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反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析

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薛怡亭, 安法财, 石天晶, 党岩, 孙德智. 反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
引用本文: 薛怡亭, 安法财, 石天晶, 党岩, 孙德智. 反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
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XUE Yiting, AN Facai, SHI Tianjing, DANG Yan, SUN Dezhi. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
Citation: XUE Yiting, AN Facai, SHI Tianjing, DANG Yan, SUN Dezhi. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
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反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析

  • 北京林业大学，水体污染源控制技术北京市重点实验室，污染水体源控制与生态修复技术北京市高等学校工程研究中心，北京 100083

    • 作者简介: 薛怡亭(1989—)，女，博士研究生。研究方向：生态环境污染机制与修复技术。E-mail：625851936@qq.com
    通讯作者: 孙德智(1960—)，男，博士，教授。研究方向：水体污染控制技术。E-mail：sdzlab@126.com
  • 基金项目:
    国家自然科学基金资助项目(51978053)

  • 中图分类号: X703.1

Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis

  • Engineering Research Center for Water Pollution Source Control and Eco-Remediation, Beijing Key Laboratory for Source Control Technology of Water Pollution, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

    • Corresponding author: SUN Dezhi, sdzlab@126.com

摘要

  • 摘要: 采用含有不同氮源的SBR进行为期220 d的反硝化型厌氧甲烷氧化(DAMO)微生物富集，研究单一氮源和多氮源对DAMO富集的影响，并用高通量测序对含有不同氮源的反应器内微生物群落结构进行了分析。结果表明，单一氮源(NO−3)和多氮源(NO−3，NO−2，NH+4)为进水的反应器硝氮降低速率分别为0.3 mg·(L·d)−1和2.8 mg·(L·d)−1，这说明多氮源比单一氮源更适合富集DAMO微生物。微生物群落结构分析结果表明，多氮源反应器中厌氧氨氧化细菌和DAMO古菌相对丰度(0.56%和0.03%)比单一氮源反应器中更高(0.3%和0.02%)。采用厌氧小瓶实验对工艺参数优化，结果确定DAMO反应的最适pH为6~7；最适温度为35 ℃；当甲烷分压大于75 kPa时，DAMO反应速率不再受甲烷分压的限制。
    Abstract: In this study, different nitrogen sources was used to enrich the denitrifying anaerobic methane oxidation (DAMO) microbial in SBR for 220 days and the influences of single nitrogen source and multiple nitrogen source on DAMO enrichment were investigated. Microbial community structure in the different SBRs was analyzed by high-throughput sequencing. The experimental results showed that the final nitrate removal rates in the SBRs with a single nitrogen source (NO−3) and a multi-nitrogen source (NO−3, NO−2, NH+4) were 0.3 mg·(L·d)−1 and 2.8 mg·(L·d)−1, respectively, indicating that multi-nitrogen source were more suitable for DAMO enrichment than single nitrogen source. High-throughput sequencing results showed that the relative abundances of anammox bacteria and DAMO archaea in the SBR with a multi-nitrogen source (0.56%, 0.03%) were higher than those in the SBR with a single nitrogen source (0.3%, 0.02%), respectively. The anaerobic vial test was used to optimize the process parameters, the optimal pH and temperatureo f DAMO reaction were 6~7 and 35 ℃, respectively. When the partial pressure of methane increased to 75 kPa, the DAMO reaction rate was no longer restricted by the partial pressure of methane.

  • 目前，我国的能源结构仍然是以煤炭为主[1]。煤炭燃烧会产生大量温室气体破坏环境。煤炭的清洁高效利用是未来发展的必然趋势。煤气化是煤炭清洁高效利用的核心技术之一[2]，也是现代煤化工产业的基础。但煤气化过程中会产生大量的废渣和高盐废水。目前，气化渣的处理方式主要为堆存和填埋，尚未实现大规模综合利用，造成了严重的环境污染和土地资源浪费[2]。高盐废水则主要是通过闪蒸去除水分后，富集盐分再统一固化填埋处置。这种处理方式能耗高、成本大，还容易产生二次污染。因此，实现煤气化渣和高盐废水的高效安全处置与资源化利用是煤化工产业可持续发展必须要解决的关键问题。

    目前，较多学者对煤气化渣进行了深入研究。赵永彬等[3]研究了宁煤集团3种煤气化炉粗渣的化学组成及矿物相构成，发现其化学组成主要包括SiO2、Al2O3、CaO、Fe2O3。其中，矿物组成主要以非晶态玻璃体和晶相矿物为主；非晶态玻璃体的含量达到67%以上，晶相则以石英、莫来石、方铁矿和方解石为主。煤气化渣分为细渣和粗渣。粗渣具有较高的火山灰性，可作为一种辅助性胶凝材料应用于水泥混凝土中[4-7]。冀文明等[8]以矿渣微粉为胶凝材料的主要成分，将CaSO4、水玻璃、NaOH、CaCl2制成复合激发剂，得到新型复合激发矿渣胶凝材料的最优配比，复合激发剂对矿渣的火山灰性具有一定的激发效果。吴波波等[9]以低品位粉煤灰混凝土为研究对象，加入石灰、硅酸盐水泥、水玻璃激发粉煤灰，发现石灰与激发剂共同作用，可加速粉煤灰地质聚合反应，促使N-A-S-H和C-A-S-H、C-S-H等凝胶生成，从而提高混凝土强度。此外，煤化工产生的高盐废水由有机物和无机盐2大类组成，有机物种类多，同时还含有氰化物、芳香族及杂环化合物等有毒物质且处理困难[10]。高盐废水COD较高，一般在500~5 000 mg·L−1；其次，高盐废水中盐分质量浓度高，通常在3 000~15 000 mg·L−1，主要含有K+、Na+、Mg2+、Ca2+等阳离子，CO32−、NO3−、Cl−、SO42−等阴离子。其中，Na+、Cl−和SO42−占到无机离子质量分数的90%以上[11]。KABOOSI等[12]曾尝试将工业废水作为混凝土的拌合水，以节约水资源。目前，利用工业废弃物制备胶凝材料是研究的热点，但多利用粉煤灰及矿渣制备胶凝材料。这是由于煤气化渣活性低等原因，故导致针对煤气化渣直接制备胶凝材料的研究较少。

    本研究以煤气化渣为原料，利用高盐废水、水玻璃及石灰复合激发剂，制备化学激发胶凝材料；研究石灰掺量、水玻璃模数与掺量及高盐废水掺量，对煤气化渣胶凝材料力学性能的影响；探讨胶凝材料水化产物的作用机制，并讨论其对环境的安全性。拟为煤化工废渣、废水的综合利用探索一条新途径。

