基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

徐晓庆; 苏命; 朱宜平; 崔长征; MUHAMMAD Suruzzaman; 徐亚楠; 于建伟; 杨敏

doi:10.12030/j.cjee.201912184

基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

1.
华东理工大学资源与环境工程学院，国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海 200237
2.
中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085
3.
上海城投原水有限公司，上海 200125

作者简介: 徐晓庆(1994—)，女，硕士研究生。研究方向：饮用水源地产嗅风险评估与调控。E-mail：lovelyyokyo@163.com

通讯作者: 崔长征(1978—)，男，博士，副教授。研究方向：环境微生物利用等。E-mail：cuichangzheng@ecust.edu.cn;

基金项目:
国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07108-002-02)；国家自然科学基金资助项目(51878649)
中图分类号: X832

Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application

1.
State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Risk Assessment and Control on Chemical Process, School of Resources and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
2.
State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
3.
Shanghai Chengtou Raw Water Co. Ltd., Shanghai 200125, China

Corresponding author: CUI Changzheng, cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

摘要: 我国地表水源中由丝状蓝藻代谢产生2-甲基异莰醇(2-MIB)导致的嗅味问题十分普遍。由于传统显微镜检测方法无法鉴别产嗅藻种，不能满足水源水质管理要求，故有必要构建能特异性表征水体产嗅潜力的检测方法。由于丝状藻代谢产生2-MIB主要受其合成功能基因调控，设计了2-MIB功能基因引物，经引物特异性检验及PCR条件优化后，构建了基于2-MIB功能基因的定量PCR方法，并采用实际环境样品进行测试与验证。结果表明：引物特异性良好，定量PCR方法能有效检测2-MIB功能基因，并绘制了标准曲线，得出检测限为8.44×10² copies·L⁻¹；实际样品测试结果显示其2-MIB功能基因浓度在2.09×10⁷~1.94×10¹⁰ copies·L⁻¹范围内，与基于仪器分析方法测定的2-MIB浓度符合线性关系(R²=0.63，P<0.01)，表明定量方法可行。该方法具有灵敏性高、特异性好的特点，能特异性检测产嗅基因，可应用于水源地中产嗅潜力评估与预警。
- 定量PCR /
- 2-甲基异莰醇 /
- 产嗅功能基因 /
- 丝状蓝藻 /
- 饮用水
Abstract: Two-methylisoborneol (2-MIB) is a typical secondary metabolite released from cyanobacteria which causes off-flavor odor problem in surface water across China. Microscopy is the traditional method to identify such cyanobacteria. However, merely it is troublesome to distinguish between 2-MIB producers and non-producers by morphological structure and cannot meet the requirement of the source water quality management. It is necessary to build the test method which can specifically characterize the odor-producing capacity of waterbody. Due to the functional gene regulation for 2-MIB yield from cyanobacteria, the primers of 2-MIB function gene were designed and its specificity test was performed, then the PCR conditions were optimized. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) can be an alternative method to evaluate 2-MIB syntheses which is controlled by 2-MIB functional gene. Here, 2-MIB identification primers (MIBF/MIBR) have been designed and tested with field samples. A good standard curve was established, R²=0.999 5, P<0.01, and the detection limit was 8.44×10² copies·L⁻¹. The concentrations of 2-MIB gene of field samples were between 2.09×10⁷ copies·L⁻¹ to 1.94×10¹⁰ copies·L⁻¹, which were significantly conformity with 2-MIB concentrations measured by GC-MS (R²=0.63, P<0.01). The high sensitivity and specificity of this qPCR-based method suggests that it can effectively evaluate the risk of 2-MIB occurrence and able to monitor source water quality management.
- fluorescence quantitative PCR /
- 2-methylisoborneol /
- odor-producing functional gene /
- filamentous cyanobacteria /
- drinking water

汞具有长距离迁移性和生物富集性，可以在大气中停留数月至1 a，随气流长距离传输，造成远离污染源地区环境汞污染。我国是全球大气汞排放量最大的国家，大约占全球大气汞排放量的30%，所以我国汞控制排放对全球汞减排具有重要意义^[1-2]。因此，我国作为全球大气汞排放量最大的国家，汞排放控制也得到全球的广泛关注，面临巨大的履约压力。2021年，WU等^[2-3]探究了2021年我国重点行业大气汞排放量为314 t，其中燃煤电厂和工业锅炉排放量分别为36 t和24 t，占总排放量的19.1%。因此，煤炭燃烧是我国汞排放控制的重点行业。

相较于国外燃煤行业专门汞控制技术（活性炭喷射技术），我国燃煤行业普遍采用污控措施协同控制措施降低烟气汞排放浓度。以燃煤电厂为例，目前燃煤电厂的污控措施基本都具有选择性催化还原(selective catalytic reduction，SCR)催化剂、除尘设备、湿法脱硫设备(wet fuel gas desulfurization device，WFGD)。汞在烟气中主要存在3种形态：气态元素汞（Hg⁰）、气态氧化汞（Hg²⁺）和颗粒态汞（Hg_p）^[4-6]。Hg²⁺和Hg_p分别被WFGD和除尘设备控制捕集下来，捕集效率高达80%和99%以上。Hg⁰不易溶于水和被除尘捕集，所以燃煤行业烟气汞主要以Hg⁰形式存在。因此，燃煤行业汞减排关键在于通过催化剂将Hg⁰转化为Hg²⁺，进而被脱硫设备捕集。

