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我国现有近5 000座市政污水处理厂，年处理污水总量超6×1010 m3。市政污水经活性污泥法处理后，其中约1/3的有机污染物可被完全氧化成二氧化碳(CO2)。而其余大部分污水有机物则经由活性污泥代谢后被转化为微生物生物质(按污水处理量及COD折算约合污染物近1×107 t)，成为市政污水处理厂产量最大的副产物——剩余污泥的主要干物质成分。剩余污泥中的有机物是生产能源、燃料和高附加值化学品的潜在原料，可被资源化利用[1-2]，故不宜简单地归类于亟需处理或处置的“有害废物”。
厌氧消化(anaerobic digestion, AD)被认为是实现剩余污泥资源化的主流技术之一[2]。然而，受限于停留时间长、沼气产率低、资源化产品单一等因素，该技术的资源回收效率与资源化产品经济价值等有待进一步提升[3]。近年来，羧酸平台引起了国内外研究者的广泛关注，其“构筑模块”为短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs, C1~C5)。SCFAs可进一步转化为多种高附加值化学品，包括酯类、生物塑料(聚羟基脂肪酸酯)、单细胞蛋白以及中链脂肪酸(medium-chain fatty acids, MCFAs)[2]。SCFAs是污泥厌氧消化的中间产物。经过水解和发酵过程，污泥中的有机物(蛋白质、多糖、脂类)被代谢转化生成SCFAs，转化率可达约70%[2, 4]。相较于传统AD产甲烷过程，污泥的厌氧发酵产SCFAs过程的停留时间、稳定性及发酵产品产率等条件均更具优势。
MCFAs是指碳原子个数为6~12的饱和脂肪酸，包括己酸(C6)、庚酸(C7)、辛酸(C8)等，在精细化工中被广泛用于制作香料、医药、化妆品及增塑剂、橡胶等化工产品。MCFAs的水溶性较弱，如己酸和辛酸在常温常压条件下的水溶解度仅为10.82 g∙L−1和0.68 g∙L−1，易于从发酵液中分离回收。碳链延长(chain elongation, CE)是微生物合成MCFAs的重要代谢途径。该过程以SCFAs为电子受体、乙醇或乳酸为电子供体进行逆向β-氧化(reverse β-oxidation，RBO)[5]。近年来，利用SCFAs产MCFAs的研究已由早期的纯培养(pure culture)体系(以人工培养基为底物接种科氏梭菌Clostridium kluyveri)向开放式培养(open culture)体系(以未经灭菌的实际有机废水或有机废弃物为底物培养混合微生物菌种)稳步推进。AGLER等[6]将发酵液pH稳定控制在5.5，利用玉米生物乙醇发酵液(富含乙醇、葡萄糖、酵母菌细胞及少量残留玉米粒生物质)产SCFAs同时进行碳链延长，并在发酵反应器下游设置在线液液萃取体系同步连续回收发酵液中的己酸，产率达到2 g∙(L∙d)−1。以此为基础，GE等[7]在550 d的连续培养过程中将己酸产率继续提高至3.4 g∙(L∙d)−1。KUCEK等[8]利用葡萄酒粗酒泥(乙醇质量分数为40%)产MCFAs，在优化条件下(pH为5.2，以COD计的有机负荷率5.8 g∙(L∙d)−1)，己酸和辛酸的总产率为3.9 g∙(L∙d)−1。除了酿酒工业产生的有机废物，合成气发酵液、餐厨垃圾、乳清废水等也被报道用作产MCFAs的原料[9-13]。综上所述，目前微生物CE技术产MCFAs的主要原料均为具有高COD且易生物降解的有机废水或废弃物，而利用市政污水处理厂剩余污泥产MCFAs的系统研究仍需深入开展。
相较于酿酒废水或餐厨垃圾，污泥的惰性组分含量较高，且经由AD过程产MCFAs的产率极低。影响污泥产MCFAs的因素包括：1)污泥水解(限速步骤)进程缓慢；2)污泥厌氧发酵累积SCFAs过程中自发产甲烷导致碳转化效率降低；3)CE微生物组驯化期较为漫长。
本研究以酿酒废水厌氧塔颗粒污泥为接种物，采用混合SCFAs为电子受体、乙醇为电子供体，通过优化水力停留时间(HRT)与醇酸比进行微生物驯化以获得在代谢功能上占主导优势的CE微生物组。同时，采用碱性热水解预处理技术促进污泥破解，进而加速水解效率、提高SCFAs产率，完成从人工配制培养基溶液到真实污泥发酵液的底物转变，以“两相发酵”工艺实现污泥产MCFAs，并基于微生物多样性和宏基因组分析进一步揭示了过程中的微生态机制，以期为污泥有机质转化高附加值化学品的策略构建提供参考。
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微生物合成MCFAs厌氧发酵的接种污泥取自河南省三门峡市渑池县白酒厂废水厌氧处理塔，污泥初始pH为7.2，挥发性悬浮物质量分数(VSS)为0.9%。在驯化期(实验设置条件见1.2节)所使用的人工培养基组分包括：乙酸钠(醇酸比为2∶1与3∶1条件下其质量浓度分别为8.20 g∙L−1与6.15 g∙L−1)、乙醇(醇酸比为2∶1与3∶1条件下其质量浓度分别为15.3 mL∙L−1与17.3 mL∙L−1)、磷酸二氢铵3.60 g∙L−1、六水氯化镁0.15 g∙L−1、七水硫酸镁0.20 g∙L−1、氯化钾0.15 g∙L−1、二水氯化钙0.20 g∙L−1、微量元素溶液1 mL∙L−1。微量元素溶液的配方为(每升溶液)：四水氯化亚铁1.50 g、氯化锌70 mg、四水氯化锰100 mg、硼酸6 mg、六水氯化钴190 mg、二水氯化铜2 mg、六水氯化镍24 mg、二水钼酸钠36 mg，以及25%稀盐酸10 mL。
用于产SCFAs的剩余污泥取自上海市闵行区水质净化厂二沉池，经过离心浓缩后(在转速为4 000 r·min−1条件下离心旋转5 min)，再利用泥水分离后的上清液将污泥总固体含量调至约3%。调整后的污泥基本理化性质如表1所示。
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CE反应器为5 L连续搅拌反应器(continuous stirred-tank reactor，CSTR)。实验中的反应体系的体积为3 L，接种比例为20% (体积分数)，温度、搅拌速率和pH分别为30 °C、200 r·min−1和6.2。反应器运行采用连续模式发酵，连续运行135 d，共分为5个运行周期(见表2)。其中，Phase Ⅰ~Ⅳ为驯化期，底物为人工配制培养基；Phase Ⅴ为实验期，底物为污泥厌氧发酵上清液。反应器运行期间，每24 h取5 mL样品测定发酵液中的底物(乙醇、乙酸)及产物(丁酸、己酸和辛酸)浓度。
污泥厌氧发酵液的制备过程分为预处理和厌氧发酵2个阶段。
1)预处理阶段：将污泥的pH用NaOH溶液(OH−物质的量为2 mol·L−1)调至11.0，水浴加热至90 ℃后持续进行热碱处理2 h，待冷却降温至37 ℃后，用HCl溶液(H+物质的量为2 mol·L−1)将pH调至7.0。
2)厌氧发酵阶段：采用全自动厌氧消化测试仪器(MultiTalent203，碧普华瑞)进行发酵，反应器为2 L培养瓶，单个反应器工作体积为1.8 L，每组可同时运行6台反应器；厌氧接种比为5:1(以TS计)，接种物取自本实验室稳定连续运行超过1 a的污泥中温厌氧消化反应罐；在发酵实验开始前通入高纯氩气5 min以吹脱溶氧，并添加50 mmol·L−1的2-溴乙烷磺酸钠(BES)用于抑制产甲烷古菌的代谢活性；发酵控制条件为温度(37 ± 1)℃、搅拌速率120 r·min−1、发酵时间5 d；最后将发酵液进行泥水分离(4 000 r·min−1高速离心5 min)，保留上清液进行高温灭菌(121℃，15 min)后，置于4 ℃下冷藏保存待用；使用前添加适量乙醇将醇酸比调至3∶1，保存时间不超过2 d。
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剩余污泥pH使用FE28标准pH计(Mettler-Toledo，瑞士)测定；其余理化指标(包括TS、VS、COD、TKN、TAN)，采用国标法测定。污泥厌氧发酵液经离心15 min (转速离心力为12 000g)后，取上清液过膜(滤膜孔径0.45 μm)，分析其SCOD、多糖、蛋白质和SCFAs浓度等。多糖和蛋白质分别采用蒽酮-硫酸比色法(以葡萄糖为标准物质)和考马斯亮蓝法(以牛血清蛋白为标准物质)[14-15]测定。SCFAs(乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸)的组分和浓度采用气相色谱法测定，即在对其酸化预处理后(添加适量3%磷酸溶液将样品pH降至4.0以下)，使用装配有火焰离子化检测仪(FID)和DB-FFAP型毛细管柱的GC-7890B气相色谱(安捷伦，美国)进行定量分析。微生物连续发酵产MCFAs实验中的底物(乙醇、SCFAs)与产物(丁酸、己酸、辛酸)浓度的定量分析方法与SCFAs相同。
