实验所用菌株取自阜新市皮革园区生化池。以乙醇为碳源、按5%接种量接入菌株进行富集培养，直至其适应新碳源环境，并能够大量繁殖；采用叠皿夹层培养法对菌株进行纯化分离，直至得到形态单一菌落，将其继续培养即得到纯化的菌株；对菌株分别进行革兰氏染色、芽孢染色、在1 600倍油镜下镜检观察；将菌株置于2份等量的浅层液体培养基中培养：1份进行摇床振荡好氧培养，1份在液体培养基液面滴加石蜡油置于厌氧培养箱中进行厌氧培养。3 d后分别进行基因测序，并利用透射电镜在放大30 000倍条件下进行镜检观察。

室温下，称取2 g氧氯化锆，溶于200 mL质量分数为95%的乙醇溶液中，ZrOCl₂在乙醇溶液中进行水解和缩聚反应，反应如式(1)和式(2)所示。

在得到无色透明的纳米二氧化锆明胶后，向200 mL溶胶中加入0.6 g丙烯酰胺单体、0.05 g亚硫酸氢钠和过硫酸钾作为引发剂，将混合溶液充分搅拌均匀，在25 ℃下，进行聚合反应30 min，得到纳米ZrO₂-聚丙烯酰胺无机-有机杂化材料。

称取质量分数为2.5%的海藻酸钠于300 mL蒸馏水中，充分溶胀后，加入200 mL纳米ZrO₂-聚丙烯酰胺杂化材料混匀溶解，密封并于室温下存放8~12 h，再向混合溶液中加入质量分数为2.5%的制孔剂聚乙二醇以及100 mL经驯化培养后处于对数期生长的菌液(平板计数法得到菌液对数期的菌密度为3×10⁸个·mL⁻¹)，充分混合、搅拌均匀后，利用注射器滴入到pH=6的2%CaCl₂饱和硼酸溶液中，期间利用搅拌器以100 r·min⁻¹的搅拌速率进行交联。4 h后取出颗粒，用0.9%生理盐水进行冲洗，再吸干表面水分，重复3遍。在小球使用前，再放入富集培养基中激活12 h。

1)机械强度测试。将固定化细菌颗粒放于100 mL的玻璃注射器中，向玻璃注射器施加一定的压力，观察颗粒的破损情况；同时，用手捏固定好的细菌颗粒，根据整个过程细菌颗粒的变化情况来描述其机械强度，从颗粒的硬度以及弹性对其进行强度分级：当颗粒较软时，认为其强度等级较差；当颗粒具有一定的硬度、弹性较差时，认为其强度等级中等；当颗粒具有一定的硬度且弹性好时，认为其强度等级良好；当颗粒硬度大且易碎时，认为其强度等级为优。

2)传质性能测试。将固定化的细菌颗粒加入到一定量的滴有墨水的蒸馏水中，2 h后取出，观察颗粒颜色进入颗粒的深度，与未加入墨水的固定化颗粒进行对比，确定其传质性能，传质性能分级如下：当颗粒仅有表面变黑且颜色较浅时，认为其传质能力较差；当距离颗粒中心约1/2处变黑且颜色较深时，认为其传质能力中等；当颗粒中心变黑、颜色较浅时，认为其传质能力良好；当颗粒中心变黑、颜色较深时，认为其传质能力为优。

3)成球性能测试。根据固定化过程肉眼判断成球状况的规则性，根据颗粒成球的黏连性判断颗粒的成球性能。成球性能分级如下：当难于成球、黏连严重时，认为其成球性能较差；当成球的形状不规则、部分黏连时，认为其成球性能中等；当成球形状规则、部分黏连时，认为其成球性能良好；当成球形状规则、无黏连时，认为其成球性能为优。

4)细菌活性测试。取一定量的细菌颗粒，置于上述配置的细菌富集培养基中，并向培养基中加入浓度为500 mg·L⁻¹的${\rm{SO}}_4^{2 - }$，隔一段时间后，观察培养基的颜色变化情况，测定${\rm{SO}}_4^{2 - }$的浓度变化，根据是否产生臭鸡蛋味的气体情况来判断固定化细菌的活性。细菌活性分级如下：当溶液颜色无明显变化、${\rm{SO}}_4^{2 - }$去除率<20%、产生极少臭鸡蛋气味气体时，认为其活性较差；当溶液颜色较浅、${\rm{SO}}_4^{2 - }$去除率为40%~60%、产生少量臭鸡蛋气味气体时，认为其活性中等；当溶液变为较黑色、${\rm{SO}}_4^{2 - }$去除率60%~80%、产生较多臭鸡蛋气味气体时，认为其活性良好；当溶液变为深黑色、${\rm{SO}}_4^{2 - }$去除率80%~95%、产生大量的臭鸡蛋气味气体时，认为其活性为优。

