Temporal and spatial variations characteristics of atmospheric particulate matter in Hubei province, China

纳米银颗粒(silver nanoparticle，AgNPs)因其抗菌广谱、高效和不易产生耐药性等特点，广泛应用于医药、个人护理、家纺和家电等行业^[1]。包含AgNPs的产品在其生产、加工、储存、使用和废弃等过程中，不可避免地直接或间接释放到环境中。据估算，约有60%的AgNPs通过污水管网进入市政污水处理厂^[2]，因此，污水处理系统是AgNPs重要的环境归趋。HOQUE等^[3]的研究结果表明，污水中AgNPs的质量浓度一般在100~200 ng·L⁻¹；ZHOU等^[4]检测到活性污泥系统污泥中Ag质量分数可达到1.6 mg·kg⁻¹。随着含有AgNPs材料的广泛应用，进入市政污水处理厂的AgNPs浓度会不断增加。活性污泥工艺是目前应用最广泛的污水生物处理技术，该工艺利用活性污泥(微生物聚集体)去除水中的各种污染物^[5-6]，包含AgNPs的污水可对活性污泥微生物活性产生抑制作用、降低出水水质、给水生生态系统带来负面影响^[7-8]。

微生物群体感应(quorum sensing，QS)是指细菌自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知细菌群体中细胞密度变化进行种内或种间信息交流，从而调节微生物的群体行为^[9]。作为高菌群密度的生态系统，活性污泥细菌的群体感应对环境变化非常敏感，可参与调控外来污染物胁迫下的自身应激代谢反应^[10-11]。在污水处理系统中，细菌可分泌和释放酰基高丝氨酸内酯类(acyl-homeserine lactones，AHLs)信号分子，诱导生物膜形成并促进生物脱氮等过程^[12-16]。HAN等^[17]的研究表明，活性污泥系统中假单胞菌属细菌分泌AHLs并参与胞外聚合物分泌、种间竞争与脱氮等过程。污水中氮的去除是污水处理厂运行的首要目标之一^[18-19]。外源投加信号分子^[20-22]和群感菌^[23-24]是目前利用微生物群体感应现象强化污水生物脱氮的主要方法。DE CLIPPELEIR等^[20]发现，向活性污泥系统中添加适量外源AHLs信号分子可提高氨氧化速率和污泥中氨氧化菌的丰度。目前，关于AgNPs胁迫下活性污泥污水处理系统中微生物分泌AHLs信号分子的变化，以及这种变化与改进系统污染物去除效率间的关系研究鲜有报道。

因此，研究AgNPs胁迫下活性污泥污水生物处理系统的脱氮性能、AHLs对AgNPs胁迫的响应及外源添加AHLs对活性污泥脱氮效率恢复的调控，对阐明活性污泥系统中AgNPs对微生物的胁迫效应，采取可行的调控污泥微生物活性的生物措施具有重要意义。

1.   材料与方法

1.1   模拟活性污泥污水处理系统

以序批式反应器(sequencing batch reactors，SBRs)模拟活性污泥污水处理系统。SBRs有效容积为1.6 L，曝气系统包括空气泵和曝气头，空气流速为2.0 L·min⁻¹。SBRs每日运行2个周期，每周期5 h，包括进水15 min、搅拌90 min、曝气90 min、静置90 min和排水15 min，非运行期的SBRs处于静置状态。SBRs启动第20 天，污泥浓度(mixed liquor suspended solids，MLSS) 和污泥容积指数(sludge volume index，SVI)分别达到(6 503±39) mg·L⁻¹和(52.6±0.8) mL·g⁻¹，活性污泥系统运行稳定。这时在进水中分别添加AgNPs和Ag⁺，开始实验。SBRs中活性污泥混合液在一个运行周期内的溶解氧(dissolved oxygen，DO)和pH分别为0.2~7.0 mg·L⁻¹和7.5~8.4，每个运行周期内均有厌氧-好氧-缺氧交替的生境，有利于SBRs对有机物、氮、磷等污染物的去除^[25]。预备实验结果表明，在1 mg·L⁻¹ AgNPs胁迫下，AHLs在SBRs泥水混合液中的浓度常常低于文中所用UPLC-MS/MS的检测限。为了准确检测AgNPs胁迫下微生物分泌AHLs的变动，实验进水中分别添加了10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹的AgNPs。活性污泥系统分为5组，每组SBRs设置3个重复，5组SBRs分别为CK(进水中不添加AgNPs，也不添加Ag⁺)，进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs，进水中分别添加3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺ (对应10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs溶解释放的Ag⁺浓度)。活性污泥系统运行周期内换水率为50%。