    1.   材料与方法

    1.1   实验原材料

    所用煤气化渣为宁煤集团提供的粗渣，将其烘干后，用球磨机粉磨，比表面积为413 m2·kg−1、平均粒径为21.58 µm，其化学组成见表1。所用高盐废水也来自宁煤集团，含有高浓度的氯盐、硫酸盐、有机物，重金属质量浓度低，为淡黄色液体，其水质见表2。高盐废水中重金属的质量浓度见表3。水玻璃(Na2SiO3)利用NaOH调整其到所需模数，所用氢氧化钠(NaOH)为分析纯，生石灰(CaO)纯度大于95%。

    表 1  煤气化渣的化学成分组成
    Table 1.  Chemical composition of coal gasification slag %
    SiO2Al2O3CaOFe2O3MgONa2OK2OTiO2SO3LOI
    49.8517.413.439.983.181.951.680.830.652.39
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    表 2  高盐废水水质
    Table 2.  High-salt wastewater quality mg·L−1
    COD硫酸盐氯盐磷酸盐总磷硝氮亚硝氮氨氮总氨
    13 153.507 650.8024 060.8021.1025.961 145.0092.3425.581 283.00
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    表 3  高盐废水中重金属的质量浓度
    Table 3.  Mass concentration of heavy metals in high-salt wastewater mg·L−1
    CrNiCuZnAsCdPb
    0.120.330.470.170.560.02—
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    1.2   样品制备

    确定基准配合比为：煤气化渣100%、水玻璃掺量9%、水玻璃模数1.2、石灰掺量11%、高盐废水掺量25%。在此基础上，改变石灰掺量分别为0、7%、9%、11%、13%、15%、17%，编号为A1~A7；水玻璃模数分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8，编号为B1~B7；水玻璃掺量分别为0、5%、7%、9%、11%、13%、15%，编号为C1~C7；高盐废水掺量分别为0、25%、50%、75%、100%，编号为D1~D5。按配合比称取相应的原料混合，成型尺寸为20×20×20 mm的6联试块，以研究不同因素对试样性能的影响。试块在80 ℃蒸汽养护条件下养护24 h后拆模，然后置于温度为(20±3) ℃、湿度为90%以上的养护箱中，养护3、7、28 d后进行抗压强度等测试。

    1.3   测试方法

    根据《建筑砂浆基本性能试验方法标准》(JGJ/T70-2009)[13]，在3、7、28 d时测量立方体样品的抗压强度，每个龄期压碎3个样品，并取平均值为抗压强度。通过X射线衍射仪(D-MAX/2500PC型，日本理学公司)对养护28 d试样的物相组成进行分析。采用扫描电子显微镜(Quanta 200，美国FEI公司)对养护28 d试样的微观形貌进行分析。采用MIP(Auto pore IV 9500，美国麦克公司)测定试样的孔分布和总孔隙率。重金属浸出试验按照国家标准《固体废弃物浸出毒性浸出方法水平振荡法》(HJ 557-2010)[14]进行，采用ICP-AES(OPTIMA，美国珀金埃尔默公司)测定滤液中重金属的质量浓度。

    2.   结果与讨论

    2.1   复合激发剂对胶凝材料力学性能的影响

    1)石灰掺量对胶凝材料强度的影响。石灰掺量对试样抗压强度的影响见图1。由图1可以看出，随石灰掺量增加，试样抗压强度呈先增大后减小的趋势。在石灰掺量为15%时，试样28 d抗压强度达到23.8 MPa，比不加石灰的A1组，抗压强度提高了930%。气化渣中CaO较少，Ca2+还不足以满足其需求，只加入水玻璃仅能提高气化渣中活性硅铝的溶解，而无法形成较多的水化产物，因此强度较低。加入石灰后，为水化体系补充了Ca2+，在水玻璃-石灰-高盐废水的复合激发下，使气化渣在钠-钙-硫-氯共同作用下，形成的强碱环境能使气化渣活性物质溶出，加速活化，又提供了形成胶凝材料必要的条件Ca2+。通过共同激发所得的高活性小分子SiO2和Al2O3，与Ca( OH)2、SO42−及Cl−，生成水化硅酸钙、钙矾石及水化氯铝酸钙等水化产物，进而提高胶凝材料强度。当石灰掺量较低时，其水化生成的Ca(OH)2，虽然对气化渣颗粒内部的Al-O键和Si-O键造成一定破坏，生成活性Al2O3和SiO2，反应生成少量类沸石水化产物[15]。但是，产生的Ca(OH)2较少，且大部分气化渣还处于未活化的状态，所以石灰掺量较少时，试样强度较低。随石灰掺量提高，Ca(OH)2生成量增加，提高了OH−的浓度，使得较多气化渣颗粒释放活性成分，因此试样强度提高。直至石灰掺量在15%时，强度达到最大值。随着石灰掺量的增加，生成了过量的Ca(OH)2，然而Ca(OH)2具有膨胀性，标准养护条件下导致试件发生膨胀[16]。因此，随着石灰掺量从15%增加到17%，试样强度反而下降。

    图 1  石灰掺量对煤气化渣胶凝材料抗压强度的影响
    Figure 1.  Effect of lime content on the compressive strength of coal gasification slag cementitious material
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    2)水玻璃模数对胶凝材料强度的影响。图2为水玻璃模数对试样抗压强度的影响，可以看出，随水玻璃模数的增加，抗压强度成先增大后减小，再增大后减小的趋势。水玻璃模数为1.4时，试样28 d抗压强度可达到26.5 MPa。随水玻璃模数的升高，Na2O质量分数降低，SiO2质量分数增加。其中，Na2O质量分数在反应过程中有2方面作用：一方面，激发剂中的Na2O的质量分数越高，pH值越大，气化渣释放出硅、铝四面单体数量越多，有利于发生生成凝胶的聚合反应，使得体系抗压强度提高；另一方面，当激发剂中碱过多时，Na+会在气化渣颗粒表面发生钝化反应，阻碍原材料的进一步溶解，导致样品强度降低[17]。激发剂中的SiO2质量分数，在反应过程中也有2方面作用：一方面，由于气化渣中Si的溶解速度较慢，激发剂掺入的SiO2能解决反应初期，灰体难以释放出足够的[SiO4]4−四面体，参与后续反应的问题，使得体系的聚合反应更充分，有效提高胶凝材料的早期强度[18]；另一方面，增加激发剂中SiO2的质量分数，会导致激发剂中SiO2的聚合度大大提高，降低SiO2的反应活性，同时部分多余的SiO2，将在反应后期发生水解，生成无定型硅酸以及碱类物质，导致材料的泛碱现象[19]，进而影响胶凝材料抗压强度的发展。因此，当水玻璃掺量一定时，水玻璃最佳模数值为1.4。这能够使得体系中Na2O和SiO2的质量分数对试样强度发展作用最优，制得强度最优的胶凝材料。

