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近年来，随着我国畜禽养殖业的集约化、规模化发展以及动物疾病复杂性的增加，抗生素多作为饲料添加剂用于预防、治疗动物疾病，促进动物生长。但被摄入体内的抗生素很难为动物机体完全吸收[1]，有很大一部分(30%~90%)随着动物粪便以畜禽养殖废水的形式进入水体环境[2-3]，导致畜禽养殖废水成为水体环境中抗生素污染的主要来源之一[4]。畜禽养殖废水中的抗生素进入环境中会发生非生物降解(光解、水解和氧化降解等)和生物降解(植物或微生物降解)反应。四环素类抗生素(tetracyclines，TCs)在中国及世界畜禽养殖业中的使用量均为最大[5]。猪场等养殖废水中的TCs残留量可达mg·L−1级别，在畜禽养殖排污口及周边水体则为几到几十μg·L−1级[6]。目前，废水中四环素类抗生素的去除手段主要分为以物化过程为主的常规处理工艺[7](如混凝、沉淀、消毒、过滤等)和深度处理工艺(如吸附、高级氧化、离子交换、生物处理和膜技术等)[8]。相比其他处理方法，微生物处理法成本低，易控制，条件简单，适用广，是去除废水中TCs的理想措施。TCs具有生物抑制作用，所以可生化性较差。零价铁(zero valence iron，ZVI)既是微生物的营养元素和高效催化剂，又是一种酶的激活剂[9]，能提高有机物污染物的可生化性。A/O-MBR工艺易于延长污泥停留时间(sludge retention time，SRT)，富集硝化细菌，提高污泥浓度，具有占地面积小、抗冲击负荷强[10]、对有毒污染物去除效率高等优点，因此，适用于畜禽养殖废水中TCs的去除。
本研究主要分析了盐酸四环素(tetracycline hydrochloride，TC-HCl)的降解特性，为废水中TC-HCl的归趋和环境行为的研究提供参考；同时利用零价铁与不锈钢网膜构成的原电池与传统A/O-MBR工艺相耦合，探究该工艺在畜禽养殖废水中TC-HCl净化处理中的适用性和优势，为畜禽养殖废水中TCs处理工艺的选择提供参考。
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实验所用TC-HCl为阿拉丁试剂，纯度为96%，分子式为C22H25ClN2O8，相对分子质量为480.90，熔点为220~223 ℃，大鼠口服实验的半致死量为6 443 mg·kg−1。
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实验采用自主设计的原电池耦合A/O-MBR(见图1)，反应器总体积为46 cm×28 cm×70 cm，好氧池与厌氧池的体积比为2∶1。厌氧池内置1块3 mm×200 mm×300 mm的铁片，底部填充有煤质柱状活性炭；好氧池内共置有4块有效膜面积为22.7 cm×17.5 cm的不锈钢网膜组件并填充以直径为15 mm的星型悬浮填料。铁片与不锈钢网膜间通过外接100 Ω电阻形成闭合回路。系统为底部进水，连续曝气，出水经不锈钢膜件过滤后抽出。实验通过投加蔗糖、氯化铵、磷酸二氢钾和盐酸四环素对畜禽养殖废水进行模拟，并维持进水COD、TN和TP分别为500、25和5 mg·L−1左右。实验混合液回流比为90%，水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)为24 h，跨膜压差(transmembrane pressure，TMP)达到0.03 MPa时进行膜清洗。系统厌氧池(A池)与好氧池(O池)的电导率分别为826 μS·cm−1和658 μS·cm−1，开路电压为0.309 V，平均输出电压为0.164 V，功率密度为0.011 W·m−3。
构成原电池反应的实验原理如图2所示，厌氧阳极室在零价铁的氧化作用及微生物的产电作用下形成电子，好氧阴极室的氧气作为电子受体发生氧化还原反应。不锈钢膜件得电子后带负电，污染物(多带负电)不易吸附，与此同时，氧还原还可经二电子途径生成H2O2，原位去除附着在膜面上的污染物[11]，有利于延缓膜污染，降低运行成本。
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COD、NH3-N、TP、浊度的测定参考《水和废水监测分析方法》[12]。采用紫外可见分光光度法测定TC-HCl含量，检测方法准确性验证如下。
实验梯度配制不同质量浓度的TC-HCl标准溶液，测定356 nm下的吸光度，绘制标准工作曲线(见图3)，对其进行线性拟合，R2为0.999 4，线性良好。
在不含抗生素的系统出水中，添加不同量的TC-HCl，进行回收率实验(见表1)，实验结果显示，运用紫外分光光度法测定TC-HCl的平均回收率为97.45%~123.00%，相对标准偏差(n=6)为0.18%~4.15%。
以上结果表明，废水中可能含有的复杂物质成分对TC-HCl的检测无明显影响，可运用紫外分光光度法测定废水中的TC-HCl。
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废水中的抗生素主要通过水解、光解以及微生物吸附降解等作用从水相中去除[13]。实验在250 mL的锥形瓶中进行，考察不同水质、温度、初始质量浓度和光照强度下TC-HCl的降解特性。以不含抗生素的模拟废水为溶剂，配置不同浓度的抗生素废水，密封置于恒温培养箱中，检测0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60 h时的TC-HCl含量。
1)废水水质对TC-HCl降解效果的影响。当TC-HCl的初始质量浓度为30 mg·L−1时，在28 ℃下，恒温避光培养60 h后，考察废水水质对TC-HCl降解率的影响，结果如图4所示。不同水质下的TC-HCl降解速率差异显著(P<0.01)，纯水中的降解度明显较低，最终降解率为6.20%。因纯水中不含微生物和营养元素，故TC-HCl主要发生水解反应；畜禽养殖废水中含有微生物和营养元素，TC-HCl可通过水解和微生物吸附分解作用从水相中去除，降解速率和降解率提高，最终降解率为36.95%。废水中的物质组成会影响TC-HCl的降解特性，微生物的吸附降解作用是水体中TC-HCl降解的重要途径。SELVAM等[14]研究发现，添加外源微生物，提高微生物活性可促进抗生素降解。许静等[15]研究土壤中5种磺胺类药物的降解情况发现，加入的外源微生物的吸附、降解作用是磺胺类药物在土壤中降解的主要途径。
