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白洋淀为华北平原最大的半封闭式浅水湖泊，淀区物种丰富，多数水域大型水生植物覆盖度为60%左右。经调查，白洋淀共有水生植物39种，隶属于19科30属，其中分布面积较广的优势群落有芦苇群落、狭叶香蒲群落、金鱼藻群落等[1]。水生植物构成了白洋淀湿地独特的环境生态，然而由于收割不及时、管护不到位，湿地水生植被残体在水体中大量堆积、腐烂，导致水体溶解氧降低、透明度减少[2]，水体恶臭，氮、磷等有机物浓度升高，并释放多种硫化物(硫醇、甲硫醚、二甲基二硫醚等)，引发生态灾害[3]。沈爱春等[4]在太湖进行的原位实验发现，蓝藻的集聚死亡会导致水体的溶解氧降低，水体营养盐含量迅速增加，TN和
NH+4 -N的浓度可增加16倍和48倍；胡红伟等[5]以白龟湖湿地优势植物菖蒲和芦苇为研究对象，证实倒伏腐解初期水体NH+4 -N、TP、COD 浓度都急剧升高，并对沉积物理化性质有较大影响。藕翔等[6]的研究表明，沉水植物苦草在腐解期间水体pH会上升，而在腐解初期会急剧耗氧，使水质恶化。因此，开展相关探索并选择合适的技术治理水生植物残体堆积、腐烂造成的问题，是当前迫切需要研究的课题。好氧堆肥是固体废弃物资源化处理的有效技术之一，已在沉水植物“减量化、无害化”处理方面有诸多应用[7]。沉水植物与非沉水植物相比，具有氮、磷、钾等营养元素丰富、含水量高、C/N低等特点。程花等[8]通过分析马来眼子菜、金鱼藻等6种沉水植物的理化性质，证实了沉水植物堆肥的可行性。王亚等[9]以麦秸和树叶为辅料，提高了沉水植物堆肥的腐熟度。陆伟东等[10]利用水葫芦与猪粪混合堆肥，王丽芬等[11]利用水葫芦与污泥混合堆肥，均取得了满意的堆肥效果。王亚梅[12]的研究结果表明，生物炭的添加可显著提高猪粪堆肥的腐熟度。有研究表明，在有机废弃物堆肥中添加生物质炭可提高堆体温度，延长堆肥高温持续的时间，减少氮素损失[13]。卢妙[14]证实了秸秆-污泥基生物炭的添加有利于污泥堆肥，同时在制备生物炭的过程中消耗了大量污泥，可更大程度的使脱水污泥减量化及无害化。NIGUSSIE等[15]通过荟萃分析发现，微生物菌剂对堆肥总氮(+30%)、总磷(+46%)、C/N(−31%)、腐殖化指数(+60%)和种子发芽指数(+28%)等堆肥腐熟指标均有明显的积极作用。张秧等[16]的研究表明，在小麦秸秆中添加微生物菌剂对腐殖质的形成有一定的促进作用。以上研究已证实，好氧堆肥是沉水植物利用的有效途径，生物炭、湿地底泥和微生物菌剂作为调理剂均可促进堆肥进程、提高堆肥品质，但以上调理剂对沉水植物堆肥腐熟的影响有待进一步研究。
本研究以白洋淀湿地大型沉水植物(金鱼藻和马来眼子菜)为研究对象，以生物炭、湿地底泥和微生物菌剂为调理剂，通过对比不同调理剂处理下好氧堆肥各处理组的理化及生物学指标，探明不同调理剂对堆肥腐熟效果的影响，提出沉水植物堆肥腐熟的科学调控方法，以期为改善白洋淀水体环境和沉水植物的资源化利用方式提供新思路。
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本实验沉水植物(金鱼藻和马来眼子菜)和湿地底泥在白洋淀打捞获取；干鸡粪和尿素用来调节堆肥碳氮比(C/N)；生物炭为SC-101型秸秆生物炭；发芽实验选择紫穗槐种子；复合微生物菌剂含有乳酸菌、酵母菌等微生物菌群，EM菌种含有双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌等微生物菌群。
本实验自制微生物菌剂的培养方法为：将500 g红糖溶于含有9 L蒸馏水的塑料桶中，取2.5 g EM菌种加入塑料桶，并混合均匀，将塑料桶密封好后置于32 ℃的气候箱中培养7 d，即可得到菌剂原液，将原液与蒸馏水按1∶10稀释后即可得到所需菌剂。堆肥原料性质见表1。
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本研究实验于2021年2月23日至3月30日在雄安生态环境研究院实验室进行。将沉水植物风干粉碎成1 cm左右的小段，置于120 ℃、1.5 kPa的高温灭菌锅中灭菌20 min，用干鸡粪和尿素调节沉水植物的C/N为28~30，湿地底泥和生物炭的添加量分别为物料总干重的10%和2%，保持堆体水分含量为65%左右。将原料置于32 cm×22 cm×16 cm的发酵盒中，并排列在温度50 ℃、湿度为65%的气候箱中进行高温发酵[17-18]。实验容器为耐高温的PP环保发酵盒，覆盖带孔的塑料薄膜，以降低水分蒸发速率。同时，根据堆体温度、水分的变化情况，在堆肥开始后每6 d翻堆1次并补充菌剂。在起堆的第0、6、12、18、24、30、36 d采用“五点取样法”取样，即分别在堆体的前、后、左、右及中心采集样品200 g，并均匀混合，一部分做风干处理用于理化指标测定，一部分常温存放用于测定种子发芽指数。
本实验共设计8个处理组，实验周期为36 d，各处理组设计见表2。
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每天在固定时间测定堆肥上、中、下的温度，并取均值作为该堆体的温度；采用外加热法测定有机质；采用凯氏定氮法测定全氮；用pH/EC仪测定pH和EC值[19]；半纤维素、纤维素、木质素的测定采用Van Soest洗涤法[20]；富里酸和胡敏酸的测定参考NY/T 1971-2010《水溶肥料腐植酸含量的测定》[21]；将鲜样与蒸馏水按1∶10(g∶mL)混合震荡2 h，浸提后在25 ℃的恒温箱内培养紫穗槐种子，48 h后记录发芽个数及根长，计算种子发芽指数。
