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农村小管径重力流灰水管道中生物膜细菌群落的特征

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李文凯, 郑天龙, 刘俊新. 农村小管径重力流灰水管道中生物膜细菌群落的特征[J]. 环境工程学报, 2020, 14(3): 691-700. doi: 10.12030/j.cjee.201905136
引用本文: 李文凯, 郑天龙, 刘俊新. 农村小管径重力流灰水管道中生物膜细菌群落的特征[J]. 环境工程学报, 2020, 14(3): 691-700. doi: 10.12030/j.cjee.201905136
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LI Wenkai, ZHENG Tianlong, LIU Junxin. Characteristics of bacterial communities in the biofilms of rural gray water small diameter gravity sewer systems[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(3): 691-700. doi: 10.12030/j.cjee.201905136
Citation: LI Wenkai, ZHENG Tianlong, LIU Junxin. Characteristics of bacterial communities in the biofilms of rural gray water small diameter gravity sewer systems[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(3): 691-700. doi: 10.12030/j.cjee.201905136
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农村小管径重力流灰水管道中生物膜细菌群落的特征

  • 1.

    中国科学院生态环境研究中心，水污染控制实验室，北京 100085

  • 2.

    中国科学院大学，北京 100049

    • 作者简介: 李文凯(1993—)，男，博士研究生。研究方向：农村污水处理与控制技术。E-mail：wkli_st@rcees.ac.cn
    通讯作者: 郑天龙(1988—)，男，博士，助理研究员。研究方向：农村污水处理技术。E-mail：tlzheng@rcees.ac.cn; 
  • 基金项目:
    国家自然科学基金资助项目(51838013，51808536)；国家重点研发计划(2016YFC0400804)

  • 中图分类号: X52

Characteristics of bacterial communities in the biofilms of rural gray water small diameter gravity sewer systems

  • 1.

    Department of Water Pollution Control Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

  • 2.

    University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

    • Corresponding author: ZHENG Tianlong, tlzheng@rcees.ac.cn ; 

摘要

  • 摘要: 为探究农村小管径重力流灰水管道系统生物膜的细菌群落结构特征，建立了一套模拟真实农村环境条件下水量变化且具有3组坡度参数(5‰，10‰，15‰)的小管径灰水管道实验设备，利用Illumina HiSeq高通量测序技术，分析了连续运行60 d后的管道生物膜的细菌群落特征。结果表明：Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes为优势菌门，优势菌属为Paenarthrobacte、Ensifer和Spingopyxis，坡度变化会显著影响生物膜细菌群落组成；小管径重力流灰水管道生物膜中存在一定丰度的反硝化细菌和硝化细菌，具有生物脱氮功能。通过PICRUSt功能预测发现，高坡度(15‰)的灰水管道具有更高的硝化和反硝化基因丰度。进一步分析可知，小管径灰水管道采用高敷设坡度的设计方案可能具有更强的生物脱氮能力。
    Abstract: To explore the characteristics of bacterial communities in the biofilms of rural gray water small diameter gravity sewer (SDGS) systems, a gray water SDGS equipment was set up which can simulate the variations of gray water flow rate in rural area and slope gradients (5‰, 10‰, 15‰). Sewer biofilms sampled after 60 d operation were analyzed by Illumina HiSeq high-throughput sequencing. Results indicated that Proteobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes were the predominant bacterial phylum and Paenarthrobacte, Ensifer and Spingopyxis were the predominant genus. Slope gradients had great influences on bacterial communities in sewer biofilms. Denitrifying bacteria and nitrite-oxidizing bacteria with certain abundance were identified in gray water SDGS biofilms, which had the function of biological nitrogen removal. The abundance of nitrification and denitrification genes predicted by the method of PICRUSt was higher in gray water SDGS biofilms with higher slope gradient (15‰). The gray water SDGS with high slope gradients could have stronger biological nitrogen removal.

  • 土壤是人类农业生产的物质基础，一旦遭受污染，会对粮食安全和人体健康造成危害。2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》[1]显示，我国土壤重金属污染问题不容乐观，污染土壤中约82.4%的土壤受到重金属及准金属污染，且土壤重金属污染具有隐蔽性、滞后性、治理难、周期长的特点[2]。重金属极易在土壤-植株体系内迁移和累积，会造成环境污染和生态破坏。因此，对土壤重金属的治理迫在眉睫。

    目前，土壤重金属的处理方法包括物理法(土壤淋洗、蒸汽浸提、电动力学修复)、化学法(化学修复剂)和生物法(微生物催化降解、植物修复、动物修复)[3]。化学原位钝化技术因其成本低、见效快、处理效果显著而得到广泛的应用[4]。常用的钝化剂主要有石灰[5]、磷酸盐[6]、有机质[7-8]、金属氧化物[9-11]和黏土矿物[12]。其中，凹凸棒石是一种典型的含水富镁铝硅酸盐黏土矿物，具有独特的化学成分和物理结构，内表面积大、孔隙较多、离子交换能力强，在化工、环保和印染等领域得到了广泛的应用。谭科艳等[13]研究了凹凸棒石对铜锌镉重金属污染土壤的修复效果，结果表明，适量添加凹凸棒石黏土矿物可对Cu的平均修复率达到31.50%，对Zn元素的平均修复率达到26.15%，对Cd元素的平均修复率达到34.92%，能够有效减少蔬菜对Cu、Zn、Cd元素的吸收。马博[14]研究表明，凹凸棒石综合钝化能力更强，且在酸性较高的极端条件下效果优于膨润土和沸石，低配比凹凸棒石对衡阳尾矿中Cr、Zn、Cd、Pb、Cu的钝化效果显著。ZHANG等[15]发现，凹凸棒石的施加可显著降低Cu的生物可利用态质量分数，缓解重金属Cu对油菜植株的生理胁迫效应。

    常用的凹凸棒石改性方法有无机改性、有机改性、生物质改性和微波改性[16]。LIANG等[17]通过制备巯基改性凹凸棒石钝化Cd污染土壤，可显著增强土壤颗粒对Cd的吸附，抑制农作物对重金属Cd的吸收。XU等[18]将纳米零价铁负载凹凸棒石施用进土壤中，可有效促进重金属Cd、Cr和Pb发生形态转变，并将其固定下来。甘肃省具有丰富的凹凸棒石矿藏，但常常因为品位较低未能得到大规模开发利用。为解决此问题，制备5种不同体积分数H2SO4、不同改性时间的酸改性凹凸棒石，探讨不同钝化材料的添加量对土壤重金属Cu和Zn的钝化效果，并结合环境风险指数和重金属修复效率评估酸改性凹凸棒石的最佳投加量，以期为农田重金属污染土壤的治理和甘肃省凹凸棒石的应用提供参考。

