酵母浸膏、蛋白胨均为生物试剂; 氯化钠(NaCl)、尿素(CH₄N₂O)、甲苯(C₇H₈)、一水合柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钠(NaOH)、苯酚(C₆H₆O)、乙醇(CH₃CH₂OH)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、2.5水合氯化镉(CdCl₂·2.5H₂O)、无水氯化钙(CaCl₂)、对二甲氨基苯甲醛((CH₃)₂NC₆H₄CHO)均为分析纯; 溴化钾(KBr)为光谱级; 次氯酸钠(NaClO)为化学纯。

火焰原子分光光度计(novAA300，德国耶拿分析仪器股份公司); (FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司); X-射线衍射仪(D-MAX2500，日本理学); FTIR(Nicolt A vatar 370 is10，美国尼高力仪器公司); 扫描电子显微镜和X射线能谱谱仪(JSM-6360 LA，日本电子株式会社); 激光粒度分布仪(BT-9300S，丹东百特仪器有限公司); 超净工作台(SW-CJ-1B，上海苏净实业有限公司); 压力蒸汽灭菌锅(DSX-280A，上海申安医疗器械厂); 恒温振荡摇床(DHZ-032R，上海博彩生物科技有限公司); pH计(PHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司)。紫外可见分光光度计(T6新世纪，济南思卓医疗器械有限公司)。

从安徽铜陵狮子山矿山不同功能区域随机采集了5份重金属污染土壤样本，土壤样品(pH为5.6)充分混合后的特性和金属浓度：Pb 46.70 mg·kg^-1，Zn 180.10 mg·kg^-1，Cu 450.20 mg·kg^-1，Cd 5.27 mg·kg^-1。LB培养基(pH=7±0.2)成分：5.0 g·L^-1酵母浸膏、10.0 g·L^-1蛋白胨，5.0 g·L^-1 NaCl，1 000 mL去离子水。产脲酶菌株用无菌水连续稀释1 g土壤样品来分离得到，将土壤悬液涂布在尿素酶实验琼脂培养基上(含尿素60 g·L^-1，酚酞30 mL·L^-1的LB培养基)，在37 ℃条件下，培养48 h，挑选使培养基的颜色从黄色变为粉红色的菌落并通过重复画线进行纯化。Cd耐受菌株复筛，通过稀释涂布平板法来确定。

将筛选得到的产脲酶菌株的对数期培养物接种到含Cd的LB琼脂平板上，并不断增加金属离子浓度(25~400 mg·L^-1)，将划线培养基置于37 ℃下恒温培养，并观察细菌的生长情况。完全抑制细菌生长的金属最低浓度被认为是最小抑制浓度。

挑选2株经过16S rDNA序列测定的不同种属的高效产脲酶和高金属耐受性的菌株，分别命名为CZW-1和CZW-3。将实验分为3组：CZW-1为A组，CZW-3为B组，CZW-1、CZW-3共培养为C组。将分离得到的2株菌从LB斜面培养基上接种到经过灭菌的100 mL LB培养基中，置于37 ℃，在170 r·min^-1的恒温摇床中过夜培养，并用于后续实验。

菌株分泌的脲酶能将尿素分解为NH₄⁺，可以通过测量培养液中的氨氮含量来测定脲酶活性强弱，脲酶活性测量采用苯酚钠-次氯酸钠比色法^[21-22]。

取pH为7.0±0.2的LB培养基75 mL分装于3只锥形瓶中，紧接着在121 ℃下灭菌20 min，A、B组冷却后接种5 mL OD₆₀₀=1.0的处于对数期的菌液，C组接种5 mL OD₆₀₀=1.0的A、B菌株按体积比1:1混合后且处于对数期的菌液，并分别向培养液中补加经抽滤灭菌的5 mmol·L^-1 CdCl₂·2.5H₂O、10 g·L^-1的尿素和100 mmol·L^-1 CaCl₂溶液20 mL，置于37 ℃、170 r·min^-1下培养48 h，且在一定的时间间隔内取样测定溶液中Cd²⁺浓度、溶液pH、尿素浓度和OD₆₀₀。

测定溶液中Cd²⁺浓度方法：取一定体积样品在8 000 r·min^-1条件下离心5 min，取上清液并运用火焰原子分光光度计测定。

测定尿素浓度方法：二甲氨基苯甲醛显色分光光度法^[23]。

采用X-射线衍射仪对沉淀物的矿物成分进行分析; 采用FT-IR对沉淀样品中的官能团进行分析; 采用扫描电子显微镜和X射线能谱仪对矿物沉淀的结构形态、沉淀元素成分进行观察和分析; 采用激光粒度分布仪^[24]对矿化产物的粒度进行分析。

不同的微生物具有不同的脲酶活性以及重金属耐受能力，3组细菌对Cd²⁺的耐受能力以及脲酶活性结果如图 1所示。A、B、C组实验脲酶活性分别为17.09、18.23、20.79 U·mL^-1，菌株混合培养的C组脲酶活性高于单一培养的A、B组。环境中不同菌株之间会存在协同或者抑制作用，混合菌株能表现出更佳的脲酶活性以及重金属耐受性^[18]。

