-
我国现有近5 000座市政污水处理厂,年处理污水总量超6×1010 m3。市政污水经活性污泥法处理后,其中约1/3的有机污染物可被完全氧化成二氧化碳(CO2)。而其余大部分污水有机物则经由活性污泥代谢后被转化为微生物生物质(按污水处理量及COD折算约合污染物近1×107 t),成为市政污水处理厂产量最大的副产物——剩余污泥的主要干物质成分。剩余污泥中的有机物是生产能源、燃料和高附加值化学品的潜在原料,可被资源化利用[1-2],故不宜简单地归类于亟需处理或处置的“有害废物”。
厌氧消化(anaerobic digestion, AD)被认为是实现剩余污泥资源化的主流技术之一[2]。然而,受限于停留时间长、沼气产率低、资源化产品单一等因素,该技术的资源回收效率与资源化产品经济价值等有待进一步提升[3]。近年来,羧酸平台引起了国内外研究者的广泛关注,其“构筑模块”为短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs, C1~C5)。SCFAs可进一步转化为多种高附加值化学品,包括酯类、生物塑料(聚羟基脂肪酸酯)、单细胞蛋白以及中链脂肪酸(medium-chain fatty acids, MCFAs)[2]。SCFAs是污泥厌氧消化的中间产物。经过水解和发酵过程,污泥中的有机物(蛋白质、多糖、脂类)被代谢转化生成SCFAs,转化率可达约70%[2, 4]。相较于传统AD产甲烷过程,污泥的厌氧发酵产SCFAs过程的停留时间、稳定性及发酵产品产率等条件均更具优势。
MCFAs是指碳原子个数为6~12的饱和脂肪酸,包括己酸(C6)、庚酸(C7)、辛酸(C8)等,在精细化工中被广泛用于制作香料、医药、化妆品及增塑剂、橡胶等化工产品。MCFAs的水溶性较弱,如己酸和辛酸在常温常压条件下的水溶解度仅为10.82 g∙L−1和0.68 g∙L−1,易于从发酵液中分离回收。碳链延长(chain elongation, CE)是微生物合成MCFAs的重要代谢途径。该过程以SCFAs为电子受体、乙醇或乳酸为电子供体进行逆向β-氧化(reverse β-oxidation,RBO)[5]。近年来,利用SCFAs产MCFAs的研究已由早期的纯培养(pure culture)体系(以人工培养基为底物接种科氏梭菌Clostridium kluyveri)向开放式培养(open culture)体系(以未经灭菌的实际有机废水或有机废弃物为底物培养混合微生物菌种)稳步推进。AGLER等[6]将发酵液pH稳定控制在5.5,利用玉米生物乙醇发酵液(富含乙醇、葡萄糖、酵母菌细胞及少量残留玉米粒生物质)产SCFAs同时进行碳链延长,并在发酵反应器下游设置在线液液萃取体系同步连续回收发酵液中的己酸,产率达到2 g∙(L∙d)−1。以此为基础,GE等[7]在550 d的连续培养过程中将己酸产率继续提高至3.4 g∙(L∙d)−1。KUCEK等[8]利用葡萄酒粗酒泥(乙醇质量分数为40%)产MCFAs,在优化条件下(pH为5.2,以COD计的有机负荷率5.8 g∙(L∙d)−1),己酸和辛酸的总产率为3.9 g∙(L∙d)−1。除了酿酒工业产生的有机废物,合成气发酵液、餐厨垃圾、乳清废水等也被报道用作产MCFAs的原料[9-13]。综上所述,目前微生物CE技术产MCFAs的主要原料均为具有高COD且易生物降解的有机废水或废弃物,而利用市政污水处理厂剩余污泥产MCFAs的系统研究仍需深入开展。
相较于酿酒废水或餐厨垃圾,污泥的惰性组分含量较高,且经由AD过程产MCFAs的产率极低。影响污泥产MCFAs的因素包括:1)污泥水解(限速步骤)进程缓慢;2)污泥厌氧发酵累积SCFAs过程中自发产甲烷导致碳转化效率降低;3)CE微生物组驯化期较为漫长。
本研究以酿酒废水厌氧塔颗粒污泥为接种物,采用混合SCFAs为电子受体、乙醇为电子供体,通过优化水力停留时间(HRT)与醇酸比进行微生物驯化以获得在代谢功能上占主导优势的CE微生物组。同时,采用碱性热水解预处理技术促进污泥破解,进而加速水解效率、提高SCFAs产率,完成从人工配制培养基溶液到真实污泥发酵液的底物转变,以“两相发酵”工艺实现污泥产MCFAs,并基于微生物多样性和宏基因组分析进一步揭示了过程中的微生态机制,以期为污泥有机质转化高附加值化学品的策略构建提供参考。
-
微生物合成MCFAs厌氧发酵的接种污泥取自河南省三门峡市渑池县白酒厂废水厌氧处理塔,污泥初始pH为7.2,挥发性悬浮物质量分数(VSS)为0.9%。在驯化期(实验设置条件见1.2节)所使用的人工培养基组分包括:乙酸钠(醇酸比为2∶1与3∶1条件下其质量浓度分别为8.20 g∙L−1与6.15 g∙L−1)、乙醇(醇酸比为2∶1与3∶1条件下其质量浓度分别为15.3 mL∙L−1与17.3 mL∙L−1)、磷酸二氢铵3.60 g∙L−1、六水氯化镁0.15 g∙L−1、七水硫酸镁0.20 g∙L−1、氯化钾0.15 g∙L−1、二水氯化钙0.20 g∙L−1、微量元素溶液1 mL∙L−1。微量元素溶液的配方为(每升溶液):四水氯化亚铁1.50 g、氯化锌70 mg、四水氯化锰100 mg、硼酸6 mg、六水氯化钴190 mg、二水氯化铜2 mg、六水氯化镍24 mg、二水钼酸钠36 mg,以及25%稀盐酸10 mL。
用于产SCFAs的剩余污泥取自上海市闵行区水质净化厂二沉池,经过离心浓缩后(在转速为4 000 r·min−1条件下离心旋转5 min),再利用泥水分离后的上清液将污泥总固体含量调至约3%。调整后的污泥基本理化性质如表1所示。
-
CE反应器为5 L连续搅拌反应器(continuous stirred-tank reactor,CSTR)。实验中的反应体系的体积为3 L,接种比例为20% (体积分数),温度、搅拌速率和pH分别为30 °C、200 r·min−1和6.2。反应器运行采用连续模式发酵,连续运行135 d,共分为5个运行周期(见表2)。其中,Phase Ⅰ~Ⅳ为驯化期,底物为人工配制培养基;Phase Ⅴ为实验期,底物为污泥厌氧发酵上清液。反应器运行期间,每24 h取5 mL样品测定发酵液中的底物(乙醇、乙酸)及产物(丁酸、己酸和辛酸)浓度。
污泥厌氧发酵液的制备过程分为预处理和厌氧发酵2个阶段。
1)预处理阶段:将污泥的pH用NaOH溶液(OH−物质的量为2 mol·L−1)调至11.0,水浴加热至90 ℃后持续进行热碱处理2 h,待冷却降温至37 ℃后,用HCl溶液(H+物质的量为2 mol·L−1)将pH调至7.0。
2)厌氧发酵阶段:采用全自动厌氧消化测试仪器(MultiTalent203,碧普华瑞)进行发酵,反应器为2 L培养瓶,单个反应器工作体积为1.8 L,每组可同时运行6台反应器;厌氧接种比为5:1(以TS计),接种物取自本实验室稳定连续运行超过1 a的污泥中温厌氧消化反应罐;在发酵实验开始前通入高纯氩气5 min以吹脱溶氧,并添加50 mmol·L−1的2-溴乙烷磺酸钠(BES)用于抑制产甲烷古菌的代谢活性;发酵控制条件为温度(37 ± 1)℃、搅拌速率120 r·min−1、发酵时间5 d;最后将发酵液进行泥水分离(4 000 r·min−1高速离心5 min),保留上清液进行高温灭菌(121℃,15 min)后,置于4 ℃下冷藏保存待用;使用前添加适量乙醇将醇酸比调至3∶1,保存时间不超过2 d。
-
剩余污泥pH使用FE28标准pH计(Mettler-Toledo,瑞士)测定;其余理化指标(包括TS、VS、COD、TKN、TAN),采用国标法测定。污泥厌氧发酵液经离心15 min (转速离心力为12 000g)后,取上清液过膜(滤膜孔径0.45 μm),分析其SCOD、多糖、蛋白质和SCFAs浓度等。多糖和蛋白质分别采用蒽酮-硫酸比色法(以葡萄糖为标准物质)和考马斯亮蓝法(以牛血清蛋白为标准物质)[14-15]测定。SCFAs(乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸)的组分和浓度采用气相色谱法测定,即在对其酸化预处理后(添加适量3%磷酸溶液将样品pH降至4.0以下),使用装配有火焰离子化检测仪(FID)和DB-FFAP型毛细管柱的GC-7890B气相色谱(安捷伦,美国)进行定量分析。微生物连续发酵产MCFAs实验中的底物(乙醇、SCFAs)与产物(丁酸、己酸、辛酸)浓度的定量分析方法与SCFAs相同。
-