实验用AgNPs溶液购自北京德科岛金科技有限公司，AgNPs颗粒表面包被聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)，平均粒径为10~12 nm。AgNPs经超声仪(KQ-700DE，昆山市超声仪器公司)(100 W，40 kHz)超声5 min后，加入SBRs进水中。反应器进水中添加的Ag⁺以AgNO₃配制(进水中的${\rm{NO}}_3^ -$-N进行相应扣减)，AgNPs在纯水中溶解释放的Ag⁺浓度依照孙秀玥采用超滤法测得的结果^[26]。

1.2   进水水质及水质指标分析方法

实验中，采用南京某市政污水处理厂浓缩池污泥作为接种污泥。实验所用污水为人工模拟中等强度的城市污水，统一用纯水配置，具体组成参见孙秀玥的研究论文^[26]。配制污水所用试剂购于阿拉丁(上海)有限公司，均为分析纯。

根据《水和废水监测分析方法》^[27]，水质指标${\rm{NH}}_4^ +$-N、${\rm{NO}}_3^ -$-N、${\rm{NO}}_2^ -$-N和TN采用可见-紫外分光光度计(Shimadzu，UV-1800，Japan)测定。DO和pH分别使用便携式溶解氧仪(JPB-607A，上海雷磁仪器厂)和pH测定仪(PB-10，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)测定。泥水混合液MLSS和SVI采用水和废水标准监测方法测定^[28]。化学需氧量(chemical oxygen demand，COD)采用HACH COD 快速测定仪(HACH，DR1010，USA)测定。

1.3   SBRs系统中水相和泥相Ag浓度的测定

将活性污泥混合液分为污水(水相)和污泥(泥相)2个部分，分别测定污水和污泥中的Ag浓度。取曝气结束前30 min的泥水混合物，利用低温高速离心机(Centrifuge 5810R，Eppendorf，Germany)在4 ℃和20 000 r·min⁻¹条件下离心30 min，过0.45 μm 醋酸纤维滤膜(Whatman，USA)，滤液即为污水。将剩余部分即污泥置于110 ℃烘箱中烘干至恒重，冷却至室温后研磨，过100目筛后备用^[29]。在污泥中加入4 mL浓盐酸和1 mL浓硝酸，采用石墨炉消煮仪(SH220，上海海能仪器股份有限公司)消解。消煮残渣置于20 mL体积分数为50%的氨水中浸泡。污泥中的Ag浓度为消煮污泥中Ag浓度与消煮残渣的浸泡液Ag浓度之和。采用ICP-MS/MS (NexION 300，PerkinElmer，USA)测定污水和污泥中Ag浓度，加标回收率在96%以上。

1.4   细菌DNA提取与16S rDNA高通量测序

采用DNA提取试剂盒(MoBIO Laboratories，Inc，USA)提取活性污泥中细菌DNA，提取成功后涡旋混匀，用微量分光光度计(Thermo，NanoDrop 2000c，USA)测定DNA浓度(核酸纯度A260/A280>1.8)，DNA样品保存于-20 ℃冰箱。

活性污泥DNA样品由MiSeq平台进行Illumina高通量测序(上海凌恩生物科技有限公司)。PCR扩增通用引物为515F(GTGCCAGCMGCCGCGG)和907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)。使用QIIME(quantitative insights in microbial ecology)软件对所得序列进行生物信息学处理。利用UCLUST分类器对有效序列进行聚类，将相似性高于97%的序列归为一个分类单元(operational taxonomic units，OTU)。OTU采用贝叶斯算法(http://rdp.cme.msu.edu/)与Silva(SSU123)核糖体数据库进行对比进行聚类分析和物种分类学分析，利用R Studio进行分析并作图。

1.5   SBRs中污水AHLs提取与检测

将SBRs中的泥水混合物于4 ℃和20 000 r·min⁻¹下离心30 min，收集50 mL上清液，过0.45 μm醋酸纤维滤膜，采用固相萃取(solid-phase extraction，SPE)对上清液AHLs进行提纯和富集^[30]。具体步骤为：依次向Oasis HLB固相萃取柱(Waters，上海)加入5 mL甲醇和5 mL超纯水活化萃取柱；50 mL过膜(0.45 μm)后的上清液以<1 mL·min⁻¹的流速过柱；采用5 mL体积分数为10%的甲醇水溶液淋洗萃取柱；氮气吹干；最后加入5 mL乙腈洗脱，收集洗脱液，氮气吹洗脱液至近干，加入1 mL乙腈重新溶解，洗脱液过0.22 μm有机滤膜后，密封遮光保存于−20 ℃冰箱，用于后续检测分析。

