基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

徐晓庆; 苏命; 朱宜平; 崔长征; MUHAMMAD Suruzzaman; 徐亚楠; 于建伟; 杨敏

doi:10.12030/j.cjee.201912184

基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

1.
华东理工大学资源与环境工程学院，国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海 200237
2.
中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085
3.
上海城投原水有限公司，上海 200125

作者简介: 徐晓庆(1994—)，女，硕士研究生。研究方向：饮用水源地产嗅风险评估与调控。E-mail：lovelyyokyo@163.com

通讯作者: 崔长征(1978—)，男，博士，副教授。研究方向：环境微生物利用等。E-mail：cuichangzheng@ecust.edu.cn;

基金项目:
国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07108-002-02)；国家自然科学基金资助项目(51878649)
中图分类号: X832

Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application

1.
State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Risk Assessment and Control on Chemical Process, School of Resources and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
2.
State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
3.
Shanghai Chengtou Raw Water Co. Ltd., Shanghai 200125, China

Corresponding author: CUI Changzheng, cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

摘要: 我国地表水源中由丝状蓝藻代谢产生2-甲基异莰醇(2-MIB)导致的嗅味问题十分普遍。由于传统显微镜检测方法无法鉴别产嗅藻种，不能满足水源水质管理要求，故有必要构建能特异性表征水体产嗅潜力的检测方法。由于丝状藻代谢产生2-MIB主要受其合成功能基因调控，设计了2-MIB功能基因引物，经引物特异性检验及PCR条件优化后，构建了基于2-MIB功能基因的定量PCR方法，并采用实际环境样品进行测试与验证。结果表明：引物特异性良好，定量PCR方法能有效检测2-MIB功能基因，并绘制了标准曲线，得出检测限为8.44×10² copies·L⁻¹；实际样品测试结果显示其2-MIB功能基因浓度在2.09×10⁷~1.94×10¹⁰ copies·L⁻¹范围内，与基于仪器分析方法测定的2-MIB浓度符合线性关系(R²=0.63，P<0.01)，表明定量方法可行。该方法具有灵敏性高、特异性好的特点，能特异性检测产嗅基因，可应用于水源地中产嗅潜力评估与预警。
- 定量PCR /
- 2-甲基异莰醇 /
- 产嗅功能基因 /
- 丝状蓝藻 /
- 饮用水
Abstract: Two-methylisoborneol (2-MIB) is a typical secondary metabolite released from cyanobacteria which causes off-flavor odor problem in surface water across China. Microscopy is the traditional method to identify such cyanobacteria. However, merely it is troublesome to distinguish between 2-MIB producers and non-producers by morphological structure and cannot meet the requirement of the source water quality management. It is necessary to build the test method which can specifically characterize the odor-producing capacity of waterbody. Due to the functional gene regulation for 2-MIB yield from cyanobacteria, the primers of 2-MIB function gene were designed and its specificity test was performed, then the PCR conditions were optimized. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) can be an alternative method to evaluate 2-MIB syntheses which is controlled by 2-MIB functional gene. Here, 2-MIB identification primers (MIBF/MIBR) have been designed and tested with field samples. A good standard curve was established, R²=0.999 5, P<0.01, and the detection limit was 8.44×10² copies·L⁻¹. The concentrations of 2-MIB gene of field samples were between 2.09×10⁷ copies·L⁻¹ to 1.94×10¹⁰ copies·L⁻¹, which were significantly conformity with 2-MIB concentrations measured by GC-MS (R²=0.63, P<0.01). The high sensitivity and specificity of this qPCR-based method suggests that it can effectively evaluate the risk of 2-MIB occurrence and able to monitor source water quality management.
- fluorescence quantitative PCR /
- 2-methylisoborneol /
- odor-producing functional gene /
- filamentous cyanobacteria /
- drinking water
市政污泥是城市污水处理过程中不可避免的副产物，其含水率高、有机质含量高、成分复杂，并且含有大量的寄生虫卵、病原微生物和一定量的重金属^[1]。近年来，市政污泥的产量也在不断增加，预计2025年我国污泥年产量将突破9×10⁷ t，污泥处理处置已成为一项亟待解决的难题^[2]。污泥的主要处置方式包括卫生填埋、农业利用、干化焚烧、建筑材料利用等，我国较大部分污泥采用填埋方式，约占我国污泥总处置量的65%^[3]。

由于我国早期污水处理厂存在着“重水轻泥”的现象，导致已填埋污泥的含水率过高，力学性质较差。而填埋场的库容有限，随着污泥产量的逐年增加，目前国内许多城市的填埋场，例如上海老港、成都长安、深圳下坪、杭州天子岭的填埋场的库容已经严重不足^[4-5]，为此，许多填埋场要求将填埋污泥的含水率从80%降低至60%以下，这样可以增加至少50%的填埋库容^[6]。但是，由于污泥有机质含量高、结合水含量高、亲水性强，单一的机械处理很难将污泥含水率降低至60%以下，需结合一定的预处理方法将污泥的胞外聚合物（EPS）破解，释放出自由水后再进行脱水减量处理^[7]。当前填埋污泥的深度脱水通常采用“化学调理+板框压滤”的方法^[8]，该方法需将污泥从填埋库中挖出，运输到指定场地后再进行处理，存在着成本高、易对环境造成二次污染的问题，因此，需寻找一种高效、环保的污泥原位处理方法。