在运行周期Phase II~V(分别为反应进行50、90、120和133 d)各取发酵液2 mL,在14 000 r·min−1转速下离心旋转5 min,撇除上清液后获得微生物混菌样品置于−80 °C下冷冻保存,直至进行微生物种群多样性分析。分析内容:1)使用E.Z.N.A. Soil DNA试剂盒(Omega Bio-Tek,美国)抽提DNA,DNA浓度、纯度和完整性分别使用TBS-380、NanoDrop2000和1%琼脂凝胶电泳进行检测;2)采用338F/806R和524F/958R引物对分别进行细菌区V3~V4片段和古菌区V4~V5片段的16S rRNA扩增;3)桥式PCR扩增步骤见参考文献[16];4)高通量测序采用Illumina MiSeq PE300平台,优化原始数列后,按97%相似度进行OTU聚类,并采用RDP Classifier贝叶斯算法(Silva数据库,70%置信度)进行OTU聚类分析。
-
宏基因组分析可探究污泥厌氧发酵液作为底物合成MCFAs对微生物CE代谢过程的影响。分别提取实验周期Phase IV和Phase V的发酵液,进行DNA抽提和质量分析,方法与微生物种群多样性分析相同。DNA片段化使用Covaris M220超声破碎仪,数据质控后cleaned reads使用MegaHit(http://github.com/voutcn/megahit)进行组装拼接(contig),仅保留片段长度大于300 bp的拼接序列进入后续拼接。在基因预测阶段,使用MetaGene软件(http://metagene.cb.k.u-tokoyo.ac.jp)进行开放式阅读框(ORFs)预测,长度大于100 bp的ORF被翻译为氨基酸序列。使用CD-HIT软件(http://www.bioinformatics.org/cd-hit)对预测出的基因组进行聚类分析(95%序列一致性,90%覆盖度),选出每个聚类中最长序列作为代表性序列建立非冗余基因集,使用SOAPaligner(http://soap.genomics.org.cn)计算样品的基因丰度。最后,使用BLASTP (v 2.2.28+, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),参考NCBI_NR数据库和KEGG数据库对比该非冗余基因集序列,分别进行分类注释和功能注释。
-
调控反应器的HRT是最常见的驯化微生物菌群以产MCFAs策略之一。如图1所示,在整个驯化期间(0~90 d),丁酸、己酸和辛酸是主要的微生物CE合成产物。在实验启动期(Phase I),3种羧酸的产率均很低,至10~20 d后呈现缓慢增长趋势。在启动期结束时(20 d),丁酸、己酸和辛酸的产率已分别达到65、133和82 mg∙(L∙d)−1。进入Phase II(HRT=10 d),即反应进行至21~35 d,丁酸和辛酸的产率基本维持不变,而己酸的产率出现小幅下降;在35~40 d,丁酸和己酸的产率均迅速增长,其最高产率分别为766和756 mg∙(L∙d)−1,而辛酸产率相较于Phase I发生明显增长。在40~50 d,己酸产率保持在500~750 mg∙(L∙d)−1,但丁酸产率逐步降低至200 mg∙(L∙d)−1,而辛酸产率则上升至265 mg∙(L∙d)−1。CE代谢过程中碳链逐级延长的现象表明“丁酸+乙醇”合成己酸与“己酸+乙醇”合成辛酸的动力学变化决定了己酸产率的动态变化。当HRT由10 d缩短至5 d后,在51~60 d,丁酸和己酸的产率继续保持稳定,辛酸产率则持续下降,表明CE微生物代谢效率并未随着体系OLR增加而上升。而在60~70 d,丁酸产率由468 mg∙(L∙d)−1急剧上升至1 413 mg∙(L∙d)−1,增幅达202%;另一方面,己酸产率则维持在500 mg∙(L∙d)−1左右,辛酸的产率则出现显著下降,最终降至25 mg∙(L∙d)−1。直至Phase III结束,丁酸、己酸与辛酸的相对占比基本维持在这一水平。
底物利用率反映了微生物进行CE代谢过程的碳转化效率。在Phase I,乙醇利用率达到90%以上,但乙酸利用率却急剧下降,最终仅保持在30%左右,其原因可能是由于乙醇在发酵细菌与产甲烷古菌的协同作用下被代谢转化为乙酸、CH4与CO2。当HRT缩短至10 d(Phase II),因其自身增殖速率过低,产甲烷古菌被逐渐洗脱,而由于存在能量壁垒,导致失去了“互养搭档(syntrophic partner)”的厌氧发酵细菌无法单独进行“乙醇→乙酸”的代谢过程(CH3CH2OH + H2O → CH3COO− + H+ +2H2,ΔG0 = 9.7 kJ∙mol−1)。这表明该周期乙醇与乙酸的利用率完全取决于CE微生物菌群的相对丰度与代谢活性,在Phase II的后半期(35~50 d)上升至近100%;而在Phase III阶段,其变化趋势也基本与同时期丁酸与MCFAs的产率一致,在CE微生物菌群逐渐稳定之后,乙醇和乙酸的利用率基本稳定在90%~100%。因此,导致这一时期(65~90 d)MCFAs产率明显低于丁酸的原因可能是醇酸比过低,乙醇被更多地用于进行乙酸CE反应生成丁酸,进而限制了己酸和辛酸的合成[17-18]。
当醇酸比调至3∶1后(Phase IV),初期(90~100 d)己酸与辛酸的产率相较于Phase III时无明显变化,而丁酸产率则开始逐渐降低;乙酸利用率仍接近100%,而乙醇利用率则下降至60%左右。上述结果表明,微生物未能立即利用富余乙醇作为电子供体进行CE反应,其原因可能是发酵液乙醇浓度骤升所引起的轻微胁迫效应[17]。在100~120 d,丁酸产率由1 074 mg∙(L∙d)−1降至528 mg∙(L∙d)−1,降幅为50.8%,而己酸产率则由701 mg∙(L∙d)−1增至1 402 mg∙(L∙d)−1,辛酸产率也由18.2 mg∙(L∙d)−1增至200 mg∙(L∙d)−1。在此期间,乙醇利用率稳步上升,并保持在88.1%~92.3%,表明乙醇经由逆向β-氧化代谢路径用于微生物CE过程生成MCFAs。有文献报道,当醇酸比为2∶1时,以科氏梭菌Clostridium kluyveri为优势菌的微生物菌群进行CE反应的主要产物为丁酸,将醇酸比提高至3∶1或4∶1,可促使丁酸进一步转化为己酸[7, 17, 19]。在逆向β-氧化过程中,乙醇既是电子供体提供还原当量NADH,也在被氧化时为代谢提供ATP,每5 mol参与CE反应的乙醇对应1 mol被氧化为乙酸的乙醇(5CxH2x-1O2− + 6CH3CH2OH → 5Cx+2H2x+3O2− + CH3COO− + H+ + 4H2O + 2H2),因此,较高的醇酸比使得乙醇更多参与丁酸的CE反应而非厌氧氧化,从而提高了己酸产率[7]。在本研究中,考虑到醇酸比为3∶1的条件下乙醇利用率始终未达到100%,故未进一步提高培养基中的醇酸比,以避免发酵液中乙醇浓度过高而产生底物胁迫效应[18]。WU等[20]发现,当醇酸比从3∶1增至5∶1时,尽管己酸产率在短期内有所提高,但发酵液中的残留乙醇会明显抑制CE微生物的代谢活性。
总烷基量(total alkyl groups, TAL)、平均碳链长度(average chain length, ACL)与CE过程碳效率(carbon conversion efficiency, CCE)是评价微生物产MCFAs的重要指标,其计算公式如式(1)~(3)所示。
式中:C丁酸为丁酸的浓度,mmol∙L−1;C己酸为己酸的浓度,mmol∙L−1;C辛酸为辛酸的浓度,mmol∙L−1;C乙醇为乙醇的浓度,mmol∙L−1;C乙酸为乙酸的浓度,mmol∙L−1。
因为MCFA的水溶性随着碳链长度增加而降低,所以TAL与ACL与发酵液中MCFAs的可分离性能呈线性相关。如表3所示,除启动期Phase Ⅰ之外,其余运行周期内MCFAs的可分离性较好,仅在Phase Ⅲ有所降低,其主要原因在于丁酸的大量生成,而己酸、辛酸的产量不足。CCE反映了乙醇与乙酸参与CE过程被转化为C4~C8羧酸的效率。由于在Phase Ⅰ阶段产甲烷古菌代谢活性较高,CCE仅为33.4%,但在Phase Ⅱ至Ⅳ期间骤增至62.1%~72.9%,表明CE代谢过程的碳利用效率较高。己酸选择性变化趋势与己酸产率保持一致,证明了提高醇酸比有利于CE微生物合成己酸。
-