    1.   材料与方法

    1.1   实验原料

    重金属复合污染土壤采自甘肃省白银市东大沟(36° 59′ 96′′ N，104° 22′ 76′′ E)。土壤的基本理化性质为pH 7.28、土壤电导率(EC)1457 µS·cm−1、重金属Cu质量分数为1029.11 mg·kg−1、重金属Ni质量分数为87.18 mg·kg−1、重金属Zn质量分数为707.51 mg·kg−1。其中，Cu和Zn均远超国家标准限值，分别为《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》(GB 15618-2018)[19]的5.15倍和2.83倍。

    凹凸棒石质黏土复合矿物(简称为“凹凸棒石”)购自甘肃当地，原矿采自甘肃省临泽县板桥镇红色凹凸棒石矿，土状结构，粒度为2 mm左右，主要的矿物成分为凹凸棒石29.7%、石英21.8%、长石14.6%、白云石 6.3%、其他组分27.6%，是一种由凹凸棒石为主，石英和长石以及碳酸盐矿物等伴生的黏土质复合非金属矿物。其主要化学成分为：SiO2 48.38%、Al2O3 11.24%、Fe2O3 4.78%、MgO 7%、CaO 7.41%[20]。

    1.2   实验方法

    称取定量凹凸棒石，破碎、研磨，过200目筛(直径0.075 mm)。基于49种酸改性钝化材料的研究[21]，制备5种优选酸改性凹凸棒石，具体配制条件见表1。将凹凸棒石粉末与不同体积分数的H2SO4溶液混合，固液比为1∶10(m∶v)，500 r·min−1转速下搅拌一定时间后，烘干、研磨、过筛制得钝化材料。按2、4、8、16、24 g·kg−1的添加量，将酸改性凹凸棒石钝化材料加入到1.5 kg实际重金属复合污染土壤中，混合均匀，重量法添加去离子水，保持70%的田间持水量，钝化培育30 d后测定土壤的理化性质和重金属形态，每组处理设置不添加任何钝化材料的土壤样品作为对照，记为CK。

    表 1  酸改性凹凸棒石的制备方法
    Table 1.  The preparation method of acid modified attapulgite
    实验编号H2SO4体积分数/%反应时间/h
    A110.072
    A212.548
    A312.572
    A412.596
    A515.072
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    1.3   分析方法

    采用X射线衍射仪(MiniFlex600，日本Rigaku公司)分析改性前后的凹凸棒石晶体物相组成，扫描速度为10°·min−1，角度为5°~80°，扫描过程采用Cu-Kα 辐照。采用扫描电子显微镜(GeminiSEM500，德国ZEISS公司)观察改性前后凹凸棒石的表面形貌，将样品过200目筛网，在15 kV电压下以相同倍率下放大观察分析。

    采用pH计(pHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司)测定土壤pH，固液比为1∶2.5(m∶v)。采用电导率仪(DDS-307A，上海仪电科学仪器股份有限公司)测定土壤EC，固液比为1∶5(m∶v)。采用BaCl2-H2SO4强迫交换法测定土壤阳离子交换量(CEC)。采用BCR连续提取法测定土壤重金属化学形态。土壤重金属总量经HCl-HNO3-HF-HClO4消解后，火焰原子吸收分光光度计(TAS-990，北京普析通用仪器有限责任公司)测定浓度。

    本实验选用H2O和DTPA作为提取剂来评价土壤重金属的生物有效性。土壤重金属水溶态测定时，称取5 g土壤样品与50 mL蒸馏水均匀混合，25 ℃下充分振荡24 h，火焰原子吸收分光光度法测定上清液中重金属浓度。土壤重金属DTPA提取态测定时，称取2 g土壤样品与40 mL DTPA提取液均匀混合，25 ℃下振荡12 h，火焰原子分光光度法测定上清液中重金属浓度。

    1.4   指数计算与数据处理方法

    污染土壤的生态风险指数(Ecological risk index，ERI)指土壤中活性较高的生物有效态质量分数与重金属总量之比，用于表示土壤中重金属的生态环境风险，常用于底泥沉积物、土壤和污泥中重金属的风险评价，通常分为5个等级，即无风险(<1%)、低风险(1%~10%)、中风险(10%~30%)、高风险(30%~50%)、极高风险(>50%)。按式(1)计算[22-23]。

    ERIm=CbsCs×100% (1)

    式中：Cbs为土壤中有效态重金属的质量分数，mg·kg−1，Cs为土壤中重金属的质量分数，mg·kg−1。

    此外，潜在风险指数(potential ecological risk index)可用于评价多种重金属复合污染的生态风险，可按式(2)、式(3)计算。

    Eir=TirCidCib (2)
    RI=∑ni=1Eir (3)

    式中：Eir为单种重金属元素的潜在风险指数；Cid为土壤中重金属质量分数，mg·kg−1；Cib为国家土壤中重金属标准质量分数限值(CCub=100 mg·kg−1，CZnb=250 mg·kg−1)；Tir为单种重金属元素的生物毒性因子，其中TCur=5，TZnr=1；RI为重金属总的生态风险指数。风险等级划分依据如表2和表3所示。

    表 2  土壤中单一重金属(Er)的潜在生态风险指数
    Table 2.  The potential ecological risk index of single heavy metal (Er) in Soil
    Er风险程度
    Er ≤ 40低风险
    40 ≤Er <80中风险
    80 ≤ Er < 160较高风险
    160 ≤ Er < 320高风险
    Er > 320极高风险
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    表 3  土壤中复合重金属(RI)的潜在生态风险指数
    Table 3.  The potential ecological risk index of total heavy metals (RI) in Soil
    RI风险程度
    RI ≤ 150低风险
    150 ≤ RI <300中风险
    300 ≤ RI <600高风险
    RI ≥ 600极高风险
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    污染土壤中重金属的修复效率(Remediation ratio，RR)指BCR多级提取法中较稳定的重金属残渣态(S4)与土壤重金属4种形态总和的比值，可用于评估重金属的潜在活化风险，按式(4)计算[24]。

    RR=S4S1+S2+S3+S4×100% (4)

    式中： S1为重金属元素酸溶态质量分数，mg·kg−1；S2为重金属元素还原态质量分数，mg·kg−1；S3为重金属元素氧化态质量分数，mg·kg−1；S4为重金属元素残渣态质量分数，mg·kg−1。