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温度是堆肥工艺比较常用的物理评价指标之一，在堆肥过程中温度是影响微生物活动和堆肥工艺过程的关键因素。从图1可以看出，本实验8个处理组的温度变化趋势大致相同，主要可分为升温期、高温期、降温腐熟期[22-23]。在起堆的3~9 d，温度迅速升高且均达到最大值。这说明堆体具有良好的碳氮比、孔隙度等发酵条件，嗜热微生物分解有机物产生大量热量和气体并迅速繁殖，使得堆体迅速达到高温期。随后，温度总体呈现波动下降，并逐渐稳定。堆体最高温度为53.1~54.8 ℃，其可能的原因是，高温堆肥前期有机酸、无机酸含量升高较快，部分嗜温微生物活性受阻，数量减少，嗜热微生物成为整个堆肥过程中的优势菌种[24]。C组和H组堆肥平均温度的组间排序分别为：SB-H>S-H>B-H>CK-H、SB-C>B-C>S-C>CK-C。自制微生物菌剂较复合微生物菌剂含有更多、更有效的活性微生物，这导致喷洒自制微生物菌剂处理组的平均温度均高于其他处理组。没有添加生物炭和湿地底泥的对照组均为组内最低温度，由此说明，添加湿地底泥和生物炭的处理组也对促进堆体升温有一定的效果。在堆肥24 d左右，部分处理组堆体温度有小幅度的升高。其可能的原因为：翻堆和微生物菌剂补充的作用，高温好氧微生物再次繁殖，剩余的难分解纤维素类大分子物质开始被缓慢消耗，堆体内未分解完全的物质进行二次反应发酵。随后，堆体温度逐渐降低并趋于稳定，预示着堆肥过程结束。
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图2(a)表明，不同处理堆肥的pH均呈现出先升高后降低的趋势，堆肥结束时，pH均在7.55~7.81，这符合高温堆肥产品腐熟的pH标准[25]。在0~6 d的反应过程中，微生物降解含氮有机物发生氨化作用，产生大量的
NH+4 -N，堆体温度较高，嗜热微生物代谢蛋白质，导致氨氮的不断产生，使得pH持续升高。而在6~12 d的反应过程中，不同堆肥处理组pH均达到了最大值8.15~8.55。通过对比相同添加剂、不同微生物菌剂的处理组可看出，自制微生物菌剂较复合微生物菌剂更能促进堆肥过程中的氨化作用，对有机物质的利用更充分，从而产生更多的NH+4 ，使得pH高于其他处理组。同时，生物炭具有多孔结构、比表面积高的特点，能使更多的NH3吸附在堆体中，其表面丰富的羧基和酚羟基等酸性官能团可与NH+4 结合。因此，B-C处理组的pH略高于S-C处理组和SB-C处理组。在12~36 d的反应过程中，不同处理堆肥均趋近于腐熟，堆体孔隙度与起堆时相比有所降低，大量的有机质转变成为小分子的有机酸并逐渐积累，使得pH降低并趋于稳定[26-27]。电导率(EC)主要反映堆体中存在的可溶性盐的浓度，可作为判定堆肥是否限制作物生长的指标。当EC值小于9.0 mS·cm−1时，可认为对种子发芽没有抑制作用；当EC值小于4.0 mS·cm−1时，才能施用于土壤中，并且不会对植物产生抑制作用[28]。如图2(b)所示，不同处理的EC值在堆肥的初始阶段都有增加。造成这种趋势的原因是：部分有机物质在堆肥初期被降解成具有可溶性的小分子物质，如铵盐、磷酸盐、小分子有机酸和其他溶解的有机物等，随着堆肥反应的进行，由于有机酸的降解、腐殖质的形成以及NH3、CO2的排放等因素，不同处理的EC值均略有下降并趋于稳定。堆肥结束时，各处理的EC值为2.74(S-H)~3.36(CK-C)。这说明S-H处理组的堆肥产品对植物的毒害作用最小，CK-C处理组可能会对植物种子产生渗透压胁迫，对植物生长起到一定的抑制作用。综上所述，本实验的所有处理均可排除盐害的影响。
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图3(a)和图3(b)为堆肥过程中总有机质(TOM)和全氮(TN)的质量分数变化情况。TOM是堆肥过程中主要损失的物质，是堆肥进程中微生物进行生物化学反应的有效底物[29]，在堆肥过程中呈现出逐渐降低的趋势。固体有机物通过微生物的代谢活动形成更容易被微生物利用的溶解性有机物(DOM)，随着堆肥反应的进行，小分子有机物重组形成具有稳定结构的腐殖质[30]。在0~12 d的反应过程中，TOM质量分数降低明显。其可能的原因是：堆肥初期微生物活动旺盛，TOM以CO2、CH4、热量等形式快速损耗降解。不同处理由于物料有机碳组分的不同造成有机质降解率差异显著。第36天时， SB-H和SB-C处理组的TOM降解率分别为25.51%和21.68%，均大于添加相同菌剂的其他处理，这说明湿地底泥和生物炭的协同作用更有利于TOM的分解利用。对比B-H处理组与S-H处理组、B-C处理组与S-C处理组的TOM含量可知，生物炭对促进堆体TOM损耗转化的作用大于湿地底泥。堆肥结束时，TOM质量分数均在45%以上，符合有机肥料标准[20]。在堆肥进程中一直伴随着氮素的损失[31]，氮素在发酵过程中会不断进行氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用等，随着堆肥时间的推移、堆体体积的减小TN质量分数总体呈现上升的趋势。堆肥前期，TN质量分数明显上升。其可能的原因是：前期缩堆现象明显，湿地底泥的添加为反应提供了部分氮源，生物炭的作用减少了氮素的损失。当堆肥结束时，各处理的TN质量分数增加了22.99%~41.73%。堆体碳氮比是判断堆体是否腐熟的重要指标，当堆体C/N<20时，可认为堆肥已腐熟[32]。如图3(c)所示，本实验中，所有处理在堆肥结束时C/N均在15.08~19.39，都已达到腐熟条件。