如图2(a)所示,空白组(CK)与热碱预处理组(THALK)的剩余污泥厌氧发酵过程均在5 d后达到稳定。发酵液SCFAs的最终质量浓度(以COD计)分别为(4 240±157) mg∙L−1与(7 000±240) mg∙L−1。这表明热碱预处理对污泥絮体的破壁溶胞作用释放SCOD可明显提升SCFAs产率。对上清液成分进行分析后可知,CK组与THALK组污泥发酵液的SCFAs成分结构类似,主要为乙酸,分别占总SCFAs的51.0%与56.2%,其余为丙酸、正丁酸和正戊酸(图2(b))。其中,碳原子个数为偶数的SCFAs(乙酸、丁酸)占比达到73.3%,表明污泥厌氧发酵液可作为底物合成MCFAs,特别是己酸和辛酸。
如图3所示,Phase Ⅴ阶段的运行条件(HRT=5 d,醇酸比为 3∶1)与Phase Ⅳ阶段保持一致,当底物由人工配制培养基溶液替换为污泥发酵液后,丁酸、己酸和辛酸的合成情况并未出现明显变化,其平均产率分别为534、1 380和141 mg∙(L∙d)−1。另外,乙醇与乙酸的转化利用情况也与Phase Ⅳ阶段时基本相同,利用率保持在92.4%~98.2%。Phase Ⅴ阶段的TAL、ACL和CCE和己酸选择性分别达到519.4 mmol∙L−1、6.47和63.3%,与Phase IV阶段基本持平。因此,尽管污泥发酵液中存在蛋白质(以COD计,质量浓度946.6 mg∙L−1)、多糖(以COD计,质量浓度1 566.6 mg∙L−1)及其他包括腐殖质在内的DOM(以COD计,质量浓度3 122.1 mg∙L−1)。然而,这些DOM并未影响CE微生物合成MCFAs的过程。由此可见,当反应器内微生物保持稳定的菌群多样性结构和代谢活性时,利用污泥发酵液产MCFAs是可行的。值得注意的是,尽管污泥厌氧发酵液中含有丙酸(C3)和正戊酸(C5),但奇数碳链MCFAs(如C5戊酸、C7庚酸等)产率极低,这与HAN等[21]的研究结果一致。产生以上现象的主要原因为如下2个机制。1) CE微生物的底物选择性:在长达90 d的驯化期间, CE微生物始终以乙酸(C2)作为电子受体,并且Phase V期污泥发酵液的SCFAs也是以偶数碳链羧酸为主要组分(乙酸56.2%,正丁酸17.1%),使得CE微生物更倾向于利用乙酸和丁酸为电子受体与乙醇生成偶数碳链的MCFAs。2)逆向β-氧化过程的能量代谢机制:在电子受体为奇数碳链羧酸(如C3丙酸)CE过程中,每5 mol乙酰辅酶A生成戊酸(C5)的同时,有1 mol乙酰辅酶A会被氧化成1 mol乙酸以用于合成ATP提供细胞代谢能量,从而使得乙酸会在下一轮CE过程中,与丙酸竞争电子供体(乙醇)以生成相应的碳链延长羧酸,故理论上奇数碳链MCFAs产物选择率仅为83.33%。已有研究表明,即使仅丙酸为电子供体,奇数碳链MCFAs(C5戊酸、C7庚酸)的产物选择率也仅为35%~66%[22-24]。
综上所述,在优化条件(醇酸比为3∶1、HRT=5 d)下,总含固率为3%的剩余污泥己酸和辛酸产率分别为1.38、0.14 kg∙(L∙d)−1,以我国市政污泥年产量5×107 t(含水率80%)进行估算,以污泥定向发酵产己酸和辛酸的年产量可分别达到46×104 t与4.7×104 t。
-
图4展示了反应器不同运行周期的微生物在属水平的菌群多样性结构。Phase II阶段的优势微生物包括甲烷杆菌Methanobacterium、木里菌Muribaculaceae及乳酸杆菌Lactobacillus,其相对丰度分别为13.3%、8.7%和8.2%。其中,Methanobacterium是氢营养型产甲烷古菌,与厌氧发酵细菌共生以克服热力学能量壁垒,将乙醇和VFAs降解代谢为甲烷。有文献报道,Methanobacterium与CE微生物菌群形成的底物竞争关系是导致反应器启动期间MCFAs产率较低的微生物机制[7, 25]。Phase Ⅲ阶段的微生物群落结构较Phase Ⅱ阶段改变明显,狭义梭菌Clostridium sensu stricto_12成为优势菌(相对丰度55.0%),其他优势菌属包括醋杆菌Acetobacter(9.9%)、理研菌科属Rikenellaceae RC9(8.9%)、鲁梅尔芽胞杆菌Rummeliibacillus(6.2%),而Methanobacterium几乎未被检测到(相对丰度<0.1%),故缩短HRT是消除产甲烷古菌底物竞争的有效策略。值得注意的是,根据美国国家生物技术信息中心NCBI数据库的BLAST比对结果分析,Clostridium sensu stricto_12的OTU序列与CE模式微生物Clostridium kluyveri的OTU序列相似度大于99%[5, 26-27],故优势菌Clostridium sensu stricto_12是发酵液中合成MCFAs的核心功能细菌。Phase IV阶段的微生物群落结构与Phase III阶段的相似,Clostridium sensu stricto_12的相对丰度进一步上升至64.9%,但Acetobacter的相对丰度降至2.5%,表明提高醇酸比有利于富集CE微生物Clostridium。由于Phase V阶段的底物为污泥发酵上清液,微生物菌群结构发生了明显变化,尽管此时Clostridium sensu stricto_12仍为优势菌之一,但其相对丰度已降至29.7%。其他相对丰度较高的微生物包括脱硫弧菌Desulfovibrio(15.6%)、伪假苍黄菌Pseudoclavibacter(7.5%)、芽孢杆菌Bacillus(7.8%)。这些微生物未被证明是CE微生物,但广泛存在于市政污水处理厂的活性污泥中,因此,引入污泥发酵液会不可避免地提高这些微生物DNA水平上的相对丰度。DE VRIEZE等[28]发现,相较于DNA水平上的总微生物群落(包括活性与非活性),RNA水平上的微生物群落结构(即活性微生物)能更准确反映厌氧生态体系的状况。微生物属水平的主成分分析(PCA)结果如图5所示,成分因子1(PC1)与成分因子2(PC2)对数据点差异性贡献率之和达到94.28%。从象限分布来看,Phase Ⅲ阶段和Phase Ⅳ阶段的微生物群落结构较为相似,与Phase Ⅱ及Phase Ⅴ阶段的群落结构差异明显。
-
宏基因组分析过程中,Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段的发酵液样品原始reads数分别为67 758 922 和69 750 096。经数据质控和拼接组装后,ORF的总长度为345 493 103 bp。2组样品在KEGG功能水平上共享代谢通路260个,共享率为97%(见图6(a))。这说明底物由人工培养基替换为污泥厌氧发酵液并未使得微生物种类和功能层面产生明显差异。Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段的微生物组主要参与氨基酸合成、ABC转运、碳代谢和双组分系统等代谢过程(见图6(b)),但这些代谢过程的基因丰度在这2个周期无明显差异,与Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段的稳态阶段具有几乎一致的底物利用率和MCFAs产率相吻合。尽管Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段的微生物结构有一定变化,但体系内相应的功能基因活性却保持稳定,这是前期驯化的结果。另外,丰富的氨基酸合成、ABC转运、碳代谢等代谢过程是微生物复杂新陈代谢的保证,这也从微观角度证实了驯化后的微生物在利用污泥发酵液为底物时仍能保持相当的活性。值得注意的是,双组分系统对微生物适应快速变化的外部环境有积极作用,能实现其调控蛋白和DNA、RNA的结合,最终实现对细胞基因表达的调控[29]。
表4展示了Phase IV和PhaseV阶段微生物组在CE过程代谢通路中关键酶的丰度,包括EC 1.1.1.100(3-氧酰基-[酰载体蛋白]还原酶)、EC 2.3.1.179(β-酮脂酰-[酰载体蛋白]合成酶Ⅱ)、EC 2.3.1.180(β-酮脂酰-[酰载体蛋白]合成酶Ⅲ)、EC 6.3.4.14(生物素羧化酶)及EC 6.4.1.2(乙酰辅酶A羧化酶)。关键酶丰度的变化证实了转化底物后微生物新陈代谢的变化,但从宏观角度而言,进入Phase V阶段后,MCFAs产率并没有随微生物代谢和转录出现波动。事实上,CE过程中发酵体系内多种微生物可能共同具备关键酶,很难将某种特定酶与特定微生物相对应。因此,只要具备转录翻译功能的微生物拥有足够活性,就能够促进合成MCFAs。