    图 2  水玻璃模数对煤气化渣胶凝材料抗压强度的影响
    Figure 2.  Effect of sodium silicate modulus on the compressive strength of coal gasification slag cementitious material
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    3)水玻璃掺量对胶凝材料强度的影响。图3为水玻璃掺量对试样抗压强度的影响，可以看出，随水玻璃掺量的增加，试样抗压强度成先增大后减小的趋势。水玻璃掺量为13%时，试样28 d抗压强度达到27 MPa，相对于不加水玻璃的C1组强度提高了260%。水玻璃的引入，促进了激发剂对煤气化渣的激发效果。仅掺石灰与高盐废水使浆体中碱度有限，大量气化渣中活性硅铝没有溶出。水玻璃可水解生成NaOH，使液相的OH−增多。同时，水玻璃还能水解生成硅胶，这些硅胶可与Ca2+反应生成C-S-H凝胶[20]，进而加速气化渣与Ca(OH)2的反应，生成较多的水化产物，使得试样更加密实。不加水玻璃的C1试样，28 d强度较7 d强度增长了10.3%；加入水玻璃掺量为9%时，试样28 d强度较7 d强度增长了34.2%。水玻璃的加入，使得试样后期强度发展快。在反应初期，气化渣玻璃体中的Al-O、Si-O键发生断裂，[AlO4]5−、[SiO4]4−四面体被快速溶出形成低聚体，会在低于150 ℃的条件下发生缩聚反应，生成-Si-O-Al-O-为骨架的三维网络结构的无机高分子地质聚合物，硬化后发挥作用提高强度。随着养护龄期的增长，当试样养护到28 d时，气化渣中的氧化物原料大部分被溶解，随着解聚-缩聚反应的发生，生成了大量具有胶结作用的凝胶物质(N-A-S-H)，使试样的28 d抗压强度发展较快。

    图 3  水玻璃掺量对煤气化渣胶凝材料抗压强度的影响
    Figure 3.  Effect of sodium silicate content on the compressive strength of coal gasification slag cementitious material
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    4)高盐废水掺量对胶凝材料强度的影响。高盐废水掺量对试样抗压强度的影响见图4，可以看出，随高盐废水掺量的增加，试样抗压强度有不同程度的提高。当高盐废水掺量从0增加至100%时，试样28 d抗压强度，由11.6 MPa提高至38.8 MPa，提高了234%。高盐废水中含有大量SO42−、Cl−，随着高盐废水掺量的增加，SO42−浓度不断增加。一方面，SO42−在Ca2+作用下，与夹杂在颗粒表面的凝胶，及溶解于液相中的活性Al2O3，反应生成水化硫铝酸钙，即钙矾石(AFt)[21]。钙矾石具有一定的膨胀性，可以填补结构空隙，使试样密实度提高。另一方面，废水中的SO42−，能够与Na+反应生成Na2SO4，与石灰产生的Ca(OH)2反应生成NaOH，消耗其中的Ca2+，增加体系的碱度，这有助于活性SiO2、Al2O3的溶出，加速水化反应进程，从而提高试样强度[20]。其次，高盐废水中的Cl−与Ca2+，有较强扩散能力，能够穿过气化渣颗粒表面的水化层，与内部被激发后释放的活性Al2O3反应，生成水化氯铝酸钙[22]；Cl−还可以与Ca(OH)2反应，生成氧氯化钙复盐，不溶于水，使得试样中固相增多，从而试样的抗压强度得到了提高。因此，随高盐废水掺量增加，试样强度不断增加，高盐废水有利于激发煤气化渣胶凝材料的活性。

    图 4  高盐废水掺量对煤气化渣胶凝材料抗压强度的影响
    Figure 4.  Effect of high salt wastewater content on the compressive strength of coal gasification slag cementitious material
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    2.2   复合激发剂对胶凝材料水化产物的影响

    图5为复合激发剂激发煤气化渣水化28 d的XRD图。由图5(a)可以看出，加石灰的D2中，有C-S-H和N-A-S-H的特征峰的出现。这与刘江等[23]的研究结果一致。不加石灰的A1中，C-S-H的特征峰几乎没有，因此，试样强度最低。由图5(b)可以看出，加入水玻璃的D2试样，与不加水玻璃的C1试样相比，C-S-H和N-A-S-H的特征峰增强。不加水玻璃的C1试样，有Ca(OH)2与水化氯铝酸钙(3CaO·Al2O3·CaCl2·10H2O)的特征峰出现。D2试样中无水化氯铝酸钙的特征峰出现。这可能是由于水玻璃的加入，使胶凝材料中形成很多的N-A-S-H，消耗了活性Al2O3。因此，活性Al2O3剩余量少，生成的水化氯铝酸钙的量就变少。首先，水玻璃中的Na2O为体系提供了更多的OH−，使硅铝玻璃体迅速溶解，产生大量[SiO4]4−、[AlO4]5−，使水化产物增多。其次，水玻璃中SiO2可降低水化产物的钙硅比，使水化产物的聚合度升高，体系的后期强度明显增大。此外，不加水玻璃的C1试样，生成了过量的Ca(OH)2，导致试样体积膨胀，强度降低。C1试样中没有出现氧氯化钙复盐的特征峰。这可能是，氯离子浓度低，因此其生成量少。由图5(c)可以看出，加高盐废水的D2试样，相比于不加高盐废水的D1试样，C-S-H特征峰增强。高盐废水的加入，促进了水化反应的进行，使水化产物种类增加，复合激发剂激发效果明显。邱轶兵等[21]发现，水化产物中有一定量的钙矾石，但图5(c)中没有发现钙矾石的衍射峰。这可能是由于高盐废水中硫酸根离子浓度低，故导致钙矾石的生成量较少。此外，加入高盐废水的D2试样中，有NaCl的特征峰出现，氯离子在胶凝材料中会发生迁移，这可能会对胶凝材料的耐久性产生不利影响，后续研究应考虑胶凝材料的抗冻融性等。综上，煤气化渣在复合激发剂作用下，生成较多的Ca(OH)2参与反应，促进煤气化渣中的Si-O和Al-O发生解聚-缩聚反应，形成化学激发胶凝材料。其中，生成C-S-H、N-A-S-H、水化氯铝酸钙等产物，这些产物胶结在一起，有利于提高试样结构的密实度。

    图 5  复合激发剂激发煤气化渣水化28 d的XRD图
    Figure 5.  XRD diagram of 28 d hydration of coal gasification slag activated by composite activator
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    2.3   复合激发剂对水化产物微观形貌的影响

