由于DAMO过程最有可能发生在甲烷和氮源丰富的厌氧或缺氧环境中^[24]，为提高富集成功率，本研究接种污泥来自于北京市海棠花溪河道底泥，北京市小红门再生水厂回流污泥，延庆水稻田土和延庆池塘底泥，培养液成分与ETTWIG培养时一致^[25]。

实验采用SBR进行富集，装置如图1所示。反应器为玻璃材质，采用双层结构，夹层为水浴间，起恒温保温作用。反应器内径为15 cm、高为30 cm，内部有效体积为4.0 L，分为液相区(3.0 L)和顶部气相区(1.0 L)。进样口和取样口处设置橡胶塞，防止环境中氧气进入反应器。富集期间保持严格厌氧，溶解氧浓度低于检出限。通过底部磁力搅拌器混合培养液，通过下部进气口通入甲烷，采用循环水浴保持温度恒定在35 ℃，采用HCl或KOH溶液调节反应器pH保持在7.0~7.5。

由于DAMO微生物倍增时间长且富集时间久，为防止大量微生物流失，反应器氮源通过高浓度氮浓缩液的方式在加料口补充，以减少进出水导致的生物量流失。SBR运行周期包括进水-反应-沉淀-排水，一个运行周期为30 d，每个月最后一天停止搅拌使反应器沉淀4 h，排去反应器内1/2水，补充培养液至3 L，继续正常运行。每5 d对反应器中甲烷更新一次，保证甲烷充足。每周取水样2~3次，持续监测反应器中${\rm{NH}}_4^ +$、${\rm{NO}}_2^ -$和${\rm{NO}}_3^ -$浓度的变化。

富集培养分为2个阶段，在阶段1中首先采用硝态氮为氮源进行DAMO古菌的富集，在反应器运行稳定后，再进行不同氮源的反应器富集效果对比(阶段2)。阶段1中的具体方法为：采用SBR对原始泥样进行为期80 d的初期培养，加入新鲜培养液，氮源仅为${\rm{NO}}_3^ -$，投加${\rm{NO}}_3^ -$浓缩液使反应器中${\rm{NO}}_3^ -$浓度在50~110 mg·L⁻¹，持续监测${\rm{NO}}_3^ -$浓度，计算转化速率，当${\rm{NO}}_3^ -$消耗殆尽时，再补充${\rm{NO}}_3^ -$浓缩液，保证底物不受限。阶段2的具体方法为：平行启动2组SBR，在SBR-1和SBR-2反应器中分别接种500 mL的初期富集培养物，加入培养液到3 L混合均匀。SBR-1加入氮源仅为${\rm{NO}}_3^ -$(30~50 mg·L⁻¹)，SBR-2加入氮源为${\rm{NO}}_3^ -$(40~70 mg·L⁻¹)、${\rm{NH}}_4^ +$(30~70 mg·L⁻¹)、${\rm{NO}}_2^ -$ (10 mg·L⁻¹)，持续监测${\rm{NH}}_4^ +$、${\rm{NO}}_2^ -$、${\rm{NO}}_3^ -$浓度，当底物消耗殆尽时，再补充氮浓缩液，保证底物不受限。研究不同氮源反应器DAMO功能菌富集效果的影响。

采用有效体积150 mL的透明血清瓶进行实验，加入20 mL活性较高的SBR-2中富集220 d的培养物与100 mL新鲜培养液，用高纯氮气(99.999%)向液相中曝气10 min，橡胶塞密封，维持瓶中厌氧环境。采用排液法向瓶内充99.99%的甲烷40 mL，为避免多氮源体系中反应复杂对DAMO活性影响研究产生干扰，血清瓶中只加硝态氮，硝态氮初始浓度50 mg·L⁻¹，进行避光、150 r·min⁻¹恒温振荡培养，待体系稳定后进行影响因素实验。

