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反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析

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薛怡亭, 安法财, 石天晶, 党岩, 孙德智. 反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
引用本文: 薛怡亭, 安法财, 石天晶, 党岩, 孙德智. 反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
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XUE Yiting, AN Facai, SHI Tianjing, DANG Yan, SUN Dezhi. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
Citation: XUE Yiting, AN Facai, SHI Tianjing, DANG Yan, SUN Dezhi. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
shu

反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析

  • 北京林业大学，水体污染源控制技术北京市重点实验室，污染水体源控制与生态修复技术北京市高等学校工程研究中心，北京 100083

    • 作者简介: 薛怡亭(1989—)，女，博士研究生。研究方向：生态环境污染机制与修复技术。E-mail：625851936@qq.com
    通讯作者: 孙德智(1960—)，男，博士，教授。研究方向：水体污染控制技术。E-mail：sdzlab@126.com
  • 基金项目:
    国家自然科学基金资助项目(51978053)

  • 中图分类号: X703.1

Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis

  • Engineering Research Center for Water Pollution Source Control and Eco-Remediation, Beijing Key Laboratory for Source Control Technology of Water Pollution, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

    • Corresponding author: SUN Dezhi, sdzlab@126.com

  • 摘要: 采用含有不同氮源的SBR进行为期220 d的反硝化型厌氧甲烷氧化(DAMO)微生物富集，研究单一氮源和多氮源对DAMO富集的影响，并用高通量测序对含有不同氮源的反应器内微生物群落结构进行了分析。结果表明，单一氮源(${\rm{NO}}_3^ - $)和多氮源(${\rm{NO}}_3^ - $，${\rm{NO}}_2^ - $，${\rm{NH}}_4^ + $)为进水的反应器硝氮降低速率分别为0.3 mg·(L·d)−1和2.8 mg·(L·d)−1，这说明多氮源比单一氮源更适合富集DAMO微生物。微生物群落结构分析结果表明，多氮源反应器中厌氧氨氧化细菌和DAMO古菌相对丰度(0.56%和0.03%)比单一氮源反应器中更高(0.3%和0.02%)。采用厌氧小瓶实验对工艺参数优化，结果确定DAMO反应的最适pH为6~7；最适温度为35 ℃；当甲烷分压大于75 kPa时，DAMO反应速率不再受甲烷分压的限制。
    Abstract: In this study, different nitrogen sources was used to enrich the denitrifying anaerobic methane oxidation (DAMO) microbial in SBR for 220 days and the influences of single nitrogen source and multiple nitrogen source on DAMO enrichment were investigated. Microbial community structure in the different SBRs was analyzed by high-throughput sequencing. The experimental results showed that the final nitrate removal rates in the SBRs with a single nitrogen source (${\rm{NO}}_3^ - $) and a multi-nitrogen source (${\rm{NO}}_3^ - $, ${\rm{NO}}_2^ - $, ${\rm{NH}}_4^ + $) were 0.3 mg·(L·d)−1 and 2.8 mg·(L·d)−1, respectively, indicating that multi-nitrogen source were more suitable for DAMO enrichment than single nitrogen source. High-throughput sequencing results showed that the relative abundances of anammox bacteria and DAMO archaea in the SBR with a multi-nitrogen source (0.56%, 0.03%) were higher than those in the SBR with a single nitrogen source (0.3%, 0.02%), respectively. The anaerobic vial test was used to optimize the process parameters, the optimal pH and temperatureo f DAMO reaction were 6~7 and 35 ℃, respectively. When the partial pressure of methane increased to 75 kPa, the DAMO reaction rate was no longer restricted by the partial pressure of methane.
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  • 图 1  SBR装置图

    Figure 1.  Diagram of SBR

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    图 2  培养初期(0~80 d)反应器运行效果

    Figure 2.  Enrichment effect of the reactor during 0~80 days

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    图 3  SBR-1和SBR-2中不同氮素浓度的变化

    Figure 3.  Variations of concentration of different nitrogen species in SBR-1 and SBR-2

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    图 4  SBR-1和SBR-2中${\rm{NO}}_3^ - $转化速率

    Figure 4.  ${\rm{NO}}_3^ - $ conversion rate in SBR-1 and SBR-2

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    图 5  不同氮源SBR中细菌群落结构分析

    Figure 5.  Relative abundance distributions of bacteria community in SBR-1 and SBR-2

