1 材料与方法

1.1 材料

用于厌氧消化的剩余污泥取自无锡市硕放污水处理厂压滤机脱水污泥，接种污泥取自宜兴某柠檬水生产废水处理厂的厌氧污泥，取回后放置于4 ℃冰箱保存。餐厨垃圾取自江南大学第二食堂，由于餐厨垃圾自身性质会存在一定变化。为确保实验底物的一致性以及将餐厨垃圾自身性质变化的程度减小，将足量餐厨垃圾进行分选、去除部分油脂、105 ℃烘24 h、粉碎、装袋置于4 ℃冰箱保存。实验所用米曲霉CGMCC 3.4437从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买。实验所用的胰蛋白酶由国药集团化学试剂有限公司提供，胰蛋白酶酶活为50 000 U·g^-1。剩余污泥、接种污泥与餐厨垃圾的基本性质见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶对剩余污泥厌氧消化的影响

分别取VS比例为5∶2的剩余污泥和接种污泥，添加到1 L反应瓶中(反应瓶上部连接集气袋，底部设置取样口)，将含水率调至92.5%，最终反应体积为750 mL。分别于不同反应器中按时间段：反应开始时(第0天)、产气高峰时(第4天^[11])和气体累积产量趋于平缓时(第18天)投加50.00 mg·L^-1的胰蛋白酶(实验Ⅰ)和灭活的胰蛋白酶(实验Ⅱ)，测其甲烷产量、TS降解率及VS降解率。

1.2.2 米曲霉在餐厨垃圾中发酵产酶潜力

将餐厨垃圾调节至含水率(50±0.50)%和pH 7.50，制作成餐厨垃圾培养基。将米曲霉CGMCC 3.4437制成孢子悬浮液，孢子浓度为1×10⁴个·mL^-1，取0.5 mL孢子悬浮液接种至50 g餐厨垃圾培养基中，置于(30±1) ℃恒温搅拌水浴锅(搅拌转速为2 r·min^-1)中恒温好氧培养84 h后，获得米曲霉发酵产物。

1.2.3 米曲霉发酵产物促进剩余污泥厌氧消化

取实验所得米曲霉发酵产物VS比例为7∶2与剩余污泥混合，向所得混合物中添加VS比例为4∶1的接种污泥，添加到如1.2.1所述1 L反应瓶中，添加蒸馏水将体系含水率调至92.50%，最终反应体积为600 mL，向顶层鼓吹氮气20 min以确保反应器的厌氧环境。将米曲霉发酵产物置于50 ℃水浴锅灭活24 h，并与剩余污泥共消化作为对照实验A，以未发酵的餐厨垃圾与剩余污泥共消化作为对照实验B。向反应瓶中添加200.00 g种泥作为空白实验。反应瓶上部连接集气袋，从底部取样用于指标分析。

实验所需的温度及搅拌条件由恒温水浴摇床提供，所有实验设置3组平行实验。

1.3 分析方法

TS、VS、pH和氨氮使用国家标准方法^[12]测定；蛋白酶活性使用福林酚法^[13]；淀粉酶和还原糖使用DNS比色法^[14]；脂肪使用索氏提取法^[15]；糖类使用苯酚硫酸法^[16]；总蛋白采用凯氏定氮法^[17]；溶解性蛋白使用Folin-酚法^[18]。气体含量使用气相色谱法测定(FULI9790Ⅱ，中国)，色谱柱为TDX-01不锈钢填充柱 (直径3 mm×2 m)，填料为分子筛，柱温80 ℃，检测器温度150 ℃，载气为氩气，进样量为1 mL，主要测定N₂、CH₄以及CO₂^[19]；气体产量使用排水集气法。

采用SPSS 24.0(IBM，USA)中单因素方差分析(ANOVA)的Duncan检验法确定差异是否显著，并选择P=0.05作为统计推断阈值。

1.4 动力学模型

本研究采用3种动力学模型拟合：一级动力学模型(式(1))、修正的Gompertz模型(式(2)) 和 Cone模型(式(3))。模型的分析与拟合由Origin 9.0(OriginLab，USA)完成。