本研究设置3个影响因素实验(表1)，包括pH、温度与甲烷分压。每组实验设置3个平行，甲烷分压通过调节顶空甲烷与氮气比例设置，pH通过加入HCl和KOH溶液调节。

硝态氮、亚硝态氮、氨氮采用分光光度法进行测定(DR6 000，HACH)，MLVSS采用重量法进行计算。甲烷总量为气相甲烷与液相甲烷之和，气相甲烷采用Techcomp公司GC7 900气相色谱仪和FID检测器(美国安捷伦科技公司)进行检测，液相中甲烷浓度按照式(1)进行计算。

式中：${X}_{\mathrm{s}}$为溶液中甲烷浓度；${X}_{\mathrm{a}}$为摇晃后顶空甲烷浓度；${V}_{\mathrm{a}}$为顶空体积，mL；${b}$为甲烷液气分配系数，25 ℃时取0.03；${V}_{\mathrm{s}}$为溶液体积，mL。

在SBR-1和SBR-2反应器运行结束后，取2个反应器中适量样品进行DNA提取。DNA提取及纯化过程参照北京艾德莱生物科技有限公司DNA快速提取试剂盒说明书进行，将提取并纯化的DNA样品委托北京美吉生物医药科技有限公司进行第二代高通量测序。采用表2所示引物进行PCR扩增。高通量测序在Illumina Hiseq 2000平台(Illumia, San Diego, USA)上进行。相似度97%以上的序列合并为一个操作分类单位(OTU)。根据OTU聚类，进行各分类学水平上的群落结构与组成分析。

图2(a)表示在阶段1(0~80 d)的SBR中${\rm{NO}}_3^ -$、${\rm{NO}}_2^ -$、${\rm{NH}}_4^ +$浓度随时间的变化。由图2(a)可知，外加氮源仅为${\rm{NO}}_3^ -$，当${\rm{NO}}_3^ -$浓度低于5 mg·L⁻¹时，补充${\rm{NO}}_3^ -$保证基质不受限，在整个培养初期，${\rm{NO}}_2^ -$浓度在0~5.06 mg·L⁻¹，未发生${\rm{NO}}_2^ -$积累，氨氮浓度持续缓慢升高，通过换水的方式控制，分析氨氮的产生主要由于大量微生物细胞死亡裂解所致。

根据图2(b)对培养初期SBR中硝态氮降解速率进行了分析，可以看出，硝态氮降解速率可明显分为3个阶段。0~17 d时反应器${\rm{NO}}_3^ -$降解速率较低，且呈逐渐下降趋势，从45 mg·(L·d)⁻¹降至11 mg·(L·d)⁻¹，此时初始接种物中残留有机碳为反硝化过程提供碳源。17~30 d时${\rm{NO}}_3^ -$降解速率呈现先升高后降低的趋势，由11 mg·(L·d)⁻¹逐步升高至79 mg·(L·d)⁻¹再降低至20 mg·(L·d)⁻¹。前期上升的原因为，反应器进入内源代谢阶段，微生物利用自身贮藏物质和酶等来取得营养物质，此时大量细胞裂解死亡产生的碳源为反硝化提供电子供体，硝氮降低速率逐渐上升；后期下降的原因为，反应器内残余的除甲烷外的碳源被不断消耗而得不到补充，内源反硝化活性不断降低，硝氮降低速率逐渐下降。31~80 d反应器${\rm{NO}}_3^ -$降低速率逐渐趋于稳定，基本保持在5 mg·(L·d)⁻¹到30 mg·(L·d)⁻¹，反应器进入漫长的停滞期。此外，在第40天和第80天分别测定CH₄消耗速率与${\rm{NO}}_3^ -$消耗速率之比，用来表示DAMO对${\rm{NO}}_3^ -$转化的贡献占比。40 d时CH₄/${\rm{NO}}_3^ -$消耗计量比为0.06，80 d时CH₄/${\rm{NO}}_3^ -$消耗计量比为0.18，虽然仍未达到DAMO理论计量比0.625，但比值升高表明DAMO过程对${\rm{NO}}_3^ -$降解的贡献占比缓慢升高。