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腐殖质(HS)主要由胡敏酸(HA)和富里酸(FA)组成，它不仅是堆肥的重要产物，也是评价堆肥质量的重要指标[33]。HA是指能够溶于碱溶液而不能够在酸溶液中被溶解的腐殖质物质，在土壤养分的保持以及土壤团粒结构的形成过程中发挥着重要作用[34]。从图4(a)中可以看出，HA的质量分数整体呈波动上升趋势。堆肥结束时，各处理堆肥HA的质量分数总体上差别不大，基本稳定在4.82%~5.86%。其中，SB-C处理组的HA质量分数由初始的3.16%到堆肥结束时的5.73%，增长率最高达75.23%，除S-C处理组(47.00%)外的HA增长率均在50%以上。图4(b)为FA的质量分数变化情况。从图4（b）可以看出，FA因其较小的相对分子质量、较简单的结构特点，随着堆体中微生物的大量繁殖，原料中的FA被微生物大量分解，堆体在微生物作用下分解合成FA的速率与其矿化或聚合成HA的速率的动态变化影响着FA含量的动态变化。堆肥结束时，各处理的FA含量为2.41%~2.66%，与初始质量分数相比减少幅度表现为：SB-H>S-C>B-H>S-H>B-C>SB-C>CK-H>CK-H。
HA/FA是用来评价最终堆肥成熟度的指标之一，该指数越高表示产品越稳定。一般认为，HA/FA大于1.9时，可视为堆肥已完全腐熟，因此，分析腐殖化指数对确定堆肥成熟度至关重要[35]。HA和FA在堆肥过程中可以相互转化，在微生物的作用下，大量新的稳定的HA分子逐渐被合成，而分子量小、结构简单、不稳定的FA则逐渐被分解。因此，如图4(c)所示，随着堆肥化过程的推进，各处理HA/FA呈上升趋势。这一趋势与REN等[36]的研究结果一致。本堆肥实验结束时，HA/FA的值为1.23~1.54，腐殖化最高的4个处理组是SB-H、B-H、SB-C、S-H。这表明，在堆体中添加湿地底泥、生物炭和微生物菌剂，均能够促进沉水植物堆肥的腐殖化和聚合化，生物炭的微孔结构为微生物提供了更多的生长繁殖空间[37]，湿地底泥能显著增加堆体的微生物多样性及丰度，自制微生物菌剂的添加有效促进了难降解化合物的降解，添加剂间的协同作用能够有效促进HA的形成和FA的降解，逐渐产生复杂的HS，进而提高堆体的腐殖化程度[38]。
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发芽指数(GI)是堆肥腐熟度评价生物学指标之一，该指数既考虑了种子的发芽率，也考虑了毒性物质对种子生根的影响。当GI大于80%时，证明堆肥已基本达到腐熟状态；当GI大于100%时，可认为堆肥产物对种子生长发挥了积极作用[39]。如图5所示，堆肥初期由于产生了大量的有毒物质，铵态氮浓度过高会抑制种子萌发，不同处理的种子发芽指数在60%左右。经过36 d的堆肥腐熟，所有处理的发芽指数均有较大幅度的提升，发芽指数为104.00%~116.57%，各组的排序为：SB-H>SB-C>B-H>B-C>S-H>S-C>CK-H>CK-H。对比相同添加剂下不同微生物菌剂的作用可知，自制微生物菌剂的堆肥处理较之复合微生物菌剂更能促进种子发芽和根系生长；添加生物炭及其联用实验组发芽指数更具优势，湿地底泥和生物炭协同作用下的堆肥处理种子发芽指数最高，同时生物炭的积极作用大于湿地底泥。
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木质纤维素是构成植物的主体部分，其结构复杂较难降解，通常大量存在于生活垃圾和农业废物中。纤维素的降解直接影响着堆肥的腐殖化过程，也是限制堆肥周期的关键因素[40]。木质纤维素中的半纤维素是最易被降解的。如图6(a)所示，半纤维素质量分数总体呈现出波动下降的趋势。在堆肥初期，半纤维素作为易被降解的有机物优先成为碳源。在6 d的反应过程中，部分半纤维素的降解率均达到50%左右。在6~24 d反应过程中，半纤维素质量分数增加。其可能的原因是半纤维素的消耗速率降低，其他有机质被消耗降解，堆体总质量减小。在24~36 d反应过程中，由于微生物菌剂的补充，微生物活动旺盛，堆体中的半纤维素再次加速消耗，使得堆肥后期半纤维质量分数有小幅度的下降。堆肥结束时，各处理的半纤维素降解率为27.45%~43.94%，各处理的排序为：SB-H>B-H>SB-C>B-C>S-C>S-H>CK-H>CK-H。添加湿地底泥和生物炭的处理均对半纤维素有较高的降解率，在添加相同微生物菌剂的处理组中，添加生物炭处理的半纤维素降解率均高于添加湿地底泥的处理，且都高于对照组。
如图6(b)所示，纤维素质量分数的变化趋势与半纤维素相似。经过36 d的堆肥，各处理纤维素的降解率基本稳定在17.07%~26.92%。纤维素是植物残体中最丰富的部分，相比于半纤维素较难降解[41]。堆肥结束时，各处理纤维素的降解率为17.07%~26.92%，各处理的排序为：CK-H>CK-H>S-C>S-H>B-C>SB-C>B-H>SB-H。该降解率趋势与半纤维的降解率相反。可能的原因为：1)有效微生物通过合成纤维素酶来降解堆体中的纤维素，微生物菌剂与湿地底泥和生物炭的协同作用并不能起到促进纤维素酶合成的作用，湿地底泥和生物炭对堆体纤维素的降解没有明显的积极作用，导致处理组较对照组对纤维素的降解较差；2)由于堆肥反应的复杂性，不同处理堆体总质量的不均匀减小导致纤维素的绝对含量呈现此趋势。
如图6(c)所示，木质素的质量分数呈现出先增加后降低的趋势。堆肥前期木质素的质量分数变大，可能的原因是，木质素不含有易水解而重复的单元，是微生物最难降解的部分[42]。在堆肥反应中，微生物优先分解消耗结构相对简单、易分解的有机物，与纤维素的降解相比，木质素的降解主要集中在堆肥腐熟阶段；堆肥结束时，各处理木质素的降解率为10.86%~13.54%。SB-C处理组木质素降解率(13.54%)显著高于对照组CK-C(11.45%)，这说明生物炭和湿地底泥在沉水植物腐熟过程中对木质素的降解有促进作用。对比B-H与S-H处理组、B-C与S-C处理组的木质素含量可知，湿地底泥对堆肥过程中木质素降解的促进作用大于生物炭。其可能的原因是，生物炭虽然为微生物的生长繁殖营造了一个相对适宜的环境，但湿地底泥具有更丰富的微生物群落及数量，微生物活动更加旺盛，产生更多益于木质素分解的酶。