    为进一步分析复合激发剂对气化渣激发机理，分别对A1、C1、D1、D2试样的28 d水化产物进行微观分析，结果如图6所示。从图6(a)、图6(b)、图6(d)可以看出，D2试样中有较多的水化产物，堆积在被激发的气化渣颗粒表面以及颗粒间，有絮状C-S-H及网状N-A-S-H等凝胶生成。相比于A1、C1试样，D2试样中水化产物更加密集且孔隙较少，A1、C1中有较多的气化渣颗粒未被激发。D2中水玻璃水解后生成OH−，使气化渣中活性硅铝溶出。并且，水玻璃为体系提供了较多的活性SiO2，使水化产物聚合度提高，生成了较多的水化产物，使得结构更加密实。C1中未加水玻璃，气化渣中活性物质溶出较少，没有足够的SiO2参与水化反应，使得水化产物聚合度低，且生成量较少，导致试样强度较低。因此，水玻璃的加入，可明显增加水化产物种类及数量，进而提高复合激发剂对煤气化渣的激发效果。

    图 6  复合激发剂激发煤气化渣28 d水化产物的SEM图
    Figure 6.  SEM images of 28 d hydration products of coal gasification slag activated by composite activator
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    此外，从图6(c)、图6(d)中可以看出，D2试样中有少量针棒状的钙矾石产生，水化产物之间黏结紧，结构密实度较好。相比于D1，加入了高盐废水的D2试样，废水中SO42−、Cl−，使气化渣中更多的活性物质溶出，促进水化产物的生成。并且，生成的钙矾石等产物，能够填充结构中的孔隙，使试样密实度提高。

    2.4   复合激发剂对胶凝材料孔结构的影响

    图7为复合激发剂激发煤气化渣水化28 d孔结构的测试结果。由图7可以看出，加水玻璃的D2试样，孔径分布的峰值明显向孔径小的方向移动，且总孔隙率由不加水玻璃的C1试样35.6%，降低至22.1%。水玻璃中的Na2O水解后，产生的OH−能够与水及CaO反应生成Ca(OH)2，提高体系的碱度，促进了煤气化渣中活性硅铝的溶出。生成较多的C-S-H、N-A-S-H等物质，可填充于试样的孔结构，进而提高其力学性能。不加高盐废水的D1试样，孔径分布明显向孔径大的方向移动，且孔隙率相比于加高盐废水的D2有所提高。不加高盐废水的试样中没有SO42−及Cl−的作用。因此，水化产物生成量少，试样孔径大、孔隙率高。这导致试样结构不够密实，强度较低。A1试样的孔隙率最高，强度最低。

    图 7  复合激发剂激发煤气化渣水化28 d孔结构
    Figure 7.  28 d pore structure of coal gasification slag hydration activated by composite activator
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    2.5   煤气化渣胶凝材料重金属浸出毒性

    对不同高盐废水掺量下，制备的煤气化渣胶凝材料试样(D1、D3、D5)，进行了浸出毒性检测。通过判断其是否满足《危险废物鉴别标准浸出毒性鉴别》(GB 5085.3-2007)[24]中规定的限值，来判断高盐废水加入煤气化渣胶凝材料中，对环境有无污染。各试样重金属的毒性浸出结果如表4所示。

    表 4  各试样重金属的毒性浸出
    Table 4.  Toxic leaching of heavy metals for each sample mg·L−1
    高盐废水掺量CrNiCuZnAsCdPb
    00.0080.0240.0110.018—0.0060.013
    50%0.0080.0250.0130.028—0.0050.019
    100%0.0080.0270.0140.031—0.0040.033
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    国家标准中规定，Cr、Ni、Cu、Zn、As、Cd、Pb的浸出限值，分别不能高于5、5、100、100、5、1、5 mg·L−1。由表4可以看出，各试样中各重金属元素浸出浓度，远低于标准中的限值。利用高盐废水制备煤气化渣胶凝材料的浸出液，与原废水相比，Cr、Ni、Cu、Zn、As、Cd质量浓度均降低，而Pb质量浓度有所增加。随高盐废水掺量的增加，Ni、Cu、Zn、As、Pb浸出浓度增加，Cd浸出浓度降低，Cr的浸出浓度不变。利用复合激发剂激发煤气化渣制备的胶凝材料，对高盐废水中的重金属有一定的固化作用。因此，各元素浸出浓度得到降低。Pb浸出浓度增加可能是在激发剂作用下，煤气化渣中的活性物质释放的同时，Pb元素被释放出来，因此，其浸出浓度增加。随高盐废水掺量增加，胶凝材料中的重金属元素引入的就越多，因此，Ni、Cu、Zn、As、Pb浸出浓度增加。Cd浸出浓度降低，Cr的浸出浓度不变。这说明，在复合激发剂作用下，胶凝材料对Cd、Cr元素的固化效果好。此外，高盐废水中还存在一些铵盐，在碱性环境下会生成氨气，后续研究应考虑挥发出的氨会对大气产生的二次污染。综上所述，利用复合激发剂激发煤气化渣制备的胶凝材料，对高盐废水中的重金属元素，有一定的固化作用，且所制备的胶凝材料浸出毒性均低于国家标准中的限值。

    3.   结论

    1)复合激发剂中石灰掺量、水玻璃模数与掺量及高盐废水掺量，对煤气化渣胶凝材料的抗压强度，均有一定的影响。其中，当高盐废水掺量为100%时，试样的28 d抗压强度，最高可达38.8 MPa。

    2)水玻璃中的Na2O为体系提供了OH−，使煤气化渣中活性物质溶出，产生大量[SiO4]4−、[AlO4]5−，使水化产物增多；水玻璃中的SiO2可降低水化产物的钙硅比，硅氧四面体链变长，提高产物的聚合度，生成较多C-S-H、N-A-S-H等水化产物，使试样结构更加密实，体系的后期强度明显增大。

    3)复合激发剂对煤气化渣激发效果显著。这主要因为激发剂提供了较多的SO42−、Cl−及OH−，使气化渣活性被激发，并且引入Ca2+，促进Ca(OH)2、C-S-H、N-A-S-H、钙矾石和水化氯铝酸钙等物质的生成，使试样孔隙率降低，故本研究所制备的胶凝材料能固化高盐废水中的部分重金属。

  • 图 1  SBR装置图

    Figure 1.  Diagram of SBR

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    图 2  培养初期(0~80 d)反应器运行效果

    Figure 2.  Enrichment effect of the reactor during 0~80 days

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    图 3  SBR-1和SBR-2中不同氮素浓度的变化

    Figure 3.  Variations of concentration of different nitrogen species in SBR-1 and SBR-2

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    图 4  SBR-1和SBR-2中NO−3转化速率

    Figure 4.  NO−3 conversion rate in SBR-1 and SBR-2

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    图 5  不同氮源SBR中细菌群落结构分析

    Figure 5.  Relative abundance distributions of bacteria community in SBR-1 and SBR-2

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    图 6  不同氮源SBR中古菌属水平分析

    Figure 6.  Relative abundance distributions of archaea at the genus level in SBR-1 and SBR-2