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在运行周期Phase II~V(分别为反应进行50、90、120和133 d)各取发酵液2 mL，在14 000 r·min−1转速下离心旋转5 min，撇除上清液后获得微生物混菌样品置于−80 °C下冷冻保存，直至进行微生物种群多样性分析。分析内容：1)使用E.Z.N.A. Soil DNA试剂盒(Omega Bio-Tek，美国)抽提DNA，DNA浓度、纯度和完整性分别使用TBS-380、NanoDrop2000和1%琼脂凝胶电泳进行检测；2)采用338F/806R和524F/958R引物对分别进行细菌区V3~V4片段和古菌区V4~V5片段的16S rRNA扩增；3)桥式PCR扩增步骤见参考文献[16]；4)高通量测序采用Illumina MiSeq PE300平台，优化原始数列后，按97%相似度进行OTU聚类，并采用RDP Classifier贝叶斯算法(Silva数据库，70%置信度)进行OTU聚类分析。
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宏基因组分析可探究污泥厌氧发酵液作为底物合成MCFAs对微生物CE代谢过程的影响。分别提取实验周期Phase IV和Phase V的发酵液，进行DNA抽提和质量分析，方法与微生物种群多样性分析相同。DNA片段化使用Covaris M220超声破碎仪，数据质控后cleaned reads使用MegaHit(http://github.com/voutcn/megahit)进行组装拼接(contig)，仅保留片段长度大于300 bp的拼接序列进入后续拼接。在基因预测阶段，使用MetaGene软件(http://metagene.cb.k.u-tokoyo.ac.jp)进行开放式阅读框(ORFs)预测，长度大于100 bp的ORF被翻译为氨基酸序列。使用CD-HIT软件(http://www.bioinformatics.org/cd-hit)对预测出的基因组进行聚类分析(95%序列一致性，90%覆盖度)，选出每个聚类中最长序列作为代表性序列建立非冗余基因集，使用SOAPaligner(http://soap.genomics.org.cn)计算样品的基因丰度。最后，使用BLASTP (v 2.2.28+, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，参考NCBI_NR数据库和KEGG数据库对比该非冗余基因集序列，分别进行分类注释和功能注释。
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调控反应器的HRT是最常见的驯化微生物菌群以产MCFAs策略之一。如图1所示，在整个驯化期间(0~90 d)，丁酸、己酸和辛酸是主要的微生物CE合成产物。在实验启动期(Phase I)，3种羧酸的产率均很低，至10~20 d后呈现缓慢增长趋势。在启动期结束时(20 d)，丁酸、己酸和辛酸的产率已分别达到65、133和82 mg∙(L∙d)−1。进入Phase II(HRT=10 d)，即反应进行至21~35 d，丁酸和辛酸的产率基本维持不变，而己酸的产率出现小幅下降；在35~40 d，丁酸和己酸的产率均迅速增长，其最高产率分别为766和756 mg∙(L∙d)−1，而辛酸产率相较于Phase I发生明显增长。在40~50 d，己酸产率保持在500~750 mg∙(L∙d)−1，但丁酸产率逐步降低至200 mg∙(L∙d)−1，而辛酸产率则上升至265 mg∙(L∙d)−1。CE代谢过程中碳链逐级延长的现象表明“丁酸+乙醇”合成己酸与“己酸+乙醇”合成辛酸的动力学变化决定了己酸产率的动态变化。当HRT由10 d缩短至5 d后，在51~60 d，丁酸和己酸的产率继续保持稳定，辛酸产率则持续下降，表明CE微生物代谢效率并未随着体系OLR增加而上升。而在60~70 d，丁酸产率由468 mg∙(L∙d)−1急剧上升至1 413 mg∙(L∙d)−1，增幅达202%；另一方面，己酸产率则维持在500 mg∙(L∙d)−1左右，辛酸的产率则出现显著下降，最终降至25 mg∙(L∙d)−1。直至Phase III结束，丁酸、己酸与辛酸的相对占比基本维持在这一水平。
底物利用率反映了微生物进行CE代谢过程的碳转化效率。在Phase I，乙醇利用率达到90%以上，但乙酸利用率却急剧下降，最终仅保持在30%左右，其原因可能是由于乙醇在发酵细菌与产甲烷古菌的协同作用下被代谢转化为乙酸、CH4与CO2。当HRT缩短至10 d(Phase II)，因其自身增殖速率过低，产甲烷古菌被逐渐洗脱，而由于存在能量壁垒，导致失去了“互养搭档(syntrophic partner)”的厌氧发酵细菌无法单独进行“乙醇→乙酸”的代谢过程(CH3CH2OH + H2O → CH3COO− + H+ +2H2，ΔG0 = 9.7 kJ∙mol−1)。这表明该周期乙醇与乙酸的利用率完全取决于CE微生物菌群的相对丰度与代谢活性，在Phase II的后半期(35~50 d)上升至近100%；而在Phase III阶段，其变化趋势也基本与同时期丁酸与MCFAs的产率一致，在CE微生物菌群逐渐稳定之后，乙醇和乙酸的利用率基本稳定在90%~100%。因此，导致这一时期(65~90 d)MCFAs产率明显低于丁酸的原因可能是醇酸比过低，乙醇被更多地用于进行乙酸CE反应生成丁酸，进而限制了己酸和辛酸的合成[17-18]。
当醇酸比调至3∶1后(Phase IV)，初期(90~100 d)己酸与辛酸的产率相较于Phase III时无明显变化，而丁酸产率则开始逐渐降低；乙酸利用率仍接近100%，而乙醇利用率则下降至60%左右。上述结果表明，微生物未能立即利用富余乙醇作为电子供体进行CE反应，其原因可能是发酵液乙醇浓度骤升所引起的轻微胁迫效应[17]。在100~120 d，丁酸产率由1 074 mg∙(L∙d)−1降至528 mg∙(L∙d)−1，降幅为50.8%，而己酸产率则由701 mg∙(L∙d)−1增至1 402 mg∙(L∙d)−1，辛酸产率也由18.2 mg∙(L∙d)−1增至200 mg∙(L∙d)−1。在此期间，乙醇利用率稳步上升，并保持在88.1%~92.3%，表明乙醇经由逆向β-氧化代谢路径用于微生物CE过程生成MCFAs。有文献报道，当醇酸比为2∶1时，以科氏梭菌Clostridium kluyveri为优势菌的微生物菌群进行CE反应的主要产物为丁酸，将醇酸比提高至3∶1或4∶1，可促使丁酸进一步转化为己酸[7, 17, 19]。在逆向β-氧化过程中，乙醇既是电子供体提供还原当量NADH，也在被氧化时为代谢提供ATP，每5 mol参与CE反应的乙醇对应1 mol被氧化为乙酸的乙醇(5CxH2x-1O2− + 6CH3CH2OH → 5Cx+2H2x+3O2− + CH3COO− + H+ + 4H2O + 2H2)，因此，较高的醇酸比使得乙醇更多参与丁酸的CE反应而非厌氧氧化，从而提高了己酸产率[7]。在本研究中，考虑到醇酸比为3∶1的条件下乙醇利用率始终未达到100%，故未进一步提高培养基中的醇酸比，以避免发酵液中乙醇浓度过高而产生底物胁迫效应[18]。WU等[20]发现，当醇酸比从3∶1增至5∶1时，尽管己酸产率在短期内有所提高，但发酵液中的残留乙醇会明显抑制CE微生物的代谢活性。
总烷基量(total alkyl groups, TAL)、平均碳链长度(average chain length, ACL)与CE过程碳效率(carbon conversion efficiency, CCE)是评价微生物产MCFAs的重要指标，其计算公式如式(1)~(3)所示。
式中：C丁酸为丁酸的浓度，mmol∙L−1；C己酸为己酸的浓度，mmol∙L−1；C辛酸为辛酸的浓度，mmol∙L−1；C乙醇为乙醇的浓度，mmol∙L−1；C乙酸为乙酸的浓度，mmol∙L−1。
因为MCFA的水溶性随着碳链长度增加而降低，所以TAL与ACL与发酵液中MCFAs的可分离性能呈线性相关。如表3所示，除启动期Phase Ⅰ之外，其余运行周期内MCFAs的可分离性较好，仅在Phase Ⅲ有所降低，其主要原因在于丁酸的大量生成，而己酸、辛酸的产量不足。CCE反映了乙醇与乙酸参与CE过程被转化为C4~C8羧酸的效率。由于在Phase Ⅰ阶段产甲烷古菌代谢活性较高，CCE仅为33.4%，但在Phase Ⅱ至Ⅳ期间骤增至62.1%~72.9%，表明CE代谢过程的碳利用效率较高。己酸选择性变化趋势与己酸产率保持一致，证明了提高醇酸比有利于CE微生物合成己酸。