式中：B_t为t时间下的累计甲烷产量，mL·g^-1(以VS计)；t为厌氧消化时间，d；B_b为最大产甲烷量，mL·g^-1(以VS计)；B_max为反应体系中最高产甲烷速率，mL·(g·d)^-1(以VS计)；λ为延滞期，d；e为指数常数；k为水解速率常数，d^-1；n为形状因子。

2 结果与分析

2.1 商业蛋白酶投加对污泥厌氧消化的影响

向厌氧发酵体系中投加商业胰蛋白酶可以提高总酸产量^[20]，而挥发性脂肪酸是影响厌氧消化代谢过程的重要因素。因此，本研究首先以商业蛋白酶投加为考察对象，确定开发廉价生物酶的重要性。在反应的第0、4、18天，向实验Ⅰ和Ⅱ中分别投加商业胰蛋白酶与灭活的胰蛋白酶。由表2可知，向剩余污泥厌氧消化反应体系中添加胰蛋白酶可以增加甲烷产量，而且在反应初期投加胰蛋白酶的效果较好，甲烷产率提升了20.89%，VS、TS降解率分别达47.65%和44.86%。投加灭活的胰蛋白酶对反应体系甲烷产量的贡献不大，这说明第0、4、18天投加胰蛋白酶至实验Ⅰ所增加的甲烷产量是胰蛋白酶的活性发挥了作用，并且投加胰蛋白酶提高了反应体系中的TS降解率以及VS降解率；而蛋白酶自身的降解贡献不明显。

2.2 米曲霉发酵餐厨垃圾生产水解酶的能力

米曲霉CGMCC 3.4437在餐厨垃圾中发酵分泌淀粉酶和蛋白酶的能力如图1所示。米曲霉在餐厨垃圾中好氧发酵的第0~84小时分泌蛋白酶的活性稳步增加，在第84小时达到最高，为(5.40×10³±210.13) U·g^-1。随着发酵时间的继续延长，蛋白酶活性略有降低；在发酵的112 h，淀粉酶活性达到(4.50×10³±124.52) mg·(mL·min)^-1，淀粉酶活性在发酵120 h逐渐降低。从图1中可以明显看出，未接种米曲霉的餐厨垃圾只有极低的蛋白酶和淀粉酶活性，而在经过米曲霉发酵后的餐厨垃圾中，蛋白酶和淀粉酶活性显著上升，分别提升了73.37倍和24.52倍。同时，米曲霉在餐厨垃圾中发酵所产的水解酶特性如表3所示，蛋白酶的最适作用温度为35~45 ℃，最适作用pH为7.50。淀粉酶在温度30~70 ℃区间的热稳定性一般，在pH 5.50~8.00区间内未有明显差异，pH稳定性较优。