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    图 7  pH对DAMO活性的影响

    Figure 7.  Effect of pH on DAMO

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    图 8  温度对DAMO活性的影响

    Figure 8.  Effect of temperature on DAMO

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    图 9  甲烷分压对DAMO活性的影响

    Figure 9.  Effect of partial pressure of methane on DAMO

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    表 1  DAMO影响因素实验设置

    Table 1.  Experimental setting of influential factors on DAMO

    分组pH温度/℃甲烷分压/kPa
    实验15.0、6.0、7.0、8.035100
    实验27.025、30、35、40100
    实验37.03525、50、75、100
    分组pH温度/℃甲烷分压/kPa
    实验15.0、6.0、7.0、8.035100
    实验27.025、30、35、40100
    实验37.03525、50、75、100
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    表 2  高通量测序选用的引物序列

    Table 2.  Primer sequences for high throughput sequencing

    微生物引物名称序列(5'~3')
    细菌341b4_FCTAYGGRRBGCWGCAG
    806_RGGACTACNNGGGTATCTAAT
    古菌524F10extFTGYCAGCCGCCGCGGTAA
    Arch958RmodRYCCGGCGTTGAVTCCAATT
    微生物引物名称序列(5'~3')
    细菌341b4_FCTAYGGRRBGCWGCAG
    806_RGGACTACNNGGGTATCTAAT
    古菌524F10extFTGYCAGCCGCCGCGGTAA
    Arch958RmodRYCCGGCGTTGAVTCCAATT
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    表 3  SBR-1和SBR-2反应器CH4消耗

    Table 3.  Methane consumption in SBR-1 and SBR-2

    反应器反应时间/h甲烷消耗量/molNO−3消耗量/molCH4/NO−3消耗计量比理论DAMO计量比
    SBR-11171.909 2×10−43.471 4×10−40.5500.625
    SBR-21172.398 9×10−34.817 1×10−30.498
    反应器反应时间/h甲烷消耗量/molNO−3消耗量/molCH4/NO−3消耗计量比理论DAMO计量比
    SBR-11171.909 2×10−43.471 4×10−40.5500.625
    SBR-21172.398 9×10−34.817 1×10−30.498
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    表 4  SBR中古菌与细菌多样性指数

    Table 4.  Microbial diversity index of archaea and bacteria in SBRs

    菌种shannonsimpsonacechao
    SBR-1 反应器古菌3.362 3650.054 126156.588 2153.545 5
    SBR-2 反应器古菌3.507 8830.046 442190.670 8182.636 4
    SBR-1 反应器细菌5.672 0290.012 3892 336.9122 275.660
    SBR-2 反应器细菌5.581 8290.012 8992 400.3302 342.836
    菌种shannonsimpsonacechao
    SBR-1 反应器古菌3.362 3650.054 126156.588 2153.545 5
    SBR-2 反应器古菌3.507 8830.046 442190.670 8182.636 4
    SBR-1 反应器细菌5.672 0290.012 3892 336.9122 275.660
    SBR-2 反应器细菌5.581 8290.012 8992 400.3302 342.836
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-05-25
  • 录用日期:  2020-09-24
  • 刊出日期:  2021-02-10
薛怡亭, 安法财, 石天晶, 党岩, 孙德智. 反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
引用本文: 薛怡亭, 安法财, 石天晶, 党岩, 孙德智. 反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
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XUE Yiting, AN Facai, SHI Tianjing, DANG Yan, SUN Dezhi. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
Citation: XUE Yiting, AN Facai, SHI Tianjing, DANG Yan, SUN Dezhi. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
shu

反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析

    通讯作者: 孙德智(1960—)，男，博士，教授。研究方向：水体污染控制技术。E-mail：sdzlab@126.com
    作者简介: 薛怡亭(1989—)，女，博士研究生。研究方向：生态环境污染机制与修复技术。E-mail：625851936@qq.com
  • 北京林业大学，水体污染源控制技术北京市重点实验室，污染水体源控制与生态修复技术北京市高等学校工程研究中心，北京 100083
  • 收稿日期:  2020-05-25
  • 录用日期:  2020-09-24
  • 网络出版日期:  2021-02-22
基金项目:
国家自然科学基金资助项目(51978053)

摘要: 采用含有不同氮源的SBR进行为期220 d的反硝化型厌氧甲烷氧化(DAMO)微生物富集，研究单一氮源和多氮源对DAMO富集的影响，并用高通量测序对含有不同氮源的反应器内微生物群落结构进行了分析。结果表明，单一氮源(NO−3)和多氮源(NO−3，NO−2，NH+4)为进水的反应器硝氮降低速率分别为0.3 mg·(L·d)−1和2.8 mg·(L·d)−1，这说明多氮源比单一氮源更适合富集DAMO微生物。微生物群落结构分析结果表明，多氮源反应器中厌氧氨氧化细菌和DAMO古菌相对丰度(0.56%和0.03%)比单一氮源反应器中更高(0.3%和0.02%)。采用厌氧小瓶实验对工艺参数优化，结果确定DAMO反应的最适pH为6~7；最适温度为35 ℃；当甲烷分压大于75 kPa时，DAMO反应速率不再受甲烷分压的限制。

English Abstract

    全文HTML

  • 厌氧甲烷氧化过程根据电子受体不同通常可分为3类：一是硫酸盐还原型厌氧甲烷氧化(sulphate-dependent anaerobic methane oxidation，SAMO)[1]；二是反硝化型厌氧甲烷氧化(denitrifying anaerobic methane oxidation，DAMO)[2-4]；三是金属氧化物(铁、锰依赖型)[5-6]和重金属盐类(重铬酸盐、钒酸盐型)[7-8]厌氧甲烷氧化。反硝化型厌氧甲烷氧化(DAMO)工艺是近年来发现的一种新型脱氮工艺，其以CH4为电子供体，NO−3或NO−2为电子受体实现反硝化脱氮[9-11]。RAGHOEBARSING等[12]从荷兰运河沉积物中富集培养出反硝化型厌氧甲烷氧化微生物群落，检测到甲烷、亚硝酸盐和硝酸盐的同时消耗以及氮气的排放。通过进一步研究证明，所消耗的亚硝酸盐和硝酸盐与所产生的氮气量相当，首次证实厌氧甲烷氧化与反硝化作用的存在。有研究[13-14]发现，DAMO富集体系中通常包含以NO−2为氮源的NC10门细菌和以NO−3为氮源的DAMO古菌存在。通过DAMO古菌和DAMO细菌的配合，可实现废水中氮素的去除。由于DAMO过程不产生N2O，可以直接利用甲烷，减少温室气体的排放，且避免了反硝化过程中外加碳源引起的二次污染，同时实现废水中NO−3和NO−2的有效脱除等优点，近几年引起了研究者的广泛关注[15]。