逆向β-氧化过程(reverse β-oxidation,RBO)和脂肪酸合成(fatty acid biosynthesis,FAB)是微生物混菌体系经CE过程合成MCFAs的主要代谢途径(见图7(a))[5, 21]。相较于FAB途径,RBO途径的步骤更少,且ATP净消耗量更小,故可认为RBO更加高效。本研究中RBO和FAB途径所涉及的关键酶均被检出。RBO途径关键酶的总丰度为65 980(Phase Ⅳ)和10 630(Phase Ⅴ),而FAB途径关键酶的总丰度则达到192 904(Phase IV)和202 588(Phase V)。FAB的总丰度高于RBO表明MCFAs可能更多地经由FAB途径合成,这与HAN等[21]的研究结果一致。相较于Phase Ⅳ,Phase Ⅴ的微生物组RBO途径中的TLA、KCR、HCD、ECR酶丰度分别增加了285.0%、814.6%、40.9%、78.9%,仅有TES酶丰度降低28.2%;FAB途径中的MAT、KAS、KAR和EAR酶丰度分别增加了7.6%、18.5%、23.8%和45.6%,而ACC的酶丰度则降低25.3%。上述结果表明,中间产物乙酰辅酶A的后续代谢可能有部分从FAB转入RBO途径(见图7(b))。综上所述,在其他发酵条件(HRT、醇酸比)相同的情况下,以乙醇为电子供体,使用富SCFAs污泥发酵液为电子受体比单独使用乙酸更有利于合成MCFAs。
-
1) 当HRT由20 d优化至5 d,醇酸比保持在2∶1时,发酵体系中Methanobacterium的丰度明显降低,而关键产MCFAs菌Clostridium sensu stricto_12丰度为优势菌种,最大丰度为64.89%。然而,此时体系内堆积大量丁酸,证明通过HRT调整可洗脱污泥内竞争性产甲烷菌,对体系内微生物起到良好的驯化作用,但醇酸比偏低会导致电子供体不足,不能使丁酸进一步延长为己酸。
2) 当HRT为5 d时,将醇酸比由2∶1提升至3∶1后,乙醇作为电子供体促使丁酸进一步转化为己酸,此时己酸产率达到1 400 mg·(L·d)−1。同时,体系内微生物群落结构变化并不明显,说明乙醇含量并未对微生物造成抑制。
3) 将底物由人工配制特定培养基转为热碱预处理污泥发酵液后,丁酸、己酸和辛酸的产率并未发生明显变化。尽管此时Clostridium sensu stricto_12丰度下降,但宏基因组学分析发现,体系内关键代谢通路RBO、FBA关键酶依旧保持较高丰度,说明体系具备一定的抗冲击能力,可连续高效生产MCFAs。
利用富乙酸剩余污泥厌氧发酵液产中链脂肪酸
Conversion of acetate-rich waste activated sludge anaerobic fermentation liquor into medium-chain fatty acids
-
摘要: 为实现剩余污泥的资源化利用,探索了混菌体系中以剩余污泥为底物连续产中链脂肪酸(MCFAs)的可行性。本研究基于乙醇/乙酸人工配制废水,采用热碱水解污泥-短期厌氧发酵-微生物碳链延长(CE)反应的“两相发酵”技术合成MCFAs,并逐步优化水力停留时间(HRT)与底物醇酸比以驯化厌氧污泥微生物。结果表明:在为期135 d的连续模式CE过程中,在醇酸比为2∶1的条件下,驯化期(Phase Ⅰ~Ⅲ)的HRT由20 d逐步缩减至5 d后,典型CE微生物Clostridium sensu stricto_12成为优势菌种,其相对丰度升至65.21%,但己酸产率仅为775 mg∙(L∙d)−1;当醇酸比提高至3∶1 (Phase Ⅳ),己酸产率升至1 402 mg∙(L∙d)−1,MCFAs产物选择性明显提高。将实验期(Phase Ⅴ)系统中的底物置换为污泥厌氧发酵液,己酸产率依然稳定保持在1 400 mg∙(L∙d)−1,表明功能微生物组的结构稳定。宏基因组分析结果显示,逆向β-氧化(RBO)和脂肪酸生物合成(FAB)代谢通路均参与了CE过程的MCFAs合成;另外,相较于乙醇/乙酸人工配制废水,污泥发酵液可提高这2种代谢通路的关键酶丰度。本研究证实了污泥连续发酵产MCFAs的可行性,并阐明了过程中微生物的生态功能机制,可为污泥资源化利用提供参考。Abstract: To determine the feasibility of producing medium-chain fatty acids (MCFAs) from waste activated sludge in mixed culture, this study firstly optimized bioreactor parameters, i.e. hydraulic retention time (HRT) and ethanol : acid ratio, to assimilate anaerobes and later adopted the “two-stage fermentation” strategy, in which alkaline pretreated sludge was subjected to short-term acidogenesis and microbial chain elongation The results showed that during the 135-day chain elongation (CE) over the long term, with ethanol∶acid ratio=2∶1, when HRT was shortened from 20 d to 5 d (Phase Ⅰ~Ⅲ), the CE functional microbe, Clostridium sensu stricto_12, evolved as the dominant genus (relative abundance 65.21%). However, the maximal productivity of n-caproate was merely 775 mg∙(L∙d)−1. Subsequently, with ethanol∶acid ratio increased to 3∶1 (Phase Ⅳ), the productivity of n-caproate boosted to 1 402 mg∙(L∙d)−1, demonstrating an increased product selectivity towards MCFAs. In PhaseⅤ (test phase), during which the substrate swamped from synthetic ethanol/acetate wastewater to sludge fermentation liquor (SFL), the n-caproate productivity maintained at 1 400 mg∙(L∙d)−1. Based on the metagenomics analysis, both reverse β-oxidation (RBO) and fatty acid biosynthesis (FAB) pathways were involved in microbial chain elongation for MCFAs production. Moreover, as compared to synthetic ethanol/acetate wastewater, SFL increased the relative abundance of some key functional enzymes for the RBO and FAB pathways. The present study provided the practical evidence for continuous production of MCFAs from waste activated sludge, and more importantly, it elucidated the microbial and ecological mechanisms. Taken together, it shed a light on the sludge-derived value-added chemicals for its valorization.
