需的铁元素并提高氢化酶活性。但投加NZVI时虽然提高了氢化酶活性，脱氢酶活性却受到了抑制，这可能缘于纳米材料中活性氧的生成和氧化应激反应引起的生物毒性损害了微生物细胞结构，导致细胞死亡，进而影响微生物产氢能力[35]。
由此可见，投加100 mg·L−1 NZVI和ZVI均可有效提高氢化酶活性，投加ZVI还可提高脱氢酶活性，有利于产氢微生物的暗发酵制氢。
3. 结论
1)投加NZVI和ZVI均可显著提高餐厨垃圾暗发酵制氢性能，投加100 mg·L−1 ZVI效果最佳，最大产氢潜力和最大产氢速率分别为425.72 mL和66.32 mL·h−1，是投加NZVI实验组的1.64倍和1.34倍。投加NZVI与ZVI后，末端代谢产物以乙醇、乙酸和丁酸为主，其中乙醇占比最高(53.71%~77.09%)，发酵类型是以乙醇型发酵为主的混合型发酵。
2)投加NZVI和ZVI可使反应体系中ORP显著下降，有利于暗发酵制氢的进行。反应结束后，未投加NZVI与ZVI的实验组中Fe2+和Fe3+的浓度较反应前均有所下降，投加NZVI与ZVI的实验组Fe2+浓度有显著上升，Fe3+浓度略有提升。在投加的NZVI和ZVI浓度为300 mg·L−1时，Fe2+浓度分别是未投加NZVI和ZVI实验组的2倍和1.87倍。
3)投加NZVI和ZVI均可有效提高氢化酶活性，投加100 mg·L−1 ZVI-1实验组氢化酶活性最佳，为3.54 mL·(g·min)−1，是NZVI-1实验组的1.38倍。投加ZVI可同时提高氢化酶和脱氢酶活性，有利于产氢微生物的暗发酵制氢。
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图 5 不同时期污泥微生物基于门水平的物种相对丰度
Figure 5. Relative abundance of sludge microorganisms in different periods at phylum level
图 6 不同时期污泥微生物基于属水平的物种相对丰度
Figure 6. Relative abundance of sludge microorganisms in different periods at genus level
表 1 反应器运行策略
Table 1. Operation strategy in the reactors
反应器名称 运行阶段 时间/d 进水NH4+-N/(mg·L−1) 进水NO2−-N/(mg·L−1) HRT/h 有无回流 R1 Ⅰ 1~71 40 50 24 无 Ⅱ 72~111 60 80 24 无 Ⅲ 112~183 60 80 24 有 R2 Ⅰ 1~71 40 50 24 无 Ⅱ 72~111 60 80 24 无 Ⅲ 112~157 60 80 24 有 Ⅳ 158~221 80~120 100~150 24 有 R3 Ⅰ 1~71 40 50 24 无 Ⅱ 72~111 60 80 24 无 Ⅲ 112~221 80~120 100~150 24 有
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