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5-氟尿嘧啶（5-fluoruracil，简写5-FU）是一种广谱抗肿瘤药物，广泛用于结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等疾病的治疗中[1]. 5-氟尿嘧啶治疗剂量与中毒剂量接近，临床疗效和不良反应在不同患者中常存在巨大的个体差异[2]. 5-氟尿嘧啶导致的腹泻、口腔黏膜炎、骨髓抑制、手足综合征和心脏毒性等副作用常限制其在某些患者中的使用，其总体有效率也不尽如人意[3 − 4]. 目前，其血药浓度监测方法，主要有高效液相色谱法（HPLC法）和串联质谱法（LC-MS/MS法）. LC-MS/MS被誉为小分子检测领域的“金标准”，具有特异性强、灵敏度高、准确性高、分析时间短、高通量等优点，已成为血药浓度的监测首选方法. 但目前报道LC-MS/MS法测定5-氟尿嘧啶中，样品前处理提取方法大多采用液液萃取法[5 − 9]、衍生化法[10]、蛋白沉淀法[11]. 液液萃取法是目前5-氟尿嘧啶样品前处理应用最多的方法，需加入大量的有毒有害有机溶剂，且需要浓缩富集再检测，步骤繁琐，费时费力，污染环境，效率低下. 衍生化法虽可提高检测灵敏度及增加5-氟尿嘧啶在色谱柱上保留，但是过程相比液液萃取法更加繁琐，可操作性差. 蛋白沉淀法是一种最简单的生物样本前处理方法，一般仅需使用蛋白沉淀剂沉淀样品后可直接测定. 但由于5-氟尿嘧啶本身化合物极性较大，需使用大量有机溶剂蛋白沉淀，且配套使用HILIC 亲水模式色谱柱分离测定. 因此建立一种准确、简单、快速的样品前处理方法用于5-氟尿嘧啶血药浓度监测至关重要. 基于此，本研究建立了使用硫酸锌直接蛋白沉淀结合反相色谱串联质谱法测定人血浆中5-氟尿嘧啶的方法，并应用于胃癌患者的治疗药物监测.
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Shimadzu LCMS-8045串联质谱仪（日本岛津公司）；AP225WD电子天平（日本岛津公司）；VORTEX-6漩涡混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；Allegra 64R台式高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Milli-Q Plus 纯水器（美国密理博中国有限公司）.
5-氟尿嘧啶标准品（坛墨质检科技股份有限公司，纯度99.9%，批号21120693）；5-氟尿嘧啶-13C,15N2标准品（加拿大TRC公司，纯度99%，批号F596002）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；硫酸锌（分析纯，德国Merck公司）；水为超纯水.
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色谱条件 色谱柱：Shimadzu Shim-pack GIST-HP C18-AQ （100 mm×2.1 mm I.D., 1.9 μm）；流动相：水（A）-甲醇（B）；梯度洗脱：0—1 min，5%B；1—2 min，5%B→95%B；2—2.5 min，95%B；2.5—2.6 min，95%B→5%B；2.6—5 min，5%B；流速：0.3 mL·min−1；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL.
质谱条件 离子模式：负离子；检测方式：多反应监测（MRM）；雾化气流速：3.0 L·min−1；干燥气流速：5.0 L·min−1；加热气流速：15.0 L·min−1；脱溶剂管温度：150 ℃；加热模块温度：400 ℃；离子源温度：300 ℃；5-氟尿嘧啶及其内标MRM参数见表1.
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基质匹配校准曲线制备 精密称取5-氟尿嘧啶校准品10 mg，加水稀释并定容至10 mL，得1 mg·mL−1校准品母液. 将校准品母液用水逐级稀释并定容，得系列校准品溶液. 取系列校准品溶液10 μL，加入90 µL空白血浆，涡旋混匀1 min，得基质校准溶液，基质校准曲线浓度分别为10 、25、100、250、1000、2500、10000 ng·mL−1.
基质匹配质控品溶液制备 取低中高浓度质控品标准溶液LQC、MQC、HQC各10 μL，加入90 µL空白血浆，涡旋混匀1 min，得基质匹配质控品溶液，浓度分别为20、200 、8000 ng·mL−1.
内标溶液配制 取1 mg内标标准品5-氟尿嘧啶-13C,15N2，加水稀释并定容至10 mL，得0.1 mg·mL−1内标标准品母液. 使用时取10 μL内标标准品母液，加水稀释并定容至1 mL，得1 μg mL−1内标标准品工作液.