真空预压法具有施工工艺简单、成本低等优点，是软土地基原位处理的一种有效方法^[9-11]。近年来，将化学预调理与真空预压相结合的工艺已逐渐被应用于填埋污泥原位处理^[3,8,12-16]，该工艺在一定程度上能够实现污泥的原位减量，但是仍存在易产生臭气污染、难以保证药剂调理均匀等问题。为了寻找更加环保高效的填埋污泥原位处理方法，有研究者提出了冻融联合真空预压填埋污泥原位处理技术^[17-18]。冻融的原理是污泥被冷冻时，冷冻过程中不断生长的冰晶会破坏污泥细胞膜的完整性，使细胞脱水、收缩或溶解，使胞外聚合物释放到上清液中^[19]；同时，冻融后污泥中小颗粒团聚成大颗粒，能显著提高污泥的脱水性能，而且冻融循环可显著提高污泥的渗透系数^[20-21]。

有研究表明，采用冻融联合真空预压法处理填埋污泥时，在出水量、出水速率、沉降量、减量比、含水率均优于药剂预调理方法^[18]，但其在实验过程中并没有使用实际真空预压过程中的塑料排水板；塑料排水板作为真空预压的负压传递通道和排水通道，其性能对真空固结效率和效果有着显著影响^[22]。根据芯板与滤膜的复合方式不同，目前工程界常采用分离式和整体式2种塑料排水板，在普通土体真空预压中，已有这2种排水板类型的对比研究^{[10, 23-24]}。但是，污泥作为一种胶体状生物固体，其工程性质显著不同于软土和吹填土，但目前鲜有考察不同排水板类型对填埋污泥真空固结效果的研究。

本研究开展了不同排水板类型填埋污泥冻融-真空对比研究。首先，对填埋污泥进行冻融预处理；随后进行室内真空预压模型实验，分别设置分离式排水板(SPVD)与整体式排水板(IPVD)对照组；最后，通过对比出水量、减量比、含水率等数据，探究该法处理填埋污泥的宏观效果，并且通过压汞、电镜扫描等微观实验，探究冻融后污泥在真空预压过程中微观结构变化特性。

1.   实验方案

1.1   实验污泥

供试污泥取自上海市某污泥填埋库区，污泥填埋龄期约为12 a，占用了大量土地和地下空间，亟需对填埋库中的污泥进行原位脱水减量处理。填埋污泥的基本物理性质如表1所示。可以看出，填埋污泥含水率高，有机质含量比新鲜污泥(60%左右)有所降低。这是因为，填埋污泥受填埋龄期及厌氧消化影响，发生了一定程度的降解。填埋污泥的液塑限较大，按照细粒土的分类应为高液限有机质粉土。

表 1 污泥基本物理指标

Table 1. Basic physical indexes of sludge

比重含水率/% 密度/(g·cm⁻³) 有机质/% 液限/% 塑限/%

1.8 86 1.13 40 184 111

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采用Mastersize2000激光粒度仪对原状填埋污泥及冻融后污泥进行了粒度分布测试，粒径分布曲线如图1所示。原状污泥d₉₀为169.5 μm、d₅₀为47.28 μm，而冻融后污泥d₉₀为241.6 μm、d₅₀为65.68 μm，经冻融后，污泥颗粒粒径显著增大。这主要是因为：在冻结过程中，污泥中的小颗粒被不断生长的冰晶推挤压密，污泥小颗粒团聚为大颗粒，显著提高了其脱水沉降能力。

图 1 原状污泥与冻融后污泥颗粒粒径分布曲线

Figure 1. Particle size distribution curve of original sludge and sludge after freeze-thaw

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1.2   真空预压模型实验

真空预压实验装置由真空泵、抽滤瓶、排水板和模型箱组成，具体如图2所示。模型箱由有机玻璃桶及密封盖组成，玻璃桶高500 mm、外径320 mm、内径300 mm，密封盖为20 mm厚的有机玻璃盖板。分别采用如图3所示的分离式排水板和整体式排水板，排水板通过土工布与排水管绑扎。分离式排水板属于分体式十字型塑料排水板，排水板滤膜包裹在塑料芯板的外侧，与芯板不黏接，滤膜被制作成略大于芯板尺寸的土工织布常套包裹于芯板四周，滤膜等效孔径为75 μm；整体式排水板芯板与滤膜通过热合紧贴在一起，两者间不可作相对移动，滤膜等效孔径为120 μm。

图 2 径向真空预压模型箱示意图

Figure 2. Schematic diagram of radial vacuum preloading model box

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图 3 不同类型排水板实物图

Figure 3. Physical drawing of different types of plastic drainage boards

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采用冰柜对污泥进行冻融处理，冻结温度设置为−15 ℃，待达到冻结温度后将污泥取出于室温(22 ℃)融化。每个模型箱污泥用量为约16 kg。整个实验期间真空度保持在85 kPa左右，实验过程中对累计出水量、累计沉降量以及真空度进行监测记录，实验完成后对模型箱内污泥取样测定含水率及取样进行压汞、电镜扫描微观测试。