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    图 6  不同氮源SBR中古菌属水平分析

    Figure 6.  Relative abundance distributions of archaea at the genus level in SBR-1 and SBR-2

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    图 7  pH对DAMO活性的影响

    Figure 7.  Effect of pH on DAMO

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    图 8  温度对DAMO活性的影响

    Figure 8.  Effect of temperature on DAMO

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    图 9  甲烷分压对DAMO活性的影响

    Figure 9.  Effect of partial pressure of methane on DAMO

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    表 1  DAMO影响因素实验设置

    Table 1.  Experimental setting of influential factors on DAMO

    分组pH温度/℃甲烷分压/kPa
    实验15.0、6.0、7.0、8.035100
    实验27.025、30、35、40100
    实验37.03525、50、75、100
    分组pH温度/℃甲烷分压/kPa
    实验15.0、6.0、7.0、8.035100
    实验27.025、30、35、40100
    实验37.03525、50、75、100
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    表 2  高通量测序选用的引物序列

    Table 2.  Primer sequences for high throughput sequencing

    微生物引物名称序列(5'~3')
    细菌341b4_FCTAYGGRRBGCWGCAG
    806_RGGACTACNNGGGTATCTAAT
    古菌524F10extFTGYCAGCCGCCGCGGTAA
    Arch958RmodRYCCGGCGTTGAVTCCAATT
    微生物引物名称序列(5'~3')
    细菌341b4_FCTAYGGRRBGCWGCAG
    806_RGGACTACNNGGGTATCTAAT
    古菌524F10extFTGYCAGCCGCCGCGGTAA
    Arch958RmodRYCCGGCGTTGAVTCCAATT
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    表 3  SBR-1和SBR-2反应器CH4消耗

    Table 3.  Methane consumption in SBR-1 and SBR-2

    反应器反应时间/h甲烷消耗量/mol${\rm{NO}}_3^ - $消耗量/molCH4/${\rm{NO}}_3^ - $消耗计量比理论DAMO计量比
    SBR-11171.909 2×10−43.471 4×10−40.5500.625
    SBR-21172.398 9×10−34.817 1×10−30.498
    反应器反应时间/h甲烷消耗量/mol${\rm{NO}}_3^ - $消耗量/molCH4/${\rm{NO}}_3^ - $消耗计量比理论DAMO计量比
    SBR-11171.909 2×10−43.471 4×10−40.5500.625
    SBR-21172.398 9×10−34.817 1×10−30.498
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    表 4  SBR中古菌与细菌多样性指数

    Table 4.  Microbial diversity index of archaea and bacteria in SBRs

    菌种shannonsimpsonacechao
    SBR-1 反应器古菌3.362 3650.054 126156.588 2153.545 5
    SBR-2 反应器古菌3.507 8830.046 442190.670 8182.636 4
    SBR-1 反应器细菌5.672 0290.012 3892 336.9122 275.660
    SBR-2 反应器细菌5.581 8290.012 8992 400.3302 342.836
    菌种shannonsimpsonacechao
    SBR-1 反应器古菌3.362 3650.054 126156.588 2153.545 5
    SBR-2 反应器古菌3.507 8830.046 442190.670 8182.636 4
    SBR-1 反应器细菌5.672 0290.012 3892 336.9122 275.660
    SBR-2 反应器细菌5.581 8290.012 8992 400.3302 342.836
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-05-25
  • 录用日期:  2020-09-24
  • 刊出日期:  2021-02-10
薛怡亭, 安法财, 石天晶, 党岩, 孙德智. 反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
引用本文: 薛怡亭, 安法财, 石天晶, 党岩, 孙德智. 反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析[J]. 环境工程学报, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
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XUE Yiting, AN Facai, SHI Tianjing, DANG Yan, SUN Dezhi. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
Citation: XUE Yiting, AN Facai, SHI Tianjing, DANG Yan, SUN Dezhi. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidation microbial and its influence factors analysis[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2021, 15(2): 599-608. doi: 10.12030/j.cjee.202005194
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反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集与影响因素分析