2)环境温度对TC-HCl降解效果的影响。抗生素废水中的优势菌群可通过水解、乙酰转化和氧化还原反应降解TCs[16]，不同环境温度下微生物的活性不同。当畜禽养殖废水中的TC-HCl为30 mg·L−1时，分别于18、28、38、48 ℃下避光恒温培养60 h后，TC-HCl的降解情况如图5所示。18 ℃时，TC-HCl降解较为缓慢，降解率为29.07%。温度上升，微生物活性增强，对抗生素的吸附转化能力增强，TC-HCl的降解速率和降解率增大。温度是影响微生物生长发育的重要生态因子，根据SHELEFORD耐性定律[17]可知，任何一个生态因子对生物都存在最大和最小临界阈。在稳态条件下，当这种生态因子超过某种生物的耐受限度时，该生物就会受到损伤或无法生存[17]。继续升高温度至48 ℃，TC-HCl的降解速率和降解率下降，最终降解率为24.55%。由此可见，微生物对TC-HCl的吸附降解作用适于在较低温度下进行，TC-HCl优势菌群的最适生长温度应该为28~38 ℃。徐伊婷等[18]研究发现，经多次富集培养和筛选后得到的7株具四环素降解力的菌株，它们对四环素的降解率随着环境温度的增大，表现出缓慢上升(20~30 ℃)-稳定(30~35 ℃)-急速下降(35~40 ℃)的趋势。吴学玲等[19]在研究筛选出的1株四环素降解菌(拉乌尔菌属)降解性受温度的影响时发现，不同温度下，菌株的降解效能表现为25 ℃>30 ℃>35 ℃>20 ℃>40 ℃，当温度为25~35 ℃时，菌株降解性能较优。
3)初始质量浓度对TC-HCl降解效果的影响。TC-HCl具有生物抑制性，不同初始质量浓度下的微生物活性不同。当畜禽养殖废水中TC-HCl的初始质量浓度分别为10、15、30、60 mg·L−1时，TC-HCl的降解情况如图6所示。在28 ℃避光恒温密封条件下，TC-HCl的降解率随着降解时间的延长而增大，前24 h降解最快，60 h后的降解率分别为64.15%、41.14%、36.95%和22.60%。当初始质量浓度为10 mg·L−1时，TC-HCl的降解率最大，浓度增大，TC-HCl的降解率和降解速率下降。生物降解和污泥吸附是TCs生物处理法的主要去除途径[20]，TC-HCl会抑制厌氧微生物活性且浓度越高，抑制作用越强[21]。所以，运用微生物修复法处理废水中的TC-HCl时，应注意控制废水中TC-HCl的初始质量浓度。
4)光照对TC-HCl降解效果的影响。光解是抗生素降解的途径之一。当光照强度分别为0%、20%、40%、60%时，模拟废水中TC-HCl的初始质量浓度为30 mg·L−1，在28 ℃下，恒温培养60 h，实验结果如图7所示。避光条件下，TC-HCl的降解率最低，为36.95%。当光照强度分别为20%、40%、60%时，TC-HCl降解率分别为95.66%、98.71%、78.09%。可见20%~40%的光照条件可以大幅促进废水中TC-HCl的降解，继续增大光照强度至60%，促进作用减弱。结合纯水中30 mg·L−1的TC-HCl在0%和60%光照下浓度的变化情况可知，在纯水中，光照并不影响TC-HCl的降解情况。这可能是因为，实验所用光照培养箱中的灯管为三基色直管荧光灯，培养对象所能吸收到的光波长多为≥400 nm的可见光，而纯水中的TC-HCl对大于400 nm的光几乎没有吸收，所以光照对纯水中TC-HCl的稳定性没有明显作用。在废水中，物质组成复杂，很多天然水体成分(如
NO−3 、Fe2+、Cl−、CO2−3 、SO2−4 、Ca2+、Me2+和可溶性有机质(DOM)等)对抗生素的直接与间接光解都有直接影响，如其中的DOM可通过滤光作用、吸附作用和DOM光致活性物种的产生影响抗生素降解；Ca2+和Me2+会与抗生素络合，从而影响其降解；Cl−可通过促进抗生素自敏化产生1O2，促进抗生素光解；水体中的不同物质成分对不同类别抗生素的光解影响具有很大的差异，这种差异与抗生素的结构、光解途径及产生的活性物种相关[22]。因此，模拟废水中TC-HCl的降解受光照影响较大。废水中抗生素的降解过程多符合一级反应动力学。计算方法[23-24]如式(1)所示。
式中：Ct为t时刻废水中的抗生素浓度，mg·L−1；C0为初始抗生素浓度，mg·L−1；K为反应速率常数，t为反应时间，h。
将TC-HCl的降解过程进行拟合，拟合效果较好(见表2)。避光条件下，TC-HCl的半衰期仅为6.4 h，可在最短的时间内达到降解平衡，但平衡时的浓度最高，降解率最小。在不同光照条件下，TC-HCl的半衰期随光照强度的增大，先增大后减小，平衡时的浓度先减小后增大。实验过程中发现，模拟废水中的TC-HCl在20%和40%光照下，培养一段时间后，溶液呈透亮的玫红色，60%光照下的溶液呈混浊的浅红色，0%光照下的溶液则为白色浊状。由此可见，在不同光照强度下，TC-HCl的降解机理有所不同；20%~40%光照下，DOM的滤光和吸附作用较弱，主要通过光致活性物种的产生影响TC-HCl的降解，
NO−3 、Fe2+、Cl−、CO2−3 等则可通过影响光解作用来影响TC-HCl的降解；60%光照下的溶液浊度随培养时间的延长而增大，DOM吸附作用增大的同时，滤光作用也增大，光照的促进作用下降甚至消失，平衡浓度较高。综上可知，畜禽养殖废水中的TC-HCl可通过微生物处理法去除。废水中TC-HCl降解的最适温度为28~38 ℃，最适光照强度为20%~40%。运用生物修复法处理TC-HCl时应注意控制TC-HCl的初始质量浓度。