目前，燃煤电厂普遍采用钒钨钛催化剂作为商业脱硝催化剂，但V₂O₅的高毒性、致癌性等特点限制了钒钨钛催化剂的使用。氧化铈（CeO₂）具有良好储氧能力和氧化还原特性，可以作为催化剂V₂O₅的替代活性组分^[7-9]。以往的研究表明，Ce基催化剂表现出良好的NO_x还原能力或Hg⁰氧化能力，但单一的CeO₂难以满足NO_x还原和Hg⁰氧化双重催化需求，构建多活性位点多反应区域是满足NO_x和Hg⁰协同控制的重要条件。CeMnTi催化剂具备良好的Hg⁰氧化性能和NO_x低温还原性能，但CeO₂高氧化性使SO₂转化为Ce(SO₄)₂或Ce₂(SO₄)₃，造成催化剂失活^[10-12]。基于以上研究，开发SCR烟气条件下具备Hg⁰高效氧化和良好抗硫性能的催化剂尤为必要。

基于以上研究结果与不足，考虑到NH₃、SO₂和Hg⁰酸碱性的差异，本研究以CeO₂为活性位点、TiO₂为载体、WO₃和CuO为改性剂，制备多种Ce基催化剂，构建酸碱性多反应活性区域，分离NH₃、SO₂和Hg⁰吸附反应区域，降低NH₃、SO₂和Hg⁰的竞争吸附，提高催化剂Hg⁰氧化能力，探究了催化剂协同催化脱除和抗硫反应机制，为燃煤行业多污染协同控制和多设备协同控汞提供理论依据。

1. 材料及方法

1.1 催化剂的制备

本研究采用德固赛公司生产的商业TiO₂ (P25) 作为催化剂的载体。基于已有研究^[13]结果，将一定量的Ce(NO₃)₃·6H₂O和草酸溶解于去离子水，按照Ce:W:Cu:Ti比例添加一定量的(NH₄)₁₀H₂(W₂O₇)₆和Cu(NO₃)₂，再添加一定量的P25形成混合溶液，微波处理15 min。将混合溶液搅拌24h，然后再放入110 ℃烘箱中干燥12 h，最后在马弗炉中500 ℃焙烧4h后，自然降温到25 ℃，制备出不同Ce基催化剂。将催化剂研磨压片过筛得到40~60目催化剂样品用于汞氧化实验。所得催化剂包括Ce5Ti(Ce∶Ti=5∶95)、Ce5W9Ti(Ce∶W∶Ti=5∶9∶86)以及Cu5Ce5W9Ti(Cu∶Ce∶W∶Ti=5∶5∶9∶81)。

1.2 催化剂的表征分析

本研究采用X射线衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)、H₂程序升温还原测试(H₂-TPR)、CO₂程序升温脱附分析(CO₂-TPD)和X射线透射电镜(TEM)等表征手段对反应前后的催化剂进行表征，分析催化剂表面理化性质，探究汞氧化反应机制。XRD 物相分析采用Bruker D8 (德国布鲁克公司)，管电流30 mA，管电压40 kV，扫描角度2θ为10°~90°，扫描速度为2 °·min⁻¹。XPS分析采用X射线光电子能谱仪(Thermo ESCALAB 250XI)分析催化剂表面Cu、Ce、W、Ti、O、S、N、Cl和Hg元素的价态。H₂-TPR实验采用AutoChem II 2920 型化学吸附仪 (Micrometritics Co.)，实验步骤如下：取 50 mg 样品(40~60 目)，在纯氧气氛下 400 ℃ 预处理 30 min；降温到50 ℃后用He吹扫15 min；然后通入体积分数为10% H₂+90%Ar混合气，待仪器基线平稳后，以10 ℃·min⁻¹速率升温至600 ℃，采用TCD 检测耗氢量。CO₂-TPD实验步骤如下：取100 mg 样品 (40~60 目)，在氦气氛下经500 ℃预处理30 min；冷却至50 ℃，再通入30 mL·min⁻¹的CO₂吸附至饱和，氦气吹扫1h 后开始TPD 实验，以10 ℃·min⁻¹ 速率升温至800 ℃，采用TCD 检测。

1.3 烟气模拟实验

本研究采用固定床实验装置探究催化剂汞氧化性能。该固定床实验装置包括四部分：模拟烟气配气系统、汞源发生系统、催化反应系统和汞浓度与形态测试系统。催化反应系统通过加热系统精准调控反应温度，温度误差≤2 ℃。模拟烟气配气系统包括高纯氮气（N₂）、氧气（O₂）、标准混合气（HCl、SO₂、NO和NH₃等）和80 μg·m⁻³ Hg⁰，标准混合气均采用N₂作为平衡气。以上标准气体均采用质量流量控制器控制气体添加，混合气体总流量为1L·min⁻¹。空速是催化剂催化氧化性能的重要实验参数，本实验催化剂空速约为100 000 h⁻¹。研究中各种模拟烟气组分见表1。反应前后烟气中Hg⁰和Hg²⁺的浓度通过烟气分析仪分析（Thermo Fisher 80i）。汞氧化率通过式(1)计算。

表 1 汞催化氧化实验模拟烟气组分

Table 1. The components of simulated flue gas in mercury oxidation experiments

序号	组分	温度	元素比例
1	基本烟气组分	100~450 ℃	6%O₂+N₂
2	SCR烟气组分	200、300和400 ℃	6%O₂+134 mg·m⁻³ NO+76 mg·m⁻³ NH₃+N₂
3	SCR+HCl烟气组分	200、300和400 ℃	6%O₂+134 mg·m⁻³ NO+76 mg·m⁻³ NH₃+16 mg·m⁻³ HCl+N₂
4	SCR+SO₂烟气组分	200、300和400 ℃	SCR组分+1 429 mg·m⁻³ SO₂
5	SCR+HCl+SO₂烟气组分	200、300和400 ℃	SCR组分+16 mg·m⁻³ HCl+1 429 mg·m⁻³ SO₂

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$\eta =\frac{{C}_{\mathrm{H}{\mathrm{g}}_{}^{2+}}}{{C}_{\mathrm{H}{\mathrm{g}}_{}^{\mathrm{t}}}}\times 100\%$