    通讯作者: 孙德智(1960—)，男，博士，教授。研究方向：水体污染控制技术。E-mail：sdzlab@126.com
    作者简介: 薛怡亭(1989—)，女，博士研究生。研究方向：生态环境污染机制与修复技术。E-mail：625851936@qq.com
  • 北京林业大学，水体污染源控制技术北京市重点实验室，污染水体源控制与生态修复技术北京市高等学校工程研究中心，北京 100083
  • 收稿日期:  2020-05-25
  • 录用日期:  2020-09-24
  • 网络出版日期:  2021-02-22
基金项目:
国家自然科学基金资助项目(51978053)

摘要: 采用含有不同氮源的SBR进行为期220 d的反硝化型厌氧甲烷氧化(DAMO)微生物富集，研究单一氮源和多氮源对DAMO富集的影响，并用高通量测序对含有不同氮源的反应器内微生物群落结构进行了分析。结果表明，单一氮源(${\rm{NO}}_3^ - $)和多氮源(${\rm{NO}}_3^ - $，${\rm{NO}}_2^ - $，${\rm{NH}}_4^ + $)为进水的反应器硝氮降低速率分别为0.3 mg·(L·d)−1和2.8 mg·(L·d)−1，这说明多氮源比单一氮源更适合富集DAMO微生物。微生物群落结构分析结果表明，多氮源反应器中厌氧氨氧化细菌和DAMO古菌相对丰度(0.56%和0.03%)比单一氮源反应器中更高(0.3%和0.02%)。采用厌氧小瓶实验对工艺参数优化，结果确定DAMO反应的最适pH为6~7；最适温度为35 ℃；当甲烷分压大于75 kPa时，DAMO反应速率不再受甲烷分压的限制。

English Abstract

    全文HTML

  • 厌氧甲烷氧化过程根据电子受体不同通常可分为3类：一是硫酸盐还原型厌氧甲烷氧化(sulphate-dependent anaerobic methane oxidation，SAMO)[1]；二是反硝化型厌氧甲烷氧化(denitrifying anaerobic methane oxidation，DAMO)[2-4]；三是金属氧化物(铁、锰依赖型)[5-6]和重金属盐类(重铬酸盐、钒酸盐型)[7-8]厌氧甲烷氧化。反硝化型厌氧甲烷氧化(DAMO)工艺是近年来发现的一种新型脱氮工艺，其以CH4为电子供体，${\rm{NO}}_3^ - $或${\rm{NO}}_2^ - $为电子受体实现反硝化脱氮[9-11]。RAGHOEBARSING等[12]从荷兰运河沉积物中富集培养出反硝化型厌氧甲烷氧化微生物群落，检测到甲烷、亚硝酸盐和硝酸盐的同时消耗以及氮气的排放。通过进一步研究证明，所消耗的亚硝酸盐和硝酸盐与所产生的氮气量相当，首次证实厌氧甲烷氧化与反硝化作用的存在。有研究[13-14]发现，DAMO富集体系中通常包含以${\rm{NO}}_2^ - $为氮源的NC10门细菌和以${\rm{NO}}_3^ - $为氮源的DAMO古菌存在。通过DAMO古菌和DAMO细菌的配合，可实现废水中氮素的去除。由于DAMO过程不产生N2O，可以直接利用甲烷，减少温室气体的排放，且避免了反硝化过程中外加碳源引起的二次污染，同时实现废水中${\rm{NO}}_3^ - $和${\rm{NO}}_2^ - $的有效脱除等优点，近几年引起了研究者的广泛关注[15]。