图1 米曲霉在餐厨垃圾中发酵产蛋白酶及淀粉酶的情况

Fig. 1 Fermentation of protease and amylase by Aspergillus oryzae in food waste

综合蛋白酶和淀粉酶活性，选择好氧发酵84 h的产物，进行后续米曲霉发酵产物(富酶餐厨)促进剩余污泥厌氧消化实验^[21]。

2.3 分泌酶对厌氧消化体系中CH₄产量及含量的影响

米曲霉在餐厨垃圾中好氧发酵为反应体系提供了充足的蛋白酶以及淀粉酶。如图2(a)所示，富酶餐厨组厌氧消化所得甲烷总产量高于中温灭活的富酶餐厨组和未发酵餐厨组，分别为(308.46±19.47) mL·g^-1、(196.65±10.72) mL·g^-1和(233.64±10.31) mL·g^-1。在反应初期，3组实验的产气速率都较高，此时，底物的快速水解酸化为产甲烷菌提供充足的碳源，产甲烷菌活性较高，均在反应第8天达到甲烷总产量的50%；但富酶餐厨组日甲烷产量高于中温灭活的富酶餐厨组和未发酵餐厨组。富酶餐厨组累计甲烷产量高于未发酵餐厨组，这是由于富酶餐厨组所添加的底物中有很高的蛋白酶和淀粉酶活性，加快了底物水解速率，促进产甲烷过程快速进行。富酶餐厨组累计甲烷产量高于中温灭活的富酶餐厨组，这也从侧面反映出共消化体系中的甲烷增量来自于富酶餐厨本身所富含的大量蛋白酶和淀粉酶。富酶餐厨组、中温灭活的富酶餐厨组和未发酵餐厨组在厌氧消化的第31天甲烷日产量均几乎为0，此时反应体系虽有部分蛋白质和多糖，但都不易被微生物水解，厌氧消化反应减缓；此时富酶餐厨组累计甲烷产量相比中温灭活的富酶餐厨组和未发酵餐厨组显著提高(P<0.05)，分别是中温灭活的富酶餐厨组和未发酵餐厨组的1.56倍和1.31倍。虽然富酶餐厨与污泥混合可以获得较高的甲烷增量，但这增量主要是来源污泥还是富酶餐厨仍然需要进一步研究。但就目前的研究来看，餐厨垃圾自身可生化降解性较高，对酶促作用的需求较污泥小，所以推测甲烷增量主要来源于污泥。

图2 反应体系中甲烷产量及含量差异

Fig. 2 Differences in methane production and content between reaction systems

由图2(b)可知，富酶餐厨组平均甲烷含量为65.87%，中温灭活的富酶餐厨组平均甲烷含量为62.64%，未发酵餐厨组平均甲烷含量为61.49%。中温灭活的富酶餐厨组与未发酵餐厨组的甲烷含量无明显差异，富酶餐厨组的甲烷含量明显高于中温灭活的富酶餐厨组(P<0.05)和未发酵餐厨组(P<0.05)。这是由于米曲霉在餐厨垃圾中生长代谢，不仅分泌了大量蛋白酶和淀粉酶，同时可能产生部分纤维素酶^[22]，促进纤维素的降解，导致富酶餐厨组反应体系中表现出较高的甲烷含量。

2.4 分泌酶对厌氧体系中多糖、还原糖、蛋白质、氨氮含量的影响

如图3(a)所示，富酶餐厨组与中温灭活的富酶餐厨组的初始溶解性多糖含量较高，这是由于米曲霉在餐厨垃圾中生长代谢分泌淀粉酶，促进底物中的淀粉溶出^[23]。由于微生物更易于利用多糖^[24]，反应0~7 d，富酶餐厨组溶解性多糖减少了(1 479.84±34.08) mg·L^-1，未发酵餐厨组溶解性多糖减少了 (1 068.00±57.89) mg·L^-1；另一方面，由于中温灭活的富酶餐厨组中米曲霉产生的水解酶已被灭活，溶解性多糖只能被消化微生物降解，反应0~7 d内，中温灭活的富酶餐厨组的溶解性多糖只减少了 (1 378.15±32.09) mg·L^-1，略低于富酶餐厨组。图3(c)所示的是厌氧消化体系中还原糖含量的变化，富酶餐厨组初始还原糖含量与中温灭活的富酶餐厨组相差不大，反应0~10 d，富酶餐厨组与中温灭活的富酶餐厨组、未发酵餐厨组的还原糖含量均呈上升趋势，此时溶解性多糖不断被分解成单糖、二糖，还原糖含量增加；中温灭活的富酶餐厨组还原糖含量增加的趋势不如富酶餐厨组明显，归因于中温灭活的富酶餐厨组淀粉酶活性没有富酶餐厨组高(图3(b))。溶解性多糖在反应运行6 d后维持稳定；运行10 d后，还原糖产生量低于还原糖消耗量，还原糖含量逐渐降低并趋于稳定。

图3 反应体系中多糖、蛋白质、还原糖以及氨氮含量变化情况

Fig. 3 Changes in the contents of polysaccharide, protein, reducing sugar and ammonia nitrogen in reaction systems