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1) TC-HCl对原电池耦合A/O-MBR工艺运行稳定性的影响。实验利用原电池耦合A/O-MBR工艺去除含TC-HCl的畜禽养殖废水，考察TC-HCl初始质量浓度分别为0、2.50、5.00、7.50、10.00 mg·L−1时系统对COD、NH3-N和TP的24 h去除率，分析TC-HCl对系统运行稳定性的影响。实验结果如图8所示，当进水中不含TC-HCl时，系统的COD、NH3-N及TP去除率分别为99.87%(出水COD为0.776 mg·L−1)、80.85%(出水NH3-N浓度4.767 mg·L−1)和90.46%(出水TP浓度0.474 mg·L−1)，去除效果良好，出水水质符合《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A的排放标准。在进水中添加TC-HCl后，系统NH3-N和TP的去除率与对照组间具有显著差异(P<0.01)。进水TC-HCl浓度增大，系统NH3-N去除率缓缓下降，当TC-HCl为10 mg·L−1时，系统NH3-N去除率最低(67.95%)。系统运行前期，TP去除率受TC-HCl的影响最大，TC-HCl为7.5 mg·L−1时，TP去除率达到最低(71.40%)，TC-HCl浓度为10.0 mg·L−1时，TP去除率为76.04%，可见系统对废水中的TC-HCl具有一定的适应性。当TC-HCl浓度≤5.0 mg·L−1时，增大TC-HCl浓度，系统的COD去除率无显著性差异(P1=0.011，P2=0.117)，进一步增大TC-HCl浓度，系统COD去除率明显下降，一段时间后又能维持新的稳定(TC-HCl浓度为7.5 mg·L−1和10.0 mg·L−1时，COD去除率无显著性差异(P=0.012>0.01)。
综上可知，原电池耦合A/O-MBR工艺具有良好的去污效能，添加TC-HCl对系统脱氮除磷作用具有显著抑制性，对COD去除率的影响较小。余忻[25]研究发现，抗生素废水的生物毒性与COD、NH3-N的Spearman相关性显著。李娟英等[26]研究TCs对硝化污泥的抑制作用发现，TCs会抑制硝化污泥表面保护膜的形成，使活性污泥细胞破裂、解体，从而导致硝化速率迅速降低。胡哲太等[27]研究表明，土霉素容易抑制好氧吸磷作用(类属TCs)，对生物除磷具有显著的抑制作用。因为生物脱氮除磷过程繁复，涉及氨氧化细菌、硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌以及释磷菌和聚磷菌等一系列微生物[28]，这些微生物对TC-HCl的耐受性都会影响系统脱氮除磷效率的受抑制程度。所以，系统脱氮除磷作用受TC-HCl的影响较大。
2)原电池耦合A/O-MBR对TC-HCl的去除效能。活性污泥对疏水性有机物TCs具有良好的吸附作用，是TCs在污泥中迁移转化和从污水中去除的主要方式，污泥吸附性能受初始质量浓度影响[29]。由图9可知，系统对初始质量浓度≤10.00 mg·L−1的TC-HCl的去除率均高于90%，去除效果良好。TC-HCl浓度由2.50 mg·L−1上升至5.00 mg·L−1时，TC-HCl去除率下降了3.42%，进一步增大浓度，TC-HCl去除率缓缓上升。TC-HCl浓度由7.50 mg·L−1上升至10.00 mg·L−1时，TC-HCl去除率无显著性差异(P=0.109>0.01)。在原电池耦合A/O-MBR工艺中，TC-HCl的去除主要通过活性污泥与活性炭的物理吸附作用和微生物的降解作用实现，在一定范围内，TC-HCl越大，活性污泥与活性炭的平衡吸附量越大。姜忠帅[30]发现，增大四环素浓度，可提高载铁活性炭对四环素的平衡吸附量，但增大到一定程度后，活性炭的平衡吸附量基本稳定。刘春燕等[31]的研究则表明，TCs初始浓度增大，活性污泥对TCs的吸附量增大，吸附速率降低，出水浓度增大。所以，增大TC-HCl浓度，一定程度上有利于活性炭和微生物的物理吸附，但四环素对活性污泥脱氢酶的产生具有明显的抑制作用，浓度越大，生物抑制作用越强[32]，微生物降解作用减弱。可见，当TC-HCl浓度≥5.00 mg·L−1时，物理吸附在TC-HCl的去除中起主导作用。
实验考察了不同HRT下系统对TC-HCl的去除情况。由图10可知，当TC-HCl的初始质量浓度为10.00 mg·L−1时，系统对TC-HCl的15 min去除率可达92.02%，延长系统HRT，TC-HCl去除率在95%左右。TC-HCl在污水生物处理中的吸附作用显著，可通过表面络合、静电吸附和离子交换作用被活性污泥所吸附[33]，从而从水相中去除。进水前期，活性炭和活性污泥中的吸附位点多，吸附速率快，随后吸附逐渐饱和，吸附速率趋近为零，吸附总量趋于平稳。
3)各工艺在系统运行过程中的效用。原电池耦合A/O-MBR工艺是糅合了A/O工艺、MBR工艺和电化学作用的新型集成工艺，为探究不同组合工艺的净化效能，实验维持TC-HCl的初始质量浓度为10 mg·L−1左右，连续运行6 d，测定开/闭路下A/O-MBR工艺和传统A/O工艺下系统进出水中主要污染物的含量，分析原电池耦合A/O-MBR工艺的运行优势。由图11可知，传统A/O工艺对COD和TC-HCl具有较好的去除效果，但氨氮和总磷去除率仅为53.82%和35.80%。耦合了MBR后的A/O工艺脱氮除磷效能分别提升至67.45%和80.93%。因为A/O工艺与MBR耦合之后，在膜的截留作用下，可实现SRT和HRT的分离，延长污泥泥龄，富集世代周期较长的硝化细菌和亚硝化细菌，增强硝化作用[34]，提高氨氮去除率。而测定水中总磷时取的是包括悬浮物的混合水样[12]，实验中A/O工艺的出水浊度为58.66 NTU，经A/O-MBR工艺膜滤作用后的出水浊度为32.90 NTU，有效去除了部分悬浮物，降低了出水TP浓度，提高了出水水质。开/闭路条件下的系统去污效能无显著性差异(P>0.01)，但传统A/O-MBR工艺在运行过程中膜污染问题严重，运行成本较高，运用受限[35-36]，将A/O-MBR工艺与原电池相耦合用于延缓膜污染具有一定的理论支撑。