2.   实验结果及分析

2.1   累积出水量

由累计出水量变化曲线(图4)可以看出，分离式排水板和整体式排水板两者最终出水量差别不大。整体式排水板的最终出水量为8 830 mL，而分离式排水板的最终出水量为8640 mL，二者仅相差190 mL。在实验初期，分离式排水板与整体式排水板的出水速率都很高，在前4 h的出水量可达总出水量的70%以上。这可能是因为污泥经冻融后，污泥细胞内外不断生长的冰晶使得污泥细胞破裂，导致污泥细胞膜的完整性被破坏，EPS被破解，从而释放细胞内外的物质，导致污泥絮体结构被破坏，释放出大量的结合水和间隙水，进而大幅提高了污泥的脱水性能^[19]。冻融后污泥中含有大量的自由水，这导致前期出水速率及出水量都很高。

图 4 不同排水板类型累积出水量变化曲线

Figure 4. Change curve of cumulative water discharge of different PVD types

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在前4 h，分离式排水板的累计出水量达7 050 mL，占总出水量的81.5%，而后出水速率突然变缓，后139 h的出水量仅为1 590 mL；而整体式排水板在前4 h累计出水量为6 410 mL，后139 h的出水量为2 420 mL。造成后期出水量差异的可能原因为，分离式排水板的等效滤膜孔径为75 μm，而整体式排水板的滤膜孔径为120 μm，在真空排水固结前期，渗流通道尚未形成，污泥颗粒在真空负压及孔隙水压力的作用下不断向排水板附近运移，由于分离式排水板等效滤膜孔径过小，部分细小颗粒未能穿过滤膜，从而影响排水板附近的渗流通道的通畅性，造成一定的淤堵。这也与已有研究^{[10, 25]}的结果一致。但由于冻融后污泥颗粒粒径增大，小颗粒含量少，只造成部分淤堵，大部分排水通道仍保持通畅，所以二者最终出水量差异不大。

2.2   累计沉降量与减量比

由累计沉降量变化曲线(图5)可以看出，冻融污泥原始高度为20.5 cm，分离式排水板的最终高度为7.8 cm，整体式排水板的最终高度为8.55 cm，二者均下降50%以上。污泥在冻融时，污泥颗粒被不断生长的冰晶推挤压密，污泥小颗粒得以团聚为大颗粒，并显著提高了大中孔隙的分布，在真空预压固结时显著提高了其渗透固结性，从而提高了污泥的固结度。与分离式排水板相比，整体式排水板的高度变化却相对较小。这可能是因为：本次实验高度测量仅取实验模型箱两侧高度变化平均值记录，而取样后发现，整体式排水板处理后污泥在侧壁附近发生了1 cm左右的径向收缩，若考虑径向收缩的变化来计算实验后污泥体积，则分离式排水板污泥的最终体积为5 510 cm³，而整体式排水板最终体积为5 262 cm³，相比分离式排水板体积变化更大，这也与累计出水量变化规律相互印证。而整体式排水板最终出现了径向收缩现象，径向收缩是因为在真空排水固结过程中，在排水板远端的土颗粒在水力梯度的作用下不断向排水板中心处运移^[26]。这也说明采用整体式排水板后冻融污泥整体的排水固结效果较好，整体渗流通道顺畅，真空负压影响范围可覆盖到远端土体，污泥整体固结度较好。

图 5 不同排水板类型累积沉降量变化曲线

Figure 5. Variation curve of cumulative settlement of different PVD types

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经计算，两种不同类型排水板的最终减量比均在60%以上，整体式排水板的减量比为63.6%，分离式排水板的减量比为61.9%。这表明整体式排水板减量比略优于分离式排水板，冻融联合真空预压法可有效实现填埋污泥的原位减量。

2.3   含水率

实验结束后，从排水板中心处开始，沿径向在0、15、30 cm处取污泥上、中、下3个位置，每个位置取3个样对照，测定不同位置处的含水率，结果如图6所示。

图 6 不同排水板类型含水率变化

Figure 6. Change of water content of different PVD types

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1) 原始污泥含水率为86%，经冻融联合真空预压处理后，其含水率大幅度下降，含水率最低可降至59.5%。

2) 沿半径方向污泥整体含水率分布呈现出逐渐增加的变化规律。径向上的差异主要是由于：离开排水板中心的距离和水力梯度的差异，排水板附近水力梯度大，水更容易渗流排出，而距离排水板较远处水力梯度小，水不易排出，所以靠近排水板中心处含水率更低。

3) 沿深度方向呈现出上部含水率低、底部含水率高的分布规律。这是因为：真空负压强度沿着排水板衰减，排水板周围土体水力梯度逐渐减小，对排水板的影响范围逐渐减小，影响范围沿着排水板呈现出倒锥形逐渐减小的趋势^[24]，这导致上部由于真空负压强度高，水力梯度大，水容易排出，而底部由于真空强度衰减，水力梯度减小，故形成底部含水率高、上部含水率低的分布规律。

