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菌渣含有丰富的蛋白、多糖、氨基酸等营养物质，若不对其充分利用，则会造成资源浪费。我国每年产生数量庞大的菌渣，其中好氧堆肥技术是实现菌渣资源化最常用途径。然而，传统堆肥腐熟过程是由自然微生物参与的生理生化过程，存在堆肥周期长、腐熟较慢等缺点[1]。目前，接种外源微生物促进堆肥过程[2]是好氧堆肥应用的常用方式。在应用广泛的外源添加物中，微生物菌剂的添加不仅能加速堆肥进程[3-5]，还可以提高堆肥产品品质。在堆肥初期，接种微生物菌剂可通过菌群联合作用缩短发酵周期[6]。因此，国内外众多学者致力于培养不同功能的微生物菌剂应用于堆肥，使其快速升温，进而缩短堆肥周期。
固态菌剂可弥补液体菌剂存货短、不易运输的缺陷[7]，故得到了广泛应用。目前，常见固态菌剂的制备方法有真空干燥法、低温冷冻干燥、喷雾干燥法等。而微生物固定化技术中的“吸附-包埋”法是近年来新兴的固态菌剂制备技术[8-10]。该技术的产品质量及保质期表现优异，广泛应用于大气和水处理中，但在农业固废处理中的应用却鲜有报道。
本研究利用“吸附-包埋”技术，以多孔淀粉为载体吸附剂[11-13]，将吸附筛选出的微生物进行冷冻干燥[14-18]得到“吸附”产品，即包埋基础产品，再将该产品通过“包埋”技术制备出可应用于菌渣堆肥体系中的新型固态菌剂，并对每个步骤的产品进行效果验证，以期为农用微生物菌剂的制备提供参考。
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1) 供试菌株。供试菌株为课题组前期筛选的堆肥用芽孢杆菌，编号为B402、B409、B508。参考文献[19]的方法制备混合菌剂：利用1.5 L Biltech-3JG-2发酵罐进行混菌发酵；优化培养基为NB，加入15 g·L−1葡萄糖和15 g·L−1酵母粉；培养参数为pH 7.5、转速 250 r·min−1、DO通气比(每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)为2.25 。制得混合菌液记为液态菌剂M，混合菌液的活菌数数量级为1010 cfu·mL−1。
2) 吸附载体及冻干保护剂。载体为多孔淀粉，购买于西安某科技公司，其产品质量符合国家标准（GB 31637-2016）。冻干保护剂有3类：糖类保护剂(乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖)、醇类保护剂(甘露醇)、防腐剂(硫代硫酸钠、抗坏血酸、维生素E)。
3) “吸附-包埋”制备法。将液态菌剂M与多孔淀粉按特定比例混合，投加保护剂后置于−80 ℃低温冰箱中预处理30 min；将预处理后的样品置于冷冻干燥机中，等待20~30 min，直到冷冻舱温度低于−40 ℃；在低温下打开真空泵开关，等待10~15 min，直到系统压力低于1.33×104 Pa；待样品干燥完全后取出，一般为24 h。
对冻干过程中用到的糖类保护剂、醇类保护剂和抗氧化剂的种类和浓度进行单因素实验，以此为基础进行响应面优化，以确定最佳冻干保护剂组合，得到粉末态固态菌剂D，记为后续包埋处理的基础产品。将固态菌剂以1∶10的比例置于无菌水中，在40 ℃、160 r·min−1的条件下培养30 min获得发酵液，活菌数的测定采用稀释平板培养计数法，发酵液进行10倍稀释后，涂布平板进行活菌计数。将发酵液在70 ℃下处理15 min 后进行冷却，采用稀释梯度平皿计数法统计活菌数即为芽孢数。通过式(1)和(2)计算存活率和芽孢率。
式中：所有活菌数的单位均为cfu·mL−1。
利用海藻酸钠和CaCl2将包埋基础产品(固态菌剂D)制备成微生物小球(即固态菌剂Q)。包埋处理可进一步提高固态菌剂的保存期，并减少外源微生物菌剂投加到堆体时产生的拮抗及抑制作用。操作过程如图1所示。
4）固态微生物菌剂的产品质量及保存期的确定。与液态菌剂相比，固态菌剂更易运输、保存，货架期更长。为评估固态菌剂中活菌的保存期，每隔7 d测定1次制得微生物菌剂(菌剂M、D、Q)的存活率作为评价指标。 不同保存温度对固态菌剂的保存期可能会产生不同影响。将上述固态菌剂D、Q平均分为3份，每份约80 g，置于食品级PE自封袋中。将其分别置于室温条件下(20 ℃左右)、4 ℃冷藏室中、−20 ℃的冷冻室中，每隔7 d测定1次存活率。
5）菌剂堆肥效果的验证。在PVC箱中进行堆肥实验，堆肥材料为菌渣和秸秆。设置3个实验组，在堆肥初期分别投加放置已保存3个月的菌剂M、D、Q，记为CK、PF、GF组。调整实验条件C/N约为20%，含水率为60%。实验装置如图2所示。
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使用Design-Expert.v8.0.6.1进行响应面分析，采用平板计数法[20]测定有效活菌数。在堆肥效果验证中，温度早晚各测定1次取平均值，且分别在0、3、5、7、14、21、28、35 d时进行翻堆取样，测定堆肥过程中的有机质(organic matter，OM)、可溶性有机质成分的变化及GI，以此衡量不同菌剂处理下的堆肥腐熟度，判断制备菌剂的实际应用效果。
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1) 菌液M与多孔淀粉比例的优化。将菌液M与多孔淀粉以不同比例混合，测定冻干后吸附菌液在多孔淀粉中的存活率[21]和芽孢率。当菌液M(体积)与多孔淀粉(质量)的比例(v∶m)大于2.5时，菌液和多孔淀粉分层现象严重，表明此时多孔淀粉对菌液M已达吸附饱和。如图3所示，随着菌液M与多孔淀粉比例不断提高，产品中活菌存活率不断上升。而从经济角度考虑，确定菌液M与多孔淀粉的最佳混合比例为2.5∶1，此时的活菌存活率为41.08%、芽孢率为46.56%。
2) 冷冻干燥保护剂选择的响应面优化。响应面优化是通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[22]。对糖类、醇类、抗氧化剂[23]进行单因素实验，进而对冷冻干燥保护剂进行响应面优化。单因素实验结果表明，糖类、醇类、抗氧化剂分别选择质量分数为10%的乳糖、质量分数为2.5%的甘露醇、质量分数为0.015%硫代硫酸钠。