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1)在沉水植物堆肥时，将生物炭和湿地底泥作为调理剂可使堆体迅速升温并延长高温持续时间，从而促进沉水植物堆肥中碳、氮转化循环过程，提高腐殖质含量。
2)生物炭较湿地底泥更能促进堆肥C/N下降，提高种子发芽指数；生物炭和湿地底泥的协同作用可显著提高沉水植物好氧堆肥进程、优化堆肥的理化性质。
3)自制微生物菌剂为堆体提供了更有效的微生物种群，可促进木质纤维素降解酶的合成，提高木质纤维素的生物降解率，加速腐殖质的形成，从而易形成更稳定、更高效的堆肥产品。
不同调理剂对2种沉水植物好氧堆肥腐熟效果的影响
Effects of different conditioners on the maturity enhancement of two kinds of submerged plants composting
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摘要: 为探讨大型沉水植物资源化利用的新途径，防止二次污染，以白洋淀较为丰富的沉水植物为原料，选择湿地底泥、生物炭和微生物菌剂为调理剂进行堆肥实验，共设置6个处理组及2个对照组，以研究不同调理剂对沉水植物好氧堆肥腐熟效果的影响。结果表明，同时添加湿地底泥和生物炭的2个处理组能明显加快堆肥进程，温度可迅速升高到54.8和54.4 ℃，且高温持续时间更长；添加自制微生物菌剂处理组的有机质消耗率和全氮增长率显著高于添加复合微生物菌剂的处理组，添加生物炭和湿地底泥处理组堆肥产品的腐殖化指数(HA/FA)更高；半纤维素、纤维素和木质素的最大降解率分别为43.94%、26.92%和13.54%；堆肥结束时，所有处理的种子发芽指数均大于100%。自制微生物菌剂能显著影响碳、氮的转化进程；而生物炭能更能促进堆肥形成稳定的腐殖质，其腐熟效果较湿地底泥也更加显著。Abstract: In order to explore new ways of resource utilization of submerged plants and prevent the secondary pollution, this study used the richer submerged plants in Baiyangdian as raw materials, and selected wetland sediment, biochar and microbial agents as conditioners for composting experiments. A total of six treatment groups and two control groups were set up to study the effects of different conditioners on the quality of aerobic composting products of submerged plants. The results showed that the two treatment groups added with Sediment and biochar could significantly accelerate the composting process, the temperature raised to 54.8 and 54.4 ℃ rapidly, and the high temperature lasted longer. The consumption rate of organic matter and the growth rate of total nitrogen in the treatment group with homemade biological inoculants were significantly higher than those in the treatment group with compound microbial inoculants, and the humification index (HA/FA) of the composting product of the treatment group added with biochar and Sediment was higher. The maximum degradation rates of hemicellulose, cellulose and lignin were 43.94%, 26.92% and 13.54%, respectively. At the end of composting, the seed germination index of all treatments was greater than 100%. This research showed that homemade biological inoculants could significantly affect the conversion process of carbon and nitrogen; while biochar could promote composting to form humus stable, and its maturity enhancement was more significant than that of sediment.