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如图2(a)所示，空白组(CK)与热碱预处理组(THALK)的剩余污泥厌氧发酵过程均在5 d后达到稳定。发酵液SCFAs的最终质量浓度(以COD计)分别为(4 240±157) mg∙L−1与(7 000±240) mg∙L−1。这表明热碱预处理对污泥絮体的破壁溶胞作用释放SCOD可明显提升SCFAs产率。对上清液成分进行分析后可知，CK组与THALK组污泥发酵液的SCFAs成分结构类似，主要为乙酸，分别占总SCFAs的51.0%与56.2%，其余为丙酸、正丁酸和正戊酸(图2(b))。其中，碳原子个数为偶数的SCFAs(乙酸、丁酸)占比达到73.3%，表明污泥厌氧发酵液可作为底物合成MCFAs，特别是己酸和辛酸。
如图3所示，Phase Ⅴ阶段的运行条件(HRT=5 d，醇酸比为 3∶1)与Phase Ⅳ阶段保持一致，当底物由人工配制培养基溶液替换为污泥发酵液后，丁酸、己酸和辛酸的合成情况并未出现明显变化，其平均产率分别为534、1 380和141 mg∙(L∙d)−1。另外，乙醇与乙酸的转化利用情况也与Phase Ⅳ阶段时基本相同，利用率保持在92.4%~98.2%。Phase Ⅴ阶段的TAL、ACL和CCE和己酸选择性分别达到519.4 mmol∙L−1、6.47和63.3%，与Phase IV阶段基本持平。因此，尽管污泥发酵液中存在蛋白质(以COD计，质量浓度946.6 mg∙L−1)、多糖(以COD计，质量浓度1 566.6 mg∙L−1)及其他包括腐殖质在内的DOM(以COD计，质量浓度3 122.1 mg∙L−1)。然而，这些DOM并未影响CE微生物合成MCFAs的过程。由此可见，当反应器内微生物保持稳定的菌群多样性结构和代谢活性时，利用污泥发酵液产MCFAs是可行的。值得注意的是，尽管污泥厌氧发酵液中含有丙酸(C3)和正戊酸(C5)，但奇数碳链MCFAs(如C5戊酸、C7庚酸等)产率极低，这与HAN等[21]的研究结果一致。产生以上现象的主要原因为如下2个机制。1) CE微生物的底物选择性：在长达90 d的驯化期间， CE微生物始终以乙酸(C2)作为电子受体，并且Phase V期污泥发酵液的SCFAs也是以偶数碳链羧酸为主要组分(乙酸56.2%，正丁酸17.1%)，使得CE微生物更倾向于利用乙酸和丁酸为电子受体与乙醇生成偶数碳链的MCFAs。2)逆向β-氧化过程的能量代谢机制：在电子受体为奇数碳链羧酸(如C3丙酸)CE过程中，每5 mol乙酰辅酶A生成戊酸(C5)的同时，有1 mol乙酰辅酶A会被氧化成1 mol乙酸以用于合成ATP提供细胞代谢能量，从而使得乙酸会在下一轮CE过程中，与丙酸竞争电子供体(乙醇)以生成相应的碳链延长羧酸，故理论上奇数碳链MCFAs产物选择率仅为83.33%。已有研究表明，即使仅丙酸为电子供体，奇数碳链MCFAs(C5戊酸、C7庚酸)的产物选择率也仅为35%~66%[22-24]。
综上所述，在优化条件(醇酸比为3∶1、HRT=5 d)下，总含固率为3%的剩余污泥己酸和辛酸产率分别为1.38、0.14 kg∙(L∙d)−1，以我国市政污泥年产量5×107 t(含水率80%)进行估算，以污泥定向发酵产己酸和辛酸的年产量可分别达到46×104 t与4.7×104 t。
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图4展示了反应器不同运行周期的微生物在属水平的菌群多样性结构。Phase II阶段的优势微生物包括甲烷杆菌Methanobacterium、木里菌Muribaculaceae及乳酸杆菌Lactobacillus，其相对丰度分别为13.3%、8.7%和8.2%。其中，Methanobacterium是氢营养型产甲烷古菌，与厌氧发酵细菌共生以克服热力学能量壁垒，将乙醇和VFAs降解代谢为甲烷。有文献报道，Methanobacterium与CE微生物菌群形成的底物竞争关系是导致反应器启动期间MCFAs产率较低的微生物机制[7, 25]。Phase Ⅲ阶段的微生物群落结构较Phase Ⅱ阶段改变明显，狭义梭菌Clostridium sensu stricto_12成为优势菌(相对丰度55.0%)，其他优势菌属包括醋杆菌Acetobacter(9.9%)、理研菌科属Rikenellaceae RC9(8.9%)、鲁梅尔芽胞杆菌Rummeliibacillus(6.2%)，而Methanobacterium几乎未被检测到(相对丰度<0.1%)，故缩短HRT是消除产甲烷古菌底物竞争的有效策略。值得注意的是，根据美国国家生物技术信息中心NCBI数据库的BLAST比对结果分析，Clostridium sensu stricto_12的OTU序列与CE模式微生物Clostridium kluyveri的OTU序列相似度大于99%[5, 26-27]，故优势菌Clostridium sensu stricto_12是发酵液中合成MCFAs的核心功能细菌。Phase IV阶段的微生物群落结构与Phase III阶段的相似，Clostridium sensu stricto_12的相对丰度进一步上升至64.9%，但Acetobacter的相对丰度降至2.5%，表明提高醇酸比有利于富集CE微生物Clostridium。由于Phase V阶段的底物为污泥发酵上清液，微生物菌群结构发生了明显变化，尽管此时Clostridium sensu stricto_12仍为优势菌之一，但其相对丰度已降至29.7%。其他相对丰度较高的微生物包括脱硫弧菌Desulfovibrio(15.6%)、伪假苍黄菌Pseudoclavibacter(7.5%)、芽孢杆菌Bacillus(7.8%)。这些微生物未被证明是CE微生物，但广泛存在于市政污水处理厂的活性污泥中，因此，引入污泥发酵液会不可避免地提高这些微生物DNA水平上的相对丰度。DE VRIEZE等[28]发现，相较于DNA水平上的总微生物群落(包括活性与非活性)，RNA水平上的微生物群落结构(即活性微生物)能更准确反映厌氧生态体系的状况。微生物属水平的主成分分析(PCA)结果如图5所示，成分因子1(PC1)与成分因子2(PC2)对数据点差异性贡献率之和达到94.28%。从象限分布来看，Phase Ⅲ阶段和Phase Ⅳ阶段的微生物群落结构较为相似，与Phase Ⅱ及Phase Ⅴ阶段的群落结构差异明显。
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宏基因组分析过程中，Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段的发酵液样品原始reads数分别为67 758 922 和69 750 096。经数据质控和拼接组装后，ORF的总长度为345 493 103 bp。2组样品在KEGG功能水平上共享代谢通路260个，共享率为97%(见图6(a))。这说明底物由人工培养基替换为污泥厌氧发酵液并未使得微生物种类和功能层面产生明显差异。Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段的微生物组主要参与氨基酸合成、ABC转运、碳代谢和双组分系统等代谢过程(见图6(b))，但这些代谢过程的基因丰度在这2个周期无明显差异，与Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段的稳态阶段具有几乎一致的底物利用率和MCFAs产率相吻合。尽管Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段的微生物结构有一定变化，但体系内相应的功能基因活性却保持稳定，这是前期驯化的结果。另外，丰富的氨基酸合成、ABC转运、碳代谢等代谢过程是微生物复杂新陈代谢的保证，这也从微观角度证实了驯化后的微生物在利用污泥发酵液为底物时仍能保持相当的活性。值得注意的是，双组分系统对微生物适应快速变化的外部环境有积极作用，能实现其调控蛋白和DNA、RNA的结合，最终实现对细胞基因表达的调控[29]。