基于单因素实验，选乳糖的质量分数(A)、甘露醇的质量分数(B)、硫代硫酸钠的质量分数(C)3个关键影响因素，进行3因素3水平响应面优化研究；以活菌存活率为评价指标，研究关键影响因素对冷冻干燥后所得产品的综合效应，获得固态菌剂制备的最佳方法。因素水平设计如表1所示，实验方案设计及结果如表2所示，方差分析如表3所示。
以活菌存活率为评价指标对该模型进行方差分析及模型系数检验。由表3可知，模型的P=0.05<0.05，表明模型适应性好，具有统计学意义。由P值可知，模型变量中的A2、B2、C2对存活率影响显著，说明实验因素和响应因素之间不是简单的线性关系。在该模型中，失拟误差为P=0.112 4>0.05，表明模型拟合度较好，失拟误差可能来源于实验中的随机误差。在选取的各因素水平范围内，按照响应的影响因素顺序为A(乳糖的质量分数)>C(硫代硫酸钠的质量分数)>B(甘露醇的质量分数)。
为确定3个因素的最佳组合，对其进行两两交互，绘制响应曲面及等高线图[24]，即1个因素确定1个中值，观察其他2个因素之间的交互影响，并确定最佳范围，结果见图4。
根据响应面优化结果得到冷冻干燥过程保护剂中乳糖、甘露醇、硫代硫酸钠的最佳添加比例，分别为10%~11%、2.4%~2.6%、0.012%~0.015%。根据响应面分析结果，拟合响应面方程如式(3)所示。
通过模型方程确定最佳组合：在乳糖、甘露醇、硫代硫酸钠的质量分数分别为11%、2.6%、0.013%的条件下，预测的最大存活率为91.532 1%(可信度99.8%)。根据模拟得到的最佳组合，进行验证实验。此时，冷冻干燥后菌剂中活菌的存活率为(92.43±1.43)%，芽孢率可达(68.79±2.15)%。一般来说，市面上的冻干保护剂可保证冻干后的活菌存活率>90%。评估表明，优化保护剂与市面上所售冻干保护剂效果相当。该阶段制备的固态菌剂记为菌剂D。制得的固态菌剂实物如图5所示。
活菌数是衡量菌剂质量的关键指标。液态菌剂M中内含大量的芽孢杆菌，芽孢能适应不良环境，对物理伤害和很多有毒的化学物质都有很强的抗性，而在条件适宜时又可转变为营养细胞，从事正常的代谢活动，适合制作农用微生物菌剂，因此，在测定活菌数的同时，测定芽孢率的变化。
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利用海藻酸钠和CaCl2对固态菌剂D进行包埋，得到目标产品固态菌剂Q。以成型及较好的机械强度为前提，确定了最佳CaCl2的质量分数为5%、海藻酸钠的质量分数为6%，掺入量为20%，并将其放置室温条件下失水，以此制备微生物小球。图6为制得菌剂Q的外貌形态照片。
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制备的固态菌剂属于农用微生物菌剂，故将其与农用微生物菌剂国家标准(GB 20287-2006)中的各项指标进行对比(见表4)。对比结果表明，制得的固态菌剂D、Q各项指标均符合国家标准。
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为研究不同温度条件对固态菌剂保存期的影响，研究了固态菌剂的保存温度。由图7可知，在90 d内，3种微生物菌剂的活性均呈现下降趋势。存活率下降最快的是液态菌剂M，在第60天其活性即低至无法检出，此时菌剂已严重腐臭变质，且出现了霉菌。而固态菌剂D、M在90 d后存活率仍然可达44.12%、47.69%，其有效活菌数依然达标。表4中其他指标亦可达到国家标准。
由图8中可知，不同保存温度下，固态菌剂M、Q的最终存活率均可达标，表4中涉及的其他指标在90 d后亦可达标。说明固态菌剂M、Q对保存温度并无苛刻要求。
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将制备的3种微生物菌剂放置90 d后，添加入堆肥初期的堆体中进行效果验证。由图9(a)可知，反应温度变化均呈现先上升后下降的趋势。设置3个处理组(CK、PF、GF)，以初始活菌数相同，CK、PF、GF组添加了保存6个月后的液态菌剂，PF组添加了菌剂M，添加了菌剂Q。3个处理组(CK、PF、GF)的高温期分别持续4、5、5 d，最高温分别为56、60、62 ℃，高温阶段的整体温度趋势为GF>PF>CK。由图7可知，CK处理组在3个月后发生变质、活菌数无法检出，故将其投加到堆体中并无促进作用。与PF处理组相比，GF处理组的效果更佳，说明单位质量GF组菌剂的活菌活性大于PF组，且GF组菌剂在3个月后的存活率更高(见图7)。以上结果表明，研究制得的固态菌剂可在保存若干月后仍维持较高的存活率。在整个堆肥过程中，在升温阶段，GF组菌剂的外貌形态除颜色外并无明显改变；高温期结束后，在堆体中已无法观察到颗粒态的菌剂，说明菌剂的外包结构已被破坏(海藻酸钠和可溶性淀粉已被降解)，致使微生物暴露入体系中，菌剂中的微生物的繁殖提升了堆肥温度，并加速了堆肥进程[25-26]。
随着堆肥进程深入，堆体中有机质不断消耗，呈现下降趋势(见图9(b))。随着微生物的增长繁殖，进入高温期后，有机质以较高速率降解；高温期结束时，降解速度减缓。由图9(b)可知，与放置3个月的液态菌剂相比，PF组和GF组表现出更佳的处理效果，说明与放置3个月失活的液态菌剂相比，固态菌剂存活率更能得以保证，特别是包埋后的GF组菌剂，其处理效果更佳。在堆肥后期(14~28 d)，GF组菌剂的处理效果出现较大幅度下降。其原因可能是：由于此时颗粒态菌剂外表已完全降解，菌剂已全部释放，进一步促进了堆体中有机质的降解。
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堆肥过程中堆体腐殖质的变化可衡量堆体的腐熟度。测定堆肥过程中可溶性有机质(dissolved organic matter，DOM)各成分的变化，并进行了区域积分(荧光区域积分)，结果如图10和表5所示。