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Key words:
- submerged plants /
- aerobic composting /
- wetland sediment /
- biochar /
- microbial inoculants
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农村污水的分质收集处理是农村污水资源化的重要方式。农村生活污水按照其污水来源和水质特征的不同，可以大致分为灰水和黑水2大类。其中，灰水是指不包括冲厕污水(黑水)在内的生活杂排水，主要包括餐厨污水、洗涤污水和洗浴污水等[1-2]。灰水由于基本不含肠道病原微生物、污染物浓度较低且易于自然生物处理的特点，具有很高的直接回用价值[1]。为缓解水资源压力，灰水单独采用管道收集并直接用于灌溉的回用方式已经得到了一定的应用[3]。而农村污水治理工程设施投资中的管道敷设成本占所有建设投资的70%以上，管道敷设成本过高直接限制了农村地区污水收集治理工作的有效开展[4-5]。小管径重力流排水系统具有管道成本低、施工开挖土方量少、建设迅速等诸多优点，非常适用于经济条件相对落后的农村地区[6-7]。基于此，小管径重力流灰水管道系统具有明显的经济优势和生态环境效益，具有较大的推广潜力和应用前景。
排水管道生物膜具有一定的污水预处理功能，并且可能产生CH4、H2S等具有环境和健康风险的气体，对于市政排水管道生物膜的微生物群落特征已经有了相对广泛的研究[8-10]。然而，农村污水特征与市政排水相比，其水质水量具有明显的随时间变化规律，即每天在用餐时段污水水量较大，而夜间基本没有污水排放[11]。具体到管道容量较小的小管径系统中，在早中晚时段，污水排放高峰期，管道经常临近满管流状态；而在夜间，基本处于断流状态。不同的流态决定了不能直接套用市政污水管道生物膜数据来解析农村污水管道生物膜，当前对于农村污水管道生物膜的认识仍处于起步阶段，更是罕有针对农村灰水管道生物膜的研究。
本研究采用实验室规模的小管径重力流灰水管道系统，研究了小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落、氮硫循环管道功能菌特征以及氮循环功能基因分布情况，重点探讨了管道敷设坡度对于小管径重力流灰水管道生物膜细菌群落的影响。本研究丰富了排水管道生物膜认知体系，为小管径重力流灰水管道的优化设计和应用提供了参考。
1. 材料与方法
1.1 实验装置
本研究采用的实验装置为实验室规模的小管径重力流管道模拟系统。整个系统由3套不同敷设坡度(5‰，10‰，15‰)的透明UPVC排水管道系统(φ50 mm×3.5 mm，单组管道总长5 m，溢彩，中国)、PVC阀门(百盛，中国)、高位水箱(PVC板自制)、循环水箱(PVC板自制)、潜水泵(HQB-5000，森森，中国)、恒温器(300 W，YEE，中国)等组成(图1)。灰水由潜水泵经循环水箱提升至高位水箱，沿排水管道依靠重力作用流下，最终回到循环水箱。灰水在整套系统中循环流动，模拟小管径重力流灰水管道的生物膜生境，同时保证了3套管道中的灰水水质相同，有效避免了水质差异造成的生物膜群落结构差异。为进行生物膜取样，在距直管道起点1 m处设置30 cm长的取样管道，两侧采用50 mm PVC活接头(联塑，中国)连接，确保取样管道的轴线与直管道重合。
图 1 小管径重力流模拟装置示意图Figure 1. Schematic diagram of simulated small diameter gravity sewers1.2 水质特征及分析测试方法
为模拟实际农村灰水在小管径重力流管道中的真实流态，本研究利用调节潜水泵功率和阀门开闭的方式保持管道内的充满度随时间有规律的变化，管道实际充满度和平均灰水流速如图2所示。整个实验设备的运行水温维持在20 ℃并保持避光运行，以模拟真实的灰水管道运行状态。本研究进水采用人工配制的灰水，配制方法见表1。每2 d换水一次，运行水质条件见表2。整套设备连续运行60 d，形成成熟的管道生物膜。
表 1 配制灰水组分浓度Table 1. Composition of synthetic gray water常量物质 浓度/(mg·L−1) 微量物质 浓度/(μg·L−1) 葡萄糖 80 CaCl2·2H2O 73.50 蛋白胨 80 MgSO4·7H2O 51.25 CH3COONa 54 Na2SiO3·9H2O 30.43 NaHCO3 91 Al2(SO4)3·16H2O 11.78 KCl 57 FeCl3·6H2O 4.83 KNO3 7 ZnSO4·7H2O 0.88 NH4Cl 19 H3BO3 0.58 NaH2PO4·2H2O 15 CuSO4·5H2O 0.39 食用油 30 MnCl2·4H2O 0.27 十二烷基苯磺酸钠 5 KI 0.03 EDTA 20.00 注：pH=7。 | Show Table
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图 2 管道充满度及流速随时间的变化Figure 2. Variation of relative depth and flow velocity with time in sewers表 2 实验灰水水质特征Table 2. Characteristics of gray water in the experiment测试结果 pH DO/(mg·L−1) COD/(mg·L−1) 
-N/(mg·L−1)TN/(mg·L−1) TP/(mg·L−1) 
/(mg·L−1)LAS/(mg·L−1) 平均值 7.07 4.26 121.56 4.90 14.33 3.83 18.07 2.69 标准差 0.13 0.57 85.88 0.63 1.22 0.94 7.33 1.60 注：LAS为阴离子表面活性剂。 | Show TableDownLoad:
