1 材料与方法

1.1 实验原料

土壤样品采集于新疆克拉玛依油田原油污染土，用于进行原油污染土壤微生物修复实验。土壤样品含油率为3.2%，其中饱和烃含量67.3%、芳香分含量19.5%、胶质含量8.4%、沥青质含量3.1%。土样去除砾石后，过20目筛分，密封储存在4 ℃冰箱待用。稀油样品密度0.767 g·cm^-3，黏度1 912.32 mPa·s (50 ℃)，饱和烃含量71.32%、芳香分含量20.87%、胶质含量6.47%、沥青质含量3.01%。稠油样品密度0.972 g·cm^-3，黏度6 024.21 mPa·s (50 ℃)，饱和烃含量36.67%、芳香分含量23.18%、胶质含量26.32%、沥青质含量14.39%。

LB培养基：蛋白胨 10 g、酵母膏 5 g、NaCl 10 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 6.8~7.0。无机盐培养基：硝酸铵 2 g、磷酸氢二钾 1.5 g、磷酸二氢钾 3 g、七水合硫酸镁 0.1 g、七水合硫酸亚铁 0.2 g、乙二胺四乙酸二钠 0.01 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 7.5。固体培养基：在液体培养基中加入15%的琼脂。驯化筛选培养基：无机盐培养基中加入1%的稀油或稠油样品。血平板培养基：脱纤维绵羊血50 mL、营养琼脂23 g、蒸馏水1 000 mL。

1.2 实验方法

混菌的驯化筛选：取含油的预存土样10 g，加到含90 mL无机盐的三角瓶中，30 ℃、150 r·min ^-1的恒温摇床上振荡培养7 d。取上层悬浊液10 mL接入新鲜含1%稀油的无机盐培养基中，在相同条件下振荡培养7 d。连续培养3次后，再取10 mL分别接入含1%稀油和1%稠油的新鲜无机盐培养基中进行驯化培养，所得混菌液标记为M2和M3，在相同条件下振荡培养7 d。连续培养3次即得到稀油富集驯化的混菌M2和稀油、稠油逐级富集驯化得到的混菌M3。取10 mL富集后的培养液，接种于90 mL LB液体培养基中，活化24 h后，在灭菌的离心管中加入1 mL活化后的培养液和1 mL 40%的灭菌甘油，旋涡振荡5 min混匀，于-80 ℃冰箱中保存。

将驯化后的混菌M2和M3用无菌水稀释到10^-5、10^-6和10^-7，分别将不同稀释度的菌液100 μL涂布于含有十六烷、液体石蜡(C₁₈~C₃₀)、柴油(C₁₀~C₂₂)、稀油、稠油、混合多环芳烃(苯并[a]芘、荧蒽、萘)的无机盐固体培养基上，30 ℃恒温培养箱中培养7 d后，对稀释相同倍数的平板上的菌落计数，用于考察混菌在不同石油类碳源培养基上的生长情况。另外，将驯化后的混菌M2和M3以10%的接种量，接种于含有1 g·L ^-1 稀油和稠油的无机盐培养基中，在30 ℃、150 r·min ^-1的恒温摇床里振荡培养7 d，考察混菌对稀油和稠油降解率。将驯化后的混菌在LB培养基中培养24 h后，待发酵液OD_{600 nm}为2.5时，接种10 μL 于血平板中央，放入30 ℃恒温培养箱中培养48 h观察溶血圈大小。另外，取10 mL用于测定发酵液的表面张力，用于表征混菌产表面活性剂的能力。

混菌M3最佳生长条件的研究：将驯化筛选出的混菌M3接种于LB培养基中培养24 h，然后按照10%的接种量向1 g·L^-1原油无机盐培养基中接种混菌培养液，在150 r·min^-1的恒温摇床里振荡培养7 d，分别考察混菌在不同温度(20、30、40、50、60 ℃)、不同pH(5、6、7、8、9)、不同盐度(0%、0.5%、1%、2%、3%氯化钠)和不同氮源(氯化铵、硝酸钠、尿素、磷酸氢二铵)的条件下对原油的降解效果。