在整个堆肥过程中，蛋白质的质量分数从初始的13.60%~18.13%，降至2.93%~3.88%(0~7 d)，说明高温期是蛋白质降解的主要时期。堆肥结束后，蛋白质的质量分数低至0~0.73%。腐殖酸的质量分数由最初的30.37%~33.81%增至80.43%~83.18%。与CK组相比，PF、GF处理组的微生物溶解产物较少且腐殖物质(富里酸和腐殖质)含量较高，说明添加微生物菌剂可促进堆肥的腐殖化过程。而GF处理组效果更佳说明包埋微生物菌剂在3个月后能发挥更好的作用。
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种子发芽指数(germination index，GI)是衡量堆体中是否存在毒性物质的参数之一，也被认为是判断堆肥是否腐熟的间接指标[27]。研究表明，当种子GI达到50%时，可认为堆肥产品的植物毒性在可忍耐的水平；当种子GI达到80%时，可认为堆肥已达到无毒水平，堆肥已经腐熟[27]。由图11可知，3个处理组的种子GI均大于80%，由此可判断本研究的堆体已腐熟，且因为植物毒性低、堆肥效果较好。
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1）利用“吸附-包埋”技术制备新型固态菌剂的最佳制备工艺为：将多孔淀粉与菌液以2.5∶1时混合后进行冷冻干燥，最佳冻干保护剂组合为乳糖11%、甘露醇2.6%、硫代硫酸钠0.013%，得到包埋基础产品(固态菌剂D)，对基础产品进行包埋，得到新型固态菌剂Q。
2）对制备的固态菌剂D、Q进行了产品质量分析，结果表明：初始及3个月后的各项指标均符合国家农用微生物菌剂国家标准(GB 20287-2006)，且对保存温度研究发现，制备的固态菌剂更适宜放置在阴凉干燥环境中。
3）对制备菌剂进行了品质监控，发现菌剂稳定性及存活率均处于较高水平。对菌渣堆肥效果验证表明，与添加液态菌剂M组相比，添加D、Q的2组堆体更早进入高温期，堆体启动较快，且高温期持续时间更长；有机质降解率、最终产品质量更高。上述结果说明，利用“吸附-包埋”技术制备固态菌剂在农用领域是可行的且效果较好，可为今后微生物菌剂的制备提供参考。
多孔淀粉固定化堆肥用微生物菌剂的制备条件优化及其堆肥效果验证
Preparation optimization and performance validation of microbial agent for porous starch immobilized compost
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摘要: 为提升菌渣的堆肥效率，研制了一种保质期较长且可应用于堆肥体系中的固态微生物菌剂。利用堆体中筛选出的微生物制备了混合菌液M，利用多孔淀粉作为吸附载体对其进行吸附，并经冷冻干燥得到包埋基础产品固态菌剂D，然后采用包埋技术将D制成固态菌剂Q。结果表明，新鲜制备的3个阶段微生物菌剂(M、D、Q)的各项指标均符合国家标准；制备3个月后，菌剂Q的存活率仍高达47.69%，远高于菌剂M的0，与比菌剂D提高了8.10%；最终堆肥验证中，菌剂D、Q表现出明显的优势，堆肥过程启动得更早，且腐殖酸含量分别提高了2.61%、3.44%，故菌剂Q的性能最佳。利用“吸附-包埋”技术制备固态菌剂可行且效果明显，可为微生物菌剂的制备提供参考。Abstract: To develop a solid microorganism having a longer shelf life and can be applied to the slag composting system, the mixed bacteria prepared by the microorganisms screened in the stack is prepared by “adsorption-embedded” fixation techniques. A novel solid fungicide Q is prepared by adsorbing the mixed carbide using a porous starch as an adsorption carrier, freeze-drying to obtain a embedding base product, which is recorded as a solid fungicide D, and using embedding techniques to the base product. Results show that the various indicators of freshly prepared microbacterial agents (M, D, Q) meet the national standards. After three months, the survival rate of the bacterioside Q is as high as 47.69%, which is much higher than the 0% of the bacteriosida. It increased by 8.10% compared to the bacterial agent D. In the final compost, the fungicides D and Q showed significant advantages, whereby the compost was started earlier and the humic acid content increased by 2.61%, 3.44% respectively. The bactericide Q showed the optimal performance. The preparation of solid fungicide using the "adsorption-embedded" fixation techniques was demonstrated to be feasible and satisfactory, which can provide reference for the preparation of microbial agents.