设计6组直径为50 mm、高为50 cm、总容积为0.98 L的动态柱，底部0~3 cm填有进水炉渣含水层，含水层以上30 cm填充反应层，反应层以上设有3 cm炉渣过滤层，如图1所示。1^#柱反应层采用纳米ZrO₂-SRB颗粒，颗粒中包含200 mL杂化材料和100 mL菌液，进水水力负荷为2.935 m³·(m²·d)⁻¹，进水成分近似模拟该地区地下水的成分：5 mg·L⁻¹ F⁻、10 mg·L⁻¹ Cr(Ⅵ)、10 mg·L⁻¹ Cr(Ⅲ)、500 mg·L⁻¹ ${\rm{SO}}_4^{2 - }$、pH=4.6；2^#柱反应层采用与1^#柱相同密度的SRB，进行挂膜处理，且在2^#柱中加入与1^#柱相同量的杂化材料；3^#、4^#柱进水水力负荷分别为1.468、4.403 m³·(m²·d)⁻¹，5^#柱进水成分中将Cr(Ⅵ)提高为50 mg·L⁻¹，6^#柱进水成分中将F⁻提高为10 mg·L⁻¹；各柱中保持纳米ZrO₂-SRB颗粒数量以及其他进水条件均与1^#柱相同。连续测定出水各个污染物的浓度及pH的提升效果。

利用0.1 mol·L⁻¹ HCl、0.2 mol·L⁻¹乙醇和质量分数为2.5%硫脲作为洗脱液，将吸附污染离子后的纳米ZrO₂-SRB颗粒加入50 mL洗脱液，并在35 ℃下180 r·min⁻¹下振荡处理60 min，再放入富集培养基中激活12 h。脱附完成后，再次进行吸附，如此吸附-脱附重复3次，并计算每次再生后颗粒对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$、F⁻的去除率。

pH采用玻璃电极法测定；Cr(Ⅵ)采用二苯碳酰二肼分光光度法测定；Cr(Ⅲ)采用高锰酸钾氧化-二苯碳酰二肼分光光度法测定；${\rm{SO}}_4^{2 - }$采用铬酸钡分光光度法测定；F⁻采用离子选择电极法测定。

1 600倍油镜下镜检SRB的革兰氏染色、经番红复染的芽孢染色、SRB透射电镜放大30 000倍的检测结果如图2所示。由图2(a)可看出，经革兰氏染色后，SRB被染为红色，初步判断该菌株呈阴性；由图2(b)可看出，经番红复染后被染为红色，说明该菌株无芽孢；由图2(c)可明显看出，该菌株呈杆状，且具有鞭毛。

好氧和厌氧条件下培养的菌株经DNA测序后，测序结果相同，说明该菌株生化类型为兼性厌氧型。基因测序以及BLAST基因库比对、序列同源性分析如表1所示，可看出，该兼性厌氧菌与Citrobacter amalonaticus TB10的相似性最高，相似度达99.93%，说明该菌株与Citrobacter amalonaticus TB10属于同一性质的菌株，均为柠檬酸性杆菌。并利用MEGA 6.0软件得到所测菌株序列与其他物质的亲缘关系；得到的进化树结果如图3所示。

将制得的纳米ZrO₂-聚丙烯酰胺杂化材料在60 ℃条件下烘干，采用SEM在放大倍数为5 000倍下观察其表观结构，并进行EDS能谱和FT-IR红外光谱分析，结果如图4所示。可以看出，纳米ZrO₂-聚丙烯酰胺杂化材料表面孔隙明显，质地均匀，分散性较好；主要含N—H、C—H、C=O、C—N、Zr—O—Zr特征峰，说明杂化材料中既有有机物吸收峰又有无机物吸收峰，由此可见，ZrO₂与聚丙烯酰胺间是通过共价键连接。

固定化细菌颗粒如图5所示。通过对其做系列性能分析后，发现其在成球过程中形状规则且无黏连，说明其成球性好；在玻璃注射器中施加一定的压力后不易破损，压力增大，破损程度增大，说明其具有一定的硬度、弹性较好；将其加入到滴有墨水的蒸馏水中，2 h取出后发现其中心颜色变黑，且颜色较深，说明其传质性能良好；将其放于培养基中一段时间后，发现培养基颜色变深，且有黑色沉淀生成，会产生一种臭鸡蛋气味的气体产生，此时测定硫酸根的去除率为69.9%，说明其活性良好。