采用UPLC-MS/MS超高效液相色谱串联质谱仪(Xevo TQ-Smicro，Waters，USA)定量检测活性污泥混合液水相中N-丁酰基-高丝氨酸内酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone，C₄-HSL)、N-己酰基-高丝氨酸内酯 (N- hexanoyl -L -homoserine lactone，C₆-HSL)、N-辛酰基-高丝氨酸内酯 (N- octanoyl -L -homoserine lactone，C₈-HSL)、N-癸酰基-高丝氨酸内酯(N- decanoyl -L -homoserine lactone，C₁₀-HSL)、N-十二烷酰基-高丝氨酸内酯 (N- dodecanoyl -L -homoserine lactone，C₁₂-HSL)和N-十四烷酰基-高丝氨酸内酯 (N- tetradecanoyl -L -homoserine lactone，C₁₄-HSL) 6种信号分子。液相色谱柱BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm；Waters)，运行时间为4 min，柱温为40 ℃，流动相A为含甲酸的超纯水(体积分数0.1%)，B为含甲酸的乙腈(体积分数0.1%)，采用梯度洗脱，流速为300 μL·min⁻¹。质谱采用双通道多反应检测模式，离子源采用正离子模式，去溶剂气体为氮气，流量为992.0 L·h⁻¹，锥孔气体为氩气，流量为1.0 L·h⁻¹，离子源温度为149 ℃，去溶剂化温度为497 ℃，进样量为3 μL。活性污泥混合液中6种信号分子的加标回收率为51.22%~137.71%。

1.6   外源添加AHLs类信号分子

在反应器运行第65 天，向5组反应器中分别一次性加入浓度均为10 nmol·L⁻¹的C₆-HSL、C₈-HSL和C₁₂-HSL混合溶液，并以1.1节中相同的运行方法继续运行SBRs。

1.7   数据统计和分析方法

所有数据均采用3次重复的平均值±标准偏差来表示。数据统计和分析使用Excel 2016，采用Origin 9.2软件绘图。

2.   结果与讨论

2.1   AgNPs和Ag⁺对SBRs污染物去除性能的影响

1) SBRs泥水混合液中水相和泥相中Ag浓度的比较分析。取CK及进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs，3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的SBRs第1、5、10、20、30、40、50和60 天曝气阶段的泥水混合物，分别测定水相和泥相中Ag质量浓度，减去CK反应器泥水混合液中水相和泥相Ag质量浓度，结果如图1所示。SBRs运行初期，各反应器水相中Ag质量浓度分别为(636.59±1.59)、(1 120.54±66.78)、(8.13±0.60)和(11.81±1.75) μg·L⁻¹(图1(a))，运行期间，各反应器水相中Ag质量浓度呈下降趋势。SBRs运行至第60 天，进水中分别添加10 mg·L⁻¹ AgNPs，3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺，反应器中水相平均Ag质量浓度均降至0.25 μg·L⁻¹以下，进水中添加20 mg·L⁻¹ AgNPs的反应器中水相平均Ag质量浓度降至17.40 μg·L⁻¹。

图 1  SBRs中水相和泥相Ag质量浓度

Figure 1.  Ag concentrations in supernatant and sludge of SBRs

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由图1(b)可知，进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs，3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的反应器污泥中Ag质量浓度运行期内较稳定，分别为8 418.88~9 806.72、16 966.49~20 118.67、2 829.25~3 002.99、5 747.96~6 140.47 μg·L⁻¹，SBRs污泥中Ag质量浓度与理论Ag添加量相近。由此可推断，进入活性污泥系统的AgNPs和Ag⁺主要存在泥相中^[26]。

2) AgNPs和Ag⁺对SBRs中氮去除效率的影响。SBRs连续运行60 d后，${\rm{NH}}_4^ +$-N、${\rm{NO}}_3^ -$-N和TN去除率以及出水${\rm{NO}}_2^ -$-N质量浓度变化如图2所示。由图2(a)可知，进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs的SBRs在运行期间，${\rm{NH}}_4^ +$-N平均去除率与CK相比分别降低了5.51%~19.62%和8.23%~36.91%；而进水中分别添加3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的反应器与CK相比，${\rm{NH}}_4^ +$-N平均去除率没有显著差异，均高于84.73%。这说明AgNPs对活性污泥硝化反应的抑制作用比其溶解释放出的Ag⁺作用更显著。其他研究者也有类似发现，如ZHANG等^[18]发现，进水中分别添加1 mg·L⁻¹和10 mg·L⁻¹ AgNPs导致SBRs对${\rm{NH}}_4^ +$-N的去除率由98.8%分别降低至71.2%和49.0%，AgNPs对${\rm{NH}}_4^ +$-N去除有显著抑制作用。LIANG等^[31]发现，1 mg·L⁻¹ AgNPs和1 mg·L⁻¹ Ag⁺使SBRs中活性污泥的比耗氧速率硝化作用(活性污泥混合液中添加${\rm{NH}}_4^ +$-N为底物，分别测定1 mg·L⁻¹ AgNPs和1 mg·L⁻¹ Ag⁺胁迫下活性污泥的比好氧速率，以此来代表硝化作用)分别降低了41.4%和13.5%，在相同的Ag浓度下，AgNPs对硝化作用的胁迫效应高于Ag⁺。