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Key words:
- porous starch adsorption /
- embedding /
- composting /
- microbial agent
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在农业生产中有大量未被完全利用的农药、化肥等可随农田退水一起汇入地表水中。农田退水中有机氮、耗氧有机物(以COD计)、无机磷酸盐等含量丰富[1]，且具有碳氮比(C/N)低、易造成面源污染等特点[2]，这使水体中氮(N)、磷(P)去除难度加大[3]。乌梁素海作为黄河中上游重要的保水、蓄水和调水湖泊，其补给水源主要是河套灌区的农田退水，其次是流域内入湖工业废水和生活污水[4]。据统计，每年排入乌梁素海的总氮为2 037.23 t，总磷为55.82 t[5]。因此，缓解乌梁素海水体N、P污染显得尤为重要。
人工湿地作为一种强化的生态处理设施，具有净化效果好、易运行管理等优点，在国内外被广泛应用于污染水体的处理[6]。人工湿地是通过植物、基质和微生物间的物理、化学和生物作用完成对进水污染物的降解[7]，且不会产生二次污染。因此，运用人工湿地缓解乌梁素海水体的N、P污染是一种更为生态、环保的措施。然而在采用人工湿地处理污水时，常因碳源不足而影响微生物反硝化过程，进而影响对污水的净化效果。因此，外加碳源是强化人工湿地脱氮效果的有效途径[8-12]。常见的有机碳源包括甲醇、乙醇等小分子有机物，但其易被微生物分解和利用，导致消耗量大，且成本较高[13]。而植物碳源具有来源充足、成本低廉、取材方便等优点，故日益受到广泛关注[14]。植物碳源可在浸泡过程中溶出大量的碳(C)，析出少量的N、P[15]，可为人工湿地提供充足碳源的同时降低系统N、P污染程度。
近年来，关于人工湿地的研究[16-20]逐年增多，对于乌梁素海富营养化的治理也受到人们普遍关注。目前，关于乌梁素海富营养化问题，一方面是从湖泊N、P等营养盐时空分布等方面进行机理上的探究[21-23]；另一方面则通过植物修复[24-25]、人工浮岛技术等治理湖泊富营养化[26]，或通过生态补水措施改善湖区水质[27]。而对运用人工湿地技术治理乌梁素海富营养化问题的相关研究十分匮乏。因此，本研究通过实验室模拟实验，选择乌梁素海大型优势水生植物芦苇、水葱，经过简单处理、碱泡处理、碱热处理，分析了不同预处理方式下芦苇、水葱2种植物碳源对C、N、P的析出规律，据此选出优质碳源，并进一步探究了添加优质碳源强化垂直潜流人工湿地处理农田退水的效果，以期为后续人工湿地治理乌梁素海农田退水处理提供参考。
1. 材料与方法
1.1 植物碳源预处理
芦苇、水葱为人工湿地常见植物[28]，是乌梁素海大型优势水生植物[29]。本研究选择以上2种植物做为植物碳源。材料收集后，使用蒸馏水清洗干净，置于50 ℃烘箱烘干至恒重后备用。将恒重后的碳源材料剪碎至1~2 cm并等分为3份：1份不再做任何处理；1份在自然条件下用2%的NaOH溶液浸泡24 h；1份在水浴90 ℃条件下用2%的NaOH溶液浸泡1 h。3种预处理方式分别标记为简单处理、碱泡处理、碱热处理。处理后的碳源材料经过水洗、调pH至中性、50 ℃烘干至恒重后备用。
1.2 碳源静态析出实验
称取经过简单处理、碱泡处理、碱热处理的2种碳源材料各2 g，加250 mL蒸馏水浸泡。每隔2 d更换瓶中蒸馏水，对浸泡液取样，测定浸泡液中COD、TN、TP浓度，计算各组实验中的C、N析出量，以选出最优植物碳源添加至后续人工湿地实验中。每个处理做3组平行。
1.3 人工湿地实验
在实验室内，采用有机玻璃(PMMA)材料构建2组构造相同的垂直潜流人工湿地系统(对照组CW0和投加碳源组CW1)，其直径为30 cm，高度为55 cm。人工湿地系统示意图如图1所示。湿地系统所填基质高度为45 cm，从下到上依次采用不同基质填充：下层20 cm，铺设粒径为10~30 mm的砾石；中层15 cm，铺设粒径为8~16 mm的炉渣和沸石的1∶1混合物；上层10 cm，铺设粒径为3~5 mm沸石及采自乌梁素海主排干区污泥1∶1混合物。分别在距离顶部15、30、50 cm处设置出水口。湿地系统中间插入直径为3 cm且带有均匀穿孔的聚氯乙烯塑料管，作为植物碳源投加区。种植植物为取自乌梁素海的大小均匀的芦苇，种植密度为10株·m−2。
图 1 垂直流人工湿地示意图Figure 1. Schematic diagram of the vertical flow constructed wetland(VFCW) system人工湿地启动前，先用取自乌梁素海主排干区农田退水进行60 d的微生物驯化。从2020年7月中旬开始，采用蠕动泵序批式间歇进水的方式通入实验用水，水力停留时间为3 d，实验用水是通过向自来水中添加C6H12O6、KNO3、NH4Cl、KH2PO4模拟乌梁素海农田退水(C/N=2)，配置后的COD为28.00 mg·L−1、TN为12.00 mg·L−1、NH4+-N为1.50 mg·L−1、NO3−-N为10.50 mg·L−1、TP为1.50 mg·L−1。
实验分为2个阶段。第1阶段为探究添加植物碳源对人工湿地净化农田退水效果的影响。CW0为对照组(不添加植物碳源)，直接通入实验用水(C/N=2)，通过计算在CW1组碳源投加区投加30 g(C/N=4)碱热处理芦苇，测定CW0和CW1组进出水各污染物浓度。第2阶段为探究碳源添加至不同C/N时人工湿地净化效果。经计算，在CW1组分批次投加35 g(C/N=5)、60 g(C/N=7)碱热处理芦苇，测定湿地系统内沿程(0.15、0.3、0.5 m)处进出水各污染物的浓度，探究不同C/N时净化效果，水力停留时间3 d，每3 d进行1次采样分析。