-
含氧多环芳烃(oxygenated polycyclic aromatic hydrocarbons,OPAHs)是指在多环芳烃(PAHs)的苯环上含有一个或多个羰基氧,或是含有羟基基团的一类化合物;它主要由化石或生物质燃料不完全燃烧产生,也可由环境中的多环芳烃因光氧化反应、化学氧化反应或生物转换等多种方式产生。由于其较为稳定难以降解,具有比亲代PAHs更强的毒性[1 − 2]和致突变性[3],有一部分含氧多环芳烃单体还被认为是直接的诱变剂和致癌物[4].目前国内外对于含氧多环芳烃的研究,主要集中于该类化合物的总量分析、源解析或者毒性分析等相关领域[5],各种研究文献对OPAHs的检测数据相对较少[1],故为能快速补充数据库毒性数据,采用定量结构-毒性关系(quantitative structure-toxicity relationship,QSTR)相关研究为简便而又高效的理论研究方法. 金玲敏等[6]对此进行了富有成效的尝试,利用计算得到多种描述符,建构了预测OPAHs对斑马鱼胚胎急性毒性的模型。但该法首先需要计算多种描述符,过程复杂,且创新稍有不足;其次预测的结果误差偏大,平均误差达到0.371. 为此本研究创新提出新的计算简单的结构参数,采用神经网络法建模,能提高预测准确度。该法对含氧多环芳烃急性毒性的QSTR研究未见有相关报道.
神经网络法是一种基于数据驱动的误差逆向传播算法,对复杂的非线性系统,具有很强的自适应和自学习能力[7],能模拟生命过程中的神经网络行为,对数据进行智能信息化处理,故该法在化学、环境、机械等众多学科中得到广泛应用[8 − 10]. 利用神经网络法进行QSTR研究[11],对环境污染物在环境中的危险性评价具有独特的作用. 在前期[12 − 13]研究工作的基础上,根据文献[6]所列32个含氧多环芳烃分子,分析这些OPAHs分子的结构与其对斑马鱼胚胎的毒性之间的相关关系,寻找毒性数据的大小与结构之间的内在规律,从而新定义了一种可表征原子电性结构与空间结构特性的原子特征值δi,并根据多环芳烃苯环上不同位置连接羟基时,毒性大小也不一样的变化特性,对基团原子特征值δi进行校正后,建构了一种新的定位键指数L. 利用建构的新指数,与利用软件计算并优化筛选的电性拓扑态指数、及电性距离矢量3类指数有机结合,建立了一种可用于预测含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎的急性毒性的神经网络模型,所得结果令人满意. 本研究工作成果对建立含氧多环芳烃的毒性数据库、对环境污染物的快速分析检测,具有重要的理论价值和实际意义.
1. 定位键指数的建构及数据计算(Construction of localization bond index and data calculation)
1.1 生物毒性数据来源
32个含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎的急性毒性,相关数据来源于文献[6],这里毒性值采用半数效应浓度EC50的对数lgEC50表示,将分子及其生物毒性实验值lgEC50列于表1.
表 1 含氧多环芳烃的分子结构参数及其毒性Table 1. Molecular structural parameters and the toxicity of oxygenated polycyclic aromatic hydrocarbons序号No. 含氧多环芳烃Oxygenated polycyclic aromatic hydrocarbons L E16 M14 M21 M32 lgEC50 实验值Exp. 预测值Pre. 误差Err. 1 氧杂蒽酮Xanthone 71.637 12.028 37.064 7.201 7.730 2.000 1.996 −0.004 2 1,2-苯并苊醌Aceanthrenequinone 83.638 24.113 32.946 9.077 12.462 1.950 2.114 0.164 3 1,2-二羟基蒽醌1,2-dihydroxyanthraquinone 97.699 24.375 21.206 16.522 17.428 2.270 2.381 0.111 4 4,5-亚菲基酮4,5-phenanthrylene ketone 71.712 12.192 33.992 6.508 9.100 1.480 1.480 0 5 9-芴酮9-fluorenone 59.783 11.888 35.483 6.792 7.631 2.400 2.060 −0.340 6 2,7-二羟基萘2,7-dihydroxynaphthalene 64.804 0 20.364 12.852 1.469 2.300 2.064 −0.236 7 1,6-二羟基萘1,6-dihydroxynaphthalene 63.834 0 22.492 12.015 2.858 1.780 2.065 0.285 8 2-羟基-9-芴酮2-hydroxy-9-fluorenone 72.992 11.929 26.253 12.353 8.584 1.500 1.499 −0.002 9 5,12-萘并萘醌5,12-naphthacenequinone 89.567 25.090 39.987 14.650 15.275 1.720 1.722 0.002 10 2,3-二羟基萘2,3-dihydroxynaphthalene 62.891 0 22.650 9.486 2.842 1.780 1.780 0 11 1,5-二羟基萘1,5-dihydroxynaphthalene 63.419 0 24.921 10.750 4.336 1.870 2.065 0.195 12 1,8-二羟基蒽醌1,8-dihydroxyanthraquinone 100.685 24.406 21.315 17.793 17.634 2.300 2.381 0.081 13 萘嵌苯酮Perinaphthenone 59.712 11.585 33.513 8.071 5.133 1.080 1.163 0.083 14 11h-苯并[a]芴-11-酮11h-benzo[a]fluorene-11-one 77.712 12.502 45.710 7.142 9.537 1.700 2.063 0.363 15 2-羟基蒽醌2-hydroxyanthraquinone 84.919 24.273 23.761 18.391 13.913 1.110 1.115 0.005 16 1,4-二羟基蒽醌1,4-dihydroxyanthraquinone 98.769 24.406 21.216 17.632 17.682 2.700 2.381 −0.320 17 菲醌Phenanthrene-quinone 71.710 23.659 34.082 10.699 9.284 0.301 0.280 −0.021 18 1,2-萘醌1,2-naphthoquinone 53.710 22.136 22.278 10.674 4.491 0.301 0.281 −0.020 19 1,4-苯醌1,4-benzoquinone 35.710 20.566 9.066 13.534 1.213 0 −0.004 −0.004 20 1,4-蒽醌1,4-anthraquinone 71.567 23.271 27.685 14.982 8.531 0.301 0.267 −0.034 21 9-羟基苯并[a]芘9-hydroxybenzo[a]pyrene 100.278 0 60.746 7.923 1.593 0.301 0.229 −0.072 22 1,4-萘二醌1,4-naphthoquinone 53.710 22.384 20.406 13.670 6.891 −1.000 −0.997 0.003 23 12-羟基苯并[a]芘12-hydroxybenzo[a]pyrene 101.609 0 49.077 6.428 4.073 1.980 2.065 0.085 24 1,3-二羟基萘1,3-dihydroxynaphthalene 62.320 0 22.257 11.226 2.934 2.300 2.065 −0.235 25 2,6-二羟基萘2,6-dihydroxynaphthalene 64.333 0 20.318 13.012 1.480 1.840 2.065 0.225 26 苊醌Acenaphthenequinone 65.710 23.055 23.440 8.462 9.740 1.650 1.502 −0.148 27 1-羟基-9-芴酮 1-hydroxy-9-fluorenone 72.492 11.949 29.331 10.239 10.408 1.740 1.743 0.003 28 苯并[c]菲[1,4]醌Benzo[c]phenanthrene-1,4-dione 89.567 24.221 40.254 15.517 11.054 1.150 1.151 0.001 29 7,12-苯并蒽醌Benz[a]anthracene-7,12-dione 89.638 25.260 42.633 14.230 16.262 0.845 0.807 −0.038 30 苯并蒽酮1,9-benz-10-anthrone 77.712 12.494 45.859 7.733 8.894 2.360 2.046 −0.314 31 芘-4,5-二酮Pyrene-4,5-dione 83.638 24.186 32.708 10.279 11.516 0.301 0.483 0.182 32 1,4-菲醌Phenanthrene-1,4-dione 71.638 23.442 30.193 14.625 9.422 0.176 0.176 0 1.2 定位键指数L的建构
分子的结构决定分子的性质,分子中的原子不同、基团不同、连接位置不同、原子或基团受环境影响不同,均会影响分子的物理化学性质. 通过考察文献[6]中32个含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎的急性毒性与分子结构之间的关系,定义了一种新的可以应用于表征含氧多环芳烃OPAHs分子的原子特征值(δi)为:
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) 式(1)中,mi、hi、χi分别为非氢原子i的价电子数、直接连接的氢原子个数、鲍林电负性值,χc为碳原子的鲍林电负性. 由于含氧多环芳烃中,连接在苯环上不同位置的基团,对含氧多环芳烃的毒性大小影响也不同,为此对含氧多环芳烃苯环上不同位置基团的特征值进行了校正:
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2) 式(2)中,Ji为基团连接在苯环上所在位置数. 如1,2-二羟基蒽醌分子,1位羟基氧原子的δi´值为34.274、2位羟基氧原子δi´值为37.701. 在分子拓扑理论基础上,建构一种新的指数L:
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (3) 式(3)中的Σ表示每一个化学键对分子的贡献. 由于该指数是在校正了基团非氢原子在苯环上所连接的位置后,综合每个化学键对分子的贡献值,故将该指数命名为定位键指数. 根据公式(3)计算得到含氧多环芳烃的定位键指数值L列于表1中.