图 2  AgNPs与Ag⁺对SBRs出水${\rm{NH}}_4^ +$-N、${\rm{NO}}_3^ -$-N和TN去除率及NO₂N质量浓度的影响

Figure 2.  Effects of AgNPs and Ag⁺ on the removal rates of ${\rm{NH}}_4^ +$-N and ${\rm{NO}}_3^ -$-N and TN and ${\rm{NO}}_2^ -$-N concentrations in effluent

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由图2(b)可知，与CK相比，进水中分别添加3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的SBRs对${\rm{NO}}_3^ -$-N平均去除率分别降低了2.03%~8.55%和9.17%~12.73%；而与CK相比，进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs的反应器对${\rm{NO}}_3^ -$-N的去除率无显著差异。自第10 天后，5组SBRs的出水${\rm{NO}}_2^ -$-N平均质量浓度均低于0.49 mg·L⁻¹，结果见图2(c)。由图2(d)可知，与CK相比，运行至第10 天后，进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs，3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的SBRs中，TN平均去除率分别下降了0.93%~9.22%、3.34%~8.36%、1.87%~6.05% 和1.95%~9.14%。在60 d的运行期间内，进水中添加20 mg·L⁻¹ AgNPs的反应器对TN去除率显著低于CK。SBRs运行至第60 天时，CK与进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs，3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的活性污泥系统对COD的平均去除率分别为93.93%、71.84%、47.25%、93.49%和92.07%。从实验结果来看，进水中添加AgNPs对活性污泥微生物硝化作用的抑制影响更明显，导致${\rm{NH}}_4^ +$-N去除率下降，因而转化成${\rm{NO}}_3^ -$-N的比例降低；Ag⁺对活性污泥微生物反硝化作用的抑制效应较明显，但很有可能因为AgNPs抑制${\rm{NH}}_4^ +$-N转化为${\rm{NO}}_3^ -$-N，使得微生物反硝化作用的底物减少，从而导致表观上外源添加AgNPs对${\rm{NO}}_3^ -$-N去除率的抑制影响低于Ag⁺；AgNPs对活性污泥微生物去除有机碳的抑制效应明显高于其溶解释放的Ag⁺。

2.2   AgNPs和Ag⁺对活性污泥中脱氮细菌相对丰度的影响

为了研究AgNPs及其释放出的Ag⁺对SBRs脱氮效率影响的原因，采用16S rDNA高通量测序法分析了活性污泥微生物群落结构。图3为反应器运行至第60 天时，相对丰度>0.010%的典型硝化和反硝化细菌属水平热图。CK与进水中添加20 mg·L⁻¹ AgNPs的SBRs中亚硝酸菌属Nitrosomonas^[32]的平均相对丰度分别为0.160%和0.070%；进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs的SBRs中具有硝化功能的Novosphingobium^[33]的平均相对丰度从CK反应器的0.034%下降到0.005%和0.002%，AgNPs对活性污泥硝化菌的胁迫作用与浓度有关；进水中分别添加3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的反应器与CK相比，反硝化菌Dechloromonas和Caldilineaceae^[34]的平均相对丰度分别由6.100%和0.270%下降到4.700%和4.700%，0.180%和0.110%。动胶菌属zoogloea可以硝酸盐作为电子受体进行反硝化反应^[35]，进水中分别添加3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的反应器中zoogloea平均相对丰度从CK反应器的0.220%下降到0.090%和0.090%。AgNPs及其释放出的Ag⁺可以通过影响硝化菌和反硝化菌的相对丰度，从而影响活性污泥系统的脱氮效率。

图 3  SBRs运行第60天活性污泥中部分硝化和反硝化细菌属水平上分布热图

Figure 3.  Richness heat map of bacteria genera associated with nitrification and denitrification in the activated sludge fed with different concentrations of AgNPs and Ag⁺ on the 60^th day

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2.3   AgNPs对活性污泥微生物分泌AHLs信号分子浓度的影响