表4展示了Phase IV和PhaseV阶段微生物组在CE过程代谢通路中关键酶的丰度，包括EC 1.1.1.100(3-氧酰基-[酰载体蛋白]还原酶)、EC 2.3.1.179(β-酮脂酰-[酰载体蛋白]合成酶Ⅱ)、EC 2.3.1.180(β-酮脂酰-[酰载体蛋白]合成酶Ⅲ)、EC 6.3.4.14(生物素羧化酶)及EC 6.4.1.2(乙酰辅酶A羧化酶)。关键酶丰度的变化证实了转化底物后微生物新陈代谢的变化，但从宏观角度而言，进入Phase V阶段后，MCFAs产率并没有随微生物代谢和转录出现波动。事实上，CE过程中发酵体系内多种微生物可能共同具备关键酶，很难将某种特定酶与特定微生物相对应。因此，只要具备转录翻译功能的微生物拥有足够活性，就能够促进合成MCFAs。
逆向β-氧化过程(reverse β-oxidation，RBO)和脂肪酸合成(fatty acid biosynthesis，FAB)是微生物混菌体系经CE过程合成MCFAs的主要代谢途径(见图7(a))[5, 21]。相较于FAB途径，RBO途径的步骤更少，且ATP净消耗量更小，故可认为RBO更加高效。本研究中RBO和FAB途径所涉及的关键酶均被检出。RBO途径关键酶的总丰度为65 980(Phase Ⅳ)和10 630(Phase Ⅴ)，而FAB途径关键酶的总丰度则达到192 904(Phase IV)和202 588(Phase V)。FAB的总丰度高于RBO表明MCFAs可能更多地经由FAB途径合成，这与HAN等[21]的研究结果一致。相较于Phase Ⅳ，Phase Ⅴ的微生物组RBO途径中的TLA、KCR、HCD、ECR酶丰度分别增加了285.0%、814.6%、40.9%、78.9%，仅有TES酶丰度降低28.2%；FAB途径中的MAT、KAS、KAR和EAR酶丰度分别增加了7.6%、18.5%、23.8%和45.6%，而ACC的酶丰度则降低25.3%。上述结果表明，中间产物乙酰辅酶A的后续代谢可能有部分从FAB转入RBO途径(见图7(b))。综上所述，在其他发酵条件(HRT、醇酸比)相同的情况下，以乙醇为电子供体，使用富SCFAs污泥发酵液为电子受体比单独使用乙酸更有利于合成MCFAs。
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1) 当HRT由20 d优化至5 d，醇酸比保持在2∶1时，发酵体系中Methanobacterium的丰度明显降低，而关键产MCFAs菌Clostridium sensu stricto_12丰度为优势菌种，最大丰度为64.89%。然而，此时体系内堆积大量丁酸，证明通过HRT调整可洗脱污泥内竞争性产甲烷菌，对体系内微生物起到良好的驯化作用，但醇酸比偏低会导致电子供体不足，不能使丁酸进一步延长为己酸。
2) 当HRT为5 d时，将醇酸比由2∶1提升至3∶1后，乙醇作为电子供体促使丁酸进一步转化为己酸，此时己酸产率达到1 400 mg·(L·d)−1。同时，体系内微生物群落结构变化并不明显，说明乙醇含量并未对微生物造成抑制。
3) 将底物由人工配制特定培养基转为热碱预处理污泥发酵液后，丁酸、己酸和辛酸的产率并未发生明显变化。尽管此时Clostridium sensu stricto_12丰度下降，但宏基因组学分析发现，体系内关键代谢通路RBO、FBA关键酶依旧保持较高丰度，说明体系具备一定的抗冲击能力，可连续高效生产MCFAs。
利用富乙酸剩余污泥厌氧发酵液产中链脂肪酸
Conversion of acetate-rich waste activated sludge anaerobic fermentation liquor into medium-chain fatty acids
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摘要: 为实现剩余污泥的资源化利用，探索了混菌体系中以剩余污泥为底物连续产中链脂肪酸(MCFAs)的可行性。本研究基于乙醇/乙酸人工配制废水，采用热碱水解污泥-短期厌氧发酵-微生物碳链延长(CE)反应的“两相发酵”技术合成MCFAs，并逐步优化水力停留时间(HRT)与底物醇酸比以驯化厌氧污泥微生物。结果表明：在为期135 d的连续模式CE过程中，在醇酸比为2∶1的条件下，驯化期(Phase Ⅰ~Ⅲ)的HRT由20 d逐步缩减至5 d后，典型CE微生物Clostridium sensu stricto_12成为优势菌种，其相对丰度升至65.21%，但己酸产率仅为775 mg∙(L∙d)−1；当醇酸比提高至3∶1 (Phase Ⅳ)，己酸产率升至1 402 mg∙(L∙d)−1，MCFAs产物选择性明显提高。将实验期(Phase Ⅴ)系统中的底物置换为污泥厌氧发酵液，己酸产率依然稳定保持在1 400 mg∙(L∙d)−1，表明功能微生物组的结构稳定。宏基因组分析结果显示，逆向β-氧化(RBO)和脂肪酸生物合成（FAB）代谢通路均参与了CE过程的MCFAs合成；另外，相较于乙醇/乙酸人工配制废水，污泥发酵液可提高这2种代谢通路的关键酶丰度。本研究证实了污泥连续发酵产MCFAs的可行性，并阐明了过程中微生物的生态功能机制，可为污泥资源化利用提供参考。Abstract: To determine the feasibility of producing medium-chain fatty acids (MCFAs) from waste activated sludge in mixed culture, this study firstly optimized bioreactor parameters, i.e. hydraulic retention time (HRT) and ethanol : acid ratio, to assimilate anaerobes and later adopted the “two-stage fermentation” strategy, in which alkaline pretreated sludge was subjected to short-term acidogenesis and microbial chain elongation The results showed that during the 135-day chain elongation (CE) over the long term, with ethanol∶acid ratio=2∶1, when HRT was shortened from 20 d to 5 d (Phase Ⅰ~Ⅲ), the CE functional microbe, Clostridium sensu stricto_12, evolved as the dominant genus (relative abundance 65.21%). However, the maximal productivity of n-caproate was merely 775 mg∙(L∙d)−1. Subsequently, with ethanol∶acid ratio increased to 3∶1 (Phase Ⅳ), the productivity of n-caproate boosted to 1 402 mg∙(L∙d)−1, demonstrating an increased product selectivity towards MCFAs. In PhaseⅤ (test phase), during which the substrate swamped from synthetic ethanol/acetate wastewater to sludge fermentation liquor (SFL), the n-caproate productivity maintained at 1 400 mg∙(L∙d)−1. Based on the metagenomics analysis, both reverse β-oxidation (RBO) and fatty acid biosynthesis (FAB) pathways were involved in microbial chain elongation for MCFAs production. Moreover, as compared to synthetic ethanol/acetate wastewater, SFL increased the relative abundance of some key functional enzymes for the RBO and FAB pathways. The present study provided the practical evidence for continuous production of MCFAs from waste activated sludge, and more importantly, it elucidated the microbial and ecological mechanisms. Taken together, it shed a light on the sludge-derived value-added chemicals for its valorization.