为提高富集成功率，在初期培养后分别采用含有不同氮源的SBR反应器对DAMO微生物进行培养，SBR-1氮源为${\rm{NO}}_3^ -$，SBR-2氮源为${\rm{NO}}_2^ -$、${\rm{NO}}_3^ -$、${\rm{NH}}_4^ +$，反应器运行方式同初期富集方式。图3(a)与图3(b)分别表示SBR-1和SBR-2反应器中${\rm{NO}}_2^ -$、${\rm{NO}}_3^ -$、${\rm{NH}}_4^ +$浓度随时间变化过程。由图3(a)可知，SBR-1中${\rm{NO}}_2^ -$浓度始终在6.3 mg·L⁻¹以下，未发生${\rm{NO}}_2^ -$积累，氨氮浓度持续到第113天时开始下降，直到第140天时降为0 mg·L⁻¹，此后再未出现氨氮的积累，这表明微生物死亡率下降，由细胞裂解产生的氨氮不再出现，反应器内源反硝化阶段结束。

对SBR-1和SBR-2反应器中硝态氮转化速率进行分析，结果如图4(a)与图4(b)所示。富集结束时SBR-1硝氮降低速率为0.3 mg·(L·d)⁻¹，SBR-2硝氮降低速率为2.8 mg·(L·d)⁻¹。虽然反硝化速率有所波动，但从80~220 d的平均值也可以看出，SBR-1硝氮降低速率平均值为0.90 mg·(L·d)⁻¹，SBR-2硝氮降低速率平均值为1.38 mg·(L·d)⁻¹，所以多氮源相比于单一氮源的反应器更有助于DAMO古菌的富集。其主要原因可能是，在多氮源反应器中除了硝氮外，还添加了氨氮与亚硝氮，在厌氧环境下培养出部分anammox细菌，anammox细菌对${\rm{NO}}_2^ -$的亲和常数要低于DAMO细菌，对${\rm{NO}}_2^ -$的竞争能力更强，限制了DAMO细菌的大量繁殖，从而促进DAMO古菌对甲烷的利用，有利于DAMO古菌的富集。所以Anammox-DAMO系统联合作用有助于DAMO古菌的富集培养，从而提高硝氮转化速率。这与FU等^[26]的研究结果一致，他们发现，在添加不同氮源时DAMO功能菌的富集培养过程中，当采用${\rm{NO}}_2^ -$、${\rm{NO}}_3^ -$、${\rm{NH}}_4^ +$为氮源时硝氮转化速率最快。前期有研究^{[12, 27-28]}表明，DAMO微生物富集时间在300~600 d时反硝化速率为0.18~2 mmol·(L·d)⁻¹，本实验在220 d时就达到了2.8 mg·(L·d)⁻¹，有效缩短了培养时间。

由表3可知，SBR-1和SBR-2反应器在富集末期存在明显的CH₄消耗，这说明在2个反应器中均存在DAMO过程。此外2个反应器中实际CH₄/${\rm{NO}}_3^ -$消耗计量比均小于理论DAMO计量比值，引起这一偏差的原因，可能是由于系统中存在有机残留物(如微生物代谢产物等)时的异养反硝化作用所导致的。

1)不同氮源反应器微生物多样性差异分析。富集结束后对SBR-1和SBR-2中的微生物进行了群落结构分析(表4)。shannon、simpson指数反映群里多样性，simpson指数越大，说明群落多样性越低，shannon值越大，说明群落多样性越高，chao、ace指数反映群落丰富度，值越大，群落丰富度越高^[29]。综合SBR-1和SBR-2反应器中古菌多样性指数可以看出，SBR-2比SBR-1中古菌的多样性更高，丰富度更高。而从细菌群落多样性指数可以看出，SBR-1比SBR-2多样性更高，但SBR-2丰富度更高。所以多氮源富集培养DAMO比仅用硝氮培养DAMO的反应器群落结构更加丰富，微生物多样性更高。