1.4 水质及数据分析
在90 d的实验周期内，每3 d对2组人工湿地的进出水进行1次取样分析。其中DO采用哈希HQ30d53LEDTM测定；pH采用PHS-3CW型号的pH计测定；COD、TN、TP等按照《水和废水监测分析方法》进行测定[30]。数据统计、分析、绘图则使用Excel 2016、Origin 2019和SPSS 26.0软件进行。
1.5 碳/氮源累积析出量计算方法
碳元素累积析出量根据式(1)进行计算[31]。氮元素累积析出量的计算方式与碳元素相同，以TN表征氮元素的析出量[31]。
mk=mk−1+ckv/m植物 (1) 式中：
mk ck m植物 2. 结果与讨论
2.1 不同物质成分的静态析出规律
在不同预处理方式(简单处理、碱泡处理、碱热处理)下2种植物碳源(芦苇、水葱)的碳析出规律见图2。由图2可见，2种植物碳源具有相似的析出规律：均在实验开始达到碳最大析出量，在第4天时迅速下降并逐渐趋于稳定。植物析出碳(以COD计)的过程一般分为2个阶段[32]：前期植物表层的糖类、有机酸和易溶性无机盐等水溶性物质快速分解；后期在碱作用下植物体内木质素、纤维素、半纤维素等难分解物质开始分解，且分解速率缓慢。本研究中2种植物碳源的析碳过程符合上述阶段。初期水葱中的COD值显著高于芦苇，可能是水葱表面含有更多的可溶性有机碳和易脱落的有机颗粒物[33]，这些物质迅速溶解于水中且析出碳源。芦苇经过简单处理、碱泡处理、碱热处理后的最大碳源析出量分别为110.42、135.89、148.93 mg·L−1；水葱的最大碳源析出量分别为336.01、340.05、179.41 mg·L−1。通过衡量计算得出不同预处理下平均碳源析出量：芦苇分别为21.44、24.81、27.27 mg·L−1，水葱分别为44.52、61.60、28.55 mg·L−1。比较3种不同预处理方式可见：对于芦苇，碱热处理>碱泡处理>简单处理；对于水葱，碱泡处理>简单处理>碱热处理。碱处理的植物有较好的碳源析出量，这是因为碱破坏了木质纤维素的内部酯键，木质纤维素空隙率增加，内部表面积增大，聚合度和结晶度下降，使半纤维素及木质素含量均有一定程度的降低，纤维素含量增加，且碱处理增强了纤维素的水解糖化，从而促进了有机质的析出[34]。对于2种植物，水葱在处理初期碳源析出量较大，可能引起人工湿地系统出水有机物二次污染，而且在浸泡过程中其分解残留物较多，呈絮状分散在浸泡液中，在人工湿地系统中会引起系统堵塞等问题。与水葱相比较，芦苇析出碳量适中且后续问题少，因此，确定碱热处理后的芦苇为最佳碳源用于后续人工湿地实验。
图 2 不同预处理方式下2种植物的化学需氧量析出规律Figure 2. COD release of two plants with different pretreatments由图3可以看出，在不同预处理方式下2种植物碳源TN的析出规律与COD相似。实验开始即达到TN的最大析出量(4 mg·L−1以上)，在第6天迅速下降至2 mg·L−1左右，并逐渐趋于稳定。不同处理方式下2种植物TN初期析出量存在明显差异。初期芦苇最大析出量分别为6.14、4.55、4.09 mg·L−1；水葱分别为14.30、13.45、12.45 mg·L−1。水葱TN析出量较大，N元素的大量快速析出易造成人工湿地系统水质恶化。3种预处理方式下TN平均析出量分别为：芦苇2.39、2.20、1.89 mg·L−1；水葱4.82、4.07、3.25 mg·L−1。2种植物TN平均析出量从大到小依次为简单处理>碱泡处理>碱热处理组。这说明经过碱处理后，植物的纤维素结构被破坏，在预处理过程完成氮元素的提前析出，对水质的负面影响程度降低。总体来看，2种植物经过碱泡、碱热处理后TN平均析出量均有所减少，而经过碱热处理的芦苇TN平均析出量最低为1.89 mg·L−1，故芦苇可作为人工湿地最佳外加碳源。
图 3 不同预处理方式下2种植物的总氮析出规律Figure 3. TN release of two plants with different pretreatments随着植物的分解，其中所含有的磷元素也会析出到水中，因此，考察植物在水中析出的TP量非常必要。不同预处理方式下2种植物碳的TP析出规律见图4。由图4可以看出，水葱TP析出量明显高于芦苇，芦苇在不同预处理方式下TP析出量始终在0.60 mg·L−1以下，并且缓慢下降并趋于稳定；水葱初期TP析出量超过1.00 mg·L−1，第4天迅速降至0.50 mg·L−1左右，并趋于稳定。在不同处理方式下，初期芦苇最大析出量分别为0.58、0.50、0.15 mg·L−1，水葱为3.29、2.79、1.25 mg·L−1；芦苇平均析出量分别为0.18、0.16、0.09 mg·L−1，水葱为0.58、0.74、0.35 mg·L−1，水葱3个处理组TP析出量均很高，而磷元素的快速大量析出易造成人工湿地系统水质富营养化。因芦苇碱热处理组TP析出量最小，可做人工湿地最佳外加碳源。
图 4 不同预处理方式下2种植物的总磷析出规律Figure 4. TP release of two plants with different pretreatments2.2 碳、氮累积析出特性及累积量的C/N分析
将2.1部分不同预处理下2种植物析出的碳、TN实测值通过1.5部分公式计算得出对应碳、氮累积析出量数值，后用MATLAB软件进行线性拟合。