$(1)$

其中：η为汞氧化率，%；C_Hg²⁺和C_Hgt 分别代表反应管出口烟气Hg²⁺浓度和入口烟气总汞浓度，μg·m⁻³。所有数据为3组平行实验的平均值，实验数据相对误差不超过10%。

2. 结果与讨论

2.1 不同Ce基催化剂的汞氧化性能

在基本烟气组分条件下，本研究对比了Ce5Ti、Ce5W9Ti和Cu5Ce5W9Ti催化剂的汞氧化性能。如图1所示，Ce作为一种中温活性组分，Ce5Ti和Ce5W9Ti在中温区间（250~400 ℃）表现出最佳的汞氧化性能，Ce5Ti和Ce5W9Ti催化剂汞氧化率分别达到58.4%~69.1%和68.8%~81.3%。Ce5Ti和Ce5W9Ti在低温区间（100~200 ℃）的汞氧化率普遍较低，分别低于53.1%和62.5%，表现出较差的低温活性。CuO掺杂的Cu5Ce5W9Ti表现出最佳的汞氧化性能，在300 ℃下汞氧化率达到最高，为88.8%。在中温区间，Cu5Ce5W9Ti的汞氧化率稳定在86.3%~88.8%。反应温度进一步上升到450 ℃，3种催化剂的汞氧化率均降低，说明温度过高使CeO₂的催化氧化活性降低。与Ce5Ti和Ce5W9Ti相比，Cu5Ce5W9Ti在低温区间（100~200 ℃）表现出较高的汞氧化率，为76.3%~85.5%，表明CuO的掺杂可显著提升Ce基催化剂低温氧化活性。

图 1 Ce基催化剂对汞的氧化性能（基本烟气组分）

Figure 1. Mercury oxidation efficiency of various Ce-based catalysts (basic flue gas)

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2.2 SCR烟气组分对Ce基催化剂汞氧化性能影响

本研究对比了3种催化剂在基本烟气组分和SCR烟气组分条件下的汞氧化活性的差异性。如图2所示，在300 ℃下，相较于基本烟气组分，Ce5Ti催化剂在SCR烟气组分下汞氧化率明显降低，由62.7%下降到37.2%。在SCR烟气组分条件下，Ce5W9Ti催化剂汞并没有表现出明显的降低，汞氧化率由73.8%下降到62.4%，表明WO₃掺杂明显提高了Ce5W9Ti催化剂对SCR反应条件的适应性。有研究^[14-15]表明，SCR烟气组分可降低催化剂的汞氧化活性，这主要归咎于NH₃与Hg⁰对活性位点的竞争吸附作用，高浓度的NH₃分子明显降低了Hg⁰与活性位点接触的可能性。Cu5Ce5W9Ti催化剂SCR烟气组分条件下汞氧化表现与Ce5W9Ti相似，汞氧化率略微降低，由88.8%下降到81.3%，依然表现出较好的SCR烟气组分的适应性。

图 2 SCR烟气组分对Ce基催化剂汞氧化性能影响

Figure 2. Mercury oxidation efficiency of various Ce-based catalysts at SCR flue gases

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在200 ℃和400 ℃的条件下，SCR烟气组分对催化剂具有相似的的影响。在200 ℃下，SCR烟气组分对Ce5Ti和Ce5W9Ti催化剂汞氧化抑制作用较为明显，而在400 ℃下，SCR烟气组分的抑制作用相对减少。这可能是因为Ce5Ti和Ce5W9Ti催化剂缺失低温活性组分，低温条件下NH₃吸附量增加，汞氧化性能较低；而高温条件下NH₃吸附量降低，减少了对Hg⁰抑制吸附作用，提高催化剂汞氧化性能。

2.3 SO₂和HCl组分对Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂汞氧化性能影响

SO₂和HCl是燃煤烟气普遍存在的酸性气体，对催化剂汞氧化性能具有重要影响。通过以上实验筛选，本研究对比了Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂在SCR烟气组分、SCR+SO₂烟气组分、SCR+HCl烟气组分以及SCR+SO₂+HCl烟气组分中的汞氧化性能变化，分析SO₂和HCl对Ce5W9Ti和Cu5Ce5W9Ti催化剂影响。

如图3所示，在SCR烟气组分（300 ℃）下，1 429 mg·m⁻³ SO₂ 的添加明显降低了Ce5W9Ti催化剂的汞氧化性能，汞氧化率从62.4%降低到41.4%，表明SO₂严重抑制了Ce5W9Ti催化剂汞氧化活性。有研究表明：高浓度SO₂极容易吸附在CeO₂活性位点，形成稳定的硫酸铈，使Ce基活性位丧失储氧能力^[14]。SO₂同样降低了Cu5Ce5W9Ti催化剂的汞氧化性能，但汞氧化率下降幅度较小，由81.3%下降到78.8%。该结果表明CuO的掺杂明显提高了催化剂的抗硫性能，可能是CuO的掺杂增加了反应活性位点或是保护了Ce基活性位点，使得Cu5Ce5W9Ti在SO₂存在条件下依然具有较高的汞氧化性能。在200 ℃下，SO₂对Ce5W9Ti和Cu5Ce5W9Ti的汞氧化性能抑制作用进一步提高。常化振等^[16]研究表明，在低温条件下SO₂与NH₃形成大量的亚硫酸氢铵，覆盖了催化剂表面的活性位点，导致催化剂活性较低。在400 ℃条件下，SO₂的抑制作用减弱，可能因为高温抑制了SO₂吸附和亚硫酸氢铵的形成^[16]。

图 3 SO₂和HCl对Ce基催化剂汞氧化性能影响

Figure 3. Mercury oxidation efficiency of various Ce-based catalysts at the presence of SO₂ and HCl