为探究耦合原电池对A/O-MBR工艺膜污染的影响，实验通过交替开/闭路的方式运行A/O-MBR工艺，由运行过程中跨膜压差(TMP)的变化，判断膜件的污染状况。由图12中TMP的变化趋势可知，系统在开路运行时，TMP的增长速度较快，在17 d左右，就可达到0.03 MPa。在闭路运行时，膜件的污染周期延长至24 d左右。根据膜污染的3阶段理论，膜污染过程分为初始污染、缓慢污染和快速污染3个阶段[37]。系统开/闭路下的TMP变化差异主要体现在前2个阶段。在闭路时，膜件因耦合原电池的作用表面带负电，与同样带负电荷的污染物间存在静电排斥作用，在前2个污染阶段，微生物不易附着在膜面上，有利于延缓膜污染[38]。随着系统的运行，微生物不断附着在膜面上，耦合原电池不再影响膜污染状况，TMP值迅速增大。
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1)当环境温度为28~38 ℃、光照强度为20~40%时，废水中的TC-HCl可通过水解、光解及微生物吸附降解等作用从水相中去除；微生物的吸附分解作用是去除水体中TC-HCl的重要途径，可应用生物处理法去除畜禽养殖废水中的TC-HCl。
2)当原电池耦合A/O-MBR工艺的进水COD、TN和TP分别为500、25、5 mg·L−1时，系统出水水质可达《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A的标准；在进水中添加TC-HCl后，系统的脱氮除磷作用明显受抑制，但经短期驯化后可逐步适应；当TC-HCl的初始质量浓度为10.00 mg·L−1时，系统对TC-HCl的15 min去除率即可达92.02%，去除效果良好。
3) A/O-MBR工艺可明显强化传统A/O工艺的脱氮除磷效能；耦合原电池后，A/O-MBR工艺的膜件与污染物之间存在静电排斥力，有效延缓了膜污染，膜污染周期可提升至24 d左右。
原电池耦合A/O-MBR工艺去除畜禽养殖废水中的盐酸四环素
Removing tetracycline hydrochloride from livestock and poultry breeding wastewater by the coupling process of galvanic cell and A/O-MBR
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摘要: 以畜禽养殖废水中的盐酸四环素(TC-HCl)为目标污染物，研究其在水环境中的降解特性，利用原电池与传统A/O-MBR工艺相耦合，去除水中的TC-HCl，并考察其效果。结果表明：废水中的物质组成、环境温度、TC-HCl初始质量浓度以及光照强度均会影响水体中TC-HCl的降解情况；TC-HCl的初始质量浓度为30 mg·L−1，在28 ℃、40%光照下恒温培养60 h后的降解率为98.70%，降解过程符合一级反应动力学(R2=0.991)，半衰期为10.7 h。原电池耦合A/O-MBR工艺的进水COD、NH3-N和TP分别为500、25、5 mg·L−1时，系统出水水质可达《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A标准；对10.00 mg·L−1的TC-HCl，系统15 min去除率可达92.02%。A/O-MBR工艺可明显强化传统A/O工艺的脱氮除磷效能；耦合原电池可将膜污染周期提升至24 d左右，有效延缓膜污染。
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关键词:
- 畜禽养殖废水 /
- 盐酸四环素 /
- 降解特性 /
- 原电池耦合A/O-MBR工艺
Abstract: Tetracycline hydrochloride (TC-HCl), one of the most detected antibiotics in livestock and poultry breeding wastewater, was taken as the target pollutant to study its degradation characteristics in the water environment. The coupling process of galvanic cell and the traditional A/O-MBR was used to remove TC-HCl from the simulated wastewater. The results showed that wastewater composition, ambient temperature, the initial mass concentration of TC-HCl and the light intensity affected on the degradation of TC-HCl in the wastewater. The degradation rate of TC-HCl with initial concentration of 30 mg·L−1 was 98.70% under 60 h thermostatic incubation conditions at 28 ℃ and 40% illumination. The degradation process followed the first-order reaction kinetics (R2=0.991), and the half-life was 10.7 h. When the influent concentration of COD, NH3-N and TP were 500, 25, 5 mg·L−1, respectively, the effluent water quality of the coupling process could meet the first level A criteria