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相关研究[12-13]表明，经过60 d的连续运行，排水管道生物膜可以发育成熟。连续运行后，在第60天拆卸取样管道，用经过灭菌处理的药匙刮下少量位于管道内表面底部的生物膜样品，置于无菌离心管中，迅速置于4 ℃冰箱中保存，用于生物膜样品的形貌观测。另取3份平行样品，迅速置于4 ℃便携式恒温箱(FYL-12MC-B4,福意联，中国)中临时暂存，在0.5 h内，转移至−80 ℃冰箱中保存，用于生物膜细菌的群落分析，取3份平行样品群落分析结果的算术平均值。
将生物膜样品浸没于2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃避光静置24 h。然后依次利用25%、50%、75%、95%和100%的乙醇溶液进行梯度脱水，最后于−50 ℃中冷冻干燥，制得扫描电镜样品。将样品喷碳后，置于JSM-5610LV型扫描电镜(JEOL，日本)下，分析生物膜样品的形貌特征。
采用PowerSoil® DNA Isolation Kit (MoBio，美国)试剂盒提取生物膜样品的DNA，并利用细菌16S rRNA通用引物338F和806R进行PCR扩增。总PCR反应体系的体积为20 μL，包括超纯水13.25 μL，10×PCR ExTaq Buffer 2.0 μL，DNA模板(100 ng·mL−1)0.5 μL，引物338F和806R (10 mmol·L−1)各1.0 μL，dNTP 2.0 μL, ExTaq (5 U·mL−1) 0.25 μL；在95 ℃中维持5 min，继而进行30个扩增循环，每个循环包括95 ℃孵育30 s，58 ℃孵育20 s，72 ℃孵育6 s；最后在72 ℃维持7 min，得到扩增产物。扩增产物经纯化定量回收后，采用Illumina HiSeq 2500 (Illumina，美国)高通量测序平台进行测序分析。细菌高通量测序结果以97%的相似度划分为分类操作单元(OTU)，获得的OTU与细菌Silva分类学数据库比对，得到细菌群落组成信息。DNA提取和高通量测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成，高通量测序数据通过百迈客云计算平台进行处理和分析(
www.biocloud.net )。将细菌16S rRNA测序结果与Greengenes分类学数据库比对后形成的OTU文件(97%相似度)上传至PICRUSt在线分析网站(
http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/ )，运算形成按拷贝数标准化处理的OTU文件，进而依据网页内置程序进行PICRUSt宏基因组预测[14], 预测得到的KEGG分类数据(ko)通过与KEGG数据库进行比对，获得相关功能基因丰度。2. 结果和讨论
2.1 灰水管道内胶状生物膜的形貌结构
经过60 d的连续运行，小管径重力流灰水管道内壁形成了厚度相对均匀的淡黄色的胶状生物膜。生物膜的扫描电镜结果如图3所示。可以看出，脱水后的灰水管道生物膜呈粗糙的表面结构，生物膜中分布着大量的不同种类的细菌、真菌、原生动物和胞外聚合物(EPS)，灰水管道生物膜中的微生物以细菌为主，细菌种类多样，杆菌球菌密布，覆盖了整个生物膜表面。真菌数量相对较少，但仍广泛分布在灰水管道生物膜中。观察到的原生动物体表有六边形鳞片构成的外壳，从形貌特征上分析可能为网足属原生动物。原生动物的大量出现表明经过60 d的连续运行，灰水管道生物膜已经形成了复杂的微型生态系统，确认了此时生物膜已经成熟。
2.2 灰水管道胶状生物膜的细菌群落结构
通过对9个样品(每组管道各3个平行样品)的高通量测序，共获得443 338条有效序列，共划分为230个OTU。其中181个OTU为3个坡度共有(图4)，说明不同坡度下小管径重力流灰水管道生物膜细菌中绝大部分物种是共有的，坡度变化对于灰水管道生物膜中主要的细菌种类影响不大。根据香农指数曲线(图5)所示，随着取样序列数的增加，3个坡度下的平均Shannon指数逐渐趋于平缓，这说明本研究中的高通量测序深度满足进一步分析的要求，测序结果能够充分反映细菌的群落结构。
小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落结构如图6和图7所示。细菌主要以Proteobacteria (变形菌门) (57.76%±5.76%)、Actinobacteria (放线菌门) (38.46%±5.50%)、Bacteroidetes (拟杆菌门) (2.18%±0.73%)和Acidobacteria (酸杆菌门) (0.79%±0.25%)为主，其中以变形菌门和放线菌门为优势菌门。在15‰的坡度下，放线菌门的丰度显著减小，高流速条件下不利于生物膜上放线菌的生存。另外，生物膜中存在一定丰度的Nitrospirae (硝化螺旋菌门) (0.12%±0.01%)，这证明生物膜中存在硝化过程。Paenarthrobacte (38.35%±5.50%)、Ensifer (剑菌属) (17.11%±1.50%)和Spingopyxis (11.73%±4.32%)是生物膜中的优势细菌属。Paenarthrobacte是一种好氧生长的球形放线菌，可以利用多种碳源，并且可以水解淀粉类物质[15]。剑菌属是一种好氧生长的杆状变形菌，能够利用包括葡萄糖、半乳糖在内的多种碳源，不能水解淀粉，具有硝酸盐和亚硝酸盐还原能力，能够附着在其他细菌表面并使其裂解，是一种非专性捕食性细菌[16]。Spingopyxis是一种好氧生长的呈黄色外观的杆状变形菌，可以利用多种碳源，没有发酵功能，不能水解淀粉，部分种有硝酸盐还原能力[17]，它的存在解释了灰水管道生物膜淡黄色外观的成因。优势细菌属都能利用多种碳源，说明小管径重力流灰水管道生物膜对于多种有机物都有一定的生物降解能力。坡度对细菌优势属的相对丰度有显著的影响：5‰和10‰坡度下细菌丰度差异不明显，而15‰坡度下的细菌丰度与前2个坡度有显著差异。主要表现在15‰坡度下，Paenarthrobacte、Hydrogenophaga(噬氢菌属)和Haliangium丰度降低，而Ensifer (剑菌属)、Spingopyxis、Sphingobium (鞘脂菌属)和Pseudomonas (假单胞菌属) 丰度升高。