厌氧消化体系中富酶餐厨组与中温灭活的富酶餐厨组、未发酵餐厨组溶解性蛋白质含量变化如图3(b)所示。0~4 d内溶解性蛋白质含量呈上升的趋势，该阶段微生物大量利用多糖维持自身的生命活动，底物快速水解，有机质不断从固体中转变成溶解性有机质^[25]，导致溶解性蛋白质含量升高。与此同时，溶解性蛋白质被分解为多肽和氨基酸，氨基酸继而被分解为氨氮^[26,27,28]。图3(d)中，富酶餐厨组0~4 d的氨氮含量高于中温灭活的富酶餐厨组，这说明富酶餐厨组有较多的溶解性蛋白质被分解成氨基酸，继而生成氨氮。反应运行4 d后，溶解性多糖含量明显降低并趋于稳定，此时溶解性蛋白质不断被分解成小分子有机物，从而为产甲烷菌提供充足的碳源，溶解性蛋白质含量呈下降的趋势。此外，中温灭活的富酶餐厨组蛋白质含量的增加较富酶餐厨组大，也从侧面反映出0~4 d，蛋白质不断被溶出，同时不断被消耗(图3(d)氨氮含量不断升高)。由于中温灭活的富酶餐厨组被灭活，反应体系中只有极少的蛋白酶有活性，对照组蛋白质溶出速率大于消耗速率，且该趋势大于富酶餐厨组，所以富酶餐厨组蛋白质含量较中温灭活的富酶餐厨组低。在反应阶段的第18天，反应体系中可水解有机物减少，细菌水解速率降低，无法为产甲烷菌提供充足的碳源。产甲烷菌活性偏低，此时溶解性蛋白质以及氨氮含量趋于稳定，产气速率明显缓慢。

2.5 厌氧体系中蛋白酶和淀粉酶的稳定性分析

由于米曲霉利用餐厨垃圾中的营养成分完成了自身的生命代谢，并为反应体系提供了大量的蛋白酶和淀粉酶，因此富酶餐厨组初始蛋白酶与淀粉酶活性较对照组高。如图4(a)所示，在反应阶段的第0~5天内，富酶餐厨组蛋白酶活性降低了83.38%，未发酵餐厨组蛋白酶活性降低了60.69%。这是由于共消化初期底物快速水解酸化，固体物质不断溶解的同时，污泥中的抑制剂也随之溶出^[29]，进而降低酶的活性，使得反应体系中蛋白酶活性表现为快速下降。中温灭活的富酶餐厨组提前被灭活，酶活性与对照组B相差不大，保持同样的趋势。

图4 厌氧体系中蛋白酶以及淀粉酶活性稳定性

Fig. 4 Activity stability of protease and amylase in anaerobic system

如图4(b)所示，中温灭活的富酶餐厨组与未发酵餐厨组初始淀粉酶活性偏低，且2组淀粉酶活性均在0~9 d内逐步上升。此时反应底物中有大量可利用的溶解性有机物质，伴随着微生物迅速繁殖并大量分泌淀粉酶^[30]，促使反应体系中淀粉酶含量增高。由于米曲霉在餐厨垃圾中生长代谢，消耗了餐厨垃圾中的淀粉，使得反应底物中微生物可利用的淀粉没有未发酵餐厨组多。因此，反应0~9 d内，中温灭活的富酶餐厨组淀粉酶活性上升趋势较未发酵餐厨组小；由于米曲霉所产的淀粉酶热稳定性较差，富酶餐厨组淀粉酶活性不断失活，导致富酶餐厨组淀粉酶酶活性在反应0~8 d只能能维持初始酶活性的50%。反应阶段中的第15~25天，淀粉酶不断降解淀粉^[31,32,33]，使淀粉酶的活性显现出波动。随着淀粉含量的逐渐降低，对照组的淀粉酶活性逐渐下降，并趋于原始值。