3组实验下的细菌浓度OD₆₀₀、尿素水解率、溶液pH和Cd²⁺去除率在48 h内的变化见图 2。从图 2(a)中可以看出，在0~24 h内，3组细菌大量繁殖，并达到稳定状态，C组混合培养的细菌浓度OD₆₀₀高于另外2组，这表明混合培养有利于细菌生长。从图 2(b)中可以看出，在此过程中，随着细菌大量分泌出脲酶，脲酶水解尿素，3组细菌在48 h内对尿素的水解率分别为78.15%、80.32%、85.50%。结合图 2(a)、图 2(b)可以看出，混合培养细菌在细菌浓度和脲酶活性上都要比单一培养细菌的高，在KATIE等^[25]的研究中发现了相同的结果。从图 2(c)中可以看到，48 h内培养液pH的差异变化，A组pH从6.47增长至8.36;B组从6.46增长至8.35;C组pH从6.49增长至8.41。这是因为脲酶水解尿素产生CO₃^2-和NH₄⁺，NH₄⁺发生水解并导致pH上升，随着营养物质的消耗和细菌的衰亡，3组的pH最终均趋于稳定^[26]。从图 2(c)中可见，3组实验的pH增长范围基本无差异，混合培养C组的pH增长速度会快于单一培养的A组和B组。本研究中3组实验的pH变化趋势在TOBLER等^[27]的研究中也有提及。细菌对Cd²⁺去除率的结果见图 2(d)，在0~24 h内，细菌对Cd²⁺的去除率急剧上升，原因是在这期间细菌大量生长繁殖并且分泌大量脲酶，底物尿素大量水解为CO₃^2-，从而导致Cd²⁺去除率快速增加。在24~36 h内，细菌Cd²⁺去除率缓慢增长直至趋于稳定，A、B、C组的去除率分别为75.95%、77.07%、80.09%，其原因是，在24~36 h内，细菌逐渐开始衰亡，溶液中的CO₃^2-也被逐渐消耗殆尽。B组Cd²⁺去除率略微高于A组，其原因是B组菌株的脲酶活性高于A组菌株; C组混合菌株对Cd²⁺去除率明显高于A组和B组，这是由于C组混合菌株表现出更高的Cd²⁺耐受性和脲酶活性，在LI等^[28]的研究中发现，混合培养的菌株比单一培养的菌株更能在恶劣的环境下存活。成亮等^[8]筛选出碳酸盐矿化菌株，利用其矿化固结重金属Cd²⁺，可明显降低有效态重金属含量。KANG等^[18]利用从废弃的矿土堆里筛选出的4种碳酸盐菌株矿化去除重金属，发现菌株混合会有更好的协同效果，并且混合菌株对重金属有很高的去除率。张宇楠等^[29]探讨了混合菌对重金属的形态及生物有效性的影响，结果发现混合菌能有效的促进游离态的重金属离子转化为碳酸盐稳定态和有机结合态，并能显著性的降低重金属离子的迁移性和生物利用度。将细菌进行混合培养时，培养基中的细菌会分泌某种蛋白物质，其可以被看做是一种对其他细菌的生长和功能起着促进作用的传递信息，通过混合培养能达到提高产酶的目的。

图 3为3组矿化产物的XRD图谱。可以看出，A、B、C组的矿化产物均是由CdCO₃和CaCO₃组成的。细菌产生脲酶将尿素分解产生NH₄⁺和CO₃^2-，CO₃^2-与周围的Ca²⁺、Cd²⁺结合，形成不溶于水的碳酸盐固体沉淀。从图 3可以看出，单一培养和混合培养细菌的矿化产物的XRD谱图峰值不同，3组产物CdCO₃峰强度为A组 < B组 < C组。这表明，C组矿化产物结晶度会明显高于A组和B组的产物，这是因为吸收峰越尖锐，说明矿化产物结晶度越好。Ca²⁺和Cd²⁺共沉淀的现象与王继勇等^[30]的实验结果一致。3组矿化产物中A组和B组的CaCO₃和CdCO₃吸收峰峰值强度无明显差异，但是C组相较于A组和B组的CaCO₃峰值强度较弱，也有可能是混合培养的菌株在矿化去除Cd²⁺时对Cd²⁺具有优先性，从而导致沉淀中CaCO₃含量偏低。在相同的条件下，CaCO₃的溶度积会比CdCO₃的溶度积大，在重结晶时可以在CaCO₃表面形成Cd-Ca的固溶体^[31]。