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HCl的添加明显提高了Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂汞氧化性能，汞氧化率分别提高到96.2%和98.4%。该结果表明HCl的添加可能增加了新的活性位点，促进了汞氧化率。进一步添加1 429 mg·m⁻³ SO₂到模拟烟气，Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂出现下降，但Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂在SCR+HCl+SO₂烟气组分下汞氧化率（76.8%和89.7%）依然明显高于SCR组分下汞氧化率（62.4%和81.3%）。该结果表明相较于SO₂，HCl更具有竞争力，在催化剂表面依然形成新反应活性位，促进了Hg⁰的吸附和氧化。在200 ℃和400 ℃下，HCl显著提高了Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti的汞氧化率和抗硫性能。

2.4 理化表征

1) XRD分析。采用XRD技术分析了不同Ce基催化剂的晶相（图4）。3种催化剂XRD谱图主要以锐钛矿和红金石2种形态TiO₂特征峰为主（JCPDS 21-1272），符合载体P25组分80.0%锐钛矿和20.0%红金石组成特征。3种催化剂在2θ=28.35°位置出现一个微弱的CeO₂晶峰，表明Ce在载体表面高度分散，具备较高的催化氧化活性。Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂都没有出现明显的WO₃晶峰，说明元素W在催化剂表面同样高度分散。Cu5Ce5W9Ti催化剂在35.5^o和38.6^o位置出现了微弱的CuO（111）特征峰（JCPDS 48-1548），证明Cu活性组分绝大部分均匀分布在催化剂表面。基于以上结果，Ce、W和Cu元素在载体表面高度均匀分散^[13]。

图 4 Ce基催化剂XRD分析

Figure 4. XRD patterns of Ce-based catalysts

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2) TEM分析。采用TEM分析了不同Ce基催化剂表面的元素晶体形态，结果见图5。如图5(a)所示，催化剂载体P25主要以立方体形态存在。如图5(b)和图5(c)所示，Ce5Ti和Ce5W9Ti催化剂表面CeO₂以（111）晶型存在，晶格间距为0.31 nm，与XRD的分析结果一致。Ce5W9Ti催化剂表面没有发现WO₃晶体，但Ce与Ti掺杂形成钛铀矿CeTi₂O₆（110）^[17]，晶体间距为0.34 nm，说明W元素的高度分散有利于Ce与Ti原子的螯合掺杂，可形成稳定的氧空位。如图5(d)所示，Cu5Ce5W9Ti催化剂表面出现间距为0.28 nm的CuO（110）晶格条纹和间距为0.31 nm的CeO₂（111）晶格条纹，CuO与CeO₂界面形成掺杂晶体界面。在界面位置，CuO、CeO晶体中的原子被相互替代，形成晶体错位，晶体条纹边界发生扭曲转移，促进大量Cu⁺和Ce³⁺形成，使催化剂表面形成氧空位，从而提高催化剂的储氧和氧化还原能力^[18]。

图 5 Ce基催化剂TEM分析

Figure 5. The TEM images of Ce-based catalysts

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3) TPR和TPD分析。本研究采用H₂-TPR和CO₂-TPD技术分析了Ce5Ti、Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂氧化位点和活性位点酸碱性。如图6(a)所示，Ce5Ti催化剂H₂-TPR图谱出现一个270 ℃的主峰，代表CeO₂形成的氧空位或活性位点。Ce5W9Ti催化剂的H₂-TPR图谱中出现240 ℃和282 ℃ 2个主峰，结合TEM分析结果，除了CeO₂活性位点，Ce与Ti掺杂形成的钛铀矿CeTi₂O₆（110）建立新的活性位点^[17]。因此，Ce5Ti、Ce5W9Ti催化剂在中温区间（250~400 ℃）表现出良好的汞氧化性能。如图6(a)所示，Cu5Ce5W9Ti催化剂的H₂-TPR图谱中出现115、260和317 ℃ 3个主峰。260 ℃和317 ℃代表中温CeO₂活性位点和Ce-Ti活性位点，115 ℃代表低温CuO活性位点，表明CuO的掺杂可提高催化剂在低温区域活性位点的形成。因此，Cu5Ce5W9Ti催化剂在图1表现出较高的低温（100~200 ℃）汞氧化性能。

图 6 Ce基催化剂程序升温测试分析

Figure 6. Temperature programmed desorption of Ce-based catalysts

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如图6(b)所示，通过CO₂-TPD分析了3种催化剂表面活性位点的酸碱性。有研究^[19-20]表明，根据CO₂脱附温度可将活性位点酸碱性分为弱碱（100~250 ℃）、中强碱（250~600 ℃）和强碱（600~800 ℃）。在Ce5Ti的CO₂-TPD图谱中出现一个脱附主峰（140 ℃），表明CO₂主要为弱碱活性位点；Ce5W9Ti的脱附主峰温度进一步降低到132 ℃，表明酸性氧化物WO₃在催化剂表面的高度分散可进一步降低催化剂碱性强度。Cu5Ce5W9Ti的CO₂-TPD图谱包含3个特征峰，即132、547和649 ℃ ^[21-22]。在SCR+SO₂烟气条件下，强酸性气体SO₂优先与碱性活性位（Cu—O—Ce和CuO）反应，从而保护了CeO₂活性位依然保持高活性和氧化性，因此，Cu5Ce5W9Ti在SCR+SO₂烟气条件下依然表现出良好的汞氧化性能(图3)。