4) 整体式排水板上部含水率在60%左右分布，中部在65%左右分布，底部在70%左右分布；而分离式排水板的上、中、下部均在65%~70%左右分布。可见，整体式排水板的整体处理效果更好，且靠近上、中部含水率明显优于分离式排水板。这可能是因为：一方面，分离式排水板滤膜孔径较小，易造成小颗粒淤堵，从而影响排水固结效果；另一方面，由于分离式排水板芯板是内包于滤膜的，在土体压力下不可避免地出现滤膜“陷入”排水通道的情况，从而减少排水面积，而整体式排水板滤膜是胶结于芯板竖齿上的，滤膜始终是“紧绷”状态，在土体压力下变形较小^[27]，从而造成含水率分布的差异。

2.4   压汞实验

实验结束后，分别在整体式排水板、分离式排水板模型箱中心位置处取样进行压汞(MIP)实验，分析不同冻结条件下冻融污泥径向真空排水的固结孔径的大小分布规律，结果如图7、图8所示。

图 7 不同排水板类型孔径分布变化曲线

Figure 7. Pore size distribution curves of different PVD types

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图 8 不同排水板类型孔径大小变化

Figure 8. Percentage change of pores with different sizes under different PVD types

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整体式排水板与分离式排水板孔径分布有明显差异：分离式排水板主要以小孔分布为主，即以团粒内孔隙分布为主；而整体式排水板主要以微孔和介孔分布为主，即以颗粒间孔隙为主。其原因是，在真空预压过程中，真空度不断向污泥深度处传递，并以排水板为中心的径向上形成真空负压梯度，在该真空负压梯度的作用下形成真空渗流场^[28]。排板周围土体首先开始渗流出水，孔隙水在负压的作用下不断向排水板方向渗流，而此时污泥中的细小颗粒也在渗流力的作用下不断向排水板中心运移，使得排水板附近土体渗透系数不断降低，使排水板中心处的土体首先发生径向固结，土体发生压缩。

污泥经冻融后，污泥大中孔隙数量分布大幅度提高，小、微孔隙数量减少；而在真空排水固结时，较大孔隙先被压缩成较小孔隙，较小孔隙后被压缩^[29]。整体式排水板由于不易淤堵，在真空排水固结时渗流通道顺畅，固结程度高，大、中孔隙先不断被压缩为小孔隙，而后小孔隙被压缩为更小的介孔；而分离式排水板由于发生了部分淤堵，从而导致排水板中心处污泥固结程度对比整体式排水板低，主要以大、中孔隙压缩为小孔为主。这也与含水率分布规律互相印证，即整体式排水板由于固结程度高，在贴近排水板处污泥含水率低于分离式排水板。

2.5   电镜扫描

实验完成后，对不同排水板径向真空排水固结后靠近排水管中心处的污泥取微观样进行电镜扫描实验(SEM)，观察其微观结构特性，如图9所示。可以看出，整体式排水板与分离式排水板真空排水固结后污泥整体结构致密均匀，呈现出有规律的网状结构。但整体式排水板对比分离式排水板结构更加致密，固结程度高，以颗粒间孔隙分布为主；而分离式排水板固结程度低，孔径相对更大，以团粒内孔隙为主。这也与MIP实验结果相印证。

图 9 不同排水板类型电镜扫描图

Figure 9. SEM diagram of different PVD types

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3.   结论

1）分离式排水板和整体式排水板两者的最终出水量差别不大。两种不同类型排水板的最终减量比均在60%以上，整体式排水板的减量比为63.6%，分离式排水板的减量比为61.9%，整体式排水板减量比略优于分离式排水板。

2）原始污泥含水率为86%，经冻融联合真空预压处理后，其含水率大幅度下降，含水率最低可降至59.5%，符合我国填埋污泥的规范要求；其中，整体式排水板的整体处理效果更好。沿半径方向，污泥整体含水率分布呈现出逐渐增加的变化规律；沿深度方向，呈现出上部含水率低，底部含水率高的分布规律。

3）整体式排水板与分离式排水板孔径分布具有明显差异。分离式排水板主要以小孔分布为主，即以团粒内孔隙分布为主；而整体式排水板主要以微孔和介孔分布为主，即以颗粒间孔隙为主。整体式排水板对比分离式排水板结构更加致密，固结程度高，以颗粒间孔隙分布为主；而分离式排水板固结程度低，孔径相对更大，以团粒内孔隙为主。

图 1 定量PCR引物(MIBF/MIBR)凝胶电泳验证结果

Figure 1. Test result of qPCR primer MIBF/MIBR

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图 2 MIBF/MIBR质粒定量PCR标准曲线

Figure 2. Standard curve of plasmid based on primer MIBF/MIBR

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图 3 基于定量PCR方法的实际样品2-MIB功能基因丰度测试结果

Figure 3. Quantitative PCR-based detection result of 2-MIB functional genes in real environment samples

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图 4 基于 GC-MS分析法测定2-MIB物质浓度与qPCR方法测定2-MIB功能基因相关性检验