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毒品属于精神活性物质，是一类使人体在吸收后产生生理和心理依赖的物质[1]，主要包括阿片类的海洛因及吗啡（MOR）制品，可卡因、苯丙胺类的甲基苯丙胺（METH）、苯丙胺和摇头丸等[2-3]，截至2020年底，联合国毒品和犯罪办公室及欧洲药物与成瘾监测中心（EMCDDA）共鉴定出1000余种精神活性物质[4-6]。根据《2021年世界毒品问题报告》的数据显示，去年全球约有2.75亿人接触过毒品，相比2010年增加了22%，在2019年，吸毒直接导致近50万人死亡，超过 5400 万人患精神障碍疾病或丧失生命[6]，引发了极其严峻的全球公共卫生问题[7-9]。《2020年中国毒品形势报告》指出，由于疫情扩散蔓延，毒品泛滥态势仍然复杂但整体向好 ，截至2020年底，中国现有吸毒人员180.1万名，海洛因、冰毒等滥用品种仍维持较大规模[10]，严重影响了社会治安并造成了极大的社会危害[11-15]。
毒品滥用是对公共卫生和社会安全的巨大威胁[16]，并严重威胁着人体健康[17]，毒品滥用趋势的实时预测和社会危害的准确评价是当前亟待解决的问题[18]，基于污水流行病学发展而来的污水验毒技术恰好能够解决这一难题。冰毒和海洛因等传统毒品，经过人体吸食和代谢后，随着尿液排入各级污水处理系统并最终汇入环境。通过对环境样品的采集、处理和分析，可以直观获取环境中毒品母体及其代谢物的种类、浓度及变化趋势，结合数学模型计算，可反推目标区域的毒品滥用种类和滥用量[19]。该方法所得数据客观、时效性高，可用于不同区域横向比较，在估算传统毒品滥用量等方面发挥了巨大作用[20-24]。但在污水及河流等的传输过程中，由于本底因素复杂，目标物可能存在生物化学降解、吸附或其他转化过程[25]。不同水环境性质的差异对传统毒品及其代谢产物的稳定存在具有不同程度的影响[26]。Baker等[26]认为，中性水样中，METH具有较好的稳定性倾向[27]。但海洛因代谢产物6-单乙酰吗啡（6-MAM）非常不稳定，可进一步转化为MOR[28]，在污水流行病学范畴内，海洛因的估算通常是以其代谢产物6-MAM作为标准进行的[29]，但污水中，6-MAM的损失比例高达42%[26]，从而该方法失效。张小寒[30]则认为pH值可通过影响水底质中悬浮物的表面电荷，使得水样中传统毒品含量测量值偏低。张春水等[31]认为，海洛因在碱性条件下会加速降解。此外，吕昱帆等[32]在其研究中发现盐析剂NaCl的使用对6-MAM及MOR的回收率具有不同程度的影响。
为明确水环境对METH、6-MAM和MOR的基质效应，本研究选取了山东省潍坊市11条不同河流的实际水样，测定相关水质参数，采用内标法和主成分分析法探讨基本水质参数对3种精神活性物质METH、6-MAM和MOR定量分析准确度的影响；设计不同梯度pH及氯离子浓度的模拟水样，加入定量METH、6-MAM和MOR并储存不同时间，测试分析其中目标物含量，验证pH、氯离子浓度及存储时间对3种精神活性物质检出浓度的影响。
1. 实验部分（Experimental section）
1.1 实验试剂与仪器
精神活性物质METH、6-MAM及MOR由山东省公安厅提供；氘代内标储备液MOR-D3、6-MAM-D3、METH-D8（100 μg·mL−1, 美国Cerilliant公司）；实际水样来源于山东省潍坊市白浪河及利民河等处。主要化学试剂浓氨水、氢氧化钠、氯化钠、硝酸银、重铬酸钾、硫酸汞、高锰酸钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），甲醇、二氯甲烷、甲酸（色谱纯，J&K百灵威公司）。
固相萃取仪（美国SUPELCO公司），Oasis MCX固相萃取小柱（美国Waters公司），0.45 μm微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司），氮吹仪（美国Organomation公司），XW-80A漩涡混合器（中国金昌实验仪器厂），三重四极杆液质联用仪（Thermo Scientific TSQ Quantiva LC-MS），水质多参仪（美国HACH公司），Milli-Q纯水机。
1.2 实验方法
1.2.1 毒品标准储备液的配制
用分析天平分别称取0.0500 g METH、6-MAM及MOR，逐级稀释溶解于色谱纯的甲醇中，得到浓度均为50 ng·mL−1的毒品标准储备液，超声45 min使其溶解完全。
1.2.2 不同pH、氯离子浓度模拟水样配制
取浓盐酸和NaOH，加入Milli-Q水中，配制pH值分别为2、4、7、10的溶液备用。称取NaCl固体，配制质量浓度为0、1、2、3、4、5 g·L−1的溶液。在50 mL模拟水样中分别加入毒品标准储备液100 μL，使METH、6-MAM及MOR的质量浓度均为100 ng·L−1，常温（25℃）下存储12 、24、36、48、72、120 h。
1.2.3 实际水样的采集
实验样品于2019年12月在山东省潍坊市内白浪河及利民河等11条河流中采集。每个采样点取水样1000 mL, 分为两份，均置于提前用甲醇和Milli-Q水洗净并烘干的棕色玻璃瓶中。采样结束后立即运回实验室，于 4 ℃冷藏。1份样品在48 h内处理完毕，另1份加入定量毒品标准储备液，使METH、6-MAM及MOR的质量浓度均为100 ng·L−1，常温保存72 h。同步参照国家标准测试温度、pH、氯离子浓度，化学需氧量等6项相关水质参数。
1.2.4 样品前处理
①过滤：将水样经过玻璃纤维滤膜（Whatman GF/F）过滤，去除悬浮颗粒物，收集滤液至少100 mL。②MCX小柱活化：依次将甲醇、Milli-Q水和 pH=2的水溶液通过MCX小柱，控制流速为1—2 mL·min−1，充分活化并平衡柱子。③配制MOR-D3、6-MAM-D3、METH-D8的内标溶液，浓度均为200 μg·L−1。④于pH=2的条件下加载已过滤并添加内标的样品，控制流速为1—2 mL·min−1。⑤对淋洗后的SPE小柱持续抽气20 min，直至MCX小柱完全干燥。依次用甲醇和氨水/甲醇溶液（5/100，质量比）洗脱干燥的Oasis MCX柱，并控制流速为1—2 mL·min−1。⑥收集洗脱液，33 ℃水浴下置于柔和的氮气流下吹至近干，用注射器取0.5 mL 20%的甲醇水溶液复溶氮吹残留物，涡旋振荡1 min，用注射器吸取溶液，用0.45 μm针头过滤器（Whatman）过滤并转移至HPLC-MS/MS专用样品瓶中，重复此操作一次。⑦样品测试前用0.2 μm滤膜过滤，滤液上机测试。
1.2.5 分析方法优化
流动相：0.12%甲酸和30 mmol·L−1甲酸铵超纯水溶液（A相）；甲醇（B相），流速为0.3 mL·min−1，柱温为30 ℃，进样量为5 μL。以该液相色谱条件为初始方法[24]，进一步手动优化，以获得对目标化合物的最高灵敏度（表1）。
表 1 HPLC-MS流动相洗脱梯度Table 1. HPLC-MS mobile phase elution gradient时间/min Time A/% B/% 0.0 95 5 3.0 70 30 6.0 20 80 6.5 10 90 8.0 10 90 8.5 95 5 11.0 95 5 | Show Table
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质谱：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压3500 V，离子传输管温度350 ℃，离子化模式为ESI（+）；碰撞池气压（CAD）1.5 mTorr，鞘气压力（Sheath gas）为80 Arb，辅气压力（Aux gas）15 Arb。每种目标化合物及其相应内标的母离子和定量、定性离子的质荷比（m/z）见表2，其中，选取每种目标物丰度最大的离子对作为定量离子。