以COD计算碳的累积析出量，经 MATLAB 线性拟合后所得的拟合方程见图5。曲线R2均达0.94以上，表明碳累积析出量的拟合曲线能够反映释碳规律。由图5可知，不同预处理下芦苇碳累积析出量分别为20.90、25.05、27.82 mg·g−1；水葱分别为50.25、62.92、30.37 mg·g−1。碳累积量从大到小的顺序为：芦苇为碱热处理>碱泡处理>简单处理；水葱为碱泡处理>简单处理>碱热处理。对于芦苇，随着时间推移，碱热处理组的碳累积量拟合曲线趋于平行于X轴所需时间较长，具备持久析出碳源的特性，而简单处理和碱泡处理的碳源持久析出特性欠佳；对水葱而言，简单处理和碱热处理持久析出碳源特性欠佳，碱泡处理具备持久析出碳源特性。结合图2可以看出，2种植物碳源前期碳析出速率较快，而后逐渐达到平衡。
图 5 不同预处理方式下2种植物的碳累积析出量Figure 5. Carbon cumulative emissions of two plants with different pretreatment以TN浓度计算氮的累积析出量，后将2种植物的氮累积析出量进行线性拟合(图6)，拟合度均达0.97以上，说明拟合曲线能够反映实际氮析出规律。由图6可见，经简单、碱泡、碱热处理后芦苇氮累积析出量分别为1.90、1.68、1.45 mg·g−1；水葱分别为4.16、3.53、2.70 mg·g−1。2种植物氮累积析出量由大到小的顺序依次为：简单处理组>碱泡处理组>碱热处理组。总体来看，2种植物经过碱泡处理、碱热处理后氮累积析出量均有所减少，经过碱热处理芦苇氮累积析出量最低，为1.45 mg·g−1。结合图3可知，2种植物前期氮析出速率较快，且随着时间的延长逐渐达到平缓。
图 6 不同预处理方式下2种植物的氮累积析出量Figure 6. Nitrogen cumulative emissions of two plants with different pretreatment不同预处理下的2种植物在碳、氮元素析出过程中累积析出量的比值(C/N，以COD与TN比值表征)特征见图7。在不同预处理下，芦苇C/N平均值为11.92、17.03、21.67；水葱13.16、18.65、11.79。随着时间的延长，植物固体碳源中的纤维素类物质逐渐分解析出到水中，碳、氮析出量逐渐减少，导致C/N值先下降后趋于平稳。碱处理能够加速碳元素析出，去除大量氮元素，从而有较高的C/N。经过碱热处理的芦苇释所含碳元素较多、氮元素较少，C/N最大为21.67，故可优选为人工湿地外加碳源。
图 7 不同预处理下2种植物的碳、氮累积析出量的比值Figure 7. Ratio of carbon and nitrogen cumulative emissions of two plants with different pretreatment2.3 植物固体碳源添加对人工湿地净化效果影响
将优选出的经过碱热处理的芦苇投至CW1组中，以探究碳源添加对人工湿地处理污染物的强化效能。湿地进出水COD变化见图8(a)。可以看出，2组人工湿地系统进水COD平均值为29.02 mg·L−1，CW0和CW1出水COD平均值分别为7.62 mg·L−1和10.66 mg·L−1，去除率分别为73.67%和63.38%。2组人工湿地系统出水COD有相似的变化趋势。整个实验期间CW1出水COD始终是高于CW0。CW1出水COD较高的原因是，所添加的植物碳源的半纤维素和纤维素逐渐水解而不断析出有机物[35]。
图 8 添加植物碳源对湿地系统化学需氧量去除的影响Figure 8. Effect of COD removal in wetlands after adding plant carbon在CW1中再次分别投加35 g和60 g经碱热处理的芦苇，以调节系统初始水质C/N为5、7，从而探究不同C/N条件下污染物的去除情况。由图8(b)可见，在不同C/N下，其出水COD均低于进水COD，但随着C/N增大，出水COD有所增加。CW0系统C/N为2，COD去除率为73.67%，当C/N为4、5、7时，COD去除率分别为63.38%、55.20%、45.68%。C/N增加会导致系统出水COD增加，去除率降低。这说明过量添加碱热处理的芦苇一定程度上会削弱湿地系统对COD的去除效果，同时也说明C/N是影响人工湿地高效处理COD的关键因素。当湿地系统COD较高时，会导致溶解氧大量减少，从而抑制微生物的硝化去污能力；而当COD过低时，由于碳源不足，反硝化又受到抑制[36]，因此，应将外加碳源控制在合适的范围内。
不同C/N条件下湿地内自上而下沿程(0.15~0.5 m)COD变化见图8(c)。可以看出，CW0系统COD浓度沿程各部分基本一致，0.15 m以下COD降低至10 mg·L−1以下，此时系统内碳源严重不足，会影响系统的脱氮效果。当C/N为4、5、7时，湿地内沿程COD均高于CW0，而且系统底层(0.5 m)COD略高于中上层，微生物反硝化所需碳源更充足。
图9(a)反映了2组人工湿地进出水TN的变化规律。可以看出，2组人工湿地进水TN的平均质量浓度为12.01 mg·L−1，CW0和CW1出水TN的平均质量浓度分别为6.80 mg·L−1和3.35 mg·L−1。结合图9(a)和图9(b)可知，CW0和CW1 中的TN平均去除率分别为43.72%和72.00%，CW1显著高于CW0(P<0.05)。由此可知，植物碳源的添加增强了湿地系统对TN的去除。这与晋凯迪等[37]研究结果一致，证明了植物碳源调控提高人工湿地脱氮效果的可行性与高效性。
