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我国经济快速发展导致水资源需求与水资源总量之间矛盾日益突出，生态环境用水被严重挤占。在此情势下，污水净化后补给生态用水成为普遍选择。我国现行的污水排放标准较为严格，污染物浓度含量较少，但若直接补给进入河流或湖泊等水体，仍将对水环境水生态造成冲击[1-2]。
贵州某酒厂污水处理厂承担着污水收集处理的功能，水质净化达到《发酵酒精和白酒工业水污染物排放标准：GB 27631—2011》的水污染物特别排放限值后，一部分回用于厂区杂用水，一部分排入盐津河并最终汇入赤水河。为了更好地保护赤水河，该酒厂拟对污水处理厂尾水进一步深度处理。
人工湿地技术由于具有运行费用低、管理维护简单等优点，广泛应用于市政污水、工业废水、农业污水、生活污水及暴雨径流的净化[3-5]。近年来，我国更是大量将人工湿地应用于再生水[6]、地表微污染水[7]等低浓度污水的处理。人工湿地主要由植物、基质、水及微生物组成，各部分相互依存、相互关联，共同形成一个半自然半人工的生态系统。基质在人工湿地中占有最大的体积，并在污染物净化去除中起着关键性作用[8]。围绕湿地基质对磷的吸附去除作用已有大量研究，筛选并提出了诸多适用于构建人工湿地的基质类型，主要包括自然基质（碎石、火山岩、沸石等）、人造材料（砖渣、陶粒等）及工业副产物（钢渣、赤泥、无烟煤等）3大类[9-12]。但是，即便同一种基质对不同磷浓度水体的吸附效果也存在较大差别[13-14]，这使得基质应用于该酒厂污水处理厂尾水净化时存在不确定性。
本研究共收集5种本地基质并选取另外3种常见基质，对各基质的磷吸附去除性能进行比较研究，筛选适宜于该酒厂尾水深度处理生态湿地构建的本地基质类型。
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仁怀市及酒厂生产厂区选择5种本地材料作为基质筛选对象：本地的碎石、石灰岩，厂区内的破碎陶罐、厂房废弃红砖，污水处理厂的曝气生物滤池（BAF）废弃滤料。此外，自遵义市某建材公司采购3种常用湿地基质作为实验对比：火山岩、沸石和陶粒。
8种实验材料人工破碎后，采用方孔筛筛分得到粒径0.85～2.00 mm的颗粒作为实验材料。实验材料先用纯净水振荡清洗1 h，再放入烘箱内60 ℃烘干24 h后备用。
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基质pH在水土比5∶1条件下测定：取过实验材料10 g及50 mL蒸馏水置于250 mL锥形瓶中，于空气振荡器内振荡5 min后静置10 min，取上清液测定。
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将10 g基质及100 mL含磷溶液置于250 mL锥形瓶中，随后加入3滴氯仿以防止微生物活动。混合溶液采用KH2PO4人工调配，主要污染物浓度为：总磷0.5 mg/L、pH7.8。
将锥形瓶盖严后置于空气振荡器中（室温20 ℃、转速100～110 r/min），取样时间分别为10、20、30、60、90和120 min及4、8、12、24和48 h。到达设定时刻后取出锥形瓶立即过滤，通过0.45 μm滤膜后测定溶解态的总磷浓度。每种基质的实验做3个平行。
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将10 g基质与100 mL含不同磷酸盐浓度的0.01 mol/L KNO3溶液共同置于250 mL锥形瓶中，随后加入3滴氯仿以防止微生物活动。磷酸盐浓度采用KH2PO4调配，共设置7个梯度，依次为0、0.14、0.28、0.7、1.4、2.8和4.2 mg/L。将锥形瓶盖严后放入空气振荡器中（室温20 ℃、转速100～110 r/min），震荡48 h，通过0.45 μm滤膜后测定溶解态的磷酸盐浓度。每种基质的实验做3个平行。
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采用X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析，型号为ThermoFisher ESCALAB 250Xi。
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水质分析采用国家标准监测分析方法[15]：总磷采用钼锑抗分光光度法；总氮采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法；氨氮采用钠氏试剂分光光度法。