表 2 目标物测试质谱参数Table 2. Mass spectral parameters of the target compound化合物Compound 母离子Parent ion 定量离子Quantitative ion 定性离子Qualitative ion 保留时间/minRetention time m/z m/z DP/V CE/V m/z DP/V CE/V MOR 286 152.1 82 55 165 82 32 2.73 MOR-D3 289.2 152.1 80 55 165 80 41 2.72 METH 150.1 91.1 30 16 119.1 30 16 4.62 METH-D8 158.2 93.2 40 19 124.2 40 10.3 4.59 6-MAM 328.1 165.3 90 36 211.3 90 36 4.35 6-MAM-D3 331.1 165.1 90 38.3 211.2 90 25 4.36 | Show TableDownLoad:
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2. 结果与讨论(Results and discussion)
2.1 分析方法的评价
2.1.1 回收率
取3种毒品储备液适量，配制成低、中、高浓度（100 ng·L−1、300 ng·L−1、400 ng·L−1）的质控样品，分别按相同的前处理方法平行操作；每一浓度进行双样本分析，根据当日标准曲线，计算样品测定浓度，得出METH、6-MAM和MOR的方法回收率，结果见表3。数据结果表明METH、6-MAM和MOR的回收率良好。
表 3 实验方法回收率、检出限及定量限Table 3. Experimental methods Recovery rate, detection limit and quantitation limit化合物Compound 加标浓度/(ng·L−1)Added 检出浓度/ (ng·L−1)Found 方法回收率/%Method recovery 检出限/(ng·mL−1) 定量限/(ng·mL−1) ILOD MLOD ILOQ MLOQ METH 400 377.0 94.25 0.2 0.0008 0.8 0.0032 300 304.9 101.63 100 102.6 102.60 6-MAM 400 384.2 96.05 0.2 0.0008 0.8 0.0032 300 283.7 94.57 100 101.4 101.4 MOR 400 418.0 104.50 0.2 0.0008 0.8 0.0032 300 294.8 98.27 100 102.3 102.3 | Show TableDownLoad:
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2.1.2 线性范围、检出限及定量限
将低浓度目标物混合标准溶液上机测定，仪器检出限（ILOD）和仪器定量限（ILOQ）分别以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）确定。方法检出限（MLOD）和方法定量限（MLOQ）分别通过以下公式计算得到：
MLOD(或MLOQ)=ILOD(或ILOQ)×200μL50mL 式中，200 μL为上机浓缩液的体积，50 mL为前处理所取水样的体积。
取混合毒品标准溶液适量，用流动相稀释，得质量浓度分别为1.5、3、6、12、25、50、100、150、200、250 ng·mL−1系列标准溶液。依次取上述各浓度标准溶液50 mL，按照相同的前处理方法操作，记录色谱图；以标准溶液中目标物的峰面积与同位素内标的峰面积之比为纵坐标（Y），进样浓度（X）为横坐标，进行线性回归运算，得METH、6-MAM和MOR回归方程：
Y=−0.040+0.033XR2=0.9996 Y=−0.044+0.023XR2=0.9998 Y=−0.042+0.023XR2=0.9992 结果表明METH、6-MAM及MOR质量浓度在1.5—250 ng·mL−1范围内线性关系良好，仪器的检出限和定量限见表3。
2.2 河流水质参数与毒品目标物检出浓度的相关性评价
水样温度、pH值、氯离子浓度、化学需氧量、氨氮、高锰酸盐指数和溶解氧等水质参数见表4。
表 4 样品水质参数Table 4. Water quality parameters of the samples样品名称Sample name 温度/℃Temperature pH 氯离子浓度/(mg·L−1)Chloride ion 化学需氧量/(mg·L−1)COD 氨氮/(mg·L−1)NH4+-N 高锰酸盐指数/(mg·L−1)Permanganate Index 溶解氧/(mg·L−1)DO YX 3.6 8.02 1.10×104 94.0 6.67 9.30 10.1 WS 7.0 8.27 9.09×102 9.50 3.81 11.6 9.50 BQ 2.6 8.34 2.25×102 24.0 1.22 6.70 13.1 GS 4.1 8.49 5.60×102 34.0 0.87 9.40 10.8 DH 2.6 8.50 1.30×103 41.0 0.89 10.0 11.6 BX 4.4 8.56 1.26×103 40.0 1.20 7.90 15.5 CZ 3.6 8.60 1.77×103 53.0 1.30 11.4 11.8 LZ -0.3 8.62 1.29×104 141 1.09 5.10 10.1 LX 0.6 8.64 1.24×104 126 0.88 10.5 14.0 XC 3.7 8.66 1.02×103 47.0 2.22 12.7 13.7 DX 4.3 8.68 1.13×103 39.0 1.08 10.5 14.2 | Show TableDownLoad:
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检测水样中METH、MOR及6-MAM浓度（记为c1），在样品中均加入定量毒品标准储备液，使METH、6-MAM及MOR的质量浓度均为100 ng·L−1，常温保存72 h后按照2.3所述方法进行样品前处理，并检测3种毒品目标物加标后的浓度（记为c2），见表5。
表 5 样品加标前后三种毒品目标物的检出浓度Table 5. Detected concentrations of three drug targets before and after labeling样品名称Sample name METH/（ng·L−1) MOR/（ng·L−1) 6-MAM/（ng·L−1) c1 c2 c1 c2 c1 c2 YX 3.19 90.61 n.d. 6.99 n.d. 1.67 WS 2.15 98.73 1.97 25.15 1.25 23.85 BQ 1.13 103.19 3.05 44.63 n.d. 47.25 GS 3.35 99.54 n.d. 42.98 3.29 42.25 DH n.d. 91.70 n.d. 21.36 n.d. 7.37 BX 2.73 94.57 n.d. 19.41 3.12 11.03 CZ n.d. 90.50 3.26 20.41 n.d. 3.34 LZ n.d. 90.27 2.91 7.13 n.d n.d LX 1.59 92.11 2.29 4.59 n.d. 1.91 XC 3.41 95.85 n.d. 24.33 n.d. 26.29 DX 1.28 94.95 3.01 23.97 n.d. 4.01 | Show TableDownLoad:
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对河流水质参数及METH、6-MAM和MOR加标后的浓度分别进行主成分分析，探讨7个河流水质参数与污水样品中目标物检出浓度的相关性。主成分分析过程在 SPSS 20.0软件包中进行。对所有数据进行Bartlett球形度检验，相伴概率小于0.05，进行 PCA 以获得分数图和因子载荷,经变量最大旋转后,提取出特征值大于1的因子,主成分分析如图1所示。