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取100 µL基质匹配校准品、基质匹配质控品或血浆，加10 μL内标标准品工作液，涡旋混匀10 s，加入300 µL 0.1 mol·L−1硫酸锌溶液，涡旋混匀1 min，14000 r·min−1离心10 min，取上清液上机分析.
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方法学考察参考《中国药典》2020年版第四部9012中“生物样品定量分析方法验证指导原则”进行.
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按1.2项下色谱与质谱条件及1.4项下血浆样品处理方法，选取６批不同来源的空白血浆与定量下限样品（10 ng·mL−1）进行处理，处理后样品进行LC-MS/MS分析，记录色谱图，空白血浆中5-氟尿嘧啶及内标保留时间附近无内源性基质峰干扰，色谱峰峰形良好，本方法的专属性良好.
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分别进样5 μL，记录5-氟尿嘧啶及内标峰面积，以5-氟尿嘧啶及其内标浓度比（C）为横坐标，5-氟尿嘧啶峰面积与内标峰面积比（A）为纵坐标，按照最小二乘法计算回归方程及相关系数，得标准曲线为：A = 1.70×10−2C + 8.39×10−4，R2为0.999. 5-氟尿嘧啶在10—10000 ng·mL−1浓度范围内线性关系良好，标准点准确度为96.4%—103.4%，满足测定需求. 以S/N=3和S/N=10分别计算5-氟尿嘧啶的检出限LOD为0.3 ng·mL−1，定量限LOQ为 1.0 ng·mL−1，考虑到5-氟尿嘧啶体内实际药物浓度及临床应用需求，最终将校准曲线最低浓度点设为10 ng·mL−1.
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按1.4项下前处理方法对低中高浓度质控品进行前处理，每个浓度质控品重复制备6份，考察批内准确度及精密度. 通过3 d内3批重复试验，考察并计算批间准确度和精密度. 准确度用（测得值/真实值）×100%表示，结果见表2. 结果显示，质控品测得值与真实值接近，批内及批间准确度在94.8%—99.0%，RSD在0.9%—4.8%，符合相应指导原则规定.
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按1.4项下前处理方法对6份低中高浓度质控品进行前处理，分析测定峰面积为A. 取不同供体的6份空白血浆，按1.4项下前处理操作（内标工作液置换为纯水），得到空白基质，加入标准品及内标溶液，配制成与质控品同浓度分析溶液，分析测定峰面积为B. 配置不含血浆基质且与质控品同浓度标准品溶液，按1.4项下方法前处理，分析测定峰面积为C. 提取回收率=A/B×100%，基质因子=B/C×100%，内标归一化基质因子=待测物基质因子/内标基质因子×100%，变异系数用RSD表示. 本提取条件下，5-氟尿嘧啶提取回收率在95.6%—99.8%之间，RSD在2.0%—2.6%之间；基质因子在0.92—0.96%之间，RSD在2.3%—3.5%之间；内标归一化的基质因子在0.99—1.00之间，RSD在1.7%—3.2%之间，符合相应指导原则规定，具体结果见表3.
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分别考察低中高浓度血浆质控品5种条件下的稳定性：室温放置12 h，4 ℃放置24 h，−20 ℃反复冻融3次，−80 ℃放置1个月，前处理后5 ℃自动进样器放置24 h. 每一项稳定性考察按1.4中的前处理方法处理6份样本，采用新配制的标准曲线计算5-氟尿嘧啶浓度，将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差RE应在±15%以内，具体测试结果见表4，结果表明，其均值与标示浓度的相对偏差RE均在−5.2%—1.7%之间，5-氟尿嘧啶血浆样本在日常检测和储存条件下稳定性良好，符合相应指导原则规定.
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收集本院使用5-氟尿嘧啶治疗的胃癌病例共15例，其中男性10例，女性5例，平均年龄63岁. 所有患者在5-氟尿嘧啶持续静脉滴注20—30 h时，采集外周静脉血，置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管中. 采样后立即置于冰浴，并于5 ℃以3 000 r·min−1离心10 min，将上层血浆置于−80 ℃保存. 15例病例5-氟尿嘧啶的稳态血药浓度为（412.56±156.67） ng·mL−1，中位血药浓度为422.72 ng·mL−1 （166.28—645.83 ng·mL−1）.