    但DAMO微生物存在代谢活性低、倍增时间长、富集培养困难、易受环境影响等问题[16-19]。由于DAMO细菌缺少普通好氧甲烷氧化菌具有的细胞内膜，pMMO酶是好氧甲烷氧化代谢的关键酶，多存在于细胞内膜上，而DAMO细菌仅有胞质膜可供pMMO酶结合，大大限制了DAMO细菌细胞内部的甲烷氧化代谢过程，使得DAMO细菌代谢活性降低，无法更好的与DAMO古菌配合完成整个反硝化过程[20-21]。此外，由于DAMO微生物对环境要求严格，2%的氧气就会抑制DAMO过程，且甲烷作为DAMO的唯一电子供体，其在水中溶解度低，限制了甲烷传质效率，影响了DAMO的富集。LI等[22]以硝酸盐为底物进行为期600 d的DAMO培养时，测序结果显示仍没有DAMO古菌的存在。赵荣等[23]对亚硝酸盐依赖型DAMO微生物活性影响因素进行了研究，确定了最佳温度为35 ℃，最佳pH为7.5，以及最适亚硝酸盐初始浓度为2.4~3.42 mmol·L−1，但目前几乎没有针对硝酸盐依赖型DAMO微生物活性影响因素方面的研究。基于此，本研究采用不同氮源反应器进行了硝酸盐依赖型DAMO功能微生物的富集，得到DAMO功能菌；采用厌氧小瓶序批式实验，探索了其最佳运行环境，优化工艺参数；通过高通量测序手段分析了微生物群落结构的变化，探究了其反应机理，实现了DAMO功能微生物的富集与影响因素的优化。

1.   材料与方法

    1.1.   富集装置与方法

  • 由于DAMO过程最有可能发生在甲烷和氮源丰富的厌氧或缺氧环境中[24]，为提高富集成功率，本研究接种污泥来自于北京市海棠花溪河道底泥，北京市小红门再生水厂回流污泥，延庆水稻田土和延庆池塘底泥，培养液成分与ETTWIG培养时一致[25]。

    实验采用SBR进行富集，装置如图1所示。反应器为玻璃材质，采用双层结构，夹层为水浴间，起恒温保温作用。反应器内径为15 cm、高为30 cm，内部有效体积为4.0 L，分为液相区(3.0 L)和顶部气相区(1.0 L)。进样口和取样口处设置橡胶塞，防止环境中氧气进入反应器。富集期间保持严格厌氧，溶解氧浓度低于检出限。通过底部磁力搅拌器混合培养液，通过下部进气口通入甲烷，采用循环水浴保持温度恒定在35 ℃，采用HCl或KOH溶液调节反应器pH保持在7.0~7.5。

    由于DAMO微生物倍增时间长且富集时间久，为防止大量微生物流失，反应器氮源通过高浓度氮浓缩液的方式在加料口补充，以减少进出水导致的生物量流失。SBR运行周期包括进水-反应-沉淀-排水，一个运行周期为30 d，每个月最后一天停止搅拌使反应器沉淀4 h，排去反应器内1/2水，补充培养液至3 L，继续正常运行。每5 d对反应器中甲烷更新一次，保证甲烷充足。每周取水样2~3次，持续监测反应器中NH+4、NO−2和NO−3浓度的变化。

    富集培养分为2个阶段，在阶段1中首先采用硝态氮为氮源进行DAMO古菌的富集，在反应器运行稳定后，再进行不同氮源的反应器富集效果对比(阶段2)。阶段1中的具体方法为：采用SBR对原始泥样进行为期80 d的初期培养，加入新鲜培养液，氮源仅为NO−3，投加NO−3浓缩液使反应器中NO−3浓度在50~110 mg·L−1，持续监测NO−3浓度，计算转化速率，当NO−3消耗殆尽时，再补充NO−3浓缩液，保证底物不受限。阶段2的具体方法为：平行启动2组SBR，在SBR-1和SBR-2反应器中分别接种500 mL的初期富集培养物，加入培养液到3 L混合均匀。SBR-1加入氮源仅为NO−3(30~50 mg·L−1)，SBR-2加入氮源为NO−3(40~70 mg·L−1)、NH+4(30~70 mg·L−1)、NO−2 (10 mg·L−1)，持续监测NH+4、NO−2、NO−3浓度，当底物消耗殆尽时，再补充氮浓缩液，保证底物不受限。研究不同氮源反应器DAMO功能菌富集效果的影响。

    • 1.2.   DAMO影响因素实验方法

  • 采用有效体积150 mL的透明血清瓶进行实验，加入20 mL活性较高的SBR-2中富集220 d的培养物与100 mL新鲜培养液，用高纯氮气(99.999%)向液相中曝气10 min，橡胶塞密封，维持瓶中厌氧环境。采用排液法向瓶内充99.99%的甲烷40 mL，为避免多氮源体系中反应复杂对DAMO活性影响研究产生干扰，血清瓶中只加硝态氮，硝态氮初始浓度50 mg·L−1，进行避光、150 r·min−1恒温振荡培养，待体系稳定后进行影响因素实验。

    本研究设置3个影响因素实验(表1)，包括pH、温度与甲烷分压。每组实验设置3个平行，甲烷分压通过调节顶空甲烷与氮气比例设置，pH通过加入HCl和KOH溶液调节。

    • 1.3.   分析测试方法

  • 硝态氮、亚硝态氮、氨氮采用分光光度法进行测定(DR6 000，HACH)，MLVSS采用重量法进行计算。甲烷总量为气相甲烷与液相甲烷之和，气相甲烷采用Techcomp公司GC7 900气相色谱仪和FID检测器(美国安捷伦科技公司)进行检测，液相中甲烷浓度按照式(1)进行计算。

    式中：Xs为溶液中甲烷浓度；Xa为摇晃后顶空甲烷浓度；Va为顶空体积，mL；b为甲烷液气分配系数，25 ℃时取0.03；Vs为溶液体积，mL。

    • 1.4.   微生物分析方法

  • 在SBR-1和SBR-2反应器运行结束后，取2个反应器中适量样品进行DNA提取。DNA提取及纯化过程参照北京艾德莱生物科技有限公司DNA快速提取试剂盒说明书进行，将提取并纯化的DNA样品委托北京美吉生物医药科技有限公司进行第二代高通量测序。采用表2所示引物进行PCR扩增。高通量测序在Illumina Hiseq 2000平台(Illumia, San Diego, USA)上进行。相似度97%以上的序列合并为一个操作分类单位(OTU)。根据OTU聚类，进行各分类学水平上的群落结构与组成分析。