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基于实验结果，基质的磷吸附量计算，见式（1）：
式中：P为单位基质的磷吸附量，mg/kg；ct为振荡后的溶液磷浓度，mg/L；c0为初始溶液磷浓度，mg/L；Ｖ为初始溶液体积，本实验均为0.1 L；M为实验基质的质量，本实验均为10 g。
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当磷平衡浓度较低时，基质的磷吸附量与磷平衡浓度呈现明显的线性关系，基质的初始含磷量（P0）可按式（2）通过线性拟合得出[16]。
基质的磷平衡浓度（Equilibrium P Concentration，EPC0）可由式（3）计算得出。EPC0指基质与溶液维持“吸附-解吸附平衡”的浓度。
式中：ce为震荡24 h后溶液平衡浓度，mg/L；Pa为达到震荡24 h后基质的磷吸附量，mg/kg；Kd为未考虑基质的初始含磷量P0的情况下，基质线性吸附系数，L/kg。
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所有实验数据采用EXCEL进行数据统计处理，采用OriginPro 2018制图。
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根据对磷酸盐的吸附能力对比，见图1，8种基质由大到小分别为：石灰岩>火山岩>沸石>陶罐>陶粒>碎石>红砖>BAF滤料。BAF滤料不仅不具有吸附能力，反而出现磷酸盐释放现象，其原因在于：本研究采用的BAF滤料在污水处理厂中已运行较长时间，不仅已吸附了较多的磷酸盐还附着有部分微生物；而本研究采用的磷酸盐浓度较低，在振荡过程中促使滤料表面的磷酸盐往溶液中释放。红砖及碎石对磷酸盐的吸附能力较低，48 h对磷酸盐的吸附去除率不足20%。其余5种基质则表现出一定的吸附能力，48 h对磷酸盐的吸附去除率均在60%以上。
本研究开展的吸附动力学实验持续时间为48 h，石灰岩、火山岩、沸石、陶罐和陶粒5种吸附效果较好的基质在24 h后的磷酸盐吸附效果均不同程度地减弱。尤其是石灰岩在24 h已将溶液中的磷酸盐溶度从0.5降至0.03 mg/L的极低水平，在24～48 h期间基本未表现出吸附能力。根据这5种基质的吸附特征，以其构建人工湿地的水力停留时间至少应在48 h以上，以充分发挥基质的吸附性能。
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基于吸附动力学实验结果，选择石灰岩、陶罐、碎石3种具有吸附能力的基质以及对照基质火山岩开展吸附等温实验，以探究基质的磷吸附理论平衡浓度，从而判定其作为湿地基质的潜力。
根据实验结果，见图2，溶液磷酸盐浓度越高、基质的磷吸附量也更大：在磷酸盐浓度0.14 mg/L时，石灰岩的磷吸附量1.40 mg/kg为陶罐的3.03倍，但在当磷酸盐浓度为4.2 mg/L，石灰岩的磷吸附量18.13 mg/kg达到碎石的6.87倍。值得注意的是，当初始磷酸盐浓度大于1.4 mg/L时，碎石的磷吸附量开始大于陶罐，表明碎石更适合于高浓度含磷污水净化。
将磷平衡浓度与基质磷吸附量线性拟合，见图3。随着溶液初始磷浓度的升高，基质的磷吸附量也相应增大，而石灰岩、火山岩的磷吸附量增大趋势明显高于碎石和陶罐。这印证了DRIZO et al[13]结论，即溶液初始磷浓度对基质的磷吸附量有着显著影响。
基于拟合结果，采用式（3）可计算得到各基质的磷平衡浓度。EPC0的意义在于，当溶液浓度为EPC0时，基质在该溶液中既不发生磷吸附，也不出现磷的解吸附。因此，对于净化低磷酸盐浓度水体而言，基质的EPC0较为关键，EPC0偏高则意味着该基质无法将水体中的磷酸盐净化到较低水平。根据表1计算结果，4种基质磷平衡浓度均极低，表明均适宜于净化低磷酸盐浓度的水体。
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8种基质材料的pH见图4。在8种基质中，火山岩pH最低为6.54，呈现弱酸性；其他基质均呈现弱碱性，pH值在7.38～8.49之间。
由XPS测定的碎石、陶罐、石灰岩和火山岩化学组成，见表2。碎石、石灰岩和火山岩属于天然材料，O元素含量总体较高；陶罐属于人工材料，由于烧结过程中O损失，因而氧含量总体低于天然材料。
基质对磷的吸附效果受到环境温度、pH和水体磷浓度等多因素影响[17]，但化学组成被认为是关键因素，尤其是Al、Fe、Ca、Mg等元素，无定形态的金属元素越多、基质的理论磷吸附效果往往越大[18]。石灰岩含有31.95%的Ca元素以及1.06%的Mg元素，pH为8.17，偏碱性的特性有利于其发挥Ca、Mg离子的物理和化学吸附作用。火山岩含有11.56%的Fe元素以及7.04%的Al元素，pH为6.54，偏酸性的特性使Fe、Al离子发挥磷去除能力。而碎石、陶罐的Al、Fe、Ca、Mg元素含量相对更少，磷去除能力也表现得更低。