specified in Discharge Standard of Pollutants for Municipal Wastewater Treatment Plants (GB 18918-2002). After 15min treatment by the coupling process, the removal rate of TC-HCl with initial concentration of 10 mg·L−1 could reach 92.02%. The A/O-MBR process could significantly enhanced the nitrogen and phosphorus removal efficiency of the traditional A/O process. The coupled galvanic cell could extended the membrane pollution cycle to 24 d, which could effectively delay membrane fouling. -
石油烃 (PHC)是目前环境中广泛存在的有机污染物，是多种烃类 (正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃)和少量其他有机物的混合物[1-2]。PHC进入土壤后，不仅会破坏土壤结构，影响其通气性，而且石油烃进入食物链后会对人体产生不可逆性的致癌、致畸、致突变的三致作用[2]。因此，如何经济、快速、有效地去除土壤中的石油污染物成为研究的重点[3]。微生物修复技术因成本低、环境友好等优势成为目前处理处置PHC污染土壤的热点方法[4-5]。
PHC微生物修复技术是以PHC作为底物，利用微生物活动过程中发生的一系列生化反应所进行的代谢降解[6-7]。微生物修复技术在降解有害物质过程中不会破坏动植物生长的土壤环境，并且可以有效地去除土壤中的有机污染物[8]。该技术根据反应过程中是否需氧气可分为好氧修复和缺氧修复[9]。由于缺氧条件下 PHC降解速率比好氧条件下的低 (1-2个数量级)，目前利用微生物降解PHC的现场和室内研究多集中在好氧条件下[10-11]。在好氧条件下土著微生物利用氧气作为电子受体降解环境中的污染物，能够在较短的时间内达到较高的去除效率 [12]。
然而由于地下储油罐或输油管线的渗泄漏、土壤表层污染物的向下迁移等，存在着大量被PHC污染的深层土壤[12]。土壤中氧气浓度会随土壤深度的增加而降低，即使深层土壤中存在一定量的氧气也会很快被微生物好氧呼吸消耗殆尽。因此PHC污染的深层土壤往往处于缺氧条件[13]。与好氧微生物降解不同，缺氧微生物降解过程中不需要补充氧气/空气，且能够适应复杂的环境条件，并且修复成本相对较低[14]。因此，PHC的缺氧微生物降解具有明显优势。尽管如此，目前PHC缺氧微生物降解规律尚不清楚。本研究以PHC污染的深层土壤为对象，探索不同种类和质量分数的电子受体对土壤中土著微生物丰度、群落结构以及PHC缺氧降解的影响规律。研究结果可为深层PHC污染土壤修复技术的研发提供技术支持。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用土壤来自华北地区某加油站地下深度2~5 m处。采集来的土壤样品现场过2 mm 筛并充分混合后装于自封袋中，保存于盛有冰袋的保温箱中快速运回实验室，采用四分法混匀备用。本研究所用土壤样品理化性质：pH为8.41；含水率为2.23%；TOC为1.44%；总铁为2.16%；硝酸根、硫酸根离子质量分数分别为36.60、133.42 mg·kg−1；土壤中黏土61.91%，粉土37.98%，砂土0.11%。实验所用硝酸钠 (NaNO3)、无水硫酸钠 (Na2SO4)均为分析纯；正己烷 (C6H14)、二氯甲烷 (CH2Cl2)均为色谱纯；高纯氮气 (N2，99.999%)；石油烃 (C10~C40)标准溶液 (1 mg∙L−1，美国AccuStandard公司)。
本研究土壤中PHC质量分数见表1。由于原土中C31~C40组分质量分数低 (仅占C10~C40的1.6%)，在后续实验结果中对此组分不做进一步讨论。本研究主要探讨碳链长度为C1 (C10~C16)、C2 (C17~C23)、C3 (C24~C30)组分的降解规律。本研究原土中石油烃污染物以C2组分为主，其次为C1组分，C3组分占比最少。与原土 (YT)相比，灭菌土 (YTS)中C1组分的损失率最大 (35.36%)，其次是C2组分 (33.65%)，C3组分损失率最小 (17.33%)。
表 1 土壤中PHC质量分数Table 1. Mass fraction of PHC in soil组名 碳原子数 原土PHC质量分数/ (mg·kg−1) 各PHC组分占原土中PHC质量分数的比例/% 灭菌土PHC质量分数/ (mg·kg−1) 各PHC组分占灭菌土中PHC质量分数的比例/% C1 C10~C16 184.68±5.21 20.72 119.37±1.52 19.86 C2 C17~C23 626.99±14.69 70.36 416.02±6.55 69.21 C3 C24~C30 79.51±2.53 8.92 65.73±2.84 10.93 C4 C31~C40 14.53±2.08 — 13.25±1.97 — ΣPHC C10~C30 891.18±23.86 — 601.12±13.25 — | Show Table
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1.2 电子受体对深层土壤中PHC缺氧微生物降解影响