图 4为3组实验矿化产物的SEM分析结果。从图 4中可以看出，3组实验的矿化产物的形貌为椭球型颗粒状的CdCO₃和CaCO₃，且A组和B组矿化产物的直径约为2 μm，C组矿化产物的直径约为3 μm，C组矿化产物直径略微大于A组和B组矿化产物，并且C组矿化产物的表面相较于A组和B组矿化产物分布更加均匀，这表明C组在菌株混合条件下会更加有利于晶体的形成。微生物控制着细菌活动过程中的矿化过程，从而控制矿物的成核和生长^[32]。图 4(b)、图 4(d)、图 4(f)是图 4(a)、图 4(c)、图 4(e)矿化产物的局部电镜图，由此可以看出，Cd²⁺与Ca²⁺以晶格掺杂的方式形成了共沉淀，不同于其他研究中的CdCO₃或CaCO₃晶体的形貌^{[5, 33]}。这是由于在细菌表面的脲酶水解尿素形成CO₃^2-，矿化产物的结晶均沿着细胞壁上的结合位点展开，形成CdCO₃和CaCO₃晶体互相掺杂，形成矿化产物的过程中，细菌对Cd²⁺、Ca²⁺都进行矿化去除，从而导致金属离子结合位点相邻、相对和重叠^[26]。C组实验产物相较于A组和B组实验产物具有较好的结晶度和晶格掺杂形貌。这是由于混合培养细菌具有较强的脲酶活性，导致细胞表面的pH和CO₃^2-浓度相对稳定和充足，从而减少了在形成CdCO₃和CaCO₃晶体互相掺杂过程中的团聚现象。采用EDS分析3组矿化产物中的元素成分百分比，结果如表 1所示。在3组矿化产物中Ca含量分别为2.04%、2.87%、1.04%，Cd含量分别为25.85%、28.41%、30.13%，这表明Cd含量远高于Ca，因为Cd的离子半径大于Ca的离子半径，并且Cd在细菌表面拥有更对的结合位点，从而导致3组矿化产物中Cd含量均高于Ca。C组产物的中Cd与Ca含量比例约为29:1，远高于A组和B组矿化产物，这是由于细菌与矿物之间存在着相互作用^[34]，并且混合培养细菌拥有更多的Cd结合位点，更加有利于矿化去除Cd²⁺。

图 5为3组实验矿化产物的FT-IR分析结果。通过傅里叶变换红外光谱分析，可以确定微生物矿化沉淀的主要官能团。CO₃^2-在红外区的吸收频率由1 530~320 cm^-1强吸收峰、1 100~1 040 cm^-1弱吸收峰、890~800 cm^-1以及745~670 cm^-1的弱吸收峰组成。3 400 cm^-1附近的吸收峰为O—H和N—H键的伸缩振动峰; 1 637 cm^-1附近是结晶水的吸收峰^[35]。在1 637 cm^-1和1 044 cm^-1处的吸收峰主要是蛋白酰胺Ⅰ带和Ⅱ带的C＝O基的伸缩振动吸收峰; 1 380 cm^-1和856 cm^-1处吸收峰为矿化产物中CdCO₃和CaCO₃沉淀中C—O基团的弯曲振动吸收峰，719 cm^-1和550 cm^-1处主要为Cd—O和Ca—O共价键的振动吸收峰^[36]。FT-IR分析结果与XRD分析结果一致，表明矿化产物为碳酸盐。在1 380 cm^-1和856 cm^-1处出现的尖锐吸收峰为碳酸根的吸收峰，而3组矿物样品的吸收峰强度为C组 > B组 > A组; 从而导致矿物的结晶度大小顺序为C组 > B组 > A组。这正好与图 3矿化沉淀XRD中产物的结晶度变化一致。C组矿化产物的CO₃^2-、Ca—O等官能团的吸收峰明显强于A、B组，透过率明显降低，这也能说明混合培养细菌的矿化产物中CdCO₃和CaCO₃的含量较高。

图 6为3组实验矿化产物的粒径分布图，A、B、C组矿化产物的平均粒径分别为9.37、16.57、13.55 μm，B组和C组的矿化产物平均直径明显大于A组，这是由于脲酶活性的差异会导致沉淀晶体形状以及平均粒径大小出现差异^[37]。B组产物的粒度略微大于C组，但是C组的矿化产物粒度分布相较于A组和B矿化产物更加集中，矿化产物的大小分布比较均匀。结合图 5可知，C组混合培养下的矿化产物结晶度和晶形更好。成艳等^[38]在利用碳酸盐矿化菌矿化Pb²⁺实验中发现，反应条件会直接决定产物的粒度，这也能说明混合培养比单一培养进行矿化沉淀的条件更好，更加有利于晶体增长。

1) 选用从铜陵矿山尾矿堆中筛选得到的2株产脲酶菌株，对其进行单一培养和混合培养，都表现出了一定强度的脲酶活性和对Cd²⁺有较高的去除效果，单一培养对1 mmol·L^-1 Cd²⁺去除率分别为75.95%、77.07%，混合培养时去除率为80.09%。

2) 在矿化去除Cd²⁺过程中，混合培养细菌相比于单一培养具有较高的脲酶活性、Cd²⁺耐受性和Cd²⁺去除率。

3) XRD、FT-IR、SEM和EDS分析，发现3组实验的产物主要为CdCO₃和CaCO₃，并且C组产物具有较好的结晶度和晶格掺杂形貌; 通过粒度分析，发现C组混合培养产物的大小分布比较均匀; 菌株矿化Cd²⁺实验表明，混合培养细菌对重金属Cd污染的修复效果要比单一细菌好。