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（1）8种湿地基质在净化含磷浓度0.5 mg/L的溶液时，吸附能力由大至小为：石灰岩>火山岩>沸石>陶罐>陶粒>碎石>红砖>BAF滤料。BAF滤料在实验中出现磷的解吸附现象，红砖及碎石对磷酸盐去除率不足20%，其余5种基质对磷酸盐去除率在60%以上。
（2）对石灰岩、陶罐、碎石和火山岩的吸附等温实验结果表明；随着溶液初始磷浓度的升高，石灰岩、火山岩的磷吸附量增大趋势明显高于碎石、陶罐；4种基质的磷平衡浓度均极低，均适宜于净化低浓度含磷废水。
（3）石灰岩较高的磷去除能力在于较高的Ca、Mg元素含量，火山岩在源于其较高的Fe、Al元素含量，而碎石、陶罐的Al、Fe、Ca、Mg元素含量相对较少，磷去除能力也更低。
（4）该酒厂采用本地基质构建生态湿地时，建议以石灰岩为主，适量使用碎石、陶罐。
适用于贵州某酒厂生态湿地除磷的本地基质筛选研究
The local substrates for phosphorus removal in ecological wetlands of a distillery in Guizhou Province
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摘要: 为筛选适宜于贵州某酒厂生态湿地构建的本地基质，对贵州5种本地基质及3种常用基质开展实验研究。结果表明：各基质净化含磷浓度0.5 mg/L溶液的吸附能力由大至小为：石灰岩>火山岩>沸石>陶罐>陶粒>碎石>红砖>BAF滤料；石灰岩、陶罐、碎石、火山岩4种典型基质的磷平衡浓度均极低，均适宜于净化低浓度含磷废水；石灰岩31.95%的Ca元素及1.06%的Mg元素是其对磷吸附能力较强的原因所在，火山岩则缘于11.56%的Fe元素及7.04%的Al元素含量，而碎石、陶罐的Al、Fe、Ca、Mg元素含量相对较少、磷去除能力较低。综合来看，该酒厂采用本地基质构建生态湿地时，可以石灰岩为主，适量使用碎石、陶罐。Abstract: To select the suitable local substrates for the construction of an eco-wetland in a distillery in Guizhou Province, experimental studies were conducted on 5 local substrates and 3 common substrates. The results showed that the adsorption capacities of the substrates to purify a 0.5 mg/L phosphorus solution, from highest to lowest, were limestone > volcanic rock > zeolite > pottery pot > ceramsite > crushed stone > red brick > BAF filter material. The phosphorus equilibrium concentrations of limestone, pottery pot, crushed stone, and volcanic rock were low, which were suitable for purifying a low-concentration phosphorus-containing wastewater. Limestone had a higher phosphorus adsorption capacity due to 31.95% Ca and 1.06% Mg. Volcanic rocks had 11.56% Fe and 7.04% Al. While gravel and pottery pots had relatively low Al, Fe, Ca, and Mg contents with a low phosphorus removal capacity. When constructing an eco-wetland using a local matrix in the distillery, limestone could be used as the primary substrate, with a moderate use of gravel and pottery pot.