    但DAMO微生物存在代谢活性低、倍增时间长、富集培养困难、易受环境影响等问题[16-19]。由于DAMO细菌缺少普通好氧甲烷氧化菌具有的细胞内膜，pMMO酶是好氧甲烷氧化代谢的关键酶，多存在于细胞内膜上，而DAMO细菌仅有胞质膜可供pMMO酶结合，大大限制了DAMO细菌细胞内部的甲烷氧化代谢过程，使得DAMO细菌代谢活性降低，无法更好的与DAMO古菌配合完成整个反硝化过程[20-21]。此外，由于DAMO微生物对环境要求严格，2%的氧气就会抑制DAMO过程，且甲烷作为DAMO的唯一电子供体，其在水中溶解度低，限制了甲烷传质效率，影响了DAMO的富集。LI等[22]以硝酸盐为底物进行为期600 d的DAMO培养时，测序结果显示仍没有DAMO古菌的存在。赵荣等[23]对亚硝酸盐依赖型DAMO微生物活性影响因素进行了研究，确定了最佳温度为35 ℃，最佳pH为7.5，以及最适亚硝酸盐初始浓度为2.4~3.42 mmol·L−1，但目前几乎没有针对硝酸盐依赖型DAMO微生物活性影响因素方面的研究。基于此，本研究采用不同氮源反应器进行了硝酸盐依赖型DAMO功能微生物的富集，得到DAMO功能菌；采用厌氧小瓶序批式实验，探索了其最佳运行环境，优化工艺参数；通过高通量测序手段分析了微生物群落结构的变化，探究了其反应机理，实现了DAMO功能微生物的富集与影响因素的优化。

1.   材料与方法

    1.1.   富集装置与方法

  • 由于DAMO过程最有可能发生在甲烷和氮源丰富的厌氧或缺氧环境中[24]，为提高富集成功率，本研究接种污泥来自于北京市海棠花溪河道底泥，北京市小红门再生水厂回流污泥，延庆水稻田土和延庆池塘底泥，培养液成分与ETTWIG培养时一致[25]。

    实验采用SBR进行富集，装置如图1所示。反应器为玻璃材质，采用双层结构，夹层为水浴间，起恒温保温作用。反应器内径为15 cm、高为30 cm，内部有效体积为4.0 L，分为液相区(3.0 L)和顶部气相区(1.0 L)。进样口和取样口处设置橡胶塞，防止环境中氧气进入反应器。富集期间保持严格厌氧，溶解氧浓度低于检出限。通过底部磁力搅拌器混合培养液，通过下部进气口通入甲烷，采用循环水浴保持温度恒定在35 ℃，采用HCl或KOH溶液调节反应器pH保持在7.0~7.5。

    由于DAMO微生物倍增时间长且富集时间久，为防止大量微生物流失，反应器氮源通过高浓度氮浓缩液的方式在加料口补充，以减少进出水导致的生物量流失。SBR运行周期包括进水-反应-沉淀-排水，一个运行周期为30 d，每个月最后一天停止搅拌使反应器沉淀4 h，排去反应器内1/2水，补充培养液至3 L，继续正常运行。每5 d对反应器中甲烷更新一次，保证甲烷充足。每周取水样2~3次，持续监测反应器中${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_2^ - $和${\rm{NO}}_3^ - $浓度的变化。

    富集培养分为2个阶段，在阶段1中首先采用硝态氮为氮源进行DAMO古菌的富集，在反应器运行稳定后，再进行不同氮源的反应器富集效果对比(阶段2)。阶段1中的具体方法为：采用SBR对原始泥样进行为期80 d的初期培养，加入新鲜培养液，氮源仅为${\rm{NO}}_3^ - $，投加${\rm{NO}}_3^ - $浓缩液使反应器中${\rm{NO}}_3^ - $浓度在50~110 mg·L−1，持续监测${\rm{NO}}_3^ - $浓度，计算转化速率，当${\rm{NO}}_3^ - $消耗殆尽时，再补充${\rm{NO}}_3^ - $浓缩液，保证底物不受限。阶段2的具体方法为：平行启动2组SBR，在SBR-1和SBR-2反应器中分别接种500 mL的初期富集培养物，加入培养液到3 L混合均匀。SBR-1加入氮源仅为${\rm{NO}}_3^ - $(30~50 mg·L−1)，SBR-2加入氮源为${\rm{NO}}_3^ - $(40~70 mg·L−1)、${\rm{NH}}_4^ + $(30~70 mg·L−1)、${\rm{NO}}_2^ - $ (10 mg·L−1)，持续监测${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_2^ - $、${\rm{NO}}_3^ - $浓度，当底物消耗殆尽时，再补充氮浓缩液，保证底物不受限。研究不同氮源反应器DAMO功能菌富集效果的影响。