为深入分析管道坡度对细菌群落结构的影响，在属水平下进行LEfSe分析(图8)。图8只显示满足线性判别分析LDA值大于3.5的差异指示物种。LEfSe分析表明，在本研究中的3个管道坡度下，管道生物膜的细菌中共有24个差异指示物种，其中5‰坡度下含有10个，10‰坡度下含有5个，15‰坡度下含有9个，差异指示物种的丰度在相应的坡度下的丰度显著高于另外2个坡度的丰度。5‰坡度下的差异指示物种包括Rhodobacteraceae (红杆菌科)、Rhodobacterales (红杆菌目)、Flavihumibacter、Bacteroidetes (拟杆菌门)、Sphingobacteriaceae (鞘脂杆菌科)、Sphingobacteriia (鞘脂杆菌纲)、Flavobacteriales、Chitinophagaceae、Sphingobacteriales (鞘脂杆菌目)、Flavobacteriia。10‰坡度下的差异指示物种包括Actinobacteria (放线菌门)、Paenarthrobacter、Micrococcales (微球菌目)、Micrococcaceae (微球菌科)、Actinobacteria (放线菌门)。15‰坡度下的差异指示物种包括Alphaproteobacteria (α变形菌纲)、Proteobacteria (变形菌门)、Terrimonas、Thiotrichaceae (硫发菌科)、Thiotrichales (硫发菌目)、Blastomonas (芽单胞菌属)、Beggiatoa (贝日阿托菌属)、Obscuribacterales、Desulfurellales (硫还原菌目)。5‰、10‰、15‰ 3个坡度下差异贡献最大的指示物种分别是Rhodobacteraceae (红杆菌科)、Actinobacteria (放线菌门)和Alphaproteobacteria (α变形菌纲)。管道敷设坡度的变化可显著影响小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落结构。
2.3 氮循环和硫循环功能细菌分布特征
排水管道生物膜中的功能细菌主要由氮循环细菌和硫循环细菌组成，一般可以将其分为反硝化细菌、亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫酸盐还原细菌和硫氧化细菌5类[18-20]。本研究利用基于通用引物的高通量测序技术，研究了小管径重力流灰水管道生物膜中功能细菌(属水平)的分布特征(表3)。在本研究中，灰水管道生物膜中存在大量的以Pseudomonas (假单胞菌属) (2.78%±0.56%)和Rhodobacter (红杆菌属) (2.05%±0.94%)为主体的含有反硝化细菌的属，其中，假单胞菌属下的部分种属于好氧反硝化细菌[21]，含有反硝化细菌的属总丰度随着管道坡度的增大而逐渐降低。Nitrospira (硝化螺菌属) (0.13%±0.01%)是本研究中唯一检出的一种硝酸细菌属，以Acidiphilium (嗜酸菌属) (0.04%±0.02%)为主要代表的硫氧化菌属也有检出。在0.01%的检出限下，没有检出属水平的亚硝酸细菌和硫酸盐还原细菌。在排水系统中，亚硝酸细菌的丰度比硝酸细菌的丰度大约低一个数量级[22]，而本研究中灰水管道生物膜的硝酸细菌丰度仅为0.1%左右，因此，亚硝酸细菌在基于通用引物的高通量测序中难以检出。
表 3 灰水管道生物膜功能细菌相对丰度(属水平)Table 3. Relative abundance of functional bacteria in gray water sewer biofilms at genus level功能菌 属名 相对丰度/% 坡度5‰ 坡度10‰ 坡度15‰ 含有反硝化细菌的属 Rhodobacter 2.745 2.423 0.986 Pseudomonas 2.121 1.990 3.024 Paracoccus 0.735 0.681 0.273 Aeromonas 0.491 0.594 0.828 Xanthomonas 0.296 0.258 0.139 Acinetobacter 0.262 0.214 0.277 Microbacterium 0.093 0.065 0.058 Vibrio 0.086 0.081 0.130 Bacillus 0.081 0.083 0.082 Rhizobium 0.064 0.065 0.171 Comamonas 0.045 0.044 0.028 Erythrobacter 0.019 0.022 0.050 硝酸细菌 Nitrospira 0.126 0.132 0.118 硫氧化细菌 Acidiphilium 0.059 0.049 0.017 Sphingomonas 0.004 0.006 0.011 Beggiatoa 0.001 0.008 0.029 | Show TableDownLoad:
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在本研究中，基于通用引物未能检出硫酸盐还原菌，说明硫酸盐还原菌在管道生物膜内丰度很低，这可能是由于2个原因：其一，灰水中不含人类粪便，生活污水中的硫酸盐还原菌主要源自人类粪便[23]，本研究采用的灰水引入的硫酸盐还原菌数量较少；其二，在硫酸盐还原菌适宜生长在厌氧环境中，而本研究是好氧管道系统，环境条件不利于硫酸盐还原菌的生长。小管径重力流灰水管道生物膜中存在大量的反硝化菌和一定量的硝化细菌，而在生物膜中的硫酸盐还原菌没有达到检出水平，表明小管径重力流灰水管道具有一定的生物脱氮功能并且H2S积累的风险很低。输送生活污水的小管径重力流管道普遍存在的H2S积累问题，在小管径重力流灰水管道中可以忽略，这一现象有利于小管径灰水管道的安全应用和大范围推广。
2.4 氮循环功能基因分布特征