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水是江南园林的重要组成部分，素有“无水不成景、无水不成园”的说法[1]。水体水质好坏会在很大程度上影响到园林景观，但大多数园林水体的流动性较差、水域面积较小、自净能力偏弱，容易受到降雨径流等外源污染的冲击[2-3]。为提高水体自净效果，一般需要采取人工曝气、旁路过滤和生态浮床等强化措施。但这些方法普遍存在施工量较大、运行维护要求较高和对周边景观影响较大等问题[4–6]。
固定化生物膜技术是一种将微生物固定在一定载体上，通过增加单位水体生物量的方式，提高功能菌对污染物的降解效能的技术。该技术已被广泛应用于河湖水体的水质净化工程。WEN等[7]以玉米芯、麦秆和花生壳等为代表的生物质碳源作为固定化载体，形成的生物膜能释放有机物和氮磷等基质，促进微生物在其表面附着生长，但生物质碳源中有机物的释放速率呈现先快后慢的特点，不利于水体水质的长效治理[8]；NI等[9]在纤维生物滤池 (Fiber Biofilter) 中将聚合物填料作为微生物的固定化载体，并将形成的生物膜用于水产养殖中将有机物降解，以及将氨氮转化为硝酸盐；TABASSUM等[10]以粉末状活性炭和水性聚氨酯凝胶包裹的硝化细菌作为固定化载体 (Mass Bio System) ，形成生物膜被用于快速提升水体硝化活性。
近年来，有研究者提出了一种将具有很高的生物亲和性，能以相对恒定的速率向水体释放碳源的新型生物蜡作为微生物固定化载体的技术。该生物蜡可促进生物膜的形成，适合用于治理微污染水体[11]。目前，将生物蜡技术用于封闭园林水体水质改善与长效保持的研究仍鲜有报道，生物膜的主要功能尚不清楚。为此，本研究选取典型的江南园林水体，通过对比投放生物蜡模块前后主要水质指标的统计学变化，从工程应用的角度论证新型固定化生物膜技术对小型半封闭水体的水质净化效能，并采用高通量测序技术，对水体、沉积物和生物膜中的菌群结构功能进行分析，系统阐述利用生物蜡技术实现水质净化的关键反应机制，以期为江南园林水体的原位净化与长效保持提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验地点
实验地点选取典型的江南园林水体——苏州科技大学石湖校区九曲桥 (31°15′17.88″N,120°34′56.30″E)，水域面积约为1 200 m2，平均水深0.6~0.7 m，池底无水生植物，周边有茂密的陆生植被，定期与外部河道进行换水操作，如图1所示。该水体在春夏季受河道进水、降雨径流和内源污染等影响，容易发生局部水华现象。
研究于2021年2月—6月开展，对水体本底值进行监测，并于当年10月份投放生物蜡模块。待生物蜡挂膜成功后，于次年2—6月开展水质常规监测，以评估水体水质变化，监测频次均为每周2次。据调查，2021年苏州市平均气温 18.3 ℃，降水量1 318.6 mm，2022年平均气温 18.1 ℃，降水量1 004.2 mm。2021年和2022年苏州春夏季降雨量、平均气温相差不大，降雨形成的地表径流和树木落叶是潜在的外源污染。水体换水周期为每季度3~4次，每次换水耗时约1~2 d，其余时间水体基本处于静止状态。
1.2 生物蜡投放
生物蜡是一种采用微晶蜡固定脂肪酸 (碳源0.5%，微量元素0.1%，其他为石蜡 (标号56#) ) 的块状基质，整体呈黑色[12-13]。在水体中设置有12个投放点，平均每100 m2水面投放1块0.317 m×0.220 m×0.025 m，重1.25 kg的生物蜡。利用浮漂和配重将生物蜡模块直立悬浮在水中，如图2 (a) 所示。在水流和微生物作用下，生物蜡缓慢释放营养物质，有效促进土著微生物在其表面生成稳定的生物膜结构，期间不投加任何菌种。生物蜡挂膜周期约3个月，成熟的生物膜形态如图2 (b) 所示。
图 2 生物蜡组合示意图及生物膜形态Figure 2. Schematic diagram of Bio-wax combination and Biofilm morphology1.3 水质指标分析