图 9 添加植物碳源对湿地系统总氮去除的影响Figure 9. Effect of TN removal in wetlands after adding plant carbon不同C/N条件下进出水TN浓度及去除率见图9(c)。CW0的TN去除率最低为43.72%，C/N从4提高到7，TN去除率先升高后降低，分别为72.00%、75.67%、69.94%。 C/N为7时的TN去除效果降低，是由于碳源投加量较大，随着反应进行，系统内溶解氧被逐渐消耗，使硝化反应受到抑制，并且添加量较大会导致植物析出氮素增多，从而影响TN去除效果。当C/N较低时，会造成人工湿地系统中电子供体不足，抑制微生物反硝化，从而降低了人工湿地系统脱氮效率[38]。李晓晨等[39]指出，满足完全反硝化的C/N在4~15，但C/N会随着人工湿地的运行情况、碳源类型等不同而发生变化，所以，人工湿地最适C/N比的探讨需要针对某一特定情况进行研究。本实验中根据TN去除效果可知，其最适C/N为5。
图9(d)反映了添加碳源至不同C/N时湿地自上而下沿程(0.15~0.5 m)TN浓度的变化情况。可以看出，TN平均浓度沿程逐渐降低，去除率则沿程逐渐升高，底层(0.5 m)脱氮效果好于中上层。其可能的影响因素是溶解氧，底层溶氧浓度较低，更利于微生物进行反硝化作用脱氮。CW0系统因缺乏碳源，不能为微生物反硝化作用提供充足的电子供体，导致其脱氮效果较差，沿程TN浓度降低缓慢。添加C/N为4、5、7时的CW1系统在0.15 m以下TN浓度持续降低，明显低于CW0，脱氮效率较高。C/N=5的系统TN浓度沿程降低幅度最大，其次为C/N=7系统、C/N=4系统、CW0系统。
图10(a)描述了2组人工湿地进出水TP的变化规律。可以看出，进水的TP平均浓度为1.53 mg·L−1，CW0和CW1出水TP的平均浓度分别为0.32 mg·L−1和0.15 mg·L−1，结合图10(b)可知，平均去除率分别为78.86%和90.45%，CW1的TP去除率显著高于CW0(P<0.05)。人工湿地对磷的去除主要是通过基质吸附、微生物以及植物吸收等作用实现。在人工湿地运行初期，因植物生长密度较低，致使其发挥的作用较低，而在基质吸附能力较差的情况下，微生物的除磷作用则更为重要[40]。同时，在厌氧条件下，兼性反硝化细菌能够利用硝态氮作为电子受体，可产生与氧同样的摄磷作用，从而能将反硝化脱氮与生物除磷2个相互独立的过程有机地联合在一起[41]。通过在人工湿地中添加植物碳源，系统中反硝化菌和聚磷菌都可获得充足的碳源进行反硝化和吸磷，进而同步提高了人工湿地的脱氮除磷效果。
图 10 添加植物碳源对湿地系统总磷去除的影响Figure 10. Effect of TP removal in wetlands after adding plant carbon从图10(c)可以看出不同C/N条件下湿地出水TP浓度及去除率。CW0的TP去除率最低为78.86%，当C/N从4提高到7时，TP去除率先升高后降低，分别为90.45%和91.37%、83.39%。当C/N提高到7时，因为过量的碳会消耗溶解氧，从而影响聚磷菌吸磷，使TP去除率降低。湿地系统内添加的植物碳源不仅为微生物反硝化作用提供电子供体，还可以作为微生物生长的载体，故随反应时间的持续，湿地系统内微生物量逐渐增大，从而加大了对湿地系统内P元素的吸收[42]。结合图9(c)可知，外加碳源至C/N为5时，湿地系统内的TN、TP去除效果较好，达到了同步强化脱氮除磷的目的。
不同C/N下湿地内自上而下沿程(0.15~0.5 m)TP浓度的变化情况见图10(d)。可以看出，C/N为4和5的系统TP平均浓度随沿程低于CW0，碳源的添加强化了湿地系统的TP去除效果。在CW0及C/N为4的湿地系统内，二者TP去除效果随沿程增加而增强，底层(0.5 m)去磷效果最好；在C/N为5的湿地系统内，自上而下沿程TP的去除效果相差不大，且效果较好，为最适碳氮比。C/N为7的系统因碳源增加底层除磷效果变差，溶氧可能是限制因素。
3. 结论
1)2种植物碳源经简单处理、碱泡处理和碱热处理后，依据其COD、TN、TP的平均析出量可知，碱热处理的芦苇能提供大量碳源，氮、磷析出较少，可作为人工湿地的优质外加碳源，且具备持久析出碳源的特性。
2)人工湿地系统中添加碱热处理的芦苇时，在不显著增加系统出水COD的前提下，总氮、总磷平均去除率可达75.67%、91.37%，显著提高了人工湿地的脱氮除磷能力。
3)通过添加不同量植物碳源以调控初始水质C/N，发现植物碳源添加的最适C/N为5，此时可达到同步强化脱氮除磷的目的。
4)由沿程(0.15~0.5 m)变化可知，在碳源充足的情况下，TN、TP在人工湿地底层的去除效果好于中上层，底层微生物反硝化作用强，可促进系统脱氮。其中，氧气可能是脱氮的限制因素之一。
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图 3 不同菌液与淀粉比例下的存活率及芽孢率
Figure 3. Bacteria survival rate and spore rate under different ratios of bacterial liquid to starch
图 6 将微生物小球室温下失水后得到的固态菌剂Q
Figure 6. Solid agent Q obtained by dehydration of microbial balls under room temperature
图 7 3种制备菌剂的存活率随时间的变化
Figure 7. Changes of the survival rate of the three preparation agents over time
图 8 菌剂D、Q在不同保存温度下的存活率
Figure 8. Survival rate of bactericidal agent D and Q at different storage temperatures
图 9 堆肥过程中温度和有机质的变化
Figure 9. Changes of temperature and organic matter during composting
图 10 堆肥过程中DOM的三维荧光图