    2.   结果与讨论

    2.1   土壤理化性质

    土壤pH、电导率和阳离子交换量影响着重金属的化学形态，是评价重金属迁移转化和作物生长发育情况的重要指标[25]。施用不同酸改性凹凸棒石后的土壤pH见图1(a)，与对照组相比，向土壤中施加5种酸改性凹凸棒石后，土壤pH均呈现显著降低的趋势。在同一投加量水平下，A3处理组pH显著低于其他处理组。这是因为，天然的凹凸棒石本身呈弱碱性，含有大量的羟基等官能团[26]，而改性添加的H2SO4具有强酸性，能够和土壤及凹凸棒石中的碱性物质发生反应，从而降低土壤pH，调节土壤的酸碱度。本研究采用的实际污染土壤为北方地区常见的碱性土壤，酸改性凹凸石的施用有效改善了土壤的酸碱环境。不同酸改性凹凸棒石处理后的土壤EC见图1(b)，在同一酸改性凹凸棒石处理组中，土壤EC随着添加量的增加而显著增加，且A5处理组EC值显著高于其他处理组。土壤CEC随着凹凸棒石添加量的增加而增加，但不同添加量间差异性不显著(图1(c))。除A4材料投加量为8 mg·kg−1时土壤CEC较高外，其他投加量水平下，A5处理组CEC也显著高于其他处理组。一方面，凹凸棒石的表面带有Na+、K+和Ca2+等阳离子，本身具有较高的阳离子交换容量，随着投加量的增加，土壤中带电的离子浓度升高，从而提高土壤电导率[27]；另一方面，当改性时添加的H2SO4体积分数较大时，凹凸棒石表面会带有大量的H+，这些活泼的阳离子可能会和土壤中的Cu2+、Zn2+发生阳离子交换反应，提高土壤的EC和CEC [28]。

    图 1  酸改性凹凸棒石钝化土壤的理化性质
    Figure 1.  The physicochemical properties of soil stabilized with acid-modified attapulgite
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    2.2   土壤重金属的生物有效态

    土壤中重金属的水溶态可直观地反映重金属的生物可利用度，这部分形态的重金属质量分数很低，但是却可以直接被植物吸收利用，具有极强的迁移性和毒性，因此常常作为土壤重金属污染评价的重要指标[29]。不同改性凹凸棒石处理后的土壤生物有效态重金属质量分数见图2。从图2可以看出，添加酸改性凹凸棒石后，水溶态Cu和Zn的质量分数均较对照组显著降低。尽管随着投加量的增加，水溶态重金属质量分数出现了先降低后轻微升高的趋势，但差异并未达显著水平。实验结果表明，当投加量为16 g·kg−1时，酸改性凹凸棒石对Cu、Zn的钝化效果最好。其中，A5处理组中水溶态Cu的质量分数最低，较对照组降低了47.38%；A3处理组中水溶态Zn的质量分数最低，较对照组降低了64.44%。土壤中DTPA提取态重金属质量分数常常用来评估植物对重金属的吸收情况，DTPA络合剂能够与重金属离子结合，形成稳定的水溶性络合物，可直观地评价重金属的生物有效性[30]。添加酸改性凹凸棒石后，Cu和Zn的DTPA提取态质量分数均较对照组显著降低。当投加量为16 g·kg−1时，A5处理组中DTPA提取态Cu的质量分数最低，较对照组下降了24.25%，A3处理组中DTPA提取态Zn的质量分数最低，较CK下降了46.77%。DTPA提取态重金属的降低趋势与水溶态重金属基本保持一致。这与罗宁临等[31]的研究结果基本一致。造成以上结果的原因可能是：1)酸改性使得凹凸棒石表面和孔隙内的碳酸盐杂质得以去除，晶束团聚结构变得更加紧密，内表面积和缝隙增大，增强了其对重金属Cu、Zn的吸附能力[32]；2)酸改性凹凸棒石的施用提高了土壤的阳离子交换容量，土壤中游离的Cu2+、Zn2+通过阳离子交换作用，与带有负电荷的凹凸棒石和土壤颗粒结合，显著降低了重金属的生物有效性[27,33]；3)凹凸棒石表面带有大量的硅羟基等官能团，能与重金属发生络合反应，从而将其固定[14,34]。本研究结果说明，采用优质的钝化材料是降低土壤重金属毒性的关键，而控制合适的投加量对农田土壤的修复也至关重要。

    图 2  酸改性凹凸棒石钝化土壤中重金属的生物有效态质量分数
    Figure 2.  The bioavailable heavy metals in soil stabilized with acid-modified attapulgite
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    2.3   土壤重金属形态分布

    BCR多级提取法中，重金属各种形态的活性大小依次为酸溶态>可还原态>可氧化态>残渣态[35]。其中，酸溶态重金属的生物可利用度最高，可还原态和可氧化态重金属容易随着pH和氧化还原电位等环境条件的变化而变化，重新释放到环境介质中，残渣态重金属最稳定，不易在土壤中迁移转化，生态毒性最低[35-37]。酸改性凹凸棒石钝化后土壤中重金属形态分布见图3和图4。添加不同酸改性凹凸棒石后，酸溶态Cu和Zn的质量分数较对照组显著降低，而残渣态Cu和Zn的质量分数上升(图3，图4)。当投加量为16 g·kg−1时，A3处理组中酸溶态Cu和Zn的占比最低，残渣态Cu的比例较对照组上升了3.96%；残渣态Zn的比例较对照组上升了15.26%，这与武成辉等[38]和陶玲等[39]的研究结果一致。添加不同酸改性凹凸棒石可影响重金属在土壤中的形态，促进重金属从活性较高的酸溶态、可还原态向活性较低的可氧化态、残渣态转变，降低了Cu、Zn的生态毒性，实现了土壤的钝化修复。其原因可能是：1)凹凸棒石及其改性材料的添加可通过一系列吸附、离子交换、沉淀和络合作用降低酸溶态Cu、Zn质量分数[40]；2)凹凸棒石经过酸处理后，起支撑作用的八面体和四面体溶解，导致凹凸棒石的孔道增大，比表面积增加，凹凸棒石的吸附性能提高[41]；3)残渣态重金属 Cu、Zn一般存在于硅酸盐、原生和次生矿物等土壤的晶格中，当向污染土壤中施用酸改性凹凸棒石后，随着钝化时间的延长，低价的Cu2+、Zn2+可能会在凹凸棒石八面体或四面体结构中与Si4+发生晶格置换，能长期稳定在土壤中[42]。

    图 3  酸改性凹凸棒石钝化土壤中重金属Cu的BCR形态分布
    Figure 3.  The chemical speciation distribution of Cu in soil stabilized with acid-modified attapulgite
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    图 4  酸改性凹凸棒石钝化土壤中重金属Zn的BCR形态分布
    Figure 4.  The chemical speciation distribution of Zn in soil stabilized with acid-modified attapulgite
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    2.4   酸改性凹凸棒石的表征分析

    为验证上述作用机理，本实验对凹凸棒石改性前后的微观形貌和晶体结构进行表征，扫描电子显微镜图像如图5所示。供试凹凸棒石原矿(ATP)主要呈棒状晶束堆积结构，晶束较长，棒晶密实，孔道结构较少。经不同浓度H2SO4和不同活化时间处理后，凹凸棒石的棒晶发生解束，晶束变短，排列相对松散，可直接接触的点位增多，增强了凹凸棒石对重金属的吸附能力。这与陈雪芳[43]等的研究结果一致：酸改性能够溶解凹凸棒石中的八面体阳离子和四面体硅，使得八面体结构起主要的支撑作用，凹凸棒石孔道开放，孔径增大，比表面积增大，吸附性能提高。但是，当酸浓度较高时，会对层间的阳离子起较强的溶出作用，破坏晶体结构，进而降低凹凸棒石的吸附性能[44]。