使用EXO水质分析仪 (YSI，USA) 现场测定了叶绿素a的浓度，使用赛氏盘现场测定了透明度。使用国标法测定水样的氨氮 ([NH4+-N]) 、总氮 (TN) 、总磷 (TP) ，使用重铬酸盐法测定水样COD。
1.4 微生物高通量测序
2022年7月，分别采集水体中水样 (Water) 、沉积物 (Sediment) 和生物蜡表面生物膜 (Biofilm) 样品。水样经0.22 μm孔径滤膜过滤后，与其他固态样品一同-80 ℃条件下保存。使用试剂盒 (Fast DNA Spin kit for soil，M.P。Company，U.S.) 对各组样品进行DNA提取，每组设置3个平行样。使用引物338F ( 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') 和806R ( 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') ，进行16S rRNAV3-V4区基因扩增。PCR扩增完成后，用AxyPrepTM DNA凝胶提取试剂盒 (Axygen Biosciences，Union City，U.S.) 对产物进行纯化。将处理完成后的样品送往Illumina MiSeq 测序平台进行高通量测序。
1.5 细菌群落多样性分析
使用Usearch (version 11) 以97 %的相似性对OTU代表序列进行分类学分析。基于抽平后的OTU数据集，使用Uparse (version 11) 计算了α多样性指数 (Chao1和Shannon指数) ，并进行 (PCoA) 主坐标分析。在门和属水平上，比较了不同介质菌群结构的差异性。采用Kruskal-Wallis 秩和检验方法检验对多组样本进行物种组间差异显著性检验。使用Gephi (version 0.10.1) 分析不同介质细菌在属水平上的共现性网络。使用Faprotax预测不同介质细菌的潜在代谢功能。
2. 结果与讨论
2.1 投放前后理化性质分析
图3所示为投放生物蜡前后水体的各项监测数据，修复前为红色，修复后为蓝色。2021年2—6月：水体的COD、氨氮、总氮和总磷服从正态分布，均值分别为 (35.74±7.01) mg·L−1、 (0.91±0.43) mg·L−1、 (1.90±0.61) mg·L−1、和 (0.34±0.07) mg·L−1，离散系数分别为0.20、0.47、0.32和0.21；池体平均透明度为 (0.41±0.03) m，低于苏州水体均值0.51 m[14]；叶绿素a的平均质量浓度为 (19.90±1.20) μg·L−1，高于苏州河道春夏季均值15.36 μg·L−1，这表明该水体属于轻度富营养化程度[15-16]。2022年2—6月：水体的COD、氨氮、总氮和总磷平均值分别为 (27.12±4.88) mg·L−1、 (0.48±0.21) mg·L−1、 (1.10±0.32) mg·L−1和 (0.26±0.05) mg·L−1，较2021年同期分别下降24.12 %、47.25 %、42.11 %和23.53 %，各项指标的离散系数降至0.18、0.44、0.29和0.19；水体透明度平均值升高至 (0.53±0.05) m；叶绿素a平均质量浓度降至 (15.96±0.96) μg·L−1，这表明该水体富营养化程度有所改善。与生物蜡的多种修复功能相比，传统的硅藻土和多孔黏土材料等生物膜载体仅能用于提高水体的生物量，改善部分指标[17-18]。
图 3 生物蜡投放前后，九曲桥主要水质指标的浓度分布情况Figure 3. Concentration distribution of major water quality indicators按照监测次数计算，2021年2—6月，COD、总氮、氨氮和总磷达到《地表水环境质量标准》 (GB3838-2002) Ⅳ 类标准的百分比分别为22.5 %、90.0 %、32.5 %和30.0 %。除受外河水质影响外，九曲桥周边分布有大量落叶乔木和灌木，落叶等凋落物是造成水体氮磷超标的重要源头之一[19]。2022年2—6月，水体COD、总氮、氨氮和总磷的Ⅳ类水达标率分别较2021年同期提高了3.0倍、1.1倍、2.1倍和2.3倍，九曲桥春夏季的水质得到明显改善 (图4) 。