4) XPS分析。本研究采用XPS技术分析催化剂表面各种元素价态，探究催化剂汞氧化机制。如图7(a)所示，Ce元素能谱图包含8个分峰：u₀、u₁、u₂、u₃、v₀、v₁、v₂和v₃。其中u₁和v₁代表Ce³⁺；u₀、u₂、u₃、v₀、v₂和v₃代表Ce⁴⁺，Ce³⁺一般作为氧空位或是吸附氧位点^[23]。Ce5W9Ti催化剂Ce³⁺峰面积和Ce⁴⁺峰面积比例（Ce³⁺/Ce⁴⁺）为31.2%，Cu5Ce5W9Ti 的Ce³⁺/Ce⁴⁺面积比例上升到39.2%。该结果与TEM分析结果一致，说明CuO与CeO₂掺杂形成晶体错位，形成更多Ce³⁺和氧空位。

图 7 Ce基催化剂XPS分析

Figure 7. XPS analysis of Ce-based catalysts

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如图7(b)所示，Ce5W9Ti和Cu5Ce5W9Ti催化剂表面O元素2个特征峰：529.9~530.0 eV特征峰代表晶格氧，530.8~531.0 eV特征峰代表活性氧^[24-25]。活性氧一般是氧空位吸附的高活性吸附氧，为Hg⁰氧化的关键活性位点。Ce5W9Ti催化剂活性氧特征峰面积占比为38.7%，Cu5Ce5W9Ti的活性氧特征峰面积占比为45.8%，该结果与Ce³⁺/Ce⁴⁺面积比例上升一致。如图7(c)所示，Cu5Ce5W9Ti催化剂表面在932.5 eV和934.2 eV的2个主要特征峰分别代表Cu⁺和CuO^[26]。Cu5Ce5W9Ti催化剂表面Cu主要以Cu⁺形式存在，这与Cu、Ce原子掺杂形成氧空位界面保持一致。Cu5Ce5W9Ti催化剂反应前后Cu⁺/CuO比例由69.4%下降到57.2%，这可能是部分Cu⁺形成的活性氧与SO₂反应形成大量的CuSO₄，因此，Cu²⁺比例明显上升。如图7(d)所示，Cu5Ce5W9Ti 的Ce³⁺/Ce⁴⁺面积比例由反应前的39.2%下降到反应后的35.4%，说明部分Ce³⁺活性位在反应过程中转化为稳定的Ce⁴⁺，降低了催化剂的吸氧释氧能力。如图7(e)所示,Cu5Ce5W9Ti催化剂反应前后表面O元素2个特征峰发生明显变化。Cu5Ce5W9Ti催化剂活性氧特征峰面积占比有反应前的45.8%下降到反应后的35.3%，说明大量活性氧参与了Hg⁰氧化和NOx还原反应。

XPS表征没有发现反应前的Cu5Ce5W9Ti催化剂表面存在Cl、N和Hg原子。如图7(f)所示，SCR+SO₂+HCl条件反应后的Cu5Ce5W9Ti催化剂表面Cl、N和Hg元素的价态。Cu5Ce5W9Ti催化剂表面Cl存在Cl⁻离子（198.1 eV）和活性Cl*（200.2 eV）2个特征峰^{[17, 23]}。大面积活性Cl*特征峰的出现说明HCl在Cu5Ce5W9Ti催化剂表面吸附并转化为活性Cl*，促进Hg⁰转化为HgCl₂。NO在催化剂表面XPS能谱图出现硝酸根（407.2 eV）和NO₂（405.1 eV）2个特征峰。NO₂特征峰面积要远大于硝酸根特征峰面积，说明NO在催化剂上主要以更高活性的NO₂或是亚硝酸盐官能团形式存在。反应后的Cu5Ce5W9Ti催化剂表面存在Hg元素101.6 eV和104.6 eV两个特征峰，表明吸附在催化剂表明的汞主要以 Hg²⁺形式存在。

2.5 Ce基催化剂汞氧化机制分析

基于3种Ce基催化剂汞氧化实验和理化性质表征结果，本研究发现单一活性位点的Ce5Ti和Ce5W9Ti催化剂中温区间（250~400 ℃）表现出较高汞催化氧化活性(图1)，但在SCR烟气组分下Ce5Ti的汞氧化率明显下降(图2)，这归咎于NH₃与Hg⁰竞争Ce基活性位点。WO₃的掺杂提高了Ce5W9Ti在SCR烟气组分下的汞氧化率，为62.4%。CO₂-TPD分析结果说明WO₃的掺杂增加了Ce5W9Ti催化剂酸性(图6)，增加了强碱性气体NH₃的吸附位点，降低了NH₃对Hg⁰吸附氧化竞争。同时XRD和TEM分析结果表明高度分散的WO₃可促进Ce与Ti的耦合掺杂形成钛铀矿CeTi₂O₆（110），提高氧空位的比例。CuO的掺杂提高了Cu5Ce5W9Ti催化剂在低温区间（100~200 ℃）的汞氧化率（76.3%~85.5%），并且在SCR和SCR+SO₂烟气条件下表现出较高的汞氧化率（81.3%和78.8%）。H₂-TPR分析结果说明Cu掺杂增加Cu5Ce5W9Ti催化剂低温（115 ℃）活性位点，因此，提高催化剂的低温氧化活性；CO₂-TPD分析结果表明W、Cu掺杂使Cu5Ce5W9Ti催化剂具备弱碱、中强碱、强碱3种活性位，可有效地分离酸性气体SO₂、碱性气体NH₃和Hg⁰吸附氧化反应区域，从而提高催化剂的抗硫性(图6)。TEM分析说明CuO和CeO₂晶体掺杂的界面，发生原子替代和晶体错位，形成更多的Ce³⁺和Cu⁺作为氧空位，吸附更多的活性氧作为氧化位点，这一结论也在H₂-TPR和XPS分析中得到证实(图6(a)和图7)。HCl和NO可与催化剂表面的活性氧反应，形成新的活性位点Cl^*和NO₂，促进Hg⁰氧化。综上所述，单一的活性位点难以满足NO_x还原和Hg⁰协同控制；基于NH₃、SO₂和Hg⁰酸碱性的差异，构建强弱碱性多反应活性区域，分离NH₃、SO₂和Hg⁰吸附反应区域，降低NH₃、SO₂和Hg⁰的竞争吸附，提高催化剂Hg⁰氧化能力，是提高催化剂协同污控性能和抗硫性重要途径。