2.   结果与讨论

    2.1.   DAMO功能微生物的富集

  • 图2(a)表示在阶段1(0~80 d)的SBR中NO−3、NO−2、NH+4浓度随时间的变化。由图2(a)可知，外加氮源仅为NO−3，当NO−3浓度低于5 mg·L−1时，补充NO−3保证基质不受限，在整个培养初期，NO−2浓度在0~5.06 mg·L−1，未发生NO−2积累，氨氮浓度持续缓慢升高，通过换水的方式控制，分析氨氮的产生主要由于大量微生物细胞死亡裂解所致。

    根据图2(b)对培养初期SBR中硝态氮降解速率进行了分析，可以看出，硝态氮降解速率可明显分为3个阶段。0~17 d时反应器NO−3降解速率较低，且呈逐渐下降趋势，从45 mg·(L·d)−1降至11 mg·(L·d)−1，此时初始接种物中残留有机碳为反硝化过程提供碳源。17~30 d时NO−3降解速率呈现先升高后降低的趋势，由11 mg·(L·d)−1逐步升高至79 mg·(L·d)−1再降低至20 mg·(L·d)−1。前期上升的原因为，反应器进入内源代谢阶段，微生物利用自身贮藏物质和酶等来取得营养物质，此时大量细胞裂解死亡产生的碳源为反硝化提供电子供体，硝氮降低速率逐渐上升；后期下降的原因为，反应器内残余的除甲烷外的碳源被不断消耗而得不到补充，内源反硝化活性不断降低，硝氮降低速率逐渐下降。31~80 d反应器NO−3降低速率逐渐趋于稳定，基本保持在5 mg·(L·d)−1到30 mg·(L·d)−1，反应器进入漫长的停滞期。此外，在第40天和第80天分别测定CH4消耗速率与NO−3消耗速率之比，用来表示DAMO对NO−3转化的贡献占比。40 d时CH4/NO−3消耗计量比为0.06，80 d时CH4/NO−3消耗计量比为0.18，虽然仍未达到DAMO理论计量比0.625，但比值升高表明DAMO过程对NO−3降解的贡献占比缓慢升高。

    为提高富集成功率，在初期培养后分别采用含有不同氮源的SBR反应器对DAMO微生物进行培养，SBR-1氮源为NO−3，SBR-2氮源为NO−2、NO−3、NH+4，反应器运行方式同初期富集方式。图3(a)与图3(b)分别表示SBR-1和SBR-2反应器中NO−2、NO−3、NH+4浓度随时间变化过程。由图3(a)可知，SBR-1中NO−2浓度始终在6.3 mg·L−1以下，未发生NO−2积累，氨氮浓度持续到第113天时开始下降，直到第140天时降为0 mg·L−1，此后再未出现氨氮的积累，这表明微生物死亡率下降，由细胞裂解产生的氨氮不再出现，反应器内源反硝化阶段结束。

    对SBR-1和SBR-2反应器中硝态氮转化速率进行分析，结果如图4(a)与图4(b)所示。富集结束时SBR-1硝氮降低速率为0.3 mg·(L·d)−1，SBR-2硝氮降低速率为2.8 mg·(L·d)−1。虽然反硝化速率有所波动，但从80~220 d的平均值也可以看出，SBR-1硝氮降低速率平均值为0.90 mg·(L·d)−1，SBR-2硝氮降低速率平均值为1.38 mg·(L·d)−1，所以多氮源相比于单一氮源的反应器更有助于DAMO古菌的富集。其主要原因可能是，在多氮源反应器中除了硝氮外，还添加了氨氮与亚硝氮，在厌氧环境下培养出部分anammox细菌，anammox细菌对NO−2的亲和常数要低于DAMO细菌，对NO−2的竞争能力更强，限制了DAMO细菌的大量繁殖，从而促进DAMO古菌对甲烷的利用，有利于DAMO古菌的富集。所以Anammox-DAMO系统联合作用有助于DAMO古菌的富集培养，从而提高硝氮转化速率。这与FU等[26]的研究结果一致，他们发现，在添加不同氮源时DAMO功能菌的富集培养过程中，当采用NO−2、NO−3、NH+4为氮源时硝氮转化速率最快。前期有研究[12, 27-28]表明，DAMO微生物富集时间在300~600 d时反硝化速率为0.18~2 mmol·(L·d)−1，本实验在220 d时就达到了2.8 mg·(L·d)−1，有效缩短了培养时间。

    由表3可知，SBR-1和SBR-2反应器在富集末期存在明显的CH4消耗，这说明在2个反应器中均存在DAMO过程。此外2个反应器中实际CH4/NO−3消耗计量比均小于理论DAMO计量比值，引起这一偏差的原因，可能是由于系统中存在有机残留物(如微生物代谢产物等)时的异养反硝化作用所导致的。

    • 2.2.   DAMO功能微生物群落结构分析

  • 1)不同氮源反应器微生物多样性差异分析。富集结束后对SBR-1和SBR-2中的微生物进行了群落结构分析(表4)。shannon、simpson指数反映群里多样性，simpson指数越大，说明群落多样性越低，shannon值越大，说明群落多样性越高，chao、ace指数反映群落丰富度，值越大，群落丰富度越高[29]。综合SBR-1和SBR-2反应器中古菌多样性指数可以看出，SBR-2比SBR-1中古菌的多样性更高，丰富度更高。而从细菌群落多样性指数可以看出，SBR-1比SBR-2多样性更高，但SBR-2丰富度更高。所以多氮源富集培养DAMO比仅用硝氮培养DAMO的反应器群落结构更加丰富，微生物多样性更高。

    2)不同氮源反应器微生物群落结构分析。对2个反应器中细菌群落与古菌群落结构差异进行了详细解析。对细菌门水平分析发现，SBR-1中丰度前5的门及其占比分别为Proteobacteria (23.12%)>Patescibacteria (17.83%)>Chloroflexi (14.55%)>Actinobacteria (11.88%)>Acidobacteria (9.72%)。SBR-2中丰度前5的门及其占比分别为Patescibacteria (27.29%)>Chloroflexi (16.06%)>Proteobacteria (15.30%)>Actinobacteria (11.11%)>Bacteroidetes (6.91%)。需特别注意的是，2个反应器中均含有少量的NC10门细菌，其中SBR-1中NC10占0.16%，SBR-2中NC10占0.1%，NC10门细菌是典型的亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化反硝化细菌[30]，其主要利用NO−2为电子受体，甲烷为电子供体，在厌氧环境下进行反硝化型甲烷厌氧氧化，从而达到废水中溶解甲烷与NO−2的同步去除。