    图 5  酸改性凹凸棒石的扫描电镜图
    Figure 5.  Scanning electron microscope image of acid modified attapulgite
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    酸改性凹凸棒石的X射线衍射图谱结果见图6。凹凸棒石的特征峰位于8.40°处，与标准衍射图谱(JCPDFNo.020018)一致。石英特征衍射峰的存在证实了凹凸棒石中伴生有其他物相的杂质。从图中可以看出，经过酸改性后，凹凸棒石质黏土复合矿物物相组成及凹凸棒石、白云石物相的衍射峰峰强度没有明显改变，石英杂质的峰强度有轻微减弱。这表明，酸改性过程溶解了碳酸盐等杂质，但是并未破坏凹凸棒石的骨架结构。该结果与雷春生等[45]和张萍等[46]的研究结果一致。本研究结果表明，适宜的酸浓度和改性时间能够有效改善天然凹凸棒石原矿的表面形貌和孔隙结构，使得钝化材料孔隙结构增多，孔径变大，比表面积增大，促进了其对重金属的钝化修复。

    图 6  酸改性凹凸棒石的 X 射线衍射图谱
    Figure 6.  X-ray diffraction pattern of acid modified attapulgite
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    2.5   土壤重金属的环境风险评价和钝化修复效率

    与土壤中重金属的总量相比，水溶态Cu和Zn的质量分数占比不到0.01%。因此，本研究根据DTPA提取态重金属的质量分数来评价酸改性凹凸棒石钝化剂对土壤重金属的修复效率和生态风险。对照组污染土壤中Cu和Zn的环境风险指数分别对应为24.4%和11.51%。经不同的钝化材料处理后，土壤重金属的环境风险均较对照组显著降低(表4)。当施用A5钝化材料且投加量为16 g·kg−1时，酸改性凹凸棒石处理后Cu的环境风险指数降至最低。土壤Zn的环境风险由中风险降为低风险(表5)，当施用A3材料且投加量为16 g·kg−1时，Zn的环境风险指数最低。

    表 4  不同添加量酸改性凹凸棒石钝化土壤中Cu的环境风险指数
    Table 4.  The environmental risk index of Cu in soil stabilized with different amount of acid-modified attapulgite
    酸改性凹凸棒石添加量/(g·kg−1)ERI/%
    A1A2A3A4A5
    221.81±0.13Aa20.80±0.02Ab20.40±0.11Ac20.35±0.07Ac20.49±0.23Ac
    421.72±0.06Aa20.32±0.14Bb19.88±0.26BCc19.77±0.15BCc20.28±0.13Ab
    820.26±0.07Ba19.97±0.14Cb20.10±0.13ABab19.42±0.18Dab19.36±0.06Bc
    1619.80±0.15Ca19.35±0.21Db19.67±0.11Ca19.87±0.07Ba18.48±0.17Dc
    2419.43±0.18Dab19.24±0.15Db19.35±0.17Dab19.56±0.10CDab18.78±0.09Cc
    　　注：大写字母表示不同投加量之间的差异性，小写字母表示不同钝化材料之间的差异性。
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    表 5  不同添加量酸改性凹凸棒石钝化土壤中Zn的环境风险指数
    Table 5.  The environmental risk index of Zn in soil stabilized with different amount of acid-modified attapulgite
    酸改性凹凸棒石添加量/(g·kg−1)ERI/%
    A1A2A3A4A5
    29.47±0.03Aa8.85±0.09Ab8.55±0.11Ac8.24±0.11Ad8.31±0.04Ad
    48.52±0.11BCab8.59±0.11Ba8.36±0.06Abc8.00±0.08Bd8.31±0.15Ac
    88.83±0.10BCa8.39±0.10Cb8.48±0.19Ab7.29±0.15Cc8.21±0.20Ab
    168.27±0.06Ca8.13±0.09Da6.13±0.10Bc7.09±0.10Db8.11±0.16Aa
    248.88±0.66Ba8.14±0.15Db6.23±0.22Bd7.00±0.09Dc8.26±0.14Ab
    　　注：大写字母表示不同投加量之间的差异性，小写字母表示不同钝化材料之间的差异性。
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    在复合重金属污染土壤中，除了考虑单一重金属的环境风险外，受元素共存的联合作用影响，本研究评价了多种重金属的总环境风险指数RI。除添加量为16 g·kg−1的A1处理外，其他处理均显著降低了土壤RI。由图7可知，A3材料在较高添加量(≥8 g·kg−1)时，土壤RI指数随着添加量的增加显著降低。施用A5材料且添加量为16 g·kg−1时土壤中Cu、Zn的总生态风险指数达到最低。

    图 7  酸改性凹凸棒石钝化土壤中重金属的总环境风险指数
    Figure 7.  The total environmental risk factor of heavy metals in soil stabilized with acid-modified attapulgite
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    钝化完成后，通常根据土壤中重金属的修复效率来评价钝化材料的实际应用价值。添加酸改性凹凸棒石后，Cu的修复效率随着投加量的增加呈先升高后轻微降低的趋势(表6)，当钝化材料的投加量为16 g·kg−1时，重金属Cu的修复效率明显高于其他处理组。其中，A3处理组的钝化修复效率最高，达11.96%。重金属Zn修复效率的变化趋势与Cu基本一致(表7)，当向土壤中施加16 g·kg−1的酸改性凹凸棒石后，Zn的修复效率明显高于其他处理组。其中，A3处理组Zn的钝化修复效率最高，为27.70%。

    表 6  不同添加量酸改性凹凸棒石钝化土壤中Cu的修复效率
    Table 6.  The remediation ratio of Cu in soil stabilized with different amount of acid-modified attapulgite
    酸改性凹凸棒石添加量/(g·kg−1)RR/%
    A1A2A3A4A5
    27.90±0.22Dc7.48±0.26Cc9.52±0.12Ca8.55±0.58Cb7.64±0.17Dc
    48.56±0.12Cb7.82±0.31BCc9.74±0.25Ca9.62±0.23BCa8.55±0.26Cb
    89.11±0.12Bcd8.53±0.24Bd10.20±0.45BCb11.01±0.62ABa9.76±0.20Bbc
    1611.51±0.30Aa9.87±0.28Ab11.96±0.93Aa11.24±0.15Aab11.15±0.32Aab
    2411.30±0.31Aab9.47±0.88Ac11.00±0.38Bab11.58±0.60Aa10.35±0.74Bbc
    　　注：大写字母表示不同投加量之间的差异性，小写字母表示不同钝化材料之间的差异性。
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    表 7  不同添加量酸改性凹凸棒石钝化土壤中Zn的修复效率
    Table 7.  The remediation ratio of Zn in soil stabilized with different amount of acid-modified attapulgite
    酸改性凹凸棒石添加量/(g·kg−1)RR/%
    A1A2A3A4A5
    219.21±0.40Cc20.83±0.38Cb22.62±0.47Da20.51±0.98Db23.52±0.99Ca
    421.20±0.48Bb20.86±0.46Cb24.86±1.00Ca21.18±0.30CDb25.63±0.30ABa
    822.39±0.72ABb22.50±0.60BCb24.74±0.34Ca21.97±0.52BCb25.14±0.72BCa
    1623.55±0.12Ac25.16±0.15Abc27.70±0.11Aa24.82±0.11Ac27.40±0.14Aab
    2423.06±0.70Ab22.91±0.15Bb26.23±0.36Ba23.06±0.39Bb26.77±0.12ABa
    　　注：大写字母表示不同投加量之间的差异性，小写字母表示不同钝化材料之间的差异性。
     | Show Table
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    3.   结论