Figure 4. Correlation test of 2-MIB substance concentration based on GC-MS analysis and 2-MIB functional gene determination by qPCR method

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表 1 2-MIB功能基因引物

Table 1. Primers of 2-MIB function gene

序号	名称	引物序列(5′~3′)	FACHB-1375	FACHB-1277	阴性对照	PCR产物长度/bp	来源
1	MIB3313F	CTCTACTGCCCCATTACCGAGCGA	+	+	−	913	[19]
1	MIB4226R	GCCATTCAAACCCGCCGCCCATCCA	+	+	−	913	[19]
2	MIB3324F	CATTACCGAGCGATTCAACGAGC	+	+	−	726	[19]
2	MIB4050R	CCGCAATCTGTAGCACCATGTTGA	+	+	−	726	[19]
3	MIBS-RTF	CGCTCGCTTGTGAGTGAGATAG	−	−	−	未检测	[19]
3	MIBS-RTR	GGCAGTAGAGTGGTGAGGCAGTT	−	−	−	未检测	[19]
4	MIBF	GACCCAKMTCGGCTGYTGAT	+	+	−	389	本研究
4	MIBR	TAGAAGCTGTCGTGCTGKCG	+	+	−	389	本研究
注：“+”表示PCR结果为阳性，琼脂糖凝胶电泳检测结果有条带；“−”表示PCR结果为阴性，琼脂糖凝胶电泳检测结果无条带。

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表 2 MIBF/MIBR NCBI比对结果

Table 2. NCBI blast result of MIBF/MIBR

序号	NCBI登记号	基因名	藻种拉丁名	藻种中文名	MIBF/%	MIBR/%
1	HQ830028.1	2-methylisoborneol (2-MIB) synthesis complete sequence	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	100	100
2	HQ630883.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena limnetica	湖泊伪鱼腥藻	100	100
3	AB826230.1	pgmtc gene for monoterpene cyclase	Pseudanabaena galeata	洋伪鱼腥藻	100	100
4	HQ630887.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	100	100
5	LC486303.1	mic	Microcoleus pseudautumnalis	微鞘藻属	100	100
6	HQ630885.1	MIB synthase gene	Oscillatoria limosa	泥生颤藻	100	100
7	HQ830029.1	2-methylisoborneol (2-MIB) synthesis associated operon	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
8	KP013063.1	A2 MIB cyclase gene	Leptolyngbya sp.	瘦鞘丝藻属	100	100
9	LC157987.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
10	LC157990.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
11	LC157992.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
12	LC157991.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
13	LC157989.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
14	LC157988.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
15	LC157986.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
16	KJ658377.1	2-methylisoborneol synthase gene	Oscillatoria sp.	颤藻属	100	100
17	KJ658378.1	2-methylisoborneol synthase gene	Planktothrix sp.	浮丝藻属	100	100
18	MN167115.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena galeata	洋伪鱼腥藻	100	100
19	MK759878.1	2-methylisoborneol (mib) gene, partial cds	Oscillatoria prolifera	颤藻	0	0
20	KM013398.1	A2 MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Leptolyngbya sp.	瘦鞘丝藻属	0	0
21	KM013397.1	MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Planktothricoides sp.	浮丝藻属	0	0
22	KM013396.1	MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	0	0
23	MK124613.1	MIB synthase gene, partial cds	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	0	0