利用米曲霉在餐厨垃圾中发酵所产的蛋白酶和淀粉酶代替商业生物酶能提升甲烷的产量，并且能提高混合气中甲烷的含量，但酶活性的稳定性较差。在YIN等^[20]的研究中也观察到商业胰蛋白酶在反应体系中难以维持长久活性，因此，酶活性的长久维持是进一步提高厌氧消化性能的关键因素。

2.6 污泥厌氧共消化体系的动力学分析

修正的Gompertz和 Cone模型被广泛应用于厌氧消化体系，不同的甲烷产量和底物有机物含量都影响着模型的适用性。图5为3种模型对厌氧共消化体系的拟合效果。

图5 动力学模型拟合

Fig. 5 Kinetic model fitting

表4所示为厌氧共消化体系过程中一级动力学模型、修正的Gompertz与Cone 模型的动力学拟合参数。从表4可以看出，一级动力学模型的R²值的区间为0.989~0.992，修正的Gompertz模型的R²值的区间为0.978~0.992，Cone模型的R²的区间为0.986~0.989。一级动力学模型和修正的Gompertz模型最大产甲烷量(B_b)与模型的预测值相近，误差分别为0.79%~8.29%、3.13%~7.47%。Cone模型最大产甲烷量预测值为实际值的21.86%~24.48%。但一级动力学模型最大产甲烷量(B_b)与模型的预测值误差较修正的Gompertz模型大，且修正的 Gompertz模型R²值为0.992，由此可见，修正的 Gompertz模型更适用于本研究中的富酶餐厨组的厌氧消化体系。修正的 Gompertz模型拟合结果中，富酶餐厨组B_max为 21.58 mL·g^-1(以VS计)，远大于中温灭活的富酶餐厨组与未发酵餐厨组，说明在富酶餐厨的作用下，富酶餐厨组的产甲烷速率有所提高^[34]。富酶餐厨组的λ值为-0.57，大于未发酵餐厨组，说明未发酵餐厨组反应启动较富酶餐厨组迅速，反应结束时富酶餐厨组有更高的累计甲烷产量，这与λ值大的反应体系拥有较高的甲烷产量的规律^[7]相一致。Cone模型的k值代表产甲烷速率的快慢，范围一般为0~0.161 d^-1[35,36]。从表4中可知，富酶餐厨组产甲烷速率弱于对照组，但在实际实验操作过程中，富酶餐厨组产甲烷速率优于对照组，从这一点也可得知Cone模型不适用于本次实验。从R²以及最大甲烷量预测值可以得知修正的Gompertz模型更能准确拟合富酶餐厨与剩余污泥共消化体系中产甲烷过程。

3 结论

1) 利用米曲霉对营养丰富的餐厨垃圾进行固态发酵，经过米曲霉发酵后的餐厨垃圾的蛋白酶和淀粉酶活性分别达到(5.40×10³±210.13) U·g^-1和(4.50×10³±124.52) mg·(mL·min)^-1，分别提升了73.37倍和24.52倍；将其与剩余污泥厌氧共消化，能够促进产甲烷过程，富酶餐厨与剩余污泥厌氧共消化甲烷产量达到(308.46±19.47) mL·g^-1(以VS计)，甲烷产量提升了31.91%。

2) 富酶餐厨与剩余污泥厌氧共消化能提高反应体系中甲烷含量，富酶餐厨组可以在反应阶段的第8天甲烷含量最高可达71.51%；平均甲烷含量为65.87%，是对照组的107.11%。

3) 相比一级动力学模型和Cone 模型，修正的Gompertz模型更适合于描述富酶餐厨与剩余污泥厌氧共消化产甲烷的动力学过程，最大甲烷产量和产甲烷速率均能被很好的模拟，且模型的拟合系数R²达到0.992。

4) 米曲霉在餐厨垃圾中好氧发酵所产的水解酶稳定性不高，推测是水解酶活性随着底物浓度的改变而改变，这使得米曲霉在剩余污泥厌氧消化体系中大规模利用需要更进一步的研究。

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