    • 1.2.   DAMO影响因素实验方法

  • 采用有效体积150 mL的透明血清瓶进行实验，加入20 mL活性较高的SBR-2中富集220 d的培养物与100 mL新鲜培养液，用高纯氮气(99.999%)向液相中曝气10 min，橡胶塞密封，维持瓶中厌氧环境。采用排液法向瓶内充99.99%的甲烷40 mL，为避免多氮源体系中反应复杂对DAMO活性影响研究产生干扰，血清瓶中只加硝态氮，硝态氮初始浓度50 mg·L−1，进行避光、150 r·min−1恒温振荡培养，待体系稳定后进行影响因素实验。

    本研究设置3个影响因素实验(表1)，包括pH、温度与甲烷分压。每组实验设置3个平行，甲烷分压通过调节顶空甲烷与氮气比例设置，pH通过加入HCl和KOH溶液调节。

    • 1.3.   分析测试方法

  • 硝态氮、亚硝态氮、氨氮采用分光光度法进行测定(DR6 000，HACH)，MLVSS采用重量法进行计算。甲烷总量为气相甲烷与液相甲烷之和，气相甲烷采用Techcomp公司GC7 900气相色谱仪和FID检测器(美国安捷伦科技公司)进行检测，液相中甲烷浓度按照式(1)进行计算。

    式中：$ {X}_{\mathrm{s}} $为溶液中甲烷浓度；$ {X}_{\mathrm{a}} $为摇晃后顶空甲烷浓度；$ {V}_{\mathrm{a}} $为顶空体积，mL；${b} $为甲烷液气分配系数，25 ℃时取0.03；$ {V}_{\mathrm{s}} $为溶液体积，mL。

    • 1.4.   微生物分析方法

  • 在SBR-1和SBR-2反应器运行结束后，取2个反应器中适量样品进行DNA提取。DNA提取及纯化过程参照北京艾德莱生物科技有限公司DNA快速提取试剂盒说明书进行，将提取并纯化的DNA样品委托北京美吉生物医药科技有限公司进行第二代高通量测序。采用表2所示引物进行PCR扩增。高通量测序在Illumina Hiseq 2000平台(Illumia, San Diego, USA)上进行。相似度97%以上的序列合并为一个操作分类单位(OTU)。根据OTU聚类，进行各分类学水平上的群落结构与组成分析。

2.   结果与讨论

    2.1.   DAMO功能微生物的富集

  • 图2(a)表示在阶段1(0~80 d)的SBR中${\rm{NO}}_3^ - $、${\rm{NO}}_2^ - $、${\rm{NH}}_4^ + $浓度随时间的变化。由图2(a)可知，外加氮源仅为${\rm{NO}}_3^ - $，当${\rm{NO}}_3^ - $浓度低于5 mg·L−1时，补充${\rm{NO}}_3^ - $保证基质不受限，在整个培养初期，${\rm{NO}}_2^ - $浓度在0~5.06 mg·L−1，未发生${\rm{NO}}_2^ - $积累，氨氮浓度持续缓慢升高，通过换水的方式控制，分析氨氮的产生主要由于大量微生物细胞死亡裂解所致。

    根据图2(b)对培养初期SBR中硝态氮降解速率进行了分析，可以看出，硝态氮降解速率可明显分为3个阶段。0~17 d时反应器${\rm{NO}}_3^ - $降解速率较低，且呈逐渐下降趋势，从45 mg·(L·d)−1降至11 mg·(L·d)−1，此时初始接种物中残留有机碳为反硝化过程提供碳源。17~30 d时${\rm{NO}}_3^ - $降解速率呈现先升高后降低的趋势，由11 mg·(L·d)−1逐步升高至79 mg·(L·d)−1再降低至20 mg·(L·d)−1。前期上升的原因为，反应器进入内源代谢阶段，微生物利用自身贮藏物质和酶等来取得营养物质，此时大量细胞裂解死亡产生的碳源为反硝化提供电子供体，硝氮降低速率逐渐上升；后期下降的原因为，反应器内残余的除甲烷外的碳源被不断消耗而得不到补充，内源反硝化活性不断降低，硝氮降低速率逐渐下降。31~80 d反应器${\rm{NO}}_3^ - $降低速率逐渐趋于稳定，基本保持在5 mg·(L·d)−1到30 mg·(L·d)−1，反应器进入漫长的停滞期。此外，在第40天和第80天分别测定CH4消耗速率与${\rm{NO}}_3^ - $消耗速率之比，用来表示DAMO对${\rm{NO}}_3^ - $转化的贡献占比。40 d时CH4/${\rm{NO}}_3^ - $消耗计量比为0.06，80 d时CH4/${\rm{NO}}_3^ - $消耗计量比为0.18，虽然仍未达到DAMO理论计量比0.625，但比值升高表明DAMO过程对${\rm{NO}}_3^ - $降解的贡献占比缓慢升高。