6个动态柱的出水情况如图6~图11所示。对比1^#、2^#动态柱出水情况，可以看出，在SRB和杂化材料投加量相同条件下，纳米ZrO₂-SRB颗粒反应层对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$、F⁻的去除效果要好于挂膜的SRB，对溶液中Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$的有效去除时间要长于挂膜的SRB反应层，这说明纳米ZrO₂-SRB颗粒可以利用杂化材料中的乙醇作碳源。纳米ZrO₂-SRB颗粒对溶液中Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$的作用包括SRB和纳米ZrO₂的双重作用，而F⁻的去除主要依靠纳米ZrO₂的吸附作用。Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$、F⁻的最大去除率分别为99.7%、98.8%、70.4%、92.4%；单独的SRB对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$的最大去除率分别为99.3%、72.4%、71.2%，对F⁻没有去除效果。且可以看出，2种反应层对pH的提升效果影响较小，这说明溶液中的pH主要靠SRB的作用，纳米ZrO₂对溶液pH没有提升作用。

对比1^#、3^#、4^#动态柱的出水情况，可以看出，不同进水水力负荷均不会影响到纳米ZrO₂-SRB颗粒对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$、F⁻的最大去除率，对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$、F⁻的最大去除率分别为99.7%、98.7%、71.2%、93.7%，但随着进水负荷的增大，维持污染物最大去除率的时间较短，pH最大提升水平维持的时间也有所缩短。在进水水力负荷为2.935 m³·(m²·d)⁻¹、反应进行1~14 d时，F⁻的去除率可以维持在最大水平，7~23 d期间对Cr(Ⅵ)和${\rm{SO}}_4^{2 - }$的去除率可以维持在最大水平；而当水力负荷为4.403 m³·(m²·d)⁻¹时，对F⁻的去除率仅在4 d前可维持最大，对Cr(Ⅵ)和${\rm{SO}}_4^{2 - }$的去除率仅在4.5~8.5 d时保持最大，可看出，能够保证各个污染物有效去除的时间明显缩短了。这是因为在反应层高度相同时，进水流速越大，对反应层的传质推动力越大，导致污染物与反应层的接触时间缩短，污染物未来得及和反应层充分接触便流出动态柱，但进水流速也不宜太小，太小的进水流速会延长接触时间，在相同的处理时间内处理的水量小，所以最佳进水水力负荷选择2.935 m³·(m²·d)⁻¹较为适宜。

对比1^#、5^#、6^# 3个动态柱内的出水情况，可以看出，当Cr(Ⅵ)的浓度增加到50 mg·L⁻¹时，纳米ZrO₂-SRB颗粒对Cr(Ⅵ)的最大去除率仍然可维持在99.7%，但在初始1~3 d时，由于SRB的活性较低，5^#动态柱出水中Cr(Ⅵ)的去除率仅为62.3%，相比于1^#动态柱去除率91.8%，明显有所下降。这说明纳米ZrO₂对高浓度Cr(Ⅵ)的选择吸附性较低，但是靠SRB对Cr(Ⅵ)的还原作用仍然可使出水浓度维持在较佳水平，且当Cr(Ⅵ)浓度增大后，不会影响到纳米ZrO₂对F⁻和Cr(Ⅲ)的吸附效果，但对${\rm{SO}}_4^{2 - }$的去除效果会有一定影响。由此可见，纳米ZrO₂对F⁻和Cr(Ⅲ)的吸附选择性优于Cr(Ⅵ)优于${\rm{SO}}_4^{2 - }$；当F⁻浓度增加到10 mg·L⁻¹时，对比1^#和6^#动态柱内的出水情况，可以看出，6^#动态柱中在反应1~3 d时，对F⁻、Cr(Ⅵ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$的去除率较1^#动态柱中的去除率有所变化，对F⁻的去除率由93.7%上升为96.7%，对Cr(Ⅵ)的去除率由原来的91.8%下降为87.8%，对${\rm{SO}}_4^{2 - }$的去除率由原来的30.2%降为17.5%，对Cr(Ⅲ)的去除效果基本上没有变化，说明纳米ZrO₂对F⁻的吸附性能优于Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)和${\rm{SO}}_4^{2 - }$。

纳米ZrO₂-SRB颗粒经过0、1、2、3次脱附再生后，对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$、F⁻的去除结果如图12所示。由图12可看出，经过3次循环再生后，较最初对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$、F⁻的去除率仅分别降低了1.8%、4.0%、1.5%、4.2%。由此可见，SRB在经过加入碳源乙醇和培养基活化后可以恢复其活性，颗粒可以达到较好的再生效果。这说明0.1 mol·L⁻¹ HCl、0.2 mol·L⁻¹乙醇、质量分数为2.5%硫脲和培养基的活化作用对于纳米ZrO₂-SRB颗粒是一种良好的再生剂。