图 4 生物蜡投放前后，九曲桥水体表观情况变化Figure 4. Changes in water body phenology before and after bio-wax placement in Jiujuqiao2.2 功能菌群在不同介质中的分布
图5 (a) 表明，生物蜡表面生物膜的微生物丰度 (Chao1指数) 和多样性指数 (Shannon指数) 与水体接近，均明显低于沉积物的水平。这可能是由于在水流扰动作用下，沉积物-水体界面更容易形成基质梯度 (如溶解氧) ，进而形成显著的生态位分化，有利于不同功能菌群的协同生长[20-21]。
基于Bray-Curtis距离法的PCoA分析结果表明 (图5 (b) ) ，生物膜在PC1维度 (解释度52.73%) 上介于水体和沉积物之间，在PC2维度 (解释度36.21%) 上与水体和沉积物均存在很大差异。生物膜和水体、生物膜和沉积物共有的OTU数量分别为798个和1 024个，分别占生物膜OTU总数的53.3%和68.4%。相比之下，生物膜中特有的OTU数量为264个，仅占到总数的17.6%。这说明生物膜主要由水体的土著微生物构成，悬浮的生物蜡模块不仅提高了水体中的微生物总量，还改变了微生物的空间分布形态，为降解水中污染物创造了有利条件。
如图6所示，水体样品中的优势菌门分别为变形菌门 (Proteobacteria，相对丰度38.42 %) 、放线菌门 (Actinobacteriota，33.30 %) 、蓝藻门 (Cyanobacteria，14.44%) 、拟杆菌门 (Bacteroidota，5.32 %) 和厚壁菌门 (Firmicutes，4.97 %) 。变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和蓝藻门在水体中的富集与其轻度富营养化状况是一致的[22-23]。在沉积物中，丰度前5的菌门包括变形菌门 (Proteobacteria，25.65 %)，绿弯菌门 (Chloroflexi，14.78 %)、厚壁菌门 (Firmicutes，9.47 %) 、脱硫菌门 (Desulfobacterota，8.43 %) 和硝化螺旋杆菌门 (Nitrospirota，5.80 %) 。其中，绿弯菌门和厚壁菌门的富集与沉积物中典型的缺氧环境密切相关[24]。相比之下，生物膜中变形菌门的相对丰度最高，达到69.36 %，随后为蓝藻门 (Cyanobacteria，7.79%)、蛭弧菌门 (Bdellovibrionota，6.67%)、放线菌门 (Actinobacteriota，5.22 %) 和拟杆菌门 (Bacteroidota，2.64 %) 。通常认为，变形菌门具有较强的有机物和营养盐代谢潜力，同时，其能够分泌大量胞外聚合物 (EPS) ，为生物膜的形成提供了重要的结构性物质[25-26]。此外，蛭弧菌门在生物膜中的相对丰度分别为水和沉积物中的43.47 倍和159.38 倍。作为典型的掠食性细菌，蛭弧菌门的生长说明生物膜中形成了更长的食物链和更强的淘汰压，有利于形成特定功能化的菌群结构[27]。