图 1 样品中各水质参数与三种毒品目标物的成分图Figure 1. The composition diagram of water quality parameters and three drug targets in the samplesa. METH在旋转空间的成分图； b. MOR在旋转空间的成分图； c. 6-MAM在旋转空间的成分图METH与pH及溶解氧存在较强的负相关性，说明pH或溶解氧的升高可能会导致其检出浓度的下降。MOR与6-MAM均呈现出与化学需氧量及氯离子浓度的强负相关，说明较高浓度的氯离子浓度可能造成MOR及6-MAM检出浓度不准确。此外，METH与氨氮存在明显的正相关，而水体中氨氮的主要来源是生物体代谢所产生的尿素，与人口高度密切相关。METH是中国滥用人数最多且最为广泛的毒品，氨氮浓度较大的流域为人口聚集区域，METH浓度也呈现聚集趋势。MOR及6-MAM是海洛因的代谢产物，稳定性较低，在因子分析中表现为与温度及高锰酸盐指数相关。高锰酸盐指数是反映水体中有机和无机可氧化物质污染的常用指标，结果表明在较高温度及氧化性较强的水环境中，MOR及6-MAM易于分解。
2.3 验证水质参数对模拟样品中毒品目标物的检出影响
根据实验结果，pH、氯离子浓度等均会不同程度影响3种毒品目标物的准确检出，故选取pH、氯离子浓度作为变量，设计单因素模拟实验验证其对毒品目标物稳定性的影响，此外，在应用污水验毒技术评估地区毒情及进行环境风险评估时，需要对污水及地表水中各毒品目标物进行精确定量，毒品母体及其生物标志物在不同水环境中驻留时间各不相同，也应考虑常温下不同存储时间对毒品目标物的检出影响。
2.3.1 pH对模拟样品中毒品目标物的检出影响
取pH=2、pH=4、pH=7、pH=10的模拟水样各50 mL，分别向其加入METH、6-MAM及MOR标准溶液及内标，按照1.2.4进行前处理，3种目标物的检出浓度见表6。
表 6 不同条件下模拟样品中目标物的检出浓度（ng·L−1）Table 6. Detected concentration of target in simulated samples under different conditions (ng ·L−1)条件梯度Condition Gradient METH/（ng·L−1） 回收率/%Recovery MOR/（ng·L−1） 6-MAM/（ng·L−1） MOR与6-MAM回收率/%Recovery pH 2 84.05±10.21 81.92±9.95 42.44±2.52 150.35±3.86 94.88±3.13 4 85.45±16.65 83.28±16.23 50.71±16.99 136.71±6.03 92.19±11.27 7 85.88±3.03 83.7±2.95 63.87±1.22 117.78±5.75 89.3±3.44 10 68.32±9.19 66.59±8.96 54.42±3.62 150.78±11.71 100.95±7.54 氯化钠浓度/（g·L−1） 0 57.33±1.71 55.88±1.67 34.57±0.04 81.45±0.26 57.06±0.15 1 66.99±5.53 65.29±5.39 46.97±0.77 17.49±1.13 31.58±0.94 2 54.11±1.22 52.74±1.19 33.16±1.22 0 16.21±0.6 3 53.39±1.86 52.04±1.81 38.10±0.74 0 18.62±0.36 4 50.96±3.76 49.67±3.66 35.46±1.04 0 17.33±0.51 5 55.85±0.94 54.43±0.92 37.54±2.25 0 18.35±1.1 存储时间/h 12 102.60±4.29 100±4.18 73.26±6.35 202.54±2.87 135.68±4.52 24 79.59±6.29 77.57±6.13 61.15±4.24 137.83±5.43 97.85±4.75 36 67.29±4.10 65.58±4 47.47±3.05 128.44±9.03 86.53±5.94 48 62.64±2.80 61.05±2.73 49.65±2.60 115.97±7.38 81.45±4.91 72 61.85±2.92 60.28±2.85 27.12±1.24 97.78±6.17 61.47±3.65 120 57.89±3.23 56.42±3.15 29.93±3.72 92.24±4.47 60.11±4.02 | Show TableDownLoad:
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当pH=2时，模拟样品中METH的回收率在71.97%—91.87%之间，pH值升高至4和7时，METH回收率为67.05%—99.51%，基本不变， pH升高至10时，METH的回收率明显降低，为57.63%—75.55%，即pH对METH的准确检出有影响，当水体呈现酸性及中性时，METH可以稳定存在并准确检出，在碱性水体中，METH稳定性发生改变，检出浓度下降，与实际水体因子分析的结论相符。原因可能为，在不同的pH体系中，METH的电离度及形态发生了变化。METH的结构中含有碱性的氨基官能团，溶液的pH会影响其质子化/去质子化的过程，此外，含胺类物质在水溶液中易发生光降解，且光解行为与氨基上N电子与三重激发物的转移有关，在低pH条件下，氢离子与N电子结合，阻碍了N电子向活性物的转化从而抑制其光降解，反之，N电子的可用性增强，加速了METH的降解[30]。模拟样品中，MOR在中性条件下检出浓度最高，酸性或碱性的条件下降低。6-MAM的变化趋势与其相反，中性条件下，其检出浓度最低，在酸性及碱性环境中，检出浓度较高，即pH也会干扰MOR和6-MAM在水体中的准确定量，张春水等[33]在研究中发现，海洛因的化学形式在不同pH环境下存在变化，当pH升高时，水解反应加剧，发生6-MAM向MOR的转化。实验结果对实际水体的主成分分析结果进行了补充，可知MOR在中性水体环境中较稳定，6-MAM在酸性条件下更稳定。
由图2可见，不同pH条件下， 6-MAM与MOR的浓度变化规律各不相同，两者呈现相反的趋势，在碱性水体环境中易发生6-MAM向MOR的转化，与张春水等[31]提出的海洛因在碱性条件下加速降解成MOR的结论一致。
图 2 不同pH条件下模拟样品中6-MAM和MOR的检出浓度Figure 2. Detection of 6-MAM and MOR in simulated samples at different pH conditions在实际污水验毒工作中，6-MAM与MOR均被用来估算海洛因滥用量，在pH值为2、4、7、10时，6-MAM与MOR的回收率之和分别为95%、92%、89%和100%，可知pH对于二者的定量分析及海洛因滥用量的准确估算影响较小。
2.3.2 氯离子浓度对模拟样品中毒品目标物的检出影响
取不同氯离子浓度梯度的模拟水样各50 mL，分别加入METH、6-MAM及MOR标准溶液和内标，按照1.2.4节进行前处理，结果见表6。氯化钠浓度为0 g·L−1时，3种目标物都能在模拟水环境中稳定存在。METH的检出浓度随氯离子浓度升高基本不变；MOR的检出浓度在氯化钠浓度为1 g·L−1时最高，为47.74 ng·L−1，其它浓度时在31.94—39.79 ng·L−1范围内小幅波动，因此氯离子浓度的增大对MOR的稳定性存在负影响，与2.2主成分分析所得结论吻合；6-MAM的浓度随氯离子浓度的升高变化较大，在超过2 g·L−1的氯离子浓度的水环境中不能检出。吕昱帆等[32]在对腐败血中6-MAM和MOR的检出研究中发现，在2.5 mL样品中，加入盐析剂NaCl的质量大于30 mg时，6-MAM及MOR的回收率显著降低，与2.3.2节实验结果吻合，故氯离子浓度的影响在实际应用污水验毒技术的过程中不可忽略。
2.3.3 存储时间对模拟样品中毒品目标物的检出影响
对常温（20℃）下存储不同时间的模拟水样进行前处理和定量分析，结果见表6。常温存储会使METH、6-MAM及MOR的浓度均下降，METH在120 h内降解35%左右，6-MAM在120 h内降解50%左右，MOR在120 h内降解达到了60%，即常温存储会造成METH、6-MAM及MOR在水中降解。
3. 结论（Conclusion）
（1）本文研究了山东省潍坊市的11条河流中，不同水质参数与传统精神活性物质METH、MOR、6-MAM检出浓度的相关性，运用主成分分析法进行相关性评价。结果表明，METH与pH及溶解氧存在较强的负相关，与氨氮存在明显的正相关；MOR与6-MAM均与化学需氧量及氯离子浓度负相关，与其它水质参数相关性较小。