    1)当H2SO4的体积分数为12.5%和15%，改性时间为72 h时，制得的酸改性凹凸棒石对Cu、Zn的钝化效果最佳，其最优投加量为16 g·kg−1。

    2)向土壤中施加酸改性凹凸棒石，可显著降低重金属Cu、Zn的生物有效态质量分数，当钝化材料的投加量为16 g·kg−1时，H2O提取态Cu、Zn分别降低了25.91%~47.87%和49.69%~65%，DTPA提取态Cu、Zn分别降低了8.63%~24.30%和28.26%~46.84%。这说明，16 g·kg−1凹凸棒石可以有效降低Cu、Zn的生物有效性。

    3)酸改性凹凸棒石的添加促使重金属Cu、Zn由活性较高的酸溶态向活性较低的残渣态转变，提高土壤重金属修复效率，当H2SO4的体积分数为12.5%，改性时间为72 h时，向土壤中投加16 g·kg−1酸改性凹凸棒石，Cu、Zn的修复效率最高，可达11.96%和27.70%，此时Zn的环境风险最低，降至6.13%，处于低风险。

  • 图 1  小管径重力流模拟装置示意图

    Figure 1.  Schematic diagram of simulated small diameter gravity sewers

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    图 2  管道充满度及流速随时间的变化

    Figure 2.  Variation of relative depth and flow velocity with time in sewers

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    图 3  灰水管道生物膜扫描电镜图

    Figure 3.  SEM images of gray water SDGS biofilms

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    图 4  OTUs韦恩图

    Figure 4.  Venn diagram of OTUs

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    图 5  OTU香农曲线图

    Figure 5.  Shannon diagram of OTUs

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    图 6  细菌门水平相对丰度

    Figure 6.  Relative abundance of bacteria at phylum level

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    图 7  细菌属水平相对丰度热图

    Figure 7.  Heat map of relative abundance of bacteria at genus level

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    图 8  细菌LEfSe分析图 (LDA > 3.5)

    Figure 8.  LEfSe diagram of bacteria (LDA > 3.5)

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    图 9  硝化功能基因预测丰度

    Figure 9.  Predicted abundance of nitrification genes

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    图 10  反硝化功能基因预测丰度

    Figure 10.  Predicted abundance of denitrification genes

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    表 1  配制灰水组分浓度

    Table 1.  Composition of synthetic gray water

    常量物质浓度/(mg·L−1)微量物质浓度/(μg·L−1)
    葡萄糖80CaCl2·2H2O73.50
    蛋白胨80MgSO4·7H2O51.25
    CH3COONa54Na2SiO3·9H2O30.43
    NaHCO391Al2(SO4)3·16H2O11.78
    KCl57FeCl3·6H2O4.83
    KNO37ZnSO4·7H2O0.88
    NH4Cl19H3BO30.58
    NaH2PO4·2H2O15CuSO4·5H2O0.39
    食用油30MnCl2·4H2O0.27
    十二烷基苯磺酸钠5KI0.03
    EDTA20.00
    　　注：pH=7。
    常量物质浓度/(mg·L−1)微量物质浓度/(μg·L−1)
    葡萄糖80CaCl2·2H2O73.50
    蛋白胨80MgSO4·7H2O51.25
    CH3COONa54Na2SiO3·9H2O30.43
    NaHCO391Al2(SO4)3·16H2O11.78
    KCl57FeCl3·6H2O4.83
    KNO37ZnSO4·7H2O0.88
    NH4Cl19H3BO30.58
    NaH2PO4·2H2O15CuSO4·5H2O0.39
    食用油30MnCl2·4H2O0.27
    十二烷基苯磺酸钠5KI0.03
    EDTA20.00
    　　注：pH=7。
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    表 2  实验灰水水质特征

    Table 2.  Characteristics of gray water in the experiment

    测试结果pHDO/(mg·L−1)COD/(mg·L−1)NH+4-N/(mg·L−1)TN/(mg·L−1)TP/(mg·L−1)SO2−4/(mg·L−1)LAS/(mg·L−1)
    平均值7.074.26121.564.9014.333.8318.072.69
    标准差0.130.5785.880.631.220.947.331.60
    　　注：LAS为阴离子表面活性剂。
    测试结果pHDO/(mg·L−1)COD/(mg·L−1)NH+4-N/(mg·L−1)TN/(mg·L−1)TP/(mg·L−1)SO2−4/(mg·L−1)LAS/(mg·L−1)
    平均值7.074.26121.564.9014.333.8318.072.69
    标准差0.130.5785.880.631.220.947.331.60
    　　注：LAS为阴离子表面活性剂。
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    表 3  灰水管道生物膜功能细菌相对丰度(属水平)

    Table 3.  Relative abundance of functional bacteria in gray water sewer biofilms at genus level

    功能菌属名相对丰度/%
    坡度5‰坡度10‰坡度15‰
    含有反硝化细菌的属Rhodobacter2.7452.4230.986
    Pseudomonas2.1211.9903.024
    Paracoccus0.7350.6810.273
    Aeromonas0.4910.5940.828
    Xanthomonas0.2960.2580.139
    Acinetobacter0.2620.2140.277
    Microbacterium0.0930.0650.058
    Vibrio0.0860.0810.130
    Bacillus0.0810.0830.082
    Rhizobium0.0640.0650.171
    Comamonas0.0450.0440.028
    Erythrobacter0.0190.0220.050
    硝酸细菌Nitrospira0.1260.1320.118
    硫氧化细菌Acidiphilium0.0590.0490.017
    Sphingomonas0.0040.0060.011
    Beggiatoa0.0010.0080.029
    功能菌属名相对丰度/%
    坡度5‰坡度10‰坡度15‰
    含有反硝化细菌的属Rhodobacter2.7452.4230.986
    Pseudomonas2.1211.9903.024
    Paracoccus0.7350.6810.273
    Aeromonas0.4910.5940.828
    Xanthomonas0.2960.2580.139
    Acinetobacter0.2620.2140.277
    Microbacterium0.0930.0650.058
    Vibrio0.0860.0810.130
    Bacillus0.0810.0830.082
    Rhizobium0.0640.0650.171
    Comamonas0.0450.0440.028
    Erythrobacter0.0190.0220.050
    硝酸细菌Nitrospira0.1260.1320.118
    硫氧化细菌Acidiphilium0.0590.0490.017
    Sphingomonas0.0040.0060.011
    Beggiatoa0.0010.0080.029
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图( 10) 表( 3)
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-05-23
  • 录用日期:  2019-08-20
  • 刊出日期:  2020-03-01
李文凯, 郑天龙, 刘俊新. 农村小管径重力流灰水管道中生物膜细菌群落的特征[J]. 环境工程学报, 2020, 14(3): 691-700. doi: 10.12030/j.cjee.201905136
引用本文: 李文凯, 郑天龙, 刘俊新. 农村小管径重力流灰水管道中生物膜细菌群落的特征[J]. 环境工程学报, 2020, 14(3): 691-700. doi: 10.12030/j.cjee.201905136
shu
LI Wenkai, ZHENG Tianlong, LIU Junxin. Characteristics of bacterial communities in the biofilms of rural gray water small diameter gravity sewer systems[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(3): 691-700. doi: 10.12030/j.cjee.201905136
Citation: LI Wenkai, ZHENG Tianlong, LIU Junxin. Characteristics of bacterial communities in the biofilms of rural gray water small diameter gravity sewer systems[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(3): 691-700. doi: 10.12030/j.cjee.201905136
shu