本实验以PHC污染的深层土壤为对象，考察不同质量分数 (500、1 500、5 000 mg·kg−1)的硫酸盐、硝酸盐电子受体或混合电子受体对PHC缺氧降解的影响。将15g PHC污染土壤置于50 mL血清瓶中，依次加入6 mL去离子水、硝酸盐、硫酸盐溶液或硝酸盐硫酸盐混合溶液，保持水土比为0.4∶1，土壤中电子受体质量分数为0、500、1 500、5 000 mg·kg−1。将电子受体处理组记作LS、MS、HS、LN、MN、HN、HNS。其中L、M、N代表电子受体质量分数，分别为500、1 500、5 000 mg·kg−1；S、N、NS代表电子受体种类，分别为硫酸盐、硝酸盐、硫酸盐硝酸盐混合电子受体。另设置未添加电子受体的灭菌处理 (MJ)和未灭菌 (CK)处理作为对照。所有添加电子受体和未添加电子受体的处理组均重复9次 (共计9个血清瓶)。待土壤样品准备完成后，将配有专用铝盖的血清瓶转移到密闭手套箱中完成缺氧处理后密封[14]。操作步骤：在保证手套箱密闭的情况下，启动真空泵将手套箱内部空气抽出，待压力表指针示数稳定在0.1 MPa以下时，关闭真空泵并维持手套箱内真空状态30 min后再向箱体内缓缓充入高纯氮气，待压力表指针示数略高于大气压时，停止充入氮气并维持手套箱内充满氮气状态30 min。重复上述过程3次后，在缺氧手套箱内将血清瓶压上铝盖后转移至30 ℃恒温培养箱中避光培养。本研究中去离子水、电子受体溶液以及土壤样品灭菌处理操作参照文献报道方法进行[15]。在缺氧培养30、90、150 d后进行破坏性取样 (每次随机取出3个血清瓶)并做好时间标记。所有灭菌和未灭菌处理组在30、90、150 d检测土壤中PHC质量分数，未灭菌处理组在30、90、150 d测试微生物指标。
1.3 PHC的提取与测定
土壤中PHC的提取采用超声萃取法[16]。称取2 g干燥土壤样品放入40 mL聚四氟乙烯管中，分别加入正己烷和二氯甲烷各20 mL的混合溶剂进行超声萃取30 min，高速 (5 000 r·min−1)离心10 min，此过程重复3次。将离心所得上清液过滤后通过旋转蒸发仪和氮吹仪浓缩至1 mL，转移至2 ml棕色玻璃瓶。采用气相色谱仪 (GC，Agilent 7890B型)进行PHC的浓度测定，利用外标法峰面积进行定量分析。气相色谱柱型号为HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。测定条件：进样口温度300 ℃，不分流进样，进样量1.0 μL；柱箱初始温度为50 ℃，保持2 min，以40 ℃·min−1升至230 ℃，再以20 ℃·min−1升至320 ℃，保持20 min；气体流量为高纯氮气1.5 mL·min−1，氢气30 mL·min−1，空气300 mL·min−1。
1.4 微生物指标分析方法
土壤DNA采用MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit试剂盒提取，细菌丰度的测定采用实时定量PCR扩增技术[17]。以16S rDNA作为靶基因对细菌丰度进行检测。细菌引物为338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')，片段大小为420。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环。完成上述操作后，将待测样品放在荧光定量PCR仪中进行反应，实时定量PCR扩增效率为92.20%。
微生物群落结构分析测试参照FREY等[18]的方法，使用Fastp软件对原始测序序列进行质控，采用Flash软件进行拼接 (最小重叠长度为10 bp，重叠区允许的最大错配比为0.2)。使用UPARSE软件在97%的相似度对序列进行OTU聚类分析。采用RDP classifier分类器对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA数据库进行物种注释分析 (比对阈值为80%)，统计各样品的细菌群落组成。
2. 结果与讨论
2.1 电子受体对土壤中细菌丰度和群落结构的影响
不同种类和质量分数的电子受体对土壤中细菌丰度的影响随时间变化规律如图1所示。PHC污染原土 (YT)中细菌基因拷贝数lg值为6.28 g−1，经过30、90、150 d缺氧培养后，对照组 (CK)土壤中细菌基因总量分别增加了0.10、0.21、0.30 g−1 (图1)。表明在不加入电子受体进行缺氧培养的情况下，土壤中的细菌丰度随着培养时间的增加有所增长，但增长速度缓慢。添加不同种类和质量分数的电子受体缺氧培养150 d后，土壤中细菌基因总量与对照组 (CK)相比增加了0.38~0.70个数量级，表明缺氧条件下加入电子受体促进了土壤中细菌丰度增长 (图1)。土壤中加入不同种类和质量分数的电子受体缺氧培养30、90、150 d后，土壤中细菌总量与第0 d (YT)相比分别增加了0.12~0.39、0.30~0.49、0.67~1.00个数量级，表明添加电子受体后，土壤中细菌丰度随着培养时间的增加而增长 (p<0.05)。
图 1 不同电子受体条件下土壤中细菌丰度变化Figure 1. Variation of bacterial abundance in soil under different electron acceptor conditions土壤中加入不同种类和质量分数电子受体缺氧培养150 d后，硫酸盐处理组LS、MS、HS土壤中细菌基因总量与对照组 (CK)相比增加了0.38、0.57、0.58个数量级；硝酸盐处理组LN、MN、HN土壤中细菌基因总量与对照组 (CK)相比增加了0.47、0.57、0.70个量级；混合电子受体组HNS土壤中细菌基因总量与对照组 (CK)相比增加了0.60个数量级 (图1)。总的来看，PHC污染土壤中添加电子受体种类相同时，细菌丰度随电子受体质量分数的增加而增加；添加电子受体质量分数相同时，细菌丰度从高到底排序为硝酸盐处理组>混合电子受体处理组>硫酸盐处理组。