1.3 其它参数的计算
对于化合物对生物的毒性,很难只用一种指数反映其变化规律,故常需要2种甚至2种以上的指数进行有机结合,才能建立指数与化合物对生物毒性之间良好的相关关系。考察文献[6]中含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎毒性大小与分子结构的关系,用Chemoffice3D绘图软件勾画了OPAHs分子的分子结构。利用MATLAB应用软件自编的程序[14 − 15],计算了32个OPAHs分子的电性拓扑状态指数Em和电性距离矢量Mn。通过回归分析优化筛选了电性拓扑状态指数的E16、电性距离矢量的M14、M21、M32共4个结构参数,与定位键指数L结合,与含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎的急性毒性lgEC50的相关性最优. 描述符L表征的是对应于分子拓扑图中每一边(化学键)的本征值、电性拓扑状态指数E16表征的是非氢原子=O的本征值,电性距离矢量的M14表征的是第二类碳原子(—C—)之间的相互作用、M21表征的是第二类碳原子与羰基氧原子(=O)的相互作用、M32则表征的是第三类碳原子与第九类氧原子(—O)相互作用. 正是使用了3类不同的描述符结合,故本研究可对不同的类型化合物进行建立模型;由于毒性机制增加了系统的空间异质性和复杂性,而这里选择的几类参数蕴含了化合物的电性和空间结构信息,故参数与急性毒性之间能建立良好的相关关系;经过对定位键指数(主要是原子特征值)稍进行修正,发现将其应用于芳烃、农药分子的急性毒性研究,也能取得较好的结果. 将优化筛选的E16、M14、M21、M32等数据也列于表1.
2. 模型建构(model construction)
2.1 最优变量子集回归分析和多元回归模型
将计算得到的32个含氧多环芳烃的定位键指数L、电性拓扑状态指数Em、电性距离矢量Mn等3类指数,与其对斑马鱼胚胎的急性毒性lgEC50(µmol·L−1),用MINITAB数据分析统计软件的最佳子集回归方法进行相关关系的分析,所得结果见表2.
表 2 lgEC50与参数的最佳变量子集回归结果Table 2. Results of parameters and lgEC50 with best subsets regression序号No 变量子集Subset of variables b r Radj2 R2 F S FIT 1 E16 1 0.3502 0.0934 0.1226 4.192 0.8499 0.1270 2 L,E16 2 0.5244 0.2250 0.2750 5.500 0.7858 0.3056 3 L,E16,M32 3 0.7907 0.5850 0.6252 15.567 0.5750 1.1392 4 E16,M15,M21,M32 4 0.8050 0.5959 0.6480 12.427 0.5674 1.0355 5 L,E16,M14,M21,M32 5 0.8273 0.6238 0.6845 11.280 0.5475 0.9896 6 L,E16,M14,M15,M21,M32 6 0.8274 0.6089 0.6846 9.043 0.5582 0.7980 注:表2中b表示变量数;r表示相关系数;Radj2表示调整的判定系数;R2表示决定系数;F表示Fischer检验值;S表示估计标准误差;FIT表示Kubinyi函数. stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (4) 式(4)中,n为总的分子样本数,b为所建模型的变量个数,R2为相应模型的决定系数,根据该式计算得到的各模型的FIT值列于表2。一般FIT值越大,所建模型稳定性越好,预测能力也越强.
从表2可以看出,综合考虑相关系数、标准误差和FIT值的大小,模型(5)最好,即当使用定位键指数L、电性拓扑状态指数的E16、电性距离矢量的M14、M21、M32共5个参数时,其与含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎的急性毒性有最佳的相关关系,建立的多元回归方程为:
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (5) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) 根据该多元回归模型预测得到的急性毒性lgEC50,与文献列出实验值的平均绝对误差为0.395,误差相对较大,而且方程的相关系数为0.8273,对于预测毒性数据能基本达到要求,但预测结果并不理想.
2.2 预测模型的稳定性、预测能力、离域性检验
为对含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎急性毒性的预测进一步做神经网络研究,先对式(5)的稳定性、预测能力及是否有离域值进行检验. 采用公认的逐一剔除法进行检验,即每次剔除1个含氧多环芳烃分子,用剩余31个含氧多环芳烃分子回归,可建立32个方程,获得32个检验的相关系数(相关数据见表3),所有这些相关系数的平均值为r=0.8285,该值与式(5)的相关系数较为接近,说明预测生物毒性模型(5)的稳定性较好;再使用MINITAB数据预测分析统计软件,对多元线性回归预测毒性的模型(5),采用留一法进行交互检验,得到模型(5)交叉验证相关系数R2CV=0.5050,当R2CV大于0.5时,说明稳健性较好[17];再求R2adj(0.6238)与R2CV(0.5050)的差值,得到0.1188,两者差值小于0.3,一般认为当这两种相关系数的差值<0.3时,说明模型没有过拟合,不存在离域异常值,所以这里构建的多元回归预测模型有较好的稳定性,有一定的预测能力.
表 3 检验的相关系数Table 3. Inspection of correlation coefficient r剔除分子Remove molecule 相关系数Correlation coefficient 剔除分子Remove molecule 相关系数Correlation coefficient 剔除分子Remove molecule 相关系数Correlation coefficient 剔除分子Remove molecule 相关系数Correlation coefficient 剔除分子Remove molecule 相关系数 Correlation coefficient 1 0.8276 8 0.8293 15 0.8273 22 0.8328 29 0.8335 2 0.8317 9 0.8338 16 0.8181 23 0.8245 30 0.8407 3 0.8211 10 0.8296 17 0.8195 24 0.8231 31 0.8401 4 0.8384 11 0.8296 18 0.8194 25 0.8271 32 0.8164 5 0.8362 12 0.8205 19 0.8162 26 0.8307 6 0.8339 13 0.8266 20 0.8173 27 0.8332 7 0.8266 14 0.8266 21 0.8338 28 0.8468 2.3 神经网络预测模型的构建
为了提高对含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎急性毒性预测结果的准确度,在多元回归模型式(5)的基础上,进一步采用在众多领域得到广泛应用的神经网络方法进行研究[18]. 神经网络隐含层数,按照Andrea[19]和许禄[20]规则综合后计算得到,计算公式为:
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (6) 式(6)中,n为样本总数,b为模型所取的变量数,H为神经网络三层结构中的隐含层数. 根据式(6)计算,H可取值2或3,经分别计算测试,发现H取3时,建立的神经网络预测模型相关系数最优. 故神经网络采用5-3-1的网络结构方式,并将32个含氧多环芳烃分子分为3个子集:训练集、测试集和验证集,以每5个分子作为一组,共分6组,具体分组分子见表4. 由于第六组只有1和2两个分子,故分别进入训练集和测试集. 神经网络模型的构成、总相关系数和各子集的相关系数见表4.
表 4 神经网络模型的构成及结果Table 4. Composition and Results of the neural network model神经网络模型Neural network model 总Total 训练集Training set 测试集Test set 验证集Validation set 网络结构Network structure 5-3-1 — — — — 每组分子Each group molecules — — 第2,4,5个 第1个 第3个 相关系数Correlation coefficient — 0.9826 0.9828 0.9812 0.9987 从表4可以看出,总相关系数RT的值达到0.9826,3个子集的相关系数与总相关系数之间,较为接近. 而且对于预测毒性的模型来说,相关系数能达到0.98以上,说明构建的模型比较理想,该模型的权重和偏置见表5.