农村小管径重力流灰水管道中生物膜细菌群落的特征

    通讯作者: 郑天龙(1988—)，男，博士，助理研究员。研究方向：农村污水处理技术。E-mail：tlzheng@rcees.ac.cn; 
    作者简介: 李文凯(1993—)，男，博士研究生。研究方向：农村污水处理与控制技术。E-mail：wkli_st@rcees.ac.cn
  • 1. 中国科学院生态环境研究中心，水污染控制实验室，北京 100085
  • 2. 中国科学院大学，北京 100049
  • 收稿日期:  2019-05-23
  • 录用日期:  2019-08-20
  • 网络出版日期:  2020-03-25
基金项目:
国家自然科学基金资助项目(51838013，51808536)；国家重点研发计划(2016YFC0400804)

摘要: 为探究农村小管径重力流灰水管道系统生物膜的细菌群落结构特征，建立了一套模拟真实农村环境条件下水量变化且具有3组坡度参数(5‰，10‰，15‰)的小管径灰水管道实验设备，利用Illumina HiSeq高通量测序技术，分析了连续运行60 d后的管道生物膜的细菌群落特征。结果表明：Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes为优势菌门，优势菌属为Paenarthrobacte、Ensifer和Spingopyxis，坡度变化会显著影响生物膜细菌群落组成；小管径重力流灰水管道生物膜中存在一定丰度的反硝化细菌和硝化细菌，具有生物脱氮功能。通过PICRUSt功能预测发现，高坡度(15‰)的灰水管道具有更高的硝化和反硝化基因丰度。进一步分析可知，小管径灰水管道采用高敷设坡度的设计方案可能具有更强的生物脱氮能力。

English Abstract

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  • 农村污水的分质收集处理是农村污水资源化的重要方式。农村生活污水按照其污水来源和水质特征的不同，可以大致分为灰水和黑水2大类。其中，灰水是指不包括冲厕污水(黑水)在内的生活杂排水，主要包括餐厨污水、洗涤污水和洗浴污水等[1-2]。灰水由于基本不含肠道病原微生物、污染物浓度较低且易于自然生物处理的特点，具有很高的直接回用价值[1]。为缓解水资源压力，灰水单独采用管道收集并直接用于灌溉的回用方式已经得到了一定的应用[3]。而农村污水治理工程设施投资中的管道敷设成本占所有建设投资的70%以上，管道敷设成本过高直接限制了农村地区污水收集治理工作的有效开展[4-5]。小管径重力流排水系统具有管道成本低、施工开挖土方量少、建设迅速等诸多优点，非常适用于经济条件相对落后的农村地区[6-7]。基于此，小管径重力流灰水管道系统具有明显的经济优势和生态环境效益，具有较大的推广潜力和应用前景。

    排水管道生物膜具有一定的污水预处理功能，并且可能产生CH4、H2S等具有环境和健康风险的气体，对于市政排水管道生物膜的微生物群落特征已经有了相对广泛的研究[8-10]。然而，农村污水特征与市政排水相比，其水质水量具有明显的随时间变化规律，即每天在用餐时段污水水量较大，而夜间基本没有污水排放[11]。具体到管道容量较小的小管径系统中，在早中晚时段，污水排放高峰期，管道经常临近满管流状态；而在夜间，基本处于断流状态。不同的流态决定了不能直接套用市政污水管道生物膜数据来解析农村污水管道生物膜，当前对于农村污水管道生物膜的认识仍处于起步阶段，更是罕有针对农村灰水管道生物膜的研究。

    本研究采用实验室规模的小管径重力流灰水管道系统，研究了小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落、氮硫循环管道功能菌特征以及氮循环功能基因分布情况，重点探讨了管道敷设坡度对于小管径重力流灰水管道生物膜细菌群落的影响。本研究丰富了排水管道生物膜认知体系，为小管径重力流灰水管道的优化设计和应用提供了参考。

1.   材料与方法

    1.1.   实验装置

  • 本研究采用的实验装置为实验室规模的小管径重力流管道模拟系统。整个系统由3套不同敷设坡度(5‰，10‰，15‰)的透明UPVC排水管道系统(φ50 mm×3.5 mm，单组管道总长5 m，溢彩，中国)、PVC阀门(百盛，中国)、高位水箱(PVC板自制)、循环水箱(PVC板自制)、潜水泵(HQB-5000，森森，中国)、恒温器(300 W，YEE，中国)等组成(图1)。灰水由潜水泵经循环水箱提升至高位水箱，沿排水管道依靠重力作用流下，最终回到循环水箱。灰水在整套系统中循环流动，模拟小管径重力流灰水管道的生物膜生境，同时保证了3套管道中的灰水水质相同，有效避免了水质差异造成的生物膜群落结构差异。为进行生物膜取样，在距直管道起点1 m处设置30 cm长的取样管道，两侧采用50 mm PVC活接头(联塑，中国)连接，确保取样管道的轴线与直管道重合。

    • 1.2.   水质特征及分析测试方法

  • 为模拟实际农村灰水在小管径重力流管道中的真实流态，本研究利用调节潜水泵功率和阀门开闭的方式保持管道内的充满度随时间有规律的变化，管道实际充满度和平均灰水流速如图2所示。整个实验设备的运行水温维持在20 ℃并保持避光运行，以模拟真实的灰水管道运行状态。本研究进水采用人工配制的灰水，配制方法见表1。每2 d换水一次，运行水质条件见表2。整套设备连续运行60 d，形成成熟的管道生物膜。