    为提高富集成功率，在初期培养后分别采用含有不同氮源的SBR反应器对DAMO微生物进行培养，SBR-1氮源为${\rm{NO}}_3^ - $，SBR-2氮源为${\rm{NO}}_2^ - $、${\rm{NO}}_3^ - $、${\rm{NH}}_4^ + $，反应器运行方式同初期富集方式。图3(a)与图3(b)分别表示SBR-1和SBR-2反应器中${\rm{NO}}_2^ - $、${\rm{NO}}_3^ - $、${\rm{NH}}_4^ + $浓度随时间变化过程。由图3(a)可知，SBR-1中${\rm{NO}}_2^ - $浓度始终在6.3 mg·L−1以下，未发生${\rm{NO}}_2^ - $积累，氨氮浓度持续到第113天时开始下降，直到第140天时降为0 mg·L−1，此后再未出现氨氮的积累，这表明微生物死亡率下降，由细胞裂解产生的氨氮不再出现，反应器内源反硝化阶段结束。

    对SBR-1和SBR-2反应器中硝态氮转化速率进行分析，结果如图4(a)与图4(b)所示。富集结束时SBR-1硝氮降低速率为0.3 mg·(L·d)−1，SBR-2硝氮降低速率为2.8 mg·(L·d)−1。虽然反硝化速率有所波动，但从80~220 d的平均值也可以看出，SBR-1硝氮降低速率平均值为0.90 mg·(L·d)−1，SBR-2硝氮降低速率平均值为1.38 mg·(L·d)−1，所以多氮源相比于单一氮源的反应器更有助于DAMO古菌的富集。其主要原因可能是，在多氮源反应器中除了硝氮外，还添加了氨氮与亚硝氮，在厌氧环境下培养出部分anammox细菌，anammox细菌对${\rm{NO}}_2^ - $的亲和常数要低于DAMO细菌，对${\rm{NO}}_2^ - $的竞争能力更强，限制了DAMO细菌的大量繁殖，从而促进DAMO古菌对甲烷的利用，有利于DAMO古菌的富集。所以Anammox-DAMO系统联合作用有助于DAMO古菌的富集培养，从而提高硝氮转化速率。这与FU等[26]的研究结果一致，他们发现，在添加不同氮源时DAMO功能菌的富集培养过程中，当采用${\rm{NO}}_2^ - $、${\rm{NO}}_3^ - $、${\rm{NH}}_4^ + $为氮源时硝氮转化速率最快。前期有研究[12, 27-28]表明，DAMO微生物富集时间在300~600 d时反硝化速率为0.18~2 mmol·(L·d)−1，本实验在220 d时就达到了2.8 mg·(L·d)−1，有效缩短了培养时间。

    由表3可知，SBR-1和SBR-2反应器在富集末期存在明显的CH4消耗，这说明在2个反应器中均存在DAMO过程。此外2个反应器中实际CH4/${\rm{NO}}_3^ - $消耗计量比均小于理论DAMO计量比值，引起这一偏差的原因，可能是由于系统中存在有机残留物(如微生物代谢产物等)时的异养反硝化作用所导致的。

    • 2.2.   DAMO功能微生物群落结构分析

  • 1)不同氮源反应器微生物多样性差异分析。富集结束后对SBR-1和SBR-2中的微生物进行了群落结构分析(表4)。shannon、simpson指数反映群里多样性，simpson指数越大，说明群落多样性越低，shannon值越大，说明群落多样性越高，chao、ace指数反映群落丰富度，值越大，群落丰富度越高[29]。综合SBR-1和SBR-2反应器中古菌多样性指数可以看出，SBR-2比SBR-1中古菌的多样性更高，丰富度更高。而从细菌群落多样性指数可以看出，SBR-1比SBR-2多样性更高，但SBR-2丰富度更高。所以多氮源富集培养DAMO比仅用硝氮培养DAMO的反应器群落结构更加丰富，微生物多样性更高。