    根据图5，对不同氮源SBR中细菌在目和属水平上进行分析，发现Candidatus_Nomurabacteria目在SBR-1和SBR-2中占比分别为6.54%和3.38%，其通常大量参与氮、硫和铁循环的自养类群，与溶解氧负相关。此外，在SBR-1和SBR-2中均发现厌氧氨氧化细菌，SBR-1中厌氧氨氧化菌占0.30%，SBR-2中厌氧氨氧化菌占0.56%。具体共有3种厌氧氨氧化菌属：Candidatus_Brocadia在SBR-1中占0.29%，在SBR-2中占0.24%；Candidatus_Kuenenia在SBR-1中未发现，在SBR-2中占0.29%；Candidatus_Anammoximicrobium在SBR-1中占0.01%，在SBR-2中0.03%。可见，在SBR-2中厌氧氨氧化细菌的相对丰度大于SBR-1中。虽然SBR-1的微生物培养时并未外加氨氮与亚硝氮，但大量细胞裂解死亡产生的氨氮为厌氧氨氧化菌的存在提供条件，且亚硝氮的存在很可能是由于DAMO古菌将NO−3还原为NO−2，所以从侧面证实DAMO古菌存在的可能。

    对含有不同氮源SBR中古菌门水平群落结构分析可知，SBR-1和SBR-2中前5类主要的门种类一致。其中，广古菌门Euyarchaeota在SBR-1和SBR-2中丰度均为最高，占比分别是82%和80%，它通常包含了古菌中的大多数种类，包括产甲烷菌、在极高盐浓度下生活的盐杆菌、一些超嗜热的好氧和厌氧菌等。其他古菌占比依次为奇古菌门Thaumarchaeota (SBR-1中占8.0%，SBR-2中占6.2%)、泉古菌门Crenarchaeota (SBR-1中占5.7%，SBR-2中占3.7%)和纳古菌门Nanoarchaeaeota (SBR-1中占0%，SBR-2中占6.7%)。

    由图6可知，对含不同氮源SBR中的古菌属水平进行分析发现，SBR-1中丰度前5的属及其占比分别为：甲烷杆菌属Methanobacterium (49.76%)>甲烷短杆菌Methanobrevibacter (10.04%)>甲烷八叠球菌Methanosarcina (9.76%)>Methanomassiliicoccus (2.42%)>Rice_Cluster_I (2.26%)。SBR-2中丰度前5的属及其占比分别为：甲烷杆菌属Methanobacterium (40.99%)>甲烷八叠球菌Methanosarcina (11.93%)>甲烷短杆菌Methanobrevibacter (10.85%)>Methanomassiliicoccus (2.70%)>甲烷鬃毛菌Methanosaeta (2.20%)，可见，2个反应器中主要微生物均为产甲烷古菌，同时，均发现能够进行硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化反硝化(DAMO)的古菌Candidatus_Methanoperedens，分别在SBR-1中占0.02%，SBR-2中占0.03%。可见，DAMO古菌相对丰度在多氮源的SBR-2反应器中占比略高于单一氮源的SBR-1反应器。结合之前微生物细菌的比较分析，可发现，厌氧氨氧化细菌较多时DAMO古菌丰度更高，分析原因主要由于厌氧氨氧化细菌可限制DAMO细菌的增殖，减少其对甲烷的竞争，从而促进DAMO古菌对甲烷的利用，有利于DAMO古菌的富集，所以多氮源反应器中厌氧氨氧化细菌的增殖有助有DAMO古菌的富集。

    • 2.3.   DAMO活性影响因素分析

  • 1) pH对DAMO活性的影响。不同pH条件下的DAMO过程中的反硝化速率如图7所示。当pH为5.0、6.0、7.0、8.0时，对应的7 d内平均反硝化速率分别为0.222、0.296、0.292、0.178 mg·(L·d)−1。说明当pH为6.0时，反硝化速率最大，而pH为7.0时，反硝化速率略低于pH为6.0时。这也说明，当pH在6~7时DAMO活性最强，pH过高或过低均会抑制DAMO活性。目前已报道的DAMO微生物富集培养适合的pH多在6~8[31]，ZHU等[32]的研究认为，当pH为7.4时DAMO反应活性最强，而HE等[33]研究表明，最适pH为7.6，在低于7.6时DAMO活性就会受到抑制。

    2)温度对DAMO活性的影响。理论上，由于温度越低，甲烷在水中的溶解度越高，反应器中可利用的甲烷越多，反应性运行效能越好，但过低的温度会抑制反应器中微生物的活性，所以研究温度对DAMO反应的影响至关重要。图8显示了不同温度梯度下DAMO过程反硝化速率变化，可见，在当温度为25、30、35、40 ℃时，对应的7 d内平均反硝化速率分别为0.085、0.151、0.292和0.147 mg·(L·d)−1。所以，温度为35 ℃时，反硝化速率最大，DAMO活性最强。何崭飞[34]经过短期与长期不同温度的DAMO微生物培养也表明最适温度为35 ℃。而最新研究[35]表明，当长期运行时，MBfR温度从逐步从25 ℃降低到10 ℃仍能获得较好的DAMO活性，氮去除速率为0.13 kg·(m3·d)−1，所以，长期运行时温度对反应器的影响还需进一步探究。

    3)甲烷分压对DAMO活性的影响。由于甲烷是DAMO过程的唯一碳源，而甲烷在水中的溶解度低限制了DAMO微生物的培养。在本研究中，当设置甲烷分压为25、50、75、100 kPa时，如图9所示，对应的7 d内相对反硝化速率分别为0.261、0.267、0.299、0.300 mg·(L·d)−1。可见，甲烷分压越高，反硝化速率越高；当甲烷分压在75~100 kPa时的反硝化速率高于甲烷分压为25~50 kPa的实验组。上述结果说明，较高的甲烷分压对DAMO功能有利。但甲烷分压为75 kPa和100 kPa时的2个实验组之间差别不明显，说明当甲烷分压大于75 kPa时，不再是DAMO功能的限制因素。赵荣等[23]的研究表明，甲烷分压在49 kPa以上即可满足DAMO细菌的富集培养。何崭飞等[36]通过建立甲烷传质模型表明，当甲烷分压为25.33 kPa时，不再是DAMO活性限制因素，并且提高搅拌速度有助于提高甲烷传质。

3.   结论

  • 1)单一氮源(NO−3)的SBR-1反应器和多氮源(NO−3，NO−2，NH+4)的SBR-2反应器富集末期硝氮降低速率分别为0.3 mg·(L·d)−1和2.8 mg·(L·d)−1，这说明多氮源比单一氮源更适合富集DAMO微生物。

    2) SBR-2反应器中厌氧氨氧化细菌和DAMO古菌相对丰度(0.56%和0.03%)比SBR-1中更高(0.3%和0.02%)。厌氧氨氧化细菌的增殖有助有DAMO古菌的富集。

    3)根据工艺参数优化结果确定，DAMO反应最适pH为6~7、最适温度为35 ℃；当甲烷分压大于75 kPa时，DAMO反应速率不再受甲烷分压的限制。

参考文献 (36)

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