3. 结论

1)单一活性位点的Ce5Ti和Ce5W9Ti催化剂在中温区间（250~400 ℃）表现出较高的汞氧化率，分别为58.4%~69.1%和68.8%~81.3%，但在低温区间（100~200 ℃）下的汞氧化率较低（低于53.1%和62.5%）。CuO掺杂提高了Cu5Ce5W9Ti催化剂低温活性，提高低温区间（100~200 ℃）汞氧化率至76.3%~85.5%。

2) WO₃以不定晶型的形式高度分散于催化剂的表面，可促进Ce与Ti原子的替代和掺杂，形成钛铀矿CeTi₂O₆(110)，提高氧空位的暴露；同时酸性氧化物WO₃的掺杂可增加催化剂表面酸性活性位点，促进强碱性气体NH₃的吸附，进而降低NH₃和Hg⁰对Ce基氧化位点的竞争吸附，因此，Ce5W9Ti催化剂在SCR烟气组分下依然保持较高的汞氧化性能。

3) CuO、WO₃引入在Cu5Ce5W9Ti催化剂表面形成强弱碱性多反应活性区域，分离NH₃、SO₂和Hg⁰吸附反应区域，降低NH₃、SO₂和Hg⁰的竞争吸附，提高催化剂Hg⁰氧化能力和抗硫性能，为多污控措施协同控制汞排放提供关键技术理论。

图 1 定量PCR引物(MIBF/MIBR)凝胶电泳验证结果

Figure 1. Test result of qPCR primer MIBF/MIBR

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图 2 MIBF/MIBR质粒定量PCR标准曲线

Figure 2. Standard curve of plasmid based on primer MIBF/MIBR

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图 3 基于定量PCR方法的实际样品2-MIB功能基因丰度测试结果

Figure 3. Quantitative PCR-based detection result of 2-MIB functional genes in real environment samples

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图 4 基于 GC-MS分析法测定2-MIB物质浓度与qPCR方法测定2-MIB功能基因相关性检验

Figure 4. Correlation test of 2-MIB substance concentration based on GC-MS analysis and 2-MIB functional gene determination by qPCR method

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表 1 2-MIB功能基因引物

Table 1. Primers of 2-MIB function gene

序号	名称	引物序列(5′~3′)	FACHB-1375	FACHB-1277	阴性对照	PCR产物长度/bp	来源
1	MIB3313F	CTCTACTGCCCCATTACCGAGCGA	+	+	−	913	[19]
1	MIB4226R	GCCATTCAAACCCGCCGCCCATCCA	+	+	−	913	[19]
2	MIB3324F	CATTACCGAGCGATTCAACGAGC	+	+	−	726	[19]
2	MIB4050R	CCGCAATCTGTAGCACCATGTTGA	+	+	−	726	[19]
3	MIBS-RTF	CGCTCGCTTGTGAGTGAGATAG	−	−	−	未检测	[19]
3	MIBS-RTR	GGCAGTAGAGTGGTGAGGCAGTT	−	−	−	未检测	[19]
4	MIBF	GACCCAKMTCGGCTGYTGAT	+	+	−	389	本研究
4	MIBR	TAGAAGCTGTCGTGCTGKCG	+	+	−	389	本研究
注：“+”表示PCR结果为阳性，琼脂糖凝胶电泳检测结果有条带；“−”表示PCR结果为阴性，琼脂糖凝胶电泳检测结果无条带。

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表 2 MIBF/MIBR NCBI比对结果

Table 2. NCBI blast result of MIBF/MIBR

序号	NCBI登记号	基因名	藻种拉丁名	藻种中文名	MIBF/%	MIBR/%
1	HQ830028.1	2-methylisoborneol (2-MIB) synthesis complete sequence	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	100	100
2	HQ630883.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena limnetica	湖泊伪鱼腥藻	100	100
3	AB826230.1	pgmtc gene for monoterpene cyclase	Pseudanabaena galeata	洋伪鱼腥藻	100	100
4	HQ630887.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	100	100
5	LC486303.1	mic	Microcoleus pseudautumnalis	微鞘藻属	100	100
6	HQ630885.1	MIB synthase gene	Oscillatoria limosa	泥生颤藻	100	100
7	HQ830029.1	2-methylisoborneol (2-MIB) synthesis associated operon	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
8	KP013063.1	A2 MIB cyclase gene	Leptolyngbya sp.	瘦鞘丝藻属	100	100
9	LC157987.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
10	LC157990.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
11	LC157992.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
12	LC157991.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
13	LC157989.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
14	LC157988.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
15	LC157986.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
16	KJ658377.1	2-methylisoborneol synthase gene	Oscillatoria sp.	颤藻属	100	100
17	KJ658378.1	2-methylisoborneol synthase gene	Planktothrix sp.	浮丝藻属	100	100
18	MN167115.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena galeata	洋伪鱼腥藻	100	100
19	MK759878.1	2-methylisoborneol (mib) gene, partial cds	Oscillatoria prolifera	颤藻	0	0
20	KM013398.1	A2 MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Leptolyngbya sp.	瘦鞘丝藻属	0	0
21	KM013397.1	MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Planktothricoides sp.	浮丝藻属	0	0
22	KM013396.1	MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	0	0
23	MK124613.1	MIB synthase gene, partial cds	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	0	0

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图( 4) 表( 2)