2)不同氮源反应器微生物群落结构分析。对2个反应器中细菌群落与古菌群落结构差异进行了详细解析。对细菌门水平分析发现，SBR-1中丰度前5的门及其占比分别为Proteobacteria (23.12%)>Patescibacteria (17.83%)>Chloroflexi (14.55%)>Actinobacteria (11.88%)>Acidobacteria (9.72%)。SBR-2中丰度前5的门及其占比分别为Patescibacteria (27.29%)>Chloroflexi (16.06%)>Proteobacteria (15.30%)>Actinobacteria (11.11%)>Bacteroidetes (6.91%)。需特别注意的是，2个反应器中均含有少量的NC10门细菌，其中SBR-1中NC10占0.16%，SBR-2中NC10占0.1%，NC10门细菌是典型的亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化反硝化细菌^[30]，其主要利用${\rm{NO}}_2^ -$为电子受体，甲烷为电子供体，在厌氧环境下进行反硝化型甲烷厌氧氧化，从而达到废水中溶解甲烷与${\rm{NO}}_2^ -$的同步去除。

根据图5，对不同氮源SBR中细菌在目和属水平上进行分析，发现Candidatus_Nomurabacteria目在SBR-1和SBR-2中占比分别为6.54%和3.38%，其通常大量参与氮、硫和铁循环的自养类群，与溶解氧负相关。此外，在SBR-1和SBR-2中均发现厌氧氨氧化细菌，SBR-1中厌氧氨氧化菌占0.30%，SBR-2中厌氧氨氧化菌占0.56%。具体共有3种厌氧氨氧化菌属：Candidatus_Brocadia在SBR-1中占0.29%，在SBR-2中占0.24%；Candidatus_Kuenenia在SBR-1中未发现，在SBR-2中占0.29%；Candidatus_Anammoximicrobium在SBR-1中占0.01%，在SBR-2中0.03%。可见，在SBR-2中厌氧氨氧化细菌的相对丰度大于SBR-1中。虽然SBR-1的微生物培养时并未外加氨氮与亚硝氮，但大量细胞裂解死亡产生的氨氮为厌氧氨氧化菌的存在提供条件，且亚硝氮的存在很可能是由于DAMO古菌将${\rm{NO}}_3^ -$还原为${\rm{NO}}_2^ -$，所以从侧面证实DAMO古菌存在的可能。

对含有不同氮源SBR中古菌门水平群落结构分析可知，SBR-1和SBR-2中前5类主要的门种类一致。其中，广古菌门Euyarchaeota在SBR-1和SBR-2中丰度均为最高，占比分别是82%和80%，它通常包含了古菌中的大多数种类，包括产甲烷菌、在极高盐浓度下生活的盐杆菌、一些超嗜热的好氧和厌氧菌等。其他古菌占比依次为奇古菌门Thaumarchaeota (SBR-1中占8.0%，SBR-2中占6.2%)、泉古菌门Crenarchaeota (SBR-1中占5.7%，SBR-2中占3.7%)和纳古菌门Nanoarchaeaeota (SBR-1中占0%，SBR-2中占6.7%)。

由图6可知，对含不同氮源SBR中的古菌属水平进行分析发现，SBR-1中丰度前5的属及其占比分别为：甲烷杆菌属Methanobacterium (49.76%)>甲烷短杆菌Methanobrevibacter (10.04%)>甲烷八叠球菌Methanosarcina (9.76%)>Methanomassiliicoccus (2.42%)>Rice_Cluster_I (2.26%)。SBR-2中丰度前5的属及其占比分别为：甲烷杆菌属Methanobacterium (40.99%)>甲烷八叠球菌Methanosarcina (11.93%)>甲烷短杆菌Methanobrevibacter (10.85%)>Methanomassiliicoccus (2.70%)>甲烷鬃毛菌Methanosaeta (2.20%)，可见，2个反应器中主要微生物均为产甲烷古菌，同时，均发现能够进行硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化反硝化(DAMO)的古菌Candidatus_Methanoperedens，分别在SBR-1中占0.02%，SBR-2中占0.03%。可见，DAMO古菌相对丰度在多氮源的SBR-2反应器中占比略高于单一氮源的SBR-1反应器。结合之前微生物细菌的比较分析，可发现，厌氧氨氧化细菌较多时DAMO古菌丰度更高，分析原因主要由于厌氧氨氧化细菌可限制DAMO细菌的增殖，减少其对甲烷的竞争，从而促进DAMO古菌对甲烷的利用，有利于DAMO古菌的富集，所以多氮源反应器中厌氧氨氧化细菌的增殖有助有DAMO古菌的富集。