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通常蛋白沉淀会使用有机溶剂、无机盐及有机酸等. 本研究尝试使用甲醇及乙腈进行蛋白沉淀，但处理后的样本中含有大量有机溶剂，导致明显的溶剂效应，影响峰型及色谱分离，将蛋白沉淀后的样品溶液氮吹后用水复溶，会增加前处理时间，可操作性差；当使用三氯乙酸进行蛋白沉淀，虽可以避免溶剂效应，但是高浓度三氯乙酸的使用，抑制5-氟尿嘧啶负离子信号，且更容易污染质谱；最终选择了使用硫酸锌溶液作为蛋白沉淀剂，即避免了有机溶剂蛋白沉淀产生的溶剂效应，又避免了有机酸蛋白沉淀对负离子测定的影响. 使用硫酸锌溶液进行蛋白沉淀，参考1.4项下前处理方法，在200 ng·mL−1 5-氟尿嘧啶测试浓度条件下，对硫酸锌溶液浓度及用量进行优化，结合提取效率、基质效应及绝对响应强度，最终确定使用0.1 mol·L−1硫酸锌溶液作为蛋白沉淀剂，血浆样品及蛋白沉淀剂用量为1:3 （V:V）的最优方式.
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5-氟尿嘧啶分子量较小，结构中仅含有嘧啶杂环及氟原子，这导致5-氟尿嘧啶在常规C18色谱柱上很难保留，本研究尝试了不同品牌、不同规格C18色谱柱及HILIC色谱柱等，普通C18色谱柱保留效果均较差；HILIC色谱柱虽有较好保留，但需将蛋白沉淀后溶剂置换为乙腈，可行性差. 通过色谱柱优化，最终选择了Shimadzu Shim-pack GIST-HP C18-AQ色谱柱，该色谱柱为采用键合距离优化技术的C18柱，严格控制硅胶表面键合C18长链之间的距离，加大固定相与流动相尤其是水的接触面，从而可提高极性化合物的保留. 实验中该色谱柱对5-氟尿嘧啶具有较好保留，相对于同规格普通C18色谱柱，其保留时间可增长16%，色谱峰对称性好，峰型尖锐.
本研究考察甲醇及乙腈对色谱分离保留效果的影响，当使用乙腈为流动相时，其更优的洗脱能力导致保留效果相对于甲醇变差，且灵敏度下降至甲醇为流动相时12%. 当在甲醇中分别添加0.05%甲酸、2 mmol·L−1甲酸铵及2 mmol·L−1乙酸铵时，均会明显抑制5-氟尿嘧啶信号，强度分别降低为甲醇为流动相时3%、6%及6%，最终选择甲醇及水为流动相.
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本文使用硫酸锌直接蛋白沉淀法结合串联质谱，建立了血浆中5-氟尿嘧啶测定方法，并对前处理蛋白沉淀试剂的种类及用法用量、色谱柱、流动相组成比例等进行优化. 该方法以0.1 mol·L−1 硫酸锌作为蛋白沉淀剂处理血浆样品，离心后取上清液使用串联质谱直接测定. 本方法校准曲线相关系数大于0.999；质控品测定准确度结果与理论值接近，批内及批间准确度在94.8%—99.0%之间，RSD在0.9%—4.8%之间；5-氟尿嘧啶提取回收率在95.6%—99.8%之间；基质因子在0.92—0.96之间；内标归一化的基质因子在0.99—1.00之间；稳定性各实验条件下测定浓度的均值与标示浓度的相对偏差RE均在−5.2%—1.7%之间. 该方法前处理简便、分析速度快、灵敏度高、专属性强、稳定性好，可用于5-氟尿嘧啶治疗药物监测.