添加不同种类和质量分数电子受体的土壤微生物在门水平上的群落结构及其变化如图2所示。与原土 (YT)中的优势菌种主要为变形菌门 (Proteobacteria, 35.59%)、放线菌门 (Actinobacteria, 31.80%)和厚壁菌门 (Firmicutes, 24.69%)。向PHC污染土壤中加入不同种类和质量分数的电子受体缺氧培养30、90 d和150 d后，与相同培养时间的对照组 (CK)土壤中细菌群落结构相比，经过30、90、150 d缺氧培养的电子受体处理组土壤中放线菌门的相对丰度均有所降低，厚壁菌门的相对丰度均有所增加 (150 d的HS处理组除外)，变形菌门相对丰度无明显变化。对土壤中原土 (YT)和经过150 d缺氧培养的对照组 (CK)、电子受体处理组门水平细菌群落结构进行主坐标分析 (Principal Co-ordinates Analysis, PCoA)(图3)。结果表明，原土 (YT)与对照组 (CK)、电子受体处理组之间土壤中细菌群落结构组成在门水平存在明显差异；而对照组 (CK)和电子受体处理组之间土壤中细菌群落结构组成在门水平相似 (图3)。
图 2 不同电子受体条件下土壤中细菌群落结构变化 (门水平)Figure 2. Changes of bacterial community structure in soil under different electron acceptor conditions (phylum level)
图 3 不同电子受体条件下土壤中细菌群落结构的PCoA分析 (门水平)Figure 3. PCoA analysis of bacterial community structure in soil under different electron acceptor conditions(phylum level)缺氧条件下PHC降解菌主要属于变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)[19-20]。本研究中，缺氧培养150 d后对照组 (CK)中 Proteobacteria和Firmicute基因拷贝数总量lg值为6.42g−1，与第0 d相比分别增加了0.36个数量级。缺氧培养150 d后硫酸盐处理组 (LS、MS、HS)和硝酸盐处理组 (LN、MN、HN)土壤中Firmicutes和Proteobacteria的总数量lgN较对照组 (CK)分别增加了0.39、0.53、0.58个数量级和0.47、0.58、0.70个数量级；HNS处理土壤中Firmicutes和Proteobacteria的总数量lgN较对照组 (CK)分别增加了0.60个数量级。结果表明，当土壤中加入电子受体种类相同时，土壤中PHC潜在降解菌随着电子受体的质量分数增加而增加；加入的电子受体质量分数相同时，土壤中PHC潜在降解菌丰度从高到低分别为硝酸盐、混合电子受体、硫酸盐。
2.2 电子受体对土壤中ΣPHC缺氧降解的影响
缺氧培养150 d后，灭菌处理 (MJ)和未灭菌处理 (CK)土壤中ΣPHC和C1、C2、C3降解率变化如图4所示。在灭菌处理中，ΣPHC和C1、C2、C3降解率均未超过8.85%，未明显观察到PHC的去除 (p<0.05)；而未灭菌处理中，ΣPHC和C1、C2、C3组分有较好的去除效果 (p<0.05)(图4)，降解率与原土 (YT)相比增加了11.25%~18.48%，表明PHC在缺氧培养150 d内发生了生物降解。有机污染场地土壤中往往存在着潜在降解菌[20]。本研究原土 (YT)中潜在降解菌 (Proteobacteria和Firmicute)基因拷贝数lg值为6.06 g−1。此外，硝酸盐和硫酸盐可作为缺氧条件下有机污染物微生物降解的电子受体[21]。本研究土壤中硝酸盐、硫酸盐的质量分数分别为36.60 mg·kg−1和133.42 mg·kg−1。由于所用土壤存在潜在降解菌和电子受体，缺氧培养150 d的对照处理组中发生了PHC缺氧降解。
图 4 不同电子受体条件下土壤中ΣPHC和C1、C2、C3残留率变化Figure 4. Changes in residual rates of ΣPHC and C1, C2, C3 in soil under different electron acceptor conditions如图4所示，添加不同种类和质量分数的电子受体缺氧培养150 d后，土壤中ΣPHC和C1、C2、C3组分降解率与CK相比分别增加了3.91%~21.50%和0.76%~29.67%、4.44%~19.01%、7.00%~22.14%，明显促进了PHC的缺氧降解 (p<0.05)。从图1和图2中可以看出向PHC污染深层土壤中加入硫酸盐、硝酸盐溶液缺氧培养150 d后，土壤中潜在降解菌总数量lgN与CK相比增加了0.39~0.58、0.47~0.70个数量级，促进了土壤中土著微生物的生长，土壤中PHC潜在降解菌随着电子受体的质量分数增加而增加。进一步探究土壤中PHC降解率与微生物之间的关系，发现ΣPHC和C1、C2、C3组分的降解率均随土壤中细菌丰度和潜在PHC降解菌丰度增加而增加，PHC降解率与土壤中细菌丰度/潜在PHC降解菌丰度存在正相关关系 (图5)。
图 5 不同电子受体条件下土壤中细菌、潜在PHC降解菌丰度与ΣPHC、C1、C2和C3组分降解率关系Figure 5. Relationship between abundance of bacteria and potential PHC-degrading bacteria in soil under different electron acceptor conditions and biodegradation rates of ΣPHC, C1, C2 and C3 components本研究中，缺氧培养150 d后硫酸盐处理组 (LS、MS、HS)和硝酸盐处理组 (LN、MN、HN)土壤中ΣPHC组分降解率较CK分别增加了3.91%、7.61%、13.89%和7.13%、11.28%、21.50%，使C1-C3组分降解率较CK分别增加了0.76%~7.00% (LS)、6.27%~c13.46% (MS)、11.59%~19.53% (HS)和4.56%~7.41% (LN)、13.68%~13.92% (MN)、19.01%~29.67% (LN)(图4)；HNS处理土壤中ΣPHC和C1、C2、C3组分的降解率较CK分别增加了11.59%和21.69%、14.19%、20.55% (图4)。此结果表明，添加相同种类的电子受体促进了土壤中ΣPHC和C1、C2、C3组分的缺氧生物降解，降解率随着电子受体的质量分数增加而增加；添加质量分数相同的不同种类电子受体土壤中ΣPHC和C1、C2、C3组分的降解率由高到低分别为硝酸盐、混合电子受体、硫酸盐。