混菌对土壤中原油降解能力的研究：称取含油土样1.5 kg于矩形方盒中，将驯化的混菌活化并扩增后，接入原油污染土壤中，接种量为4%。土壤中的C∶N∶P调整到100∶10∶1，土壤含水率保持在20%左右，在自然温度(25~30 ℃)下进行原油污染土壤微生物修复实验。

1.3 分析方法

脱氢酶活测定:利用2,3,5-三苯基四氮唑氯化(TTC)比色法，称2.0 g土壤并加入4%TTC溶液2 mL，密封锥形瓶，于37 ℃恒温避光培养24 h，同时设空白对照(不加土壤样品)，每组设2个平行样。培养结束后取出样品和空白对照，迅速加入25 mL丙酮振荡提取三苯基甲胺(TF)，取上清液于485 nm波长下测定吸光度值^[10]。在37 ℃时，每克样品每6 h催化产生1 mg TF为1个酶活单位，记为mg·(g·(6 h))^-1。

发酵液中的原油降解率测定：将发酵液移至分液漏斗中，加入15 mL二氯甲烷萃取，剧烈振荡5 min，静置 3 min，溶液分层后，有机相用无水硫酸钠过滤脱水后置于预先恒重的三角瓶中；此步骤重复3次后，将收集的萃取液利用氮气吹脱至恒重，并计算原油降解率。

土壤中原油降解率测定：利用自动化 Thermo ASE 350 加速溶剂萃取器进行萃取；利用重量法测定土壤中原油降解率。

土壤中原油组分分析：利用艾杰尔4组分分离系统对原油中的4组分进行分离测定。将降解后的原油用正己烷浸泡静置12 h，沉淀出沥青质并定量测定。溶液通过硅胶-氧化铝混合色谱柱，分别用正己烷、正己烷/二氯甲烷(正己烷∶二氯甲烷=1∶2)、无水乙醇、氯仿淋洗分离得到原油中的饱和烃、芳香分、胶质，称重定量。

表面张力测定：采用美国科诺工业有限公司的全自动表面张力仪A101测定发酵液的表面张力。

2 结果与讨论

2.1 石油烃降解混菌的驯化结果

2.1.1 石油烃降解混菌在含有不同石油类碳源的无机盐固体培养基上的生长情况

通过不同的富集驯化方式，得到2组混菌分别为M2和M3。其中，M2是通过稀油驯化得到的混菌，M3是通过稀油和稠油逐级驯化得到的混菌，M1为不加菌的空白对照。将混菌M2和M3涂布于含有不同石油类碳源的无机盐固体培养基上，观察混菌的生长情况。结果(见表1)表明，M2混菌在十六烷、柴油的固体培养基上生长最好，其次为液体石蜡和稀油。M3在含有十六烷、混合多环芳烃、稀油和稠油的固体培养基上的菌落数均大于M2，说明M3能够利用更多的石油类有机物，碳链较长的烃类有机混合物对M3的抑制作用较小。

2.1.2 石油烃降解混菌对稀油和稠油的降解能力对比

在无机盐加稀油和稠油的培养基中，定量考察了2组混菌降解稀油和稠油的能力，结果如图1所示。可以看出，加入混菌M2和M3后，混菌对稀油和稠油的降解率分别为不加混菌M1处理的3倍和7~9倍。混菌M3对稀油和稠油的最大降解率分别为67.8%和39%，与M2相比，对稀油和稠油的降解率分别提高了12.5%和22%。稠油中含有较高组分的胶质和沥青质，稠油的高黏度在一定程度上会抑制微生物的生长，降低微生物对原油的降解^[11]。实验结果表明，在稀油驯化之后再利用胶质和沥青质含量较高的稠油进行驯化，可以提高混菌对重质组分的适应性及耐受性，增强了其对原油中大分子组分的降解。

图1 不同驯化方式得到混菌对稀油和稠油降解能力比较

Fig.1 Comparison of thin and heavy oil degrading ability of mixed bacteria cultivated under different domestication ways