    相关研究[12-13]表明，经过60 d的连续运行，排水管道生物膜可以发育成熟。连续运行后，在第60天拆卸取样管道，用经过灭菌处理的药匙刮下少量位于管道内表面底部的生物膜样品，置于无菌离心管中，迅速置于4 ℃冰箱中保存，用于生物膜样品的形貌观测。另取3份平行样品，迅速置于4 ℃便携式恒温箱(FYL-12MC-B4,福意联，中国)中临时暂存，在0.5 h内，转移至−80 ℃冰箱中保存，用于生物膜细菌的群落分析，取3份平行样品群落分析结果的算术平均值。

    将生物膜样品浸没于2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃避光静置24 h。然后依次利用25%、50%、75%、95%和100%的乙醇溶液进行梯度脱水，最后于−50 ℃中冷冻干燥，制得扫描电镜样品。将样品喷碳后，置于JSM-5610LV型扫描电镜(JEOL，日本)下，分析生物膜样品的形貌特征。

    采用PowerSoil® DNA Isolation Kit (MoBio，美国)试剂盒提取生物膜样品的DNA，并利用细菌16S rRNA通用引物338F和806R进行PCR扩增。总PCR反应体系的体积为20 μL，包括超纯水13.25 μL，10×PCR ExTaq Buffer 2.0 μL，DNA模板(100 ng·mL−1)0.5 μL，引物338F和806R (10 mmol·L−1)各1.0 μL，dNTP 2.0 μL, ExTaq (5 U·mL−1) 0.25 μL；在95 ℃中维持5 min，继而进行30个扩增循环，每个循环包括95 ℃孵育30 s，58 ℃孵育20 s，72 ℃孵育6 s；最后在72 ℃维持7 min，得到扩增产物。扩增产物经纯化定量回收后，采用Illumina HiSeq 2500 (Illumina，美国)高通量测序平台进行测序分析。细菌高通量测序结果以97%的相似度划分为分类操作单元(OTU)，获得的OTU与细菌Silva分类学数据库比对，得到细菌群落组成信息。DNA提取和高通量测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成，高通量测序数据通过百迈客云计算平台进行处理和分析(www.biocloud.net)。

    将细菌16S rRNA测序结果与Greengenes分类学数据库比对后形成的OTU文件(97%相似度)上传至PICRUSt在线分析网站(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)，运算形成按拷贝数标准化处理的OTU文件，进而依据网页内置程序进行PICRUSt宏基因组预测[14], 预测得到的KEGG分类数据(ko)通过与KEGG数据库进行比对，获得相关功能基因丰度。

2.   结果和讨论

    2.1.   灰水管道内胶状生物膜的形貌结构

  • 经过60 d的连续运行，小管径重力流灰水管道内壁形成了厚度相对均匀的淡黄色的胶状生物膜。生物膜的扫描电镜结果如图3所示。可以看出，脱水后的灰水管道生物膜呈粗糙的表面结构，生物膜中分布着大量的不同种类的细菌、真菌、原生动物和胞外聚合物(EPS)，灰水管道生物膜中的微生物以细菌为主，细菌种类多样，杆菌球菌密布，覆盖了整个生物膜表面。真菌数量相对较少，但仍广泛分布在灰水管道生物膜中。观察到的原生动物体表有六边形鳞片构成的外壳，从形貌特征上分析可能为网足属原生动物。原生动物的大量出现表明经过60 d的连续运行，灰水管道生物膜已经形成了复杂的微型生态系统，确认了此时生物膜已经成熟。

    • 2.2.   灰水管道胶状生物膜的细菌群落结构

  • 通过对9个样品(每组管道各3个平行样品)的高通量测序，共获得443 338条有效序列，共划分为230个OTU。其中181个OTU为3个坡度共有(图4)，说明不同坡度下小管径重力流灰水管道生物膜细菌中绝大部分物种是共有的，坡度变化对于灰水管道生物膜中主要的细菌种类影响不大。根据香农指数曲线(图5)所示，随着取样序列数的增加，3个坡度下的平均Shannon指数逐渐趋于平缓，这说明本研究中的高通量测序深度满足进一步分析的要求，测序结果能够充分反映细菌的群落结构。

    小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落结构如图6和图7所示。细菌主要以Proteobacteria (变形菌门) (57.76%±5.76%)、Actinobacteria (放线菌门) (38.46%±5.50%)、Bacteroidetes (拟杆菌门) (2.18%±0.73%)和Acidobacteria (酸杆菌门) (0.79%±0.25%)为主，其中以变形菌门和放线菌门为优势菌门。在15‰的坡度下，放线菌门的丰度显著减小，高流速条件下不利于生物膜上放线菌的生存。另外，生物膜中存在一定丰度的Nitrospirae (硝化螺旋菌门) (0.12%±0.01%)，这证明生物膜中存在硝化过程。Paenarthrobacte (38.35%±5.50%)、Ensifer (剑菌属) (17.11%±1.50%)和Spingopyxis (11.73%±4.32%)是生物膜中的优势细菌属。Paenarthrobacte是一种好氧生长的球形放线菌，可以利用多种碳源，并且可以水解淀粉类物质[15]。剑菌属是一种好氧生长的杆状变形菌，能够利用包括葡萄糖、半乳糖在内的多种碳源，不能水解淀粉，具有硝酸盐和亚硝酸盐还原能力，能够附着在其他细菌表面并使其裂解，是一种非专性捕食性细菌[16]。Spingopyxis是一种好氧生长的呈黄色外观的杆状变形菌，可以利用多种碳源，没有发酵功能，不能水解淀粉，部分种有硝酸盐还原能力[17]，它的存在解释了灰水管道生物膜淡黄色外观的成因。优势细菌属都能利用多种碳源，说明小管径重力流灰水管道生物膜对于多种有机物都有一定的生物降解能力。坡度对细菌优势属的相对丰度有显著的影响：5‰和10‰坡度下细菌丰度差异不明显，而15‰坡度下的细菌丰度与前2个坡度有显著差异。主要表现在15‰坡度下，Paenarthrobacte、Hydrogenophaga(噬氢菌属)和Haliangium丰度降低，而Ensifer (剑菌属)、Spingopyxis、Sphingobium (鞘脂菌属)和Pseudomonas (假单胞菌属) 丰度升高。

    为深入分析管道坡度对细菌群落结构的影响，在属水平下进行LEfSe分析(图8)。图8只显示满足线性判别分析LDA值大于3.5的差异指示物种。LEfSe分析表明，在本研究中的3个管道坡度下，管道生物膜的细菌中共有24个差异指示物种，其中5‰坡度下含有10个，10‰坡度下含有5个，15‰坡度下含有9个，差异指示物种的丰度在相应的坡度下的丰度显著高于另外2个坡度的丰度。5‰坡度下的差异指示物种包括Rhodobacteraceae (红杆菌科)、Rhodobacterales (红杆菌目)、Flavihumibacter、Bacteroidetes (拟杆菌门)、Sphingobacteriaceae (鞘脂杆菌科)、Sphingobacteriia (鞘脂杆菌纲)、Flavobacteriales、Chitinophagaceae、Sphingobacteriales (鞘脂杆菌目)、Flavobacteriia。10‰坡度下的差异指示物种包括Actinobacteria (放线菌门)、Paenarthrobacter、Micrococcales (微球菌目)、Micrococcaceae (微球菌科)、Actinobacteria (放线菌门)。15‰坡度下的差异指示物种包括Alphaproteobacteria (α变形菌纲)、Proteobacteria (变形菌门)、Terrimonas、Thiotrichaceae (硫发菌科)、Thiotrichales (硫发菌目)、Blastomonas (芽单胞菌属)、Beggiatoa (贝日阿托菌属)、Obscuribacterales、Desulfurellales (硫还原菌目)。5‰、10‰、15‰ 3个坡度下差异贡献最大的指示物种分别是Rhodobacteraceae (红杆菌科)、Actinobacteria (放线菌门)和Alphaproteobacteria (α变形菌纲)。管道敷设坡度的变化可显著影响小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落结构。