采用UPLC-MS/MS分别检测运行至第60天时的CK与进水中添加10 mg·L⁻¹ AgNPs反应器中活性污泥微生物分泌的6种AHLs信号分子的浓度，结果如图4所示。CK中C₄-HSL、C₆-HSL、C₈-HSL、C₁₀-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL的浓度分别为(2.00±0.08)、(0.27±0.06)、(0.41±0.06)、(0.81±0.02)、(2.02±0.06)和(1.45±0.21) nmol·L⁻¹。WANG等^[36]检测离心后生物膜中C₄-HSL和C₁₂-HSL的最高浓度为0.6 nmol·g⁻¹；SUN等^[37]检测到活性污泥中含量最高的AHLs信号分子为C₈-HSL，浓度达1.3 nmol·L⁻¹。进水中添加10 mg·L⁻¹ AgNPs反应器中只检测到C₄-HSL、C₆-HSL和C₁₀-HSL 3种信号分子，其平均浓度分别为CK反应器中的1.7、0.8和1.1倍。因而，10 mg·L⁻¹ AgNPs添加于SBRs进水中可导致活性污泥微生物分泌AHLs信号分子的数量发生变化，C₄-HSL平均浓度显著增高，也可导致AHLs信号分子种类减少，其中C₈-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL均未检出。

图 4  进水中添加10 mg·L⁻¹ AgNPs反应器活性污泥中AHLs浓度

Figure 4.  AHLs concentrations in activated sludge of SBRs fed with 10 mg·L⁻¹ AgNPs

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2.4   外源加入AHLs信号分子对SBRs中污染物去除效能的影响

反应器运行至第65天时，外源加入混合AHLs。与加入前(第60 天)相比，CK与进水中分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs，3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺的反应器对${\rm{NH}}_4^ +$-N平均去除率分别降低了24.52%、28.04%、5.01%、20.73%和16.76%；对${\rm{NO}}_3^ -$-N平均去除率分别增加了13.33%、11.41%、5.82%、18.25%和8.06%；各反应器出水${\rm{NO}}_2^ -$-N浓度均有所降低，降低幅度最大的SBRs(进水分别添加3 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹ Ag⁺)中出水${\rm{NO}}_2^ -$-N平均质量浓度降低了0.21 mg·L⁻¹。外源加入AHLs后，进水分别添加10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹ AgNPs的反应器中的TN平均去除率升高，运行至第70 天时，TN平均去除率达到最大值，分别为93.01%和89.82%(图5)。综合上述结果可知，外源加入混合AHLs可在5~10 d内导致AgNPs和Ag⁺胁迫下反应器对${\rm{NH}}_4^ +$-N平均去除率降低，对${\rm{NO}}_3^ -$-N的平均去除率升高，且可显著提高AgNPs胁迫下反应器对TN的平均去除率。朱颖楠等^[38]指出，C₆-HSL可调控生物膜修复和强化脱氮。张向晖等^[39]发现，外源添加0.5 g·L⁻¹的C₆-HSL和C₈-HSL会抑制厌氧氨氧化菌群生长，但能提高活性污泥的脱氮性能。外源加入混合AHLs的种类、数量对其调控污水处理反应器中微生物的脱氮性能都有影响。

图 5  添加AHLs对AgNPs与Ag⁺胁迫下SBRs出水${\bf{NH}}_4^ +$-N、${\bf{NO}}_3^ -$-N和TN去除率及${\bf{NO}}_2^ -$-N质量浓度的影响

Figure 5.  Effects of AgNPs and Ag⁺ on the removal rates of ${\rm{NH}}_4^ +$-N and ${\rm{NO}}_3^ -$-N and TN and ${\rm{NO}}_2^ -$-N concentrations in effluent

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3.   结论

1)进入活性污泥系统中的AgNPs及其释放的Ag⁺主要存在污泥中，可影响活性污泥中硝化细菌和反硝化细菌相对丰度，抑制活性污泥微生物硝化和反硝化作用，从而降低活性污泥对TN的去除效率。

2) AgNPs胁迫影响活性污泥微生物分泌AHLs信号分子的数量和种类。10 mg·L⁻¹ AgNPs胁迫下反应器中C₄-HSL平均浓度与CK相比显著提升1.7倍，而C₈-HSL、C₁₂-HSL和C₁₄-HSL 3种信号分子浓度则低于检测限。

3) 10 mg·L⁻¹ AgNPs胁迫下的活性污泥反应器在外源加入混合AHLs 5 d后TN平均去除率由69.41%提高至93.04%，但AHLs的调节作用受种类、数量等因素影响，需要进一步开展研究。