    2)不同氮源反应器微生物群落结构分析。对2个反应器中细菌群落与古菌群落结构差异进行了详细解析。对细菌门水平分析发现，SBR-1中丰度前5的门及其占比分别为Proteobacteria (23.12%)>Patescibacteria (17.83%)>Chloroflexi (14.55%)>Actinobacteria (11.88%)>Acidobacteria (9.72%)。SBR-2中丰度前5的门及其占比分别为Patescibacteria (27.29%)>Chloroflexi (16.06%)>Proteobacteria (15.30%)>Actinobacteria (11.11%)>Bacteroidetes (6.91%)。需特别注意的是，2个反应器中均含有少量的NC10门细菌，其中SBR-1中NC10占0.16%，SBR-2中NC10占0.1%，NC10门细菌是典型的亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化反硝化细菌[30]，其主要利用${\rm{NO}}_2^ - $为电子受体，甲烷为电子供体，在厌氧环境下进行反硝化型甲烷厌氧氧化，从而达到废水中溶解甲烷与${\rm{NO}}_2^ - $的同步去除。

    根据图5，对不同氮源SBR中细菌在目和属水平上进行分析，发现Candidatus_Nomurabacteria目在SBR-1和SBR-2中占比分别为6.54%和3.38%，其通常大量参与氮、硫和铁循环的自养类群，与溶解氧负相关。此外，在SBR-1和SBR-2中均发现厌氧氨氧化细菌，SBR-1中厌氧氨氧化菌占0.30%，SBR-2中厌氧氨氧化菌占0.56%。具体共有3种厌氧氨氧化菌属：Candidatus_Brocadia在SBR-1中占0.29%，在SBR-2中占0.24%；Candidatus_Kuenenia在SBR-1中未发现，在SBR-2中占0.29%；Candidatus_Anammoximicrobium在SBR-1中占0.01%，在SBR-2中0.03%。可见，在SBR-2中厌氧氨氧化细菌的相对丰度大于SBR-1中。虽然SBR-1的微生物培养时并未外加氨氮与亚硝氮，但大量细胞裂解死亡产生的氨氮为厌氧氨氧化菌的存在提供条件，且亚硝氮的存在很可能是由于DAMO古菌将${\rm{NO}}_3^ - $还原为${\rm{NO}}_2^ - $，所以从侧面证实DAMO古菌存在的可能。

    对含有不同氮源SBR中古菌门水平群落结构分析可知，SBR-1和SBR-2中前5类主要的门种类一致。其中，广古菌门Euyarchaeota在SBR-1和SBR-2中丰度均为最高，占比分别是82%和80%，它通常包含了古菌中的大多数种类，包括产甲烷菌、在极高盐浓度下生活的盐杆菌、一些超嗜热的好氧和厌氧菌等。其他古菌占比依次为奇古菌门Thaumarchaeota (SBR-1中占8.0%，SBR-2中占6.2%)、泉古菌门Crenarchaeota (SBR-1中占5.7%，SBR-2中占3.7%)和纳古菌门Nanoarchaeaeota (SBR-1中占0%，SBR-2中占6.7%)。

    由图6可知，对含不同氮源SBR中的古菌属水平进行分析发现，SBR-1中丰度前5的属及其占比分别为：甲烷杆菌属Methanobacterium (49.76%)>甲烷短杆菌Methanobrevibacter (10.04%)>甲烷八叠球菌Methanosarcina (9.76%)>Methanomassiliicoccus (2.42%)>Rice_Cluster_I (2.26%)。SBR-2中丰度前5的属及其占比分别为：甲烷杆菌属Methanobacterium (40.99%)>甲烷八叠球菌Methanosarcina (11.93%)>甲烷短杆菌Methanobrevibacter (10.85%)>Methanomassiliicoccus (2.70%)>甲烷鬃毛菌Methanosaeta (2.20%)，可见，2个反应器中主要微生物均为产甲烷古菌，同时，均发现能够进行硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化反硝化(DAMO)的古菌Candidatus_Methanoperedens，分别在SBR-1中占0.02%，SBR-2中占0.03%。可见，DAMO古菌相对丰度在多氮源的SBR-2反应器中占比略高于单一氮源的SBR-1反应器。结合之前微生物细菌的比较分析，可发现，厌氧氨氧化细菌较多时DAMO古菌丰度更高，分析原因主要由于厌氧氨氧化细菌可限制DAMO细菌的增殖，减少其对甲烷的竞争，从而促进DAMO古菌对甲烷的利用，有利于DAMO古菌的富集，所以多氮源反应器中厌氧氨氧化细菌的增殖有助有DAMO古菌的富集。