    • 2.3.   氮循环和硫循环功能细菌分布特征

  • 排水管道生物膜中的功能细菌主要由氮循环细菌和硫循环细菌组成，一般可以将其分为反硝化细菌、亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫酸盐还原细菌和硫氧化细菌5类[18-20]。本研究利用基于通用引物的高通量测序技术，研究了小管径重力流灰水管道生物膜中功能细菌(属水平)的分布特征(表3)。在本研究中，灰水管道生物膜中存在大量的以Pseudomonas (假单胞菌属) (2.78%±0.56%)和Rhodobacter (红杆菌属) (2.05%±0.94%)为主体的含有反硝化细菌的属，其中，假单胞菌属下的部分种属于好氧反硝化细菌[21]，含有反硝化细菌的属总丰度随着管道坡度的增大而逐渐降低。Nitrospira (硝化螺菌属) (0.13%±0.01%)是本研究中唯一检出的一种硝酸细菌属，以Acidiphilium (嗜酸菌属) (0.04%±0.02%)为主要代表的硫氧化菌属也有检出。在0.01%的检出限下，没有检出属水平的亚硝酸细菌和硫酸盐还原细菌。在排水系统中，亚硝酸细菌的丰度比硝酸细菌的丰度大约低一个数量级[22]，而本研究中灰水管道生物膜的硝酸细菌丰度仅为0.1%左右，因此，亚硝酸细菌在基于通用引物的高通量测序中难以检出。

    在本研究中，基于通用引物未能检出硫酸盐还原菌，说明硫酸盐还原菌在管道生物膜内丰度很低，这可能是由于2个原因：其一，灰水中不含人类粪便，生活污水中的硫酸盐还原菌主要源自人类粪便[23]，本研究采用的灰水引入的硫酸盐还原菌数量较少；其二，在硫酸盐还原菌适宜生长在厌氧环境中，而本研究是好氧管道系统，环境条件不利于硫酸盐还原菌的生长。小管径重力流灰水管道生物膜中存在大量的反硝化菌和一定量的硝化细菌，而在生物膜中的硫酸盐还原菌没有达到检出水平，表明小管径重力流灰水管道具有一定的生物脱氮功能并且H2S积累的风险很低。输送生活污水的小管径重力流管道普遍存在的H2S积累问题，在小管径重力流灰水管道中可以忽略，这一现象有利于小管径灰水管道的安全应用和大范围推广。

    • 2.4.   氮循环功能基因分布特征

  • 基于2.3节中功能细菌的分析结果，小管径重力流灰水管道生物膜中S循环过程(特别是H2S产生过程)基本可以忽略，而反硝化菌广泛存在于自然界中，其属水平的分类尚不完全，并且已确认的反硝化菌属中并非所有的菌种都具备反硝化功能[24]，须从功能基因的角度进行深入分析，因此，本章节探讨氮循环功能基因在不同坡度管道下的分布特征。硝化功能基因的PICRUSt预测丰度如图9所示。由于灰水管道生物膜中基本不含亚硝化细菌，因此，氨单加氧酶基因amoABC以及羟胺氧化酶基因hao基本没有预测丰度，而灰水管道生物膜中一定丰度的硝化细菌携带的亚硝酸盐氧化酶基因nxrA和nxrB预测丰度很高，这明确了灰水管道生物膜中硝化作用的存在。随着管道坡度的增大，亚硝酸盐氧化酶基因nxrA和nxrB的丰度均显著增大，管道生物膜的硝化作用增强，说明大坡度的管道有利于灰水氨氮的去除。反硝化功能基因的PICRUSt预测丰度如图10所示。硝酸盐还原酶基因narGHI和napAB、亚硝酸盐还原酶基因nirK、一氧化氮还原酶基因norBC以及氧化亚氮还原酶基因nosZ在生物膜中均能大量预测到，这说明虽然本研究的灰水管道处于好氧运行状态，但其管道生物膜上仍然可以发生完整的反硝化过程。另外，nosZ的丰度显著小于其他反硝化基因，说明在灰水管道生物膜上发生的反硝化过程主要的终产物是N2O，这与好氧反硝化的终产物相吻合，同时结合管道的好氧状态，可以确定小管径灰水管道生物膜主要发生好氧反硝化过程。在15‰坡度下，灰水管道生物膜的反硝化功能基因总数显著高于另外2个坡度，表明大坡度的管道敷设方案可以加强灰水在管道内的反硝化过程，有利于灰水的生物脱氮过程。综合硝化功能基因和反硝化功能基因的预测结果，采用大坡度(15‰)的灰水管道敷设方案有利于促进灰水在管道输送过程中的生物脱氮作用。根据农村地区的污水管网敷设工程经验，15‰的管道敷设坡度在很多农村地区都具有实际应用的可行性，因此，对于小管径重力流灰水管道，在地质条件和经济条件允许的情况下，应尽量采用大坡度(15‰)的管道敷设方案。

3.   结论

  • 1)小管径重力流灰水管道生物膜中存在大量的细菌、真菌乃至原生动物。其中细菌主要以Proteobacteria (变形菌门)、Actinobacteria (放线菌门)和Bacteroidetes (拟杆菌门)为主，优势菌属为Paenarthrobacte、Ensifer (剑菌属)和Spingopyxis。管道坡度的变化会显著影响灰水管道生物膜细菌群落组成。

    2)管道功能菌主要以反硝化细菌、硝酸细菌和硫氧化细菌为主。基于通用引物的Illumina HiSeq高通量测序没有检出属水平的亚硝酸细菌和硫酸盐还原细菌。小管径重力流灰水管道具有生物脱氮潜力，H2S积累风险低，有利于其推广应用。

    3)灰水管道生物膜中具有完整的反硝化过程功能基因，反硝化过程以好氧过程为主。亚硝化过程功能基因缺失，硝化过程功能基因丰富。大坡度(15‰)的灰水管道敷设方案可以提高氮循环相关功能基因丰度，有利于促进灰水在管道输送过程中的生物脱氮作用，在条件允许的地区，应优先采用大坡度(15‰)的灰水管道设计方案。

参考文献 (24)

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