1) pH对DAMO活性的影响。不同pH条件下的DAMO过程中的反硝化速率如图7所示。当pH为5.0、6.0、7.0、8.0时，对应的7 d内平均反硝化速率分别为0.222、0.296、0.292、0.178 mg·(L·d)⁻¹。说明当pH为6.0时，反硝化速率最大，而pH为7.0时，反硝化速率略低于pH为6.0时。这也说明，当pH在6~7时DAMO活性最强，pH过高或过低均会抑制DAMO活性。目前已报道的DAMO微生物富集培养适合的pH多在6~8^[31]，ZHU等^[32]的研究认为，当pH为7.4时DAMO反应活性最强，而HE等^[33]研究表明，最适pH为7.6，在低于7.6时DAMO活性就会受到抑制。

2)温度对DAMO活性的影响。理论上，由于温度越低，甲烷在水中的溶解度越高，反应器中可利用的甲烷越多，反应性运行效能越好，但过低的温度会抑制反应器中微生物的活性，所以研究温度对DAMO反应的影响至关重要。图8显示了不同温度梯度下DAMO过程反硝化速率变化，可见，在当温度为25、30、35、40 ℃时，对应的7 d内平均反硝化速率分别为0.085、0.151、0.292和0.147 mg·(L·d)⁻¹。所以，温度为35 ℃时，反硝化速率最大，DAMO活性最强。何崭飞^[34]经过短期与长期不同温度的DAMO微生物培养也表明最适温度为35 ℃。而最新研究^[35]表明，当长期运行时，MBfR温度从逐步从25 ℃降低到10 ℃仍能获得较好的DAMO活性，氮去除速率为0.13 kg·(m³·d)⁻¹，所以，长期运行时温度对反应器的影响还需进一步探究。

3)甲烷分压对DAMO活性的影响。由于甲烷是DAMO过程的唯一碳源，而甲烷在水中的溶解度低限制了DAMO微生物的培养。在本研究中，当设置甲烷分压为25、50、75、100 kPa时，如图9所示，对应的7 d内相对反硝化速率分别为0.261、0.267、0.299、0.300 mg·(L·d)⁻¹。可见，甲烷分压越高，反硝化速率越高；当甲烷分压在75~100 kPa时的反硝化速率高于甲烷分压为25~50 kPa的实验组。上述结果说明，较高的甲烷分压对DAMO功能有利。但甲烷分压为75 kPa和100 kPa时的2个实验组之间差别不明显，说明当甲烷分压大于75 kPa时，不再是DAMO功能的限制因素。赵荣等^[23]的研究表明，甲烷分压在49 kPa以上即可满足DAMO细菌的富集培养。何崭飞等^[36]通过建立甲烷传质模型表明，当甲烷分压为25.33 kPa时，不再是DAMO活性限制因素，并且提高搅拌速度有助于提高甲烷传质。

1)单一氮源(${\rm{NO}}_3^ -$)的SBR-1反应器和多氮源(${\rm{NO}}_3^ -$，${\rm{NO}}_2^ -$，${\rm{NH}}_4^ +$)的SBR-2反应器富集末期硝氮降低速率分别为0.3 mg·(L·d)⁻¹和2.8 mg·(L·d)⁻¹，这说明多氮源比单一氮源更适合富集DAMO微生物。

2) SBR-2反应器中厌氧氨氧化细菌和DAMO古菌相对丰度(0.56%和0.03%)比SBR-1中更高(0.3%和0.02%)。厌氧氨氧化细菌的增殖有助有DAMO古菌的富集。

3)根据工艺参数优化结果确定，DAMO反应最适pH为6~7、最适温度为35 ℃；当甲烷分压大于75 kPa时，DAMO反应速率不再受甲烷分压的限制。