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[1]	SU M, JIA D M, YU J W, et al. Reducing production of taste and odor by deep-living cyanobacteria in drinking water reservoirs by regulation of water level[J]. Science of the Total Environment, 2017, 574: 1477-1483. doi: 10.1016/j.scitotenv.2016.08.134
[2]	SUN D L, YU J W, YANG M, et al. Occurrence of odor problems in drinking water of major cities across China[J]. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2014, 8(3): 411-416.
[3]	PETRO K, MANOLIS L, CHRISTINA K, et al. Treatment of unpleasant odors in municipal wastewater treatment plants[J]. Water Science and Technology, 2010, 61(10): 2635-2644. doi: 10.2166/wst.2010.211
[4]	WANG C M, AN W, GUO Q Y, et al. Assessing the hidden social risk caused by odor in drinking water through population behavioral responses using economic burden[J]. Water Research, 2020, 172: 115507. doi: 10.1016/j.watres.2020.115507
[5]	WAGNER K. A review of “algae: source to treatment (M57)”[J]. Lake & Reservoir Management, 2010, 26(4): 345-346.
[6]	SAADOUN I M, SCHRADER K K, BLEVINS W T. Environmental and nutritional factors affecting geosmin synthesis by Anabaena sp[J]. Water Research, 2001, 35(5): 1209-1218. doi: 10.1016/S0043-1354(00)00381-X
[7]	SU M, YU J W, ZHANG J Z, et al. MIB-producing cyanobacteria (Planktothrix sp.) in a drinking water reservoir: Distribution and odor producing potential[J]. Water Research, 2015, 68: 444-453.
[8]	NERENBERG R, RITTMANN B E, SOUCIE W J. Ozone biofiltration for removing MIB and geosmin[J]. Journal of American Water Works Association, 2000, 92(12): 85-95. doi: 10.1002/j.1551-8833.2000.tb09073.x
[9]	WATSON S B. Cyanobacterial and eukaryotic algal odour compounds: Signals or by-products? A review of their biological activity[J]. Phycologia, 2003, 42(4): 332-350. doi: 10.2216/i0031-8884-42-4-332.1
[10]	IZAGUIRRE G, HWANG C J, KRASNER S W, et al. Production of 2-methyliso borneol by two benthic cyanophyta[J]. Water Science & Technology, 1983, 15(6/7): 211-220.
[11]	MARTIN J F, IZAGUIRRE G, WATERSTRAT P. A planktonic Oscillatoria species from Mississippi catfish ponds that produces the off-flavor compound 2-methylisoborneol[J]. Water Research, 1991, 25(12): 1447-1451. doi: 10.1016/0043-1354(91)90173-N
[12]	SUGIURA N, IWAMI N, INAMORI Y, et al. Significance of attached cyanobacteria relevant to the occurrence of musty odor in Lake Kasumigaura[J]. Water Research, 1998, 32(12): 3549-3554. doi: 10.1016/S0043-1354(98)00153-5
[13]	ZHANG K J, ZHANG T Q, DENG Y, et al. Occurrence of algae and algae-related taste and odour (T&O) compounds in the Qingcaosha Reservoir, China[J]. Journal of Water Supply: Research and Technology-Aqua, 2015, 64(7): 824-831. doi: 10.2166/aqua.2015.072
[14]	YANG M, YU J W, LI Z L, et al. Taihu Lake not to blame for Wuxi’s woes[J]. Science, 2008, 319(5860): 158.
[15]	钟秀华, 周丽辉, 余胜兵, 等. 顶空固相微萃取-气相色谱/质谱法测定饮水中2-甲基异莰醇和土臭素[J]. 环境卫生学杂志, 2015, 5(3): 97-100.
[16]	WANG C M, CANE D E. Biochemistry and molecular genetics of the biosynthesis of the earthy odorant methylisoborneol in Streptomyces Coelicolor[J]. Journal of the American Chemical Society, 2008, 130(28): 8908-8909. doi: 10.1021/ja803639g
[17]	GIGLIO S, CHOU W K W, IKEDA H, et al. Biosynthesis of 2-methylisoborneol in Cyanobacteria[J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(3): 992-998.
[18]	GIGLIO S, JIANG J Y, SAINT C P, et al. Isolation and characterization of the gene associated with geosmin production in cyanobacteria[J]. Environmental Science & Technology, 2008, 42(21): 8027-8032.
[19]	SUURNÄKKI S, GOMEZ-SAEZ G V, RANTALA-YLINEN A, et al. Identification of geosmin and 2-methylisoborneol in cyanobacteria and molecular detection methods for the producers of these compounds[J]. Water Research, 2015, 68: 56-66. doi: 10.1016/j.watres.2014.09.037
[20]	吴燕芳. 固相萃取-气相色谱法检测水样中的土臭素和2-甲基异茨醇[C]//中国化学会有机分析专业委员会, 国家自然科学基金委. 中国化学会第十四届有机分析及生物分析学术研讨会会议论文摘要集, 2007: 281-282.
[21]	李学艳, 陈忠林, 沈吉敏, 等. 固相萃取-气质联机测定水中嗅味物质2-甲基异茨醇和土霉素[J]. 中国环境监测, 2006, 22(2): 18-21. doi: 10.3969/j.issn.1002-6002.2006.02.005
[22]	余沛芝, 阮春蓉, 陈琳琳, 等. 水中2-甲基异莰醇和土臭素的固相微萃取-气相色谱串联质谱检测方法[J]. 净水技术, 2018, 37(9): 10-14.
[23]	JOHN N, KOEHLER A V, BRENDAN R E, et al. An improved method for PCR-based detection and routine monitoring of geosmin-producing cyanobacterial blooms[J]. Water Research, 2018, 136: 34-40. doi: 10.1016/j.watres.2018.02.041

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图( 4) 表( 2)

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1. 实验方案
1.1 实验污泥
1.2 真空预压模型实验
2. 实验结果及分析
2.1 累积出水量
2.2 累计沉降量与减量比
2.3 含水率
2.4 压汞实验
2.5 电镜扫描
3. 结论

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湖库是我国许多城市的重要饮用水水源地^[1]。然而，我国35个城市水源水库中有80%的水体存在饮用水嗅味问题^[2]，其中由致嗅化合物2-甲基异莰醇(2-methylisoborneol，2-MIB)导致的水体土霉味问题居多^[3-7]。由于该物质嗅阈值极低^[5](4~16 ng·L⁻¹)，且很难通过常规水处理工艺去除^[8]，饮用水中残留的痕量2-MIB物质容易引发消费者对水质的担忧，威胁城市供水安全^[4]。水源地嗅味问题已经成为我国供水行业中重点关注的问题之一^[9]。