    • 2.3.   DAMO活性影响因素分析

  • 1) pH对DAMO活性的影响。不同pH条件下的DAMO过程中的反硝化速率如图7所示。当pH为5.0、6.0、7.0、8.0时，对应的7 d内平均反硝化速率分别为0.222、0.296、0.292、0.178 mg·(L·d)−1。说明当pH为6.0时，反硝化速率最大，而pH为7.0时，反硝化速率略低于pH为6.0时。这也说明，当pH在6~7时DAMO活性最强，pH过高或过低均会抑制DAMO活性。目前已报道的DAMO微生物富集培养适合的pH多在6~8[31]，ZHU等[32]的研究认为，当pH为7.4时DAMO反应活性最强，而HE等[33]研究表明，最适pH为7.6，在低于7.6时DAMO活性就会受到抑制。

    2)温度对DAMO活性的影响。理论上，由于温度越低，甲烷在水中的溶解度越高，反应器中可利用的甲烷越多，反应性运行效能越好，但过低的温度会抑制反应器中微生物的活性，所以研究温度对DAMO反应的影响至关重要。图8显示了不同温度梯度下DAMO过程反硝化速率变化，可见，在当温度为25、30、35、40 ℃时，对应的7 d内平均反硝化速率分别为0.085、0.151、0.292和0.147 mg·(L·d)−1。所以，温度为35 ℃时，反硝化速率最大，DAMO活性最强。何崭飞[34]经过短期与长期不同温度的DAMO微生物培养也表明最适温度为35 ℃。而最新研究[35]表明，当长期运行时，MBfR温度从逐步从25 ℃降低到10 ℃仍能获得较好的DAMO活性，氮去除速率为0.13 kg·(m3·d)−1，所以，长期运行时温度对反应器的影响还需进一步探究。

    3)甲烷分压对DAMO活性的影响。由于甲烷是DAMO过程的唯一碳源，而甲烷在水中的溶解度低限制了DAMO微生物的培养。在本研究中，当设置甲烷分压为25、50、75、100 kPa时，如图9所示，对应的7 d内相对反硝化速率分别为0.261、0.267、0.299、0.300 mg·(L·d)−1。可见，甲烷分压越高，反硝化速率越高；当甲烷分压在75~100 kPa时的反硝化速率高于甲烷分压为25~50 kPa的实验组。上述结果说明，较高的甲烷分压对DAMO功能有利。但甲烷分压为75 kPa和100 kPa时的2个实验组之间差别不明显，说明当甲烷分压大于75 kPa时，不再是DAMO功能的限制因素。赵荣等[23]的研究表明，甲烷分压在49 kPa以上即可满足DAMO细菌的富集培养。何崭飞等[36]通过建立甲烷传质模型表明，当甲烷分压为25.33 kPa时，不再是DAMO活性限制因素，并且提高搅拌速度有助于提高甲烷传质。

3.   结论

  • 1)单一氮源(${\rm{NO}}_3^ - $)的SBR-1反应器和多氮源(${\rm{NO}}_3^ - $，${\rm{NO}}_2^ - $，${\rm{NH}}_4^ + $)的SBR-2反应器富集末期硝氮降低速率分别为0.3 mg·(L·d)−1和2.8 mg·(L·d)−1，这说明多氮源比单一氮源更适合富集DAMO微生物。

    2) SBR-2反应器中厌氧氨氧化细菌和DAMO古菌相对丰度(0.56%和0.03%)比SBR-1中更高(0.3%和0.02%)。厌氧氨氧化细菌的增殖有助有DAMO古菌的富集。

    3)根据工艺参数优化结果确定，DAMO反应最适pH为6~7、最适温度为35 ℃；当甲烷分压大于75 kPa时，DAMO反应速率不再受甲烷分压的限制。

参考文献 (36)

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