注：M1代表空白对照；M2代表通过稀油驯化得到的混菌；M3代表通过稀油和稠油逐级驯化得到的混菌。

2.1.3 石油烃降解混菌产表面活性剂能力对比

表面活性剂是微生物在一定条件下产生的具有一定表面活性的代谢产物，它能够通过调节细胞表面的疏水性能来影响微生物细胞与烃类之间的亲和力，使烃类在水溶液中有效扩散，并渗入细胞内部被同化分解^[12]。为更进一步研究不同驯化方法对石油烃降解混菌降解性能的影响，对2组混菌产表面活性剂的能力也进行了测定。本研究利用溶血圈来初判微生物是否产表活^[13]。将混菌M3加到血平板上，菌液周围出现明显的透明溶血圈，如图2(a)所示。而菌液M2未出现透明的溶血圈，如图2(b)所示。这说明M3具有产表面活性剂的能力。另外，通过表面张力的测定，得出未加入混菌的对照组M1的表面张力约为69.8 mN·m^-1。M3混菌发酵液的表面张力降低最多，降至27.9 mN·m^-1。而M2的发酵液中的表面张力仅降至54.5 mN·m^-1。因此，与混菌M2相比，M3混菌具有较强的产表面活性剂的能力。生物表面活性剂提高污染物生物可利用性的作用机制主要包括乳化作用、束增溶作用、降低界面张力作用3个方面^[14]。M3混菌产生的表面活性剂通过分散和乳化原油，协助混菌M3提高对原油的降解率。

图2 血平板溶血现象

Fig.2 Hemolytic phenomenon of blood plate

2.2 石油烃降解混菌M3最佳降解条件的研究

2.2.1 温度对石油烃降解混菌M3降解原油的影响

新疆地区适宜微生物修复的季节在5—10月，但在这个时间段，每天的温差较大，白天日照强烈，温度较高，因此，在此区域进行石油烃污染土壤的微生物修复，需要考虑混菌对温度的耐受能力。本实验考察了混菌M3在不同温度条件下对原油的降解效果。如图3所示：混菌M3随着温度从20 ℃升高至30 ℃，对原油的降解率显著增高；当温度为30 ℃时，其对原油的降解率最高在69.5%；当温度从40 ℃升高至60 ℃时，其对原油的降解率虽有所降低，但仍能达到48.4%。上述结果表明，温度在20~60 ℃范围内，混菌M3对原油均具有降解能力。因此，混菌M3适用于新疆地区原油污染土壤的修复。

2.2.2 pH对石油烃降解混菌M3降解原油的影响

pH是影响微生物生长繁殖的另一个重要环境因素。通过引起细胞膜电荷发生变化，进而影响微生物对营养物质的吸收，影响微生物新陈代谢中酶的活性^[15]。找到最适pH对菌株的生长及原油降解能力的提高至关重要。如图4所示，不同pH下混菌M3的原油降解率有明显差异，当 pH为5时，原油降解率为40.1%。随着pH的升高，M3对原油的降解率也随之升高。当pH为7~8时，原油降解率达到最高，为68%左右。

图4 不同pH对M3混菌降解原油的影响

Fig.4 Effect of pH on degradation of crude oil by M3 mixed bacteria

2.2.3 盐度对石油烃降解混菌M3降解原油的影响

盐度也是影响微生物降解石油能力的重要因素。盐度的变化主要体现为环境渗透压的变化，微生物适宜生长在等渗环境中，渗透压改变可能会影响微生物的生命活性甚至导致死亡。如果外界渗透压过高，会使微生物细胞原生质脱水，引起质壁分离^[16]。如图5所示，盐度对混菌M3的原油降解率的影响不是很明显，这是由于大多数细菌可以在0.5%~3%的盐度范围内生长。当盐度为1%时，M3原油降解率最大。当盐度在3%范围内，M3的原油降解率在57%以上。上述实验结果说明混菌M3对于盐度有较广泛的适应性。

图5 不同盐度对混菌M3降解原油的影响

Fig.5 Effect of salinity on degradation of crude oil by M3 mixed bacteria

2.2.4 氮源对石油烃降解混菌M3降解原油的影响

氮元素是微生物菌体构成的必需元素，微生物生长所必须的核苷酸、维生素以及一些矿物质都需要氮元素，而氮素基本都来源于培养基，故氮源的选择对微生物的生长和降解原油有重要影响。按照等剂量氮素原则配制4种不同氮源原油培养基。如图6所示，氮源不同，M3的原油降解率也不同。其中氮源为尿素时，M3的原油降解率最高为72.2%。总体来说，硝酸盐形式的氮比铵态氮好。