2-MIB主要由丝状蓝藻生长代谢产生，这类蓝藻包括颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮颤藻属(Planktothrix)以及伪鱼腥藻属(Pseudanabaena)等^[9]。丝状蓝藻导致的2-MIB嗅味问题可最早追溯到1983年，由于水源水库底泥附着生长的颤藻引发美国加利福尼亚州3个供水系统出现嗅味问题^[10]；1991年，MARTIN等^[11]在密西西比某池塘中采集到一株产2-MIB的颤藻；1998年，日本学者SUGIURA等^[12]在Kasumigaura湖中分离出4株丝状产嗅蓝藻，包括2株席藻、1株颤藻和1株鞘丝藻，发现这些藻种生物量与水体土霉味之间存在正相关关系。

近10年来，我国关于水源地嗅味问题的报道越来越多。北京密云水库每年9—10月局部区域出现浮颤藻生长导致水体嗅味问题^[7]；上海市新建水源地青草沙水库由于丝状蓝藻爆发导致季节性嗅味问题^[13]；天津于桥水库、苏州东太湖湖滨水库、上海金泽水库及银川某化工园区水源水库等均存在由于不同种属的丝状产嗅蓝藻生长或爆发导致的嗅味问题^[14]。

大部分水源地中2-MIB由丝状蓝藻产生，由于丝状蓝藻种类较多、形态相近，不同藻种具有不同的产2-MIB特征，甚至同一藻种在不同外部环境条件下也存在产嗅差异。传统方法主要依托显微镜镜检通过藻细胞形态进行藻种计数。然而，从细胞形态上无法区分产嗅丝状藻种与非产嗅丝状藻种，因此，无法特异性检测水体中的产嗅藻；此外显微镜镜检前处理耗时长，检测效率低，准确度与精确度较低^[7]。致嗅物质2-MIB可基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法^[15]分析，但因仪器昂贵、操作要求高、运行维护成本高，大部分水源管理机构不具备该条件，且该方法只能测定水样中已产生的2-MIB物质浓度，无法提前预警，也不能鉴别产生来源。因此，有必要构建一种能特异性检测水体2-MIB产生潜力的方法。

由于丝状藻代谢产生2-MIB受相关功能基因控制，可通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)方法构建特异性检测2-MIB合成功能基因的方法。关于2-MIB的合成途径最初在放线菌中被发现^[16]，主要由SCO7701基因与SCO7700基因调控；随后，GIGLIO等^[17]发现蓝藻中2-MIB的生物合成机制为GPP的甲基化和甲基GPP的环化反应，分别由GPPMT基因和2-MIBS基因调控。根据序列相似性分析，蓝藻和放线菌的2-MIB相关基因具有相对较高的相似度和同源性^[18]。

本研究通过设计针对蓝藻中2-MIB功能基因的特异性引物，构建实时定量PCR方法，并采用实际水体检验方法的可行性，实现水源中丝状蓝藻的致嗅功能基因定量检测，进而评估水体产嗅潜力与产嗅风险，为水源嗅味问题的监测与预警提供实时、快速、科学的方法。

1. 材料与方法

1.1. 实验材料

所用藻种均为产2-MIB蓝藻，分别为FACHB-1277(Pseudanabaena sp., 伪鱼腥藻)、FACHB-1375(Planktothrix sp., 浮颤藻)，购自中国科学院淡水藻种库。藻类培养使用BG11培养基，扩大培养后用于DNA提取及致嗅物质检测等目的。

1.2. 培养藻种及环境样品DNA提取方法

取500 mL藻培养液将藻细胞过滤富集至1.2 μm滤膜(RTTP04700，1.2 µm 聚碳酸酯膜，Isopore^TM, 美国)上；随后将滤膜剪切破碎后使用FastDNA ^®SPIN Kit for Soil 试剂盒(6560-200，MPBio，美国)提取样品DNA。

1.3. 引物设计与特异性验证

采用已有研究^[19]中的2-MIB引物(MIB3313F/MIB4226R和MIB3324F/MIB4050R)可以有效扩增FACHB-1277与FACHB-1375样品中2-MIB功能基因，验证了实验藻种含MIB功能基因。但由于两对引物所扩增得到的2-MIB基因片段较长，分别为913 bp与726 bp，不能用于定量PCR扩增。进一步检验了已有研究中报道的定量PCR引物MIBS-RTF/ MIBS-RTR^[19]，发现不能扩增本研究中实验藻种的2-MIB功能基因。因此，本研究基于NCBI已公开的2-MIB功能基因数据库，设计2-MIB功能基因的特异性引物(表1)，基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将所设计的引物与NCBI中已有2-MIB基因数据库比对验证引物可行性与特异性；并采用普通PCR法测试相关引物，使用1.2 %琼脂糖凝胶电泳方法检验了引物的特异性。