Figure 10. Three-dimensional fluorescence of DOM during composting
表 1 设计因素编码与水平
Table 1. Design factor coding and level
水平 因素 A B C −1 8% 2% 0.010% 0 10% 2.5% 0.015% 1 12% 3% 0.020% 注：A为乳糖的质量分数；B为甘露醇的质量分数；C为硫代硫酸钠的质量分数。 
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表 2 响应面优化设计及实验结果
Table 2. Response surface optimization design and experimental results
分组 因素 活菌存活率 A B C 1 12% 2.5% 0.020% (79.86±0.06)% 2 10% 2% 0.020% (84.20±0.02)% 3 12% 2.5% 0.010% (89.90±0.13)% 4 10% 2.5% 0.015% (90.56±0.02)% 5 12% 3% 0.015% (89.60±0.06)% 6 8% 2.5% 0.020% (78.50±1.04)% 7 8% 2% 0.015% (78.69±0.13)% 8 10% 2% 0.010% (83.50±0.09)% 9 10% 2.5% 0.015% (89.60±0.12)% 10 10% 2.5% 0.015% (91.60±0.04)% 11 10% 3% 0.010% (84.20±0.26)% 12 8% 3% 0.015% (75.90±0.11)% 13 10% 2.5% 0.015% (89.14±0.02)% 14 10% 3% 0.020% (79.50±0.14)% 15 10% 2.5% 0.015% (88.90±0.06)% 16 8% 2.5% 0.010% (77.21±0.08)% 17 12% 2% 0.015% (81.50±0.27)% 注：A为乳糖的质量分数；B为甘露醇的质量分数；C为硫代硫酸钠的质量分数。
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表 3 回归方程的方差分析表
Table 3. Analysis of variance table for regression equation
因素及误差 变差平方和 自由度 均方 F Pr> F 显著性 A(乳糖) 116.74 1 116.74 42.15 0.000 3 + B(甘露醇) 0.21 1 0.21 0.077 0.788 8 C(Na2S2O3) 20.32 1 20.32 7.34 0.030 3 + AB 29.65 1 29.65 10.71 0.013 6 + AC 32.09 1 32.09 11.59 0.011 4 + BC 7.29 1 7.29 2.63 0.148 7 A2 105.68 1 105.68 38.16 0.000 5 + B2 52.39 1 52.39 18.92 0.003 4 + C2 54.04 1 54.04 19.51 0.003 1 + 模型 442.38 9 49.15 17.75 0.000 5 + 残差 19.39 7 2.77 失拟误差 14.41 3 4.80 3.86 0.112 4 纯误差 4.98 4 1.24 − 注: Pr > F表明无显著影响的概率。“+”为显著相关。
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表 4 自制微生物菌剂性能与国家标准的对比
Table 4. Comparison of self-made microbial agents and national standards
菌剂类型或国家标准 有效活菌数/(cfu·g−1) 霉菌杂菌数/(cfu·g−1) 水分 细度 pH 保证期 农用微生物菌剂国家标准（粉剂）（GB 20287-2006） ≥2×108 3.0×106 ≤35% ≥80% 5.5~8.5 6个月 自制微生物菌剂D ≥1.7×1010 0 6.25% 合格 6.66±0.02 − 自制微生物菌剂Q ≥3×109 0 ≤15% 合格 6.98±0.08 −
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表 5 三维荧光各区域DOM含量变化
Table 5. Change of DOM content in each region of three-dimensional fluorescence
处理组 堆肥时期 各DOM区域组分含量 区域Ⅰ 区域Ⅱ 区域Ⅲ 区域Ⅳ 区域Ⅴ CK 0 3.27% 10.33% 5.84% 38.21% 30.37% 第7天 0.51% 3.37% 7.02% 19.98% 70.32% 第35天 约为0 0.92% 6.79% 13.67% 80.43% PF 0 5.47% 12.66% 6.86% 41.85% 33.16% 第7天 0.54% 3.21% 6.53% 20.55% 70.51% 第35天 约为0 0.34% 6.27% 12.97% 82.53% GF 0 3.54% 11.54% 6.47% 43.17% 33.81% 第7天 0.36% 2.57% 6.32% 18.59% 73.82% 第35天 约为0 约为0 5.92% 13.20% 83.18%
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