表 5 神经网络模型的权重和偏置Table 5. Weights and bias of neural network model层间变化Inter layer variation 权重Weight 偏置Skewing 从输入层到隐蔽层Input to hidden 5.4333 1.8446 3.1702 7.1633 −18.8820 0.7736 −1.9282 −5.3205 −5.3938 −7.5461 16.0280 −0.1719 −0.6525 −0.9611 −3.7414 9.3688 5.4315 −1.6258 从隐蔽层到输出层Hidden to output −1.2688 −1.0919 −1.1762 −0.2436 神经网络模型的相关性明显优于多元回归模型,说明含氧多环芳烃的分子结构参数与其对斑马鱼胚胎的急性毒性之间是一种非线性关系. 利用该建构的神经网络模型进行预测含氧多环芳烃的生物毒性lgEC50,预测值与实验值的平均误差为0.112;在两者之间进行相关,所得方程的R2adj=0.9644,该值明显高于多元回归方程的R2adj =0.6238,神经网络法所得预测误差的平均值明显小于多元回归法预测值的平均误差0.395,说明神经网络法模型比多元回归法的预测精度更高. 与文献[6]采用密度泛函理论中的B3LYP方法,优化了含氧多环芳烃(OPAHs)的分子结构,然后建立预测模型所得的结果进行比较,文献方法预测毒性值的平均误差为0.371,本法构建的神经网络预测毒性模型的预测精度更好. 将本文的多元回归法和神经网络法所得的预测值(Pre.)与实验值(Exp.),分别作关系图(图1和图2),从图1和图2可以看出,神经网络模型的毒性预测结果更为可靠,准确度更高. 将神经网络法对含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎的急性毒性lgEC50预测值也列入表1,将该值与实验值之间的误差,作雷达图(图3)可以看出,没有特别异常的误差值存在;将各化合物分子预测值的误差同时也作控制图(图4),同样可以看到各化合物急性毒性预测的最大误差和最小误差,均落在标准残差范围,正负残差基本对等,正负平均值就在零线,结果可控,说明预测化合物在应用域范围内,拟合效果也较好;也说明神经网络法预测lgEC50模型稳定可靠. 故建构的模型可应用于含氧多环芳烃毒性数据库的建立,是否适用于其它环境污染物毒性预测还需要实验验证.
2.4 模型结果分析
含氧多环芳烃的毒性机制较为复杂,由于其含有羰基或羟基的极性氧原子,故化合物具有较好的水溶性,有更强的毒性[1];一般而言,多环芳烃的环数越多,毒性越强,即分子量越大的化合物,分子体积越大,疏水性越强,通常表现出更强的毒性[5];在含氧多环芳烃中,醌是一种高度氧化还原活性分子,更容易形成氧化的细胞大分子[1],从而表现出更强的毒性效应. 此外对含氧多环芳烃而言,羰基或羟基基团在苯环上连接的位置、连接的数量、相互之间的影响等等,均会影响含氧多环芳烃分子的生物毒性大小. 本文通过分析分子结构与毒性大小之间的关系,定义了原子特征值,并通过对连接在苯环上所在位置的基团,进行了原子特征值的校正,从而建构了新的定位键指数,分子体积越大,所得L值也越大,式(5)中定位键指数L前的系数也是正值,说明该指数与含氧多环芳烃的毒性变化规律一致;再将该指数与能反映基团电性的电性拓扑状态指数、能反映基团相互作用空间特性的电性距离矢量进行结合,从而建立良好的可以预测含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎急性毒性的神经网络模型,从预测的毒性结果可看出,各个分子毒性预测值的误差较小;在32个含氧多环芳烃中,只有对31号分子芘-4,5-二酮的预测相对误差偏大,该分子的结构与其相邻的前3个分子的结构相近,但其毒性实验值lgEC50明显偏小,这可能与该分子处于相邻位置的两个羰基相互影响较大,导致lgEC50值异常有关. 总体而言,本文构建的含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎急性毒性lgEC50的神经网络模型,预测结果的准确度较好,平均误差仅为0.112,优于文献方法预测误差的0.371.
预测模型中使用的定位键指数是一种新定义建构的分子结构指数,是一种创新性提出的新的分子结构指数,它充分考虑了原子的电子层级、电负性、价电子等信息,也考虑了氢原子及所处环境的拓扑空间结构信息,而且它对不同结构的分子有很好的区分能力,而且计算也较为简单. 虽然本研究的样本数偏少,但从结果看,预测效果较好,这对扩充相关类似物的急性毒性数据库的数据有一定的理论指导意义,当然这还需要进行适当的实验进行验证. 如果化合物的浓度等发生变化,相应毒性数据也会发生改变,但可以通过对训练集的数据调整,模型会有适当变化.
3. 结论(Conclusion)
(1) 新定义了一个原子特征值,并对苯环上连接基团校正后,构建了一种新的定位键指数L,该指数对分子具有良好的区分性;同时计算并优化筛选了电性拓扑状态指数的E16、电性距离矢量的M14、M21、M32,将这5个参数有机结合,与含氧多环芳烃对斑马鱼胚胎的急性毒性之间进行定量结构-毒性相关性分析,按照神经网络5-3-1的三层网络结构,建立了预测急性毒性的神经网络模型,其总相关系数RT的值达到0.9826,结构与毒性之间的相关性令人满意,lgEC50预测值的平均误差为0.112,既优于多元回归法毒性预测值的平均误差0.395,也优于文献方法预测值的平均误差0.371.
(2) 神经网络法比多元线性回归法的预测精度得到明显提高,说明分子结构与急性毒性之间是一种良好的非线性相关关系,呈现的不是线性关系.
(3)含氧多环芳烃的生物毒性,除与含环数目的多少有关外,还与羰基或羟基连接的数量、连接的位置有关,环数越多,毒性越大.