1.4. 普通PCR与qPCR扩增条件

普通PCR反应体系为：2×PCR Taq MasterMix with dye (RR005A，TAKARA Bio公司，日本)12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH₂O 8.9 μL。普通PCR扩增程序为：高保真酶活化阶段95 ℃，持续5 min；高温变性阶段95 ℃，持续30 s；低温退火阶段64 ℃，持续 45 s；延伸阶段72 ℃，持续30 s；高温变性、低温退火、延伸阶段共45个循环。

qPCR反应体系为：TB Green^TM Premix Ex Taq^TM (RR820，TAKARA Bio公司，日本)12.5 μL，上下游引物MIBF/MIBR各0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH₂O 9.5 μL。qPCR扩增程序为：高温变性95 ℃，持续10 s；低温退火64 ℃，持续20 s；延伸阶段72 ℃，持续30 s；反应共40个循环；另外，溶解曲线设置条件为由65 ℃升温至97 ℃，速率为2.2 ℃·s⁻¹。

1.5. 标准曲线的建立

基于引物MIBF与MIBR扩增FACHB-1277 DNA模板，经测序后根据序列信息合成2-MIB功能基因质粒，浓度为359 ng·μL⁻¹(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。根据式(1)计算质粒拷贝数。

式中：N为基因拷贝数浓度，copies·μL⁻¹；N_A为阿伏伽德罗常数；c为核酸质量浓度，ng·μL⁻¹；L为碱基长度，bp；M_W为单位碱基平均摩尔质量。

由式(1)计算得到质粒拷贝数为8.44×10¹¹copies·μL⁻¹。按10倍进行梯度稀释，得到7个浓度水平，以此为DNA模板，按照1.4节提及的优化体系与运行参数进行qPCR扩增。同一浓度梯度质粒DNA为模板的反应孔作3组平行实验，将得到的C_q值与2-MIB基因量的对数构建线性模型，绘制标准曲线。

1.6. 实际样品测试

配制了9个不同浓度产嗅藻的培养样品，包括FACHB-1277伪鱼腥藻-1 (S01)、FACHB-1277伪鱼腥藻-2 (S02)、FACHB-1277伪鱼腥藻-3 (S03)、FACHB-1375浮颤藻-1 (S04)、FACHB-1375浮颤藻-2 (S05)、FACHB-1375浮颤藻-3 (S06)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 01 (S10)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 02 (S11)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 03 (S12)。采集了12个南水北调工程的环境样品，包括S07~S09、S13~S21。对这21组样品分别进行了定量PCR方法检测与气相色谱-质谱联用的2-MIB物质浓度分析^{[15, 20-22]}，每个样品重复分析3次。

3. 结论

1)建立了检测水体中2-MIB功能基因的定量PCR方法，该方法能克服传统方法无法区分产嗅藻与非产嗅藻的缺点，且满足检测要求(R²=0.999 5，P<0.01)。

2)通过采集我国不同地区的实际水源样品，对比验证了定量PCR方法与仪器分析方法结果的一致性(R²=0.63，P<0.01)，说明本研究提出基于定量PCR评估水体嗅味风险的方法具有可行性。

3)基于qPCR的产嗅基因丰度检测代替了繁琐、重现性低的显微镜看藻、数藻过程。快速、准确有效地检测水体中致嗅功能基因的丰度，能起到预警作用，为水源地的水质管理提供十分重要的工具与技术支持。

参考文献 (23)

比重	含水率/%	密度/(g·cm⁻³)	有机质/%	液限/%	塑限/%
1.8	86	1.13	40	184	111

基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

作者简介: 徐晓庆(1994—)，女，硕士研究生。研究方向：饮用水源地产嗅风险评估与调控。E-mail：lovelyyokyo@163.com

通讯作者: 崔长征(1978—)，男，博士，副教授。研究方向：环境微生物利用等。E-mail：cuichangzheng@ecust.edu.cn;

Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application

Corresponding author: CUI Changzheng, cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

1. 实验方案

1.1 实验污泥

1.2 真空预压模型实验

2. 实验结果及分析

2.1 累积出水量

2.2 累计沉降量与减量比

2.3 含水率

2.4 压汞实验

2.5 电镜扫描

3. 结论

计量

出版历程

基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

通讯作者: 崔长征(1978—)，男，博士，副教授。研究方向：环境微生物利用等。E-mail：cuichangzheng@ecust.edu.cn;

English Abstract

Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application

Corresponding author: CUI Changzheng, cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

全文HTML

1.1. 实验材料

1.2. 培养藻种及环境样品DNA提取方法

1.3. 引物设计与特异性验证

1.4. 普通PCR与qPCR扩增条件

1.5. 标准曲线的建立

1.6. 实际样品测试

2.1. 引物设计与特异性验证结果分析

2.2. 定量PCR标准曲线的构建

2.3. 实际样品2-MIB基因丰度测试结果

2.4. 2-MIB监测方法的对比与验证

2.5. 2-MIB的定量PCR监测方法的应用前景

目录

全文HTML

1.1. 实验材料

1.2. 培养藻种及环境样品DNA提取方法

1.3. 引物设计与特异性验证

1.4. 普通PCR与qPCR扩增条件

1.5. 标准曲线的建立

1.6. 实际样品测试

2.1. 引物设计与特异性验证结果分析

2.2. 定量PCR标准曲线的构建

2.3. 实际样品2-MIB基因丰度测试结果

2.4. 2-MIB监测方法的对比与验证

2.5. 2-MIB的定量PCR监测方法的应用前景