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1. 材料及方法
1.1 催化剂的制备
1.2 催化剂的表征分析
1.3 烟气模拟实验
2. 结果与讨论
2.1 不同Ce基催化剂的汞氧化性能
2.2 SCR烟气组分对Ce基催化剂汞氧化性能影响
2.3 SO2和HCl组分对Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂汞氧化性能影响
2.4 理化表征
2.5 Ce基催化剂汞氧化机制分析
3. 结论

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湖库是我国许多城市的重要饮用水水源地^[1]。然而，我国35个城市水源水库中有80%的水体存在饮用水嗅味问题^[2]，其中由致嗅化合物2-甲基异莰醇(2-methylisoborneol，2-MIB)导致的水体土霉味问题居多^[3-7]。由于该物质嗅阈值极低^[5](4~16 ng·L⁻¹)，且很难通过常规水处理工艺去除^[8]，饮用水中残留的痕量2-MIB物质容易引发消费者对水质的担忧，威胁城市供水安全^[4]。水源地嗅味问题已经成为我国供水行业中重点关注的问题之一^[9]。

2-MIB主要由丝状蓝藻生长代谢产生，这类蓝藻包括颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮颤藻属(Planktothrix)以及伪鱼腥藻属(Pseudanabaena)等^[9]。丝状蓝藻导致的2-MIB嗅味问题可最早追溯到1983年，由于水源水库底泥附着生长的颤藻引发美国加利福尼亚州3个供水系统出现嗅味问题^[10]；1991年，MARTIN等^[11]在密西西比某池塘中采集到一株产2-MIB的颤藻；1998年，日本学者SUGIURA等^[12]在Kasumigaura湖中分离出4株丝状产嗅蓝藻，包括2株席藻、1株颤藻和1株鞘丝藻，发现这些藻种生物量与水体土霉味之间存在正相关关系。

近10年来，我国关于水源地嗅味问题的报道越来越多。北京密云水库每年9—10月局部区域出现浮颤藻生长导致水体嗅味问题^[7]；上海市新建水源地青草沙水库由于丝状蓝藻爆发导致季节性嗅味问题^[13]；天津于桥水库、苏州东太湖湖滨水库、上海金泽水库及银川某化工园区水源水库等均存在由于不同种属的丝状产嗅蓝藻生长或爆发导致的嗅味问题^[14]。

大部分水源地中2-MIB由丝状蓝藻产生，由于丝状蓝藻种类较多、形态相近，不同藻种具有不同的产2-MIB特征，甚至同一藻种在不同外部环境条件下也存在产嗅差异。传统方法主要依托显微镜镜检通过藻细胞形态进行藻种计数。然而，从细胞形态上无法区分产嗅丝状藻种与非产嗅丝状藻种，因此，无法特异性检测水体中的产嗅藻；此外显微镜镜检前处理耗时长，检测效率低，准确度与精确度较低^[7]。致嗅物质2-MIB可基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法^[15]分析，但因仪器昂贵、操作要求高、运行维护成本高，大部分水源管理机构不具备该条件，且该方法只能测定水样中已产生的2-MIB物质浓度，无法提前预警，也不能鉴别产生来源。因此，有必要构建一种能特异性检测水体2-MIB产生潜力的方法。

由于丝状藻代谢产生2-MIB受相关功能基因控制，可通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)方法构建特异性检测2-MIB合成功能基因的方法。关于2-MIB的合成途径最初在放线菌中被发现^[16]，主要由SCO7701基因与SCO7700基因调控；随后，GIGLIO等^[17]发现蓝藻中2-MIB的生物合成机制为GPP的甲基化和甲基GPP的环化反应，分别由GPPMT基因和2-MIBS基因调控。根据序列相似性分析，蓝藻和放线菌的2-MIB相关基因具有相对较高的相似度和同源性^[18]。

本研究通过设计针对蓝藻中2-MIB功能基因的特异性引物，构建实时定量PCR方法，并采用实际水体检验方法的可行性，实现水源中丝状蓝藻的致嗅功能基因定量检测，进而评估水体产嗅潜力与产嗅风险，为水源嗅味问题的监测与预警提供实时、快速、科学的方法。

1. 材料与方法

1.1. 实验材料

所用藻种均为产2-MIB蓝藻，分别为FACHB-1277(Pseudanabaena sp., 伪鱼腥藻)、FACHB-1375(Planktothrix sp., 浮颤藻)，购自中国科学院淡水藻种库。藻类培养使用BG11培养基，扩大培养后用于DNA提取及致嗅物质检测等目的。

1.2. 培养藻种及环境样品DNA提取方法

取500 mL藻培养液将藻细胞过滤富集至1.2 μm滤膜(RTTP04700，1.2 µm 聚碳酸酯膜，Isopore^TM, 美国)上；随后将滤膜剪切破碎后使用FastDNA ^®SPIN Kit for Soil 试剂盒(6560-200，MPBio，美国)提取样品DNA。

1.3. 引物设计与特异性验证

采用已有研究^[19]中的2-MIB引物(MIB3313F/MIB4226R和MIB3324F/MIB4050R)可以有效扩增FACHB-1277与FACHB-1375样品中2-MIB功能基因，验证了实验藻种含MIB功能基因。但由于两对引物所扩增得到的2-MIB基因片段较长，分别为913 bp与726 bp，不能用于定量PCR扩增。进一步检验了已有研究中报道的定量PCR引物MIBS-RTF/ MIBS-RTR^[19]，发现不能扩增本研究中实验藻种的2-MIB功能基因。因此，本研究基于NCBI已公开的2-MIB功能基因数据库，设计2-MIB功能基因的特异性引物(表1)，基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将所设计的引物与NCBI中已有2-MIB基因数据库比对验证引物可行性与特异性；并采用普通PCR法测试相关引物，使用1.2 %琼脂糖凝胶电泳方法检验了引物的特异性。