-
表 1 市政污水处理厂剩余污泥的基本理化性质
Table 1. Characteristics of waste activated sludge from a municipal wastewater treatment plant
pH TS/(g∙L−1) VS/(g∙L−1) COD/(mg∙L−1) SCOD/(mg∙L−1) TKN/(mg∙L−1) TAN/(mg ∙L−1) 6.72±0.05 29.66±0.60 18.63±0.38 21 100±420 346±46 2 560±94 12.4±1.5 表 2 不同运行周期的反应器运行条件
Table 2. Operational conditions of different phases of bioreactor for chain elongation
运行周期 HRT/d 醇酸比 运行时间/d Phase Ⅰ 20 2∶1 0~20 Phase Ⅱ 10 2∶1 21~50 Phase Ⅲ 5 2∶1 51~90 Phase Ⅳ 5 3∶1 91~120 Phase Ⅴ 5 3∶1 121~135 表 3 驯化期不同运行条件下的总烷基量、平均碳链长度与碳效率
Table 3. Total alkyl groups, average chain length and carbon conversion efficiency of microbial chain elongation process under different operational conditions during the acclimation period
运行周期 总烷基量/(mmol·L−1) 平均碳链长度 碳效率/% Phase Ⅰ 291.8 6.82 33.4 Phase Ⅱ 543.4 6.83 62.1 Phase Ⅲ 507 5.63 72.9 Phase Ⅳ 535.6 6.51 64.8 表 4 碳链延长(CE)过程涉及到的关键酶及其在Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段微生物组中的丰度
Table 4. Key enzymes involved in chain elongation pathways and their abundance in Phase Ⅳ and Ⅴ
关键酶的名称 缩写 EC# 功能描述 不同周期酶丰度 Phase Ⅳ Phase Ⅴ Thiolase TLA 2.3.1.16 Acetyl-CoA C-acyltransferase 1 356 5 220 Ketoacycl-CoA reductase KCR 1.1.1.36 Acetyl-CoA reductase 536 4 902 Hydroxyacyl-CoA dehydratase HCD 1.1.1.157 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase 19 452 16 412 1.1.1.35 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase 5 686 15 354 2.3.1.16 Acetyl-CoA C-acyltransferase 1 356 5 220 4.2.1.17 Enoyl-CoA hydratase 13 918 15 978 Enoyl-CoA reductase ECR 5.1.2.3 3-hydroxybutyryl-CoA epimerase 666 4 922 Thioesterase TES 3.1.2.23 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase 2 740 1 968 Acetyl-CoA carboxylase ACC 6.3.4.14 Biotin carboxylase 21 802 12 782 6.4.1.2 Acetyl-CoA carboxylase 40 616 33 858 Malonyltransferase MAT 2.3.1.39 [acyl-carrier-protein]S-malonyltransferase 15 826 17 026 Ketoacyl-ACP synthase KAS 2.3.1.41 β-ketoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅰ 5 360 11 046 2.3.1.179 β-ketoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅱ 20 000 26 892 2.3.1.180 β-ketoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅲ 32 110 30 154 Ketoacyl-ACP reductase KAR 1.1.1.100 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase 32 462 40 198 Hydroxyacyl-ACP dehydratase HAD 4.2.1.59 3-hydroxyacyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase 8 812 7 466 Enoyl-ACP reductase EAR 1.3.1.9 enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase (NADH) 14 468 16 656 1.3.1.10 enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase (NADPH, Si-specified) 1 448 6 510 -
[1] MEERBURG F A, BOON N, VAN WINCKEL T, et al. Optimizing retention times in high-rate contact stabilization for maximal recovery of organics from wastewater[J]. Environmental Science & Technology, 2016, 50(17): 9781-9790. [2] ALLOUL A, GANIGUE R, SPILLER M, et al. A three-step approach for the valorization of sewage organics as commodities[J]. Environmental Science & Technology, 2018, 52(12): 6729-6742. [3] ANGENENT L T, USACK J G, XU J, et al. Integrating electrochemical, biological, physical, and thermochemical process units to expand the applicability of anaerobic digestion[J]. Bioresource Technology, 2018, 247(9): 1085-1094. [4] CAGNETTA C, COMA M, VLAEMINCK S E, et al. Production of carboxylates from high rate activated sludge through fermentation[J]. Bioresource Technology, 2016, 217(3): 165-172. [5] ANGENENT L T, RICHTER H, BUCKEL W, et al. Chain elongation with reactor microbiomes: open-culture biotechnology to produce biochemicals[J]. Environmental Science & Technology, 2016, 50(6): 2796-2810. [6] AGLER M T, SPIRITO C M, USACK J G, et al. Chain elongation with reactor microbiomes: Upgrading dilute ethanol to medium-chain carboxylates[J]. Energy & Environmental Science, 2012, 5(8): 8189-8192. [7] GE S J, USACK J G, SPIRITO C M, et al. Long-term n-caproic acid production from yeast-fermentation beer in an anaerobic bioreactor with continuous product extraction[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(13): 8012-8021. [8] KUCEK L A, XU J J, NGUYEN M, et al. Waste conversion into n-caprylate and n-caproate: Resource recovery from wine lees using anaerobic reactor microbiomes and in-line extraction[J]. Frontiers In Microbiology, 2016, 7: 1892. [9] VASUDEVAN D, RICHTER H, ANGENENT L T. Upgrading dilute ethanol from syngas fermentation to n-caproate with reactor microbiomes[J]. Bioresource Technology, 2014, 151(9): 378-382. [10] RICHTER H, MOLITOR B, DIENDER M, et al. A narrow pH range supports butanol, hexanol, and octanol production from syngas in a continuous co-culture of Clostridium ljungdahlii and Clostridium kluyveri with in-line product extraction[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 1773. [11] LIU C, LUO G, LIU H P, et al. CO as electron donor for efficient medium chain carboxylate production by chain elongation: Microbial and thermodynamic insights[J]. Chemical Engineering Journal, 2020, 390: 124577. doi: 10.1016/j.cej.2020.124577 [12] LI X, CHEN Y G, ZHAO S, et al. Efficient production of optically pure L-lactic acid from food waste at ambient temperature by regulating key enzyme activity[J]. Water Research, 2015, 70(11): 148-157. [13] XU J J, HAO J X, GUZMAN J J L, et al. Temperature-phased conversion of acid whey waste into medium-chain carboxylic acids via lactic acid: No external e-donor[J]. Joule, 2018, 2(2): 280-295. doi: 10.1016/j.joule.2017.11.008 [14] LE C C, STUCKEY D C. Colorimetric measurement of carbohydrates in biological wastewater treatment systems: A critical evaluation[J]. Water Research, 2016, 94: 280-287. doi: 10.1016/j.watres.2016.03.008 [15] LE C C, KUNACHEVA C, STUCKEY D C. "Protein" measurement in biological wastewater treatment systems: A critical evaluation[J]. Environmental Science & Technology, 2016, 50(6): 3074-3081. [16] LÜ C X, SHEN Y W, LI C, et al. Redox-active biochar and conductive graphite stimulate methanogenic metabolism in anaerobic digestion of waste-activated sludge: Beyond direct interspecies electron transfer[J]. Sustainable Chemistry & Engineering, 2020, 8(33): 12626-12636. [17] LIU Y H, LÜ F, SHAO L M. Alcohol-to-acid ratio and substrate concentration affect product structure in chain elongation reactions initiated by unacclimatized inoculum[J]. Bioresource Technology, 2016, 218: 1140-1150. doi: 10.1016/j.biortech.2016.07.067 [18] LONKAR S, FU Z H, HOLTZAPPLE M. Optimum alcohol concentration for chain elongation in mixed-culture fermentation of cellulosic substrate[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2016, 113(12): 2597-2604. doi: 10.1002/bit.26024 [19] STEINBUSCH K J J, HAMELERS H V M, PLUGGE C M, et al. Biological formation of caproate and caprylate from acetate: Fuel and chemical production from low grade biomass[J]. Energy & Environmental Science, 2011, 4(1): 216-224. [20] WU S L, WEI W, SUN J, et al. Medium-chain fatty acids and long-chain alcohols production from waste activated sludge via two-stage anaerobic fermentation[J]. Water Research, 2020, 186: 116381. doi: 10.1016/j.watres.2020.116381 [21] HAN W H, HE P J, SHAO L M, et al. Metabolic interactions of a chain elongation microbiome[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2018, 84(22): 01614-01618. [22] GROOTSCHOLTEN T I, STEINBUSCH K J, HAMELERS H V, et al. High rate heptanoate production from propionate and ethanol using chain elongation[J]. Bioresource Technology, 2013, 136: 715-718. doi: 10.1016/j.biortech.2013.02.085 [23] GANIGUE R, NAERT P, CANDRY P, et al. Fruity flavors from waste: A novel process to upgrade crude glycerol to ethyl valerate[J]. Bioresource Technology, 2019, 289: 121574. doi: 10.1016/j.biortech.2019.121574 [24] CANDRY P, ULCAR B, PETROGNANI C, et al. Ethanol: Propionate ratio drives product selectivity in odd-chain elongation with Clostridium kluyveri and mixed communities[J]. Bioresource Technology, 2020, 313: 123651. doi: 10.1016/j.biortech.2020.123651 [25] AGLER M T, SPIRITO C M, USACK J G, et al. Development of a highly specific and productive process for n-caproic acid production: Applying lessons from methanogenic microbiomes[J]. Water Science and Technology, 2014, 69(1): 62-68. doi: 10.2166/wst.2013.549 [26] SEEDORF H, FRICKE W F, VEITH B, et al. The genome of Clostridium kluyveri, a strict anaerobe with unique metabolic features[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(6): 2128-2133. doi: 10.1073/pnas.0711093105 [27] WU S L, SUN J, CHEN X M, et al. Unveiling the mechanisms of medium-chain fatty acid production from waste activated sludge alkaline fermentation liquor through physiological, thermodynamic and metagenomic investigations[J]. Water Research, 2020, 169: 115218. doi: 10.1016/j.watres.2019.115218 [28] DE VRIEZE J, REGUEIRO L, PROPS R, et al. Presence does not imply activity: DNA and RNA patterns differ in response to salt perturbation in anaerobic digestion[J]. Biotechnology for Biofuels, 2016, 9: 244. doi: 10.1186/s13068-016-0652-5 [29] 李雷, 卫科科, 姜卫红, 等. 细菌双组分系统应答调控蛋白调控策略的多样性[J]. 中国科学:生命科学, 2017, 47(5): 462-469. -