1)微观结构表征。将包埋后得到的纳米ZrO₂-SRB颗粒和处理不含Cr(Ⅲ)的污染地下水后得到的颗粒分别在60 ℃条件下烘干，采用SEM在放大倍数为2 000倍下观察材料的表观结构和XRD分析，结果如图13所示。可以看出，处理污染物前，细菌颗粒呈现明显的微球状，孔道通畅，表面较为光滑，主要含有的成分是ZrO₂和一种有机物CH₄N₂O·C₂H₂O₄。吸附处理污染水后的细菌颗粒形状变得不为明显，且表面变得粗糙，出现大量的凸形褶皱；处理污染水后的颗粒成分主要有C、O、Zr、S、H、Cr、F等元素；处理不含Cr(Ⅲ)的污水后，出现了ZrCr₂H₁₀、C₆Cr₂O₁₂、ZrS_0.67、ZrO_0.67F₂、Cr(OH)₃新物质，Cr最终以Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)形式存在，说明SRB可将溶液中的${\rm{SO}}_4^{2 - }$还原为S^2-、将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，最终以ZrCr₂H₁₀、Cr(OH)₃、ZrS_0.67的形式被去除，且ZrS_0.67是硫化物的最终去向，残留在颗粒中；最终产物中含有Cr(Ⅵ)，说明ZrO₂-SRB处理污染地下水不但具有还原过程还存在纳米ZrO₂的吸附过程，可吸附水中的Cr(Ⅵ)和F⁻，最终分别以C₆Cr₂O₁₂和ZrO_0.67F₂形式被去除。

2)等温吸附实验。取100 mL含10 mg·L⁻¹ Cr(Ⅵ)、10 mg·L⁻¹ Cr(Ⅲ)、5 mg·L⁻¹ F⁻、500 mg·L⁻¹ ${\rm{SO}}_4^{2 - }$的溶液9份，每份分别加入质量为0.83、1.66、2.49、3.32、4.15、4.98、5.81、6.64、7.47 g纳米ZrO₂-聚丙烯酰胺杂化材料，调节原始溶液至pH=7，置于温度为25 ℃条件下，振荡反应20 min后取出，经过滤后分别测定溶液中Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、F⁻和${\rm{SO}}_4^{2 - }$浓度。

Langmuir和Freundlich模型的方程式分别如式(3)和式(4)所示。

式中：${C_{\rm{e}}}$为平衡浓度，mg·L⁻¹；$b$为${\rm{Langmuir}}$吸附常数，L·mg⁻¹；${Q_{\rm{m}}}$为达到饱和时的吸附量，mg·g⁻¹；${Q_{\rm{e}}}$为达到动态平衡时的吸附量，mg·g⁻¹。${K_{\rm{f}}}$为${\rm{Freundlich}}$吸附常数；$n$为经验常数。

F⁻、Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$ 4种离子的Langmuir模型和Freundlich模型拟合结果如表2所示。由表2可知，Freundlich模型(R²=0.997 3、0.991 6、0.998 1、0.991 1)相比于Langmuir模型(R²=0.883 9、0.790 0、0.723 2、0.639 6)可以更好地拟合杂化材料对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、F⁻、${\rm{SO}}_4^{2 - }$的吸附过程，这说明吸附不仅仅是均匀的单层吸附，更主要的是多层吸附过程。

1)室内动态柱实验结果表明：纳米ZrO₂-SRB颗粒为反应层、进水水力负荷2.935 m³·(m²·d)⁻¹时对污染物的去除效果更好；且ZrO₂-SRB颗粒对F⁻的吸附选择性优于Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)和${\rm{SO}}_4^{2 - }$。

2)结构表征结果表明：纳米ZrO₂-SRB颗粒处理污染物后出现大量凸形褶皱，且颗粒组成中出现S、Cr、F元素。

3)纳米ZrO₂-SRB颗粒处理污染物的机理为：SRB对Cr(Ⅵ)、${\rm{SO}}_4^{2 - }$存在还原作用，杂化材料对Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、F⁻存在吸附作用；且吸附等温线符合Freundlich模型，这说明吸附过程是多层吸附。

4) 0.1 mol·L⁻¹ HCl、0.2 mol·L⁻¹乙醇、质量分数为2.5%硫脲和培养基的活化共同作用对于纳米ZrO₂-SRB颗粒的再生具有良好的效果。