1.4. 普通PCR与qPCR扩增条件

普通PCR反应体系为：2×PCR Taq MasterMix with dye (RR005A，TAKARA Bio公司，日本)12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH₂O 8.9 μL。普通PCR扩增程序为：高保真酶活化阶段95 ℃，持续5 min；高温变性阶段95 ℃，持续30 s；低温退火阶段64 ℃，持续 45 s；延伸阶段72 ℃，持续30 s；高温变性、低温退火、延伸阶段共45个循环。

qPCR反应体系为：TB Green^TM Premix Ex Taq^TM (RR820，TAKARA Bio公司，日本)12.5 μL，上下游引物MIBF/MIBR各0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH₂O 9.5 μL。qPCR扩增程序为：高温变性95 ℃，持续10 s；低温退火64 ℃，持续20 s；延伸阶段72 ℃，持续30 s；反应共40个循环；另外，溶解曲线设置条件为由65 ℃升温至97 ℃，速率为2.2 ℃·s⁻¹。

1.5. 标准曲线的建立

基于引物MIBF与MIBR扩增FACHB-1277 DNA模板，经测序后根据序列信息合成2-MIB功能基因质粒，浓度为359 ng·μL⁻¹(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。根据式(1)计算质粒拷贝数。

式中：N为基因拷贝数浓度，copies·μL⁻¹；N_A为阿伏伽德罗常数；c为核酸质量浓度，ng·μL⁻¹；L为碱基长度，bp；M_W为单位碱基平均摩尔质量。

由式(1)计算得到质粒拷贝数为8.44×10¹¹copies·μL⁻¹。按10倍进行梯度稀释，得到7个浓度水平，以此为DNA模板，按照1.4节提及的优化体系与运行参数进行qPCR扩增。同一浓度梯度质粒DNA为模板的反应孔作3组平行实验，将得到的C_q值与2-MIB基因量的对数构建线性模型，绘制标准曲线。

1.6. 实际样品测试

配制了9个不同浓度产嗅藻的培养样品，包括FACHB-1277伪鱼腥藻-1 (S01)、FACHB-1277伪鱼腥藻-2 (S02)、FACHB-1277伪鱼腥藻-3 (S03)、FACHB-1375浮颤藻-1 (S04)、FACHB-1375浮颤藻-2 (S05)、FACHB-1375浮颤藻-3 (S06)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 01 (S10)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 02 (S11)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 03 (S12)。采集了12个南水北调工程的环境样品，包括S07~S09、S13~S21。对这21组样品分别进行了定量PCR方法检测与气相色谱-质谱联用的2-MIB物质浓度分析^{[15, 20-22]}，每个样品重复分析3次。

3. 结论

1)建立了检测水体中2-MIB功能基因的定量PCR方法，该方法能克服传统方法无法区分产嗅藻与非产嗅藻的缺点，且满足检测要求(R²=0.999 5，P<0.01)。

2)通过采集我国不同地区的实际水源样品，对比验证了定量PCR方法与仪器分析方法结果的一致性(R²=0.63，P<0.01)，说明本研究提出基于定量PCR评估水体嗅味风险的方法具有可行性。

3)基于qPCR的产嗅基因丰度检测代替了繁琐、重现性低的显微镜看藻、数藻过程。快速、准确有效地检测水体中致嗅功能基因的丰度，能起到预警作用，为水源地的水质管理提供十分重要的工具与技术支持。

参考文献 (23)

基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

作者简介: 徐晓庆(1994—)，女，硕士研究生。研究方向：饮用水源地产嗅风险评估与调控。E-mail：lovelyyokyo@163.com

通讯作者: 崔长征(1978—)，男，博士，副教授。研究方向：环境微生物利用等。E-mail：cuichangzheng@ecust.edu.cn;

Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application

Corresponding author: CUI Changzheng, cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

1. 材料及方法

1.1 催化剂的制备

1.2 催化剂的表征分析

1.3 烟气模拟实验

2. 结果与讨论

2.1 不同Ce基催化剂的汞氧化性能

2.2 SCR烟气组分对Ce基催化剂汞氧化性能影响

2.3 SO2和HCl组分对Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂汞氧化性能影响

2.4 理化表征

2.5 Ce基催化剂汞氧化机制分析

3. 结论

计量

出版历程

基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

通讯作者: 崔长征(1978—)，男，博士，副教授。研究方向：环境微生物利用等。E-mail：cuichangzheng@ecust.edu.cn;

English Abstract

Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application

Corresponding author: CUI Changzheng, cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

全文HTML

1.1. 实验材料

1.2. 培养藻种及环境样品DNA提取方法

1.3. 引物设计与特异性验证

1.4. 普通PCR与qPCR扩增条件

1.5. 标准曲线的建立

1.6. 实际样品测试

2.1. 引物设计与特异性验证结果分析

2.2. 定量PCR标准曲线的构建

2.3. 实际样品2-MIB基因丰度测试结果

2.4. 2-MIB监测方法的对比与验证

2.5. 2-MIB的定量PCR监测方法的应用前景

目录

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1.1. 实验材料

1.2. 培养藻种及环境样品DNA提取方法

1.3. 引物设计与特异性验证

1.4. 普通PCR与qPCR扩增条件

1.5. 标准曲线的建立

1.6. 实际样品测试

2.1. 引物设计与特异性验证结果分析

2.2. 定量PCR标准曲线的构建

2.3. 实际样品2-MIB基因丰度测试结果

2.4. 2-MIB监测方法的对比与验证

2.5. 2-MIB的定量PCR监测方法的应用前景

2.3 SO₂和HCl组分对Ce5W9Ti和 Cu5Ce5W9Ti催化剂汞氧化性能影响