（2）根据实际水样主成分分析结果，选取相关性较大的水质参数进行单因素模拟实验，结果表明，METH在中性及酸性环境下较稳定，MOR在中性条件下较稳定，6-MAM在酸性和碱性条件下均能稳定存在和准确检出；METH的检出几乎不受氯离子浓度的影响，但6-MAM及MOR受氯离子浓度的影响较大；常温（20℃）保存120 h后，METH、6-MAM和MOR的含量均有不同程度的下降。
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图 1 驯化期微生物碳链延长代谢表现
Figure 1. Performance of chain elongation under varied operational conditions during acclimation period
图 2 空白组与热碱预处理组的污泥厌氧发酵产SCFAs情况
Figure 2. Anaerobic fermentation of waste activated sludge for control group and thermal-alkaline pretreatment group
图 3 驯化期（Phase IV）向实验期（Phase V）转变期间的微生物碳链延长代谢表现
Figure 3. Performance of chain elongation from the acclimation period to the test period
图 4 不同周期的微生物在属水平上的群落结构
Figure 4. Genus-level microbial community during different operational phases
图 5 不同周期微生物群落结构的主成分分析结果
Figure 5. The principal component analysis (PCA) of the microbial communities during different operational phases
图 6 Phase IV和Phase V阶段的宏基因组分析结果
Figure 6. Metagenomics of microbiomes in Phase IV and V
表 1 市政污水处理厂剩余污泥的基本理化性质
Table 1. Characteristics of waste activated sludge from a municipal wastewater treatment plant
pH TS/(g∙L−1) VS/(g∙L−1) COD/(mg∙L−1) SCOD/(mg∙L−1) TKN/(mg∙L−1) TAN/(mg ∙L−1) 6.72±0.05 29.66±0.60 18.63±0.38 21 100±420 346±46 2 560±94 12.4±1.5
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表 2 不同运行周期的反应器运行条件
Table 2. Operational conditions of different phases of bioreactor for chain elongation
运行周期 HRT/d 醇酸比 运行时间/d Phase Ⅰ 20 2∶1 0~20 Phase Ⅱ 10 2∶1 21~50 Phase Ⅲ 5 2∶1 51~90 Phase Ⅳ 5 3∶1 91~120 Phase Ⅴ 5 3∶1 121~135
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表 3 驯化期不同运行条件下的总烷基量、平均碳链长度与碳效率
Table 3. Total alkyl groups, average chain length and carbon conversion efficiency of microbial chain elongation process under different operational conditions during the acclimation period
运行周期 总烷基量/(mmol·L−1) 平均碳链长度 碳效率/% Phase Ⅰ 291.8 6.82 33.4 Phase Ⅱ 543.4 6.83 62.1 Phase Ⅲ 507 5.63 72.9 Phase Ⅳ 535.6 6.51 64.8
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表 4 碳链延长(CE)过程涉及到的关键酶及其在Phase Ⅳ和Phase Ⅴ阶段微生物组中的丰度
Table 4. Key enzymes involved in chain elongation pathways and their abundance in Phase Ⅳ and Ⅴ
关键酶的名称 缩写 EC# 功能描述 不同周期酶丰度 Phase Ⅳ Phase Ⅴ Thiolase TLA 2.3.1.16 Acetyl-CoA C-acyltransferase 1 356 5 220 Ketoacycl-CoA reductase KCR 1.1.1.36 Acetyl-CoA reductase 536 4 902 Hydroxyacyl-CoA dehydratase HCD 1.1.1.157 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase 19 452 16 412 1.1.1.35 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase 5 686 15 354 2.3.1.16 Acetyl-CoA C-acyltransferase 1 356 5 220 4.2.1.17 Enoyl-CoA hydratase 13 918 15 978 Enoyl-CoA reductase ECR 5.1.2.3 3-hydroxybutyryl-CoA epimerase 666 4 922 Thioesterase TES 3.1.2.23 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase 2 740 1 968 Acetyl-CoA carboxylase ACC 6.3.4.14 Biotin carboxylase 21 802 12 782 6.4.1.2 Acetyl-CoA carboxylase 40 616 33 858 Malonyltransferase MAT 2.3.1.39 [acyl-carrier-protein]S-malonyltransferase 15 826 17 026 Ketoacyl-ACP synthase KAS 2.3.1.41 β-ketoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅰ 5 360 11 046 2.3.1.179 β-ketoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅱ 20 000 26 892 2.3.1.180 β-ketoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅲ 32 110 30 154 Ketoacyl-ACP reductase KAR 1.1.1.100 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase 32 462 40 198 Hydroxyacyl-ACP dehydratase HAD 4.2.1.59 3-hydroxyacyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase 8 812 7 466 Enoyl-ACP reductase EAR 1.3.1.9 enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase (NADH) 14 468 16 656 1.3.1.10 enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase (NADPH, Si-specified) 1 448 6 510
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