图6 不同氮源对混菌M3降解原油的影响

Fig.6 Effect of nitrogen source on the degradation of crude oil by M3 mixed bacteria

2.3 石油烃降解混菌对土壤中原油降解能力的研究

2.3.1 土壤中原油的含油率变化

为进一步了解混菌对新疆原油污染土壤中的原油的降解情况，将驯化得到的混菌接入新疆克拉玛依油田含油3.2%的污染土壤中。图7显示了利用混菌M3修复原油污染土壤过程中，不同时期的原油含量及降解率变化，CK为不加入混菌的空白对照。在14~28 d时M3的原油降解速率最快。实验进行56 d后，混菌M3对原油的降解率达到了55.3%，与空白相比，混菌M3的加入使原油的降解率提高了7倍。

图7 混菌M3对污染土壤中原油的降解率

Fig.7 Degradation rate of mixed bacteria M3 on oil in contaminated soil

2.3.2 土壤脱氢酶活性变化

脱氢酶是生物体产生的一种蛋白质，能促进有机物脱氢，从而使石油烃的氢原子活化并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转化。微生物对石油污染物的降解或转化从脱氢开始，因此，可利用脱氢酶的活性反映石油降解微生物的活性，进而评价其对石油烃的降解性能^[10]。加入混菌M3后，土壤中脱氢酶活性呈先增加后减少的变化趋势(见图8)，在第28天达到最大值14.5 mg·(g·(6 h))^-1，与原油降解率在前28 d增高趋势相符。由于石油烃降解混菌的添加，提高了微生物对于石油烃的代谢，有机碳的矿化很大程度上提高了脱氢酶活性。M3处理修复至中后期，脱氢酶活性呈下降趋势，可能是因为在修复过程中微生物代谢产物的累积以及难降解的毒性有机物对其活性产生了抑制作用^[17]。

图8 土壤脱氢酶活的变化

Fig.8 Changes of soil dehydrogenase activity

2.3.3 原油组分分析

土壤修复56 d后，分别对混菌作用前后的土壤中的原油组分进行分析(见表2)。结果表明，经过混菌M3降解后，原油的饱和烃、芳香分、沥青质和胶质的含量都有不同的变化。这是由于微生物选择性消耗原油不同组分的结果^[18]。原油中芳香分、胶质和沥青质的比例降低，饱和烃的比例增加，说明在混菌M3修复过程中，对重质组分也有一定的降解效果。有研究表明，微生物可以通过菌体自身的新陈代谢活动与代谢产物对原油中的沥青质等重质组分进行降解、乳化达到降黏的目的，进而提高对原油的降解率^[19]。降解作用包括2个方面：一个是通过微生物释放出的生物酶将原油中的大分子烃类转化为小分子烃^[20]；另一个是微生物产生的表面活性剂改善了原油的溶解能力，降低原油油水的表面张力^[21]。混菌M3对重质组分的降解与其具有较强的产表面活性剂的能力相关。

3 结论

1) 本研究使用不同组分的原油逐级驯化筛选高效石油烃降解混菌的方法，筛选出一组石油烃降解混菌M3。M3具有较强的产表面活性剂的能力，使发酵液的表面张力降低，增加菌体与油的接触，促进微生物对原油的降解。经过原油降解实验对比，此驯化方法比单一原油驯化得到的混菌对稀油和稠油的降解效果都高。

2) 通过对混菌M3最佳生长条件优化得出，混菌M3在温度30 ℃、pH 7~8、盐度1%、氮源选择尿素的条件下对原油的降解率最高。

3) 利用混菌M3修复原油污染土壤，土壤中脱氢酶活性呈先增加后减少的变化趋势，土壤修复56 d后，原油中的芳香分、胶质和沥青质含量降低，饱和烃含量升高。混菌M3具有改善原油物性和增强原油流动性的能力，最终使土壤中的原油降解率达到55.3%。

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