基于2.3节中功能细菌的分析结果，小管径重力流灰水管道生物膜中S循环过程(特别是H2S产生过程)基本可以忽略，而反硝化菌广泛存在于自然界中，其属水平的分类尚不完全，并且已确认的反硝化菌属中并非所有的菌种都具备反硝化功能[24]，须从功能基因的角度进行深入分析，因此，本章节探讨氮循环功能基因在不同坡度管道下的分布特征。硝化功能基因的PICRUSt预测丰度如图9所示。由于灰水管道生物膜中基本不含亚硝化细菌，因此，氨单加氧酶基因amoABC以及羟胺氧化酶基因hao基本没有预测丰度，而灰水管道生物膜中一定丰度的硝化细菌携带的亚硝酸盐氧化酶基因nxrA和nxrB预测丰度很高，这明确了灰水管道生物膜中硝化作用的存在。随着管道坡度的增大，亚硝酸盐氧化酶基因nxrA和nxrB的丰度均显著增大，管道生物膜的硝化作用增强，说明大坡度的管道有利于灰水氨氮的去除。反硝化功能基因的PICRUSt预测丰度如图10所示。硝酸盐还原酶基因narGHI和napAB、亚硝酸盐还原酶基因nirK、一氧化氮还原酶基因norBC以及氧化亚氮还原酶基因nosZ在生物膜中均能大量预测到，这说明虽然本研究的灰水管道处于好氧运行状态，但其管道生物膜上仍然可以发生完整的反硝化过程。另外，nosZ的丰度显著小于其他反硝化基因，说明在灰水管道生物膜上发生的反硝化过程主要的终产物是N2O，这与好氧反硝化的终产物相吻合，同时结合管道的好氧状态，可以确定小管径灰水管道生物膜主要发生好氧反硝化过程。在15‰坡度下，灰水管道生物膜的反硝化功能基因总数显著高于另外2个坡度，表明大坡度的管道敷设方案可以加强灰水在管道内的反硝化过程，有利于灰水的生物脱氮过程。综合硝化功能基因和反硝化功能基因的预测结果，采用大坡度(15‰)的灰水管道敷设方案有利于促进灰水在管道输送过程中的生物脱氮作用。根据农村地区的污水管网敷设工程经验，15‰的管道敷设坡度在很多农村地区都具有实际应用的可行性，因此，对于小管径重力流灰水管道，在地质条件和经济条件允许的情况下，应尽量采用大坡度(15‰)的管道敷设方案。
3. 结论
1)小管径重力流灰水管道生物膜中存在大量的细菌、真菌乃至原生动物。其中细菌主要以Proteobacteria (变形菌门)、Actinobacteria (放线菌门)和Bacteroidetes (拟杆菌门)为主，优势菌属为Paenarthrobacte、Ensifer (剑菌属)和Spingopyxis。管道坡度的变化会显著影响灰水管道生物膜细菌群落组成。
2)管道功能菌主要以反硝化细菌、硝酸细菌和硫氧化细菌为主。基于通用引物的Illumina HiSeq高通量测序没有检出属水平的亚硝酸细菌和硫酸盐还原细菌。小管径重力流灰水管道具有生物脱氮潜力，H2S积累风险低，有利于其推广应用。
3)灰水管道生物膜中具有完整的反硝化过程功能基因，反硝化过程以好氧过程为主。亚硝化过程功能基因缺失，硝化过程功能基因丰富。大坡度(15‰)的灰水管道敷设方案可以提高氮循环相关功能基因丰度，有利于促进灰水在管道输送过程中的生物脱氮作用，在条件允许的地区，应优先采用大坡度(15‰)的灰水管道设计方案。
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图 1 不同处理堆肥过程中温度的变化
Figure 1. Changes in temperature during composting in different treatments
图 2 不同处理堆肥过程中pH和EC值的变化
Figure 2. Changes in pH and EC during composting in different treatments
图 3 不同处理堆肥过程中总有机质、全氮和C/N的变化
Figure 3. Changes in organic matter、Total nitrogen and C/N during composting in different treatments
图 4 不同处理堆肥HA、FA和HA/FA的变化
Figure 4. Changes of HA, FA and HA/FA during composting in different treatments
图 5 不同处理堆肥GI值的变化
Figure 5. Changes of seed germination index during composting in different treatments
图 6 不同处理堆肥纤维素、半纤维素和木质素的质量分数变化
Figure 6. Changes in relative contents of cellulose, hemicellulose and lignin in compost with different treatments
表 1 堆肥原料特征参数
Table 1. Characteristic parameters of composting raw material
% 供试材料 总有机质 全氮 半纤维素 纤维素 木质素 沉水植物 84.62 1.33 15.8 29.2 8.9 干鸡粪 63.11 3.62 — — — 堆肥物料 76.36 2.69 7.62 15.9 4.88 注：堆肥物料为沉水植物（金鱼藻∶马来眼子菜=1∶1）与干鸡粪按一定比例混合。
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表 2 实验因素水平表
Table 2. Standard table of experimental
处理组别 湿地底泥/% 生物炭/% 菌剂类型 CK-C 0 0 复合微生物菌剂 S-C 10 0 复合微生物菌剂 B-C 0 2 复合微生物菌剂 SB-C 10 2 复合微生物菌剂 CK-H 0 0 自制微生物菌剂 S-H 10 0 自制微生物菌剂 B-H 0 2 自制微生物菌剂 SB-H 10 2 自制微生物菌剂 注：CK为对照组，S代表湿地底泥，B代表生物炭，SB代表湿地底泥+生物炭，C代表复合微生物菌剂，H代表自制微生物菌剂。
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