虽然添加不同种类和质量分数的电子受体明显促进了PHC的降解 (图4)，但所有处理中ΣPHC和C1、C2、C3组分在30 d内快速降解；而随着时间的推移 (培养90 d后)，各处理组中PHC的降解速率都明显减慢或停止 (图5)。由于有机污染物进入土壤后往往会经历一个较长时间的“老化”过程，往往以“快”、“慢”、“极慢”等解吸组分形式存在[22-25]。污染物的“快”解吸组分易于生物利用，“慢”和“极慢”等解吸组分不易被生物利用，难以进一步去除[26-28]。因此，在培养前期易被生物利用的PHC可能已经被生物降解去除，致使培养的后期阶段 (如培养90 d后)PHC的降解速率均明显减慢或停止。
如图4(b)~图4(d)所示，添加不同种类和质量分数的电子受体缺氧培养150 d后，土壤中C1和C2、C3组分缺氧降解率均在HN处理组最高 (降解率为40.92%和37.48%、34.87%)，HS处理组最低 (降解率为30.78%和30.07%、31.70%)，HNS处理组介于二者之间 (降解率为32.94%和32.67%、33.28%)。由此可以观察到在所有5 000 mg·kg−1处理中，随着碳数的增加，PHC去除率降低，各组分PHC降解率为C1>C2>C3。这表明土壤中添加不同组分PHC的缺氧降解效果与其碳链长度成反比。C1组分具有高挥发性和较低的分子量，且疏水性弱、易被生物利用[29]，其降解率甚至达到30.78%~40.92% (图4)。随着C2、C3组分碳链长度增加，分子量逐渐增大，物质结构更加稳定，其生物有效性也更低，难以被生物利用[30]，其降解率为30.07%~37.48%、31.70%~34.87%。此外，土壤中C1组分在培养30 d后残留率迅速降低，随着时间的推移趋于稳定或停止；C2、C3组分在培养30 d后降解速率显著降低但未停止，随着时间的推移 (90 d)后趋于稳定或停止 (图4)。这可能是由于土壤中C1组分生物有效性更高更易被生物利用；而C2、C3组分生物因其有效性低而难以被微生物降解去除，导致其降解速率减慢。
3. 结论
1)向PHC污染的深层土壤中加入的电子受体种类相同时，土壤中细菌丰度、潜在PHC降解菌丰度随电子受体的质量分数增加而增加，ΣPHC和C1、C2、C3组分的降解率也随加入电子受体的质量分数增加而增加。
2)向PHC污染深层土壤中加入相同质量分数的不同种类电子受体时，土壤中细菌丰度和PHC潜在降解菌丰度从高到低分别为硝酸盐、混合电子受体、硫酸盐。ΣPHC和C1、C2、C3组分降解率为硝酸盐处理>混合电子受体处理>硫酸盐处理。
3)土壤中ΣPHC和C1、C2、C3组分的降解率随着土壤中细菌丰度、潜在PHC降解菌丰度的增加而增加，PHC的降解率与土壤中细菌丰度/潜在PHC降解菌丰度存在正相关关系。
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图 4 废水水质对TC-HCl降解速率的影响
Figure 4. Effect of wastewater quality onthe degradation rate of TC-HCl
图 6 不同初始质量浓度下TC-HCl的降解情况
Figure 6. TC-HCl degradation at differentinitial mass concentrations
图 8 不同浓度TC-HCl下系统的去污效果
Figure 8. Decontamination effect of system with different concentrations of TC-HCl
表 1 系统出水检测方法的回收率(n=6)
Table 1. Recovery rate of detection method for system effluent (n=6)
序号 已知量/(mg·L−1) 添加量/(mg·L−1) 测得量/(mg·L−1) 回收率/% 相对标准偏差/% 1 0 0.9 1.107 123.00 4.15 2 0 1.5 1.775 118.33 1.77 3 0 3.0 3.409 113.63 0.53 4 0 6.0 6.331 105.52 1.31 5 0 12.0 11.986 99.88 0.79 6 0 15.0 14.814 98.76 0.37 7 0 18.0 18.050 100.28 0.92 8 0 24.0 23.611 98.38 0.54 9 0 27.0 26.815 99.31 0.18 10 0 30.0 29.234 97.45 0.29
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表 2 光照下TC-HCl的一级动力学方程及参数
Table 2. First-order kinetic equation and parameters of TC-HCl under illumination conditions
光照/% 一级动力学方程 K t1/2/h R2 质量浓度/(mg·L−1) 0 Ct=11.28e−0.109 0t+20.94 0.109 0 6.4 0.977 30 20 Ct=32.04e−0.050 7t−1.09 0.050 7 13.7 0.986 30 40 Ct=31.92e−0.064 7t−1.16 0.064 7 10.7 0.991 30 60 Ct=25.70e−0.068 5t+6.09 0.068 5 10.1 0.994 30
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