直接蛋白沉淀结合串联质谱法用于血浆中5-氟尿嘧啶治疗药物监测应用
Application of direct protein precipitation combined with tandem mass spectrometry in monitoring 5-fluorouracil therapeutic drugs in plasma
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摘要: 本文建立一种直接蛋白沉淀结合串联质谱法测定血浆中5-氟尿嘧啶浓度的方法. 以0.1 mol·L−1硫酸锌作为蛋白沉淀剂处理血浆样品，离心后取上清液直接测定. 以5-氟尿嘧啶-13C，15N2为内标标准品，采用Shimadzu Shim-pack GIST-HP C18-AQ (100 mm×2.1 mm I.D.，1.9 μm)色谱柱；水(Ａ相)-甲醇(Ｂ相)为流动相，梯度洗脱：0—1 min，5%B；1—2 min，5%B→95%B；2—2.5 min，95%B；2.5—2.6 min，95%B→5%B；2.6—5 min，5%B，流速：0.3 mL∙min−1；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；采用电喷雾离子源，负离子多反应监测模式(MRM)进行质谱定量分析. 检测离子对：5-氟尿嘧啶 m/z 129.1→42.1，5-氟尿嘧啶-13C，15N2内标标准品 m/z 132.1→44.1. 该方法校准曲线相关系数大于0.999. 质控品测定准确度结果与理论值接近，批内及批间准确度在94.8%—99.0%之间，RSD在0.9%—4.8%之间. 5-氟尿嘧啶提取回收率在95.6%—99.8%之间. 基质因子在0.92—0.96之间，内标归一化的基质因子在0.99—1.00之间. 稳定性各实验条件下每一测定浓度的均值与标示浓度的相对偏差RE均在-5.2%—1.7%之间. 该方法前处理简便、分析速度快、灵敏度高、专属性强、稳定性好，可用于5-氟尿嘧啶治疗药物监测.Abstract: To develop a method for the determination of 5-fluorouracil in plasma by direct protein precipitation coupled with tandem mass spectrometry. Plasma samples were treated with 0.1 mol·L−1 zinc sulfate as protein precipitator, and the supernatant was taken after centrifugation for direct determination. Using 5-fluorouracil-13C,15N2 as internal standards and Shimadzu shim pack GIST-HP C18-AQ (100 mm × 2.1 mm I.D., 1.9 μm) as chromatographic column; Water (phase A) - methanol (phase B) as mobile phase; Gradient elution: 0—1 min, 5% B; 1—2 min, 5%B→95%B; 2—2.5 min, 95%B; 2.5—2.6 min, 95%B→5%B; 2.6—5 min, 5% B; Flow rate: 0.3 mL∙min−1; Column temperature: 35 ℃; Injection volume: 5 μL; Mass spectrometry quantitative analysis was carried out by using ESI and multi reaction monitoring negative ion mode (MRM); Detection ion pair: 5-fluorouracil m/z 129.1→42.1; 5-fluorouracil-13C,15N2 internal standard m/z 132.1→44.1. The correlation coefficient was greater than 0.999. The determination accuracy of the quality control was close to the theoretical value. The intra batch and inter batch accuracy were in the range of 94.8%—99.0%, and the RSD were in the range of 0.9%—4.8%. The recovery of 5-fluorouracil were in the range of 95.6%—99.8%. The matrix factor were in the range of 0.92—0.96, and the normalized matrix factor of internal standard were in the range of 0.99—1.00. The relative deviation RE between each measured concentration and the marked concentration under all conditions of the stability test were in the range of -5.2%—1.7%. This method has the advantages of simple pretreatment, fast analysis speed, high sensitivity, specificity and good stability, and can be used for the monitoring 5-fluorouracil.
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表 1 MRM参数
Table 1. MRM parameters
名称 母离子（m/z） 子离子（m/z） Q1 Pre Bias /V CE/V Q3 Pre Bias/V 5-氟尿嘧啶 129.1 42.1 10 17 14 5-氟尿嘧啶-13C,15N2 132.1 44.1 10 17 14 
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表 2 准确度及精密度考察结果（n=6）
Table 2. Results of accuracy and precision （n=6）
质控品 浓度/（ng·mL−1） 批内 批间 准确度/% 精密度/% 准确度/% 精密度/% LQC 20 96.5 2.7 94.8 4.8 MQC 200 99.0 1.1 97.6 3.6 HQC 8000 97.7 0.9 97.1 1.7
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表 3 提取回收率及基质效应 （n=6）
Table 3. Extraction recovery and matrix effect （n=6）
考察浓度/ （ng·mL−1） 提取回收率/% RSD/% 基质因子 RSD/% 内标归一化基质因子 RSD/% 20 95.6 2.6 0.92 3.5 0.99 3.2 200 98.8 2.4 0.95 2.6 0.99 2.1 8000 99.8 2.0 0.96 2.3 1.00 1.7
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表 4 稳定性结果 （n=6）
Table 4. Stability results （n=6）
标示浓度/（ng·mL−1） 室温放置12 h 4 ℃放置24 h −20℃反复冻融3次 −80 ℃放置1个月 5 ℃自动进样器放置24 h RE% RSD/% RE% RSD/% RE% RSD/% RE% RSD/% RE% RSD/% 20 −4.4 2.7 −2.3 2.2 −4.3 2.8 −2.3 2.7 −5.2 3.1 200 −3.4 2.5 −2.1 2.5 −1.9 1.7 −2.6 2.5 −3.5 2.3 8000 −1.7 2.1 −0.8 1.7 0.2 1.9 1.7 2.1 −1.4 1.6
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