图 6 不同介质的细菌群落在门水平上的菌群结构组成Figure 6. Structural composition of bacterial communities in different media at the gate level如图7所示，通过在属水平上比较不同介质的细菌群落组合，可获得更详细的生态位信息。LEfSe (LDA Effect Size) 分析 (LDA>4) 表明水体中有Acinetobacter (变形菌门，3.63 %) 、 Aurantimicrobium (放线菌门，2.73 %) 、CL500-29_marine_group (放线菌门，3.40 %) 等12个属与其他介质存在显著差异，其中，Acinetobacter、Limnohabitans、CL500-29_marine_group和Polymucleobacter分别在硝化[28]、硝酸盐还原[29]、反硝化[30]和溶解性有机物降解[31]等碳氮循环的过程中发挥作用。具有溶磷能力的Exiguobacterium含量相对较少，这可能是水体磷元素去除率低的原因。沉积物中有norank_f_norank_o__SBR1031 (绿弯菌门，3.00 %) 、Sva0485 (Sva0485门，2.27 %) 、Anaeromyxobacter (黏球菌门，3.18 %) 等5个属与其他介质存在显著差异，其中norank_f_norank_o__SBR1031可利用多种有机物进行发酵生长，在清除微量有机物方面有积极作用[32]。生物膜中有Aquabacterium (变形菌门，16.25 %) 、Hydrogenophaga (变形菌门，7.23 %) 、Caulobacter (变形菌门，3.14 %) 等7个属与其他介质存在显著差异。同时生物蜡表面的生物膜上存在厌氧或厌氧兼性的反硝化细菌[33] (如Hydrogenophaga和Caulobacter) 和异养硝化-好氧反硝化细菌[34] (如Novosphingobium和Sulfuritalea) ，这些细菌为水体氨氮的高去除率和高达标率提供了前提条件。水环境中活性有机物降解菌和反硝化菌的明显增加，可有效减少耗氧污染物，提高水体的承载能力，有利于水质的改善。与玉米芯等生物质碳源作为固定化生物膜载体类似，投加生物蜡选择性地促进了具有固氮和反硝化能力的氮循环微生物的生长[35]。
图 7 不同介质细菌群落的属水平LEfSe分析 (LDA>4)Figure 7. Genus-level LEfSe analysis of bacterial communities in different media (LDA > 4)2.3 不同介质中的菌群间功能预测
如图8所示，尽管沉积物中的微生物多样性远高于水和生物膜，但生物膜上形成了更为复杂的微生物关联关系。水体、沉积物和生物膜中丰度前50的菌属之间边数分别为448条边、396条边和446条边。从共现网络发现，水体和生物蜡表面微生物的相互作用主要以变形菌门、放线菌门和拟杆菌门为主，而沉积物中相互作用的微生物具有很高的均质性，以变形菌门、绿弯菌门和脱硫菌门为主。生物膜网络中的正相关性最高，而天然环境中的网络正负相似。这表明在生物膜上微生物之间发生了更紧密的共生关系，互利的共生关系可能涉及代谢物的交换、基因和电子的转移以及信号分子的传输[36]， 生物蜡持续释放微生物生长基质有利于在生物膜中形成复杂的关联网络。目前，生物蜡对不同种土著微生物的选择性富集机理尚不清楚，有待后续探究。
图 8 不同介质中前50属的共现网络图 (r2>0.7，p＜0.001)Figure 8. Co-occurrence network plots of the top 50 genera in different media (r2 > 0.7，p < 0.001)共现网络的关键物种对潜在的微生物功能很重要，是细菌群落结构和生态系统稳定性的驱动力，与不同介质的代谢循环密切相关[37]。作为水体的关键物种，拟杆菌门的pseudarcicella利用藻类分解物中的多种物质 (碳水化合物，氨基酸，丙酮酸) 作为其碳源，且更适宜在贫营养低浊度环境下生存[38]，hgc I_clade、Flavobacterium等具有溶藻能力的细菌[39]，能与pseudarcicella形成“微循环”，增强水体的藻类分解和有机物去除能力。沉积物中脱硫菌门的Syntrophus 可能与硫酸盐还原有关，能在厌氧条件下以硫化物、元素硫、硫代硫酸盐和氢为电子供体，以硝酸盐为电子受体进行硫代谢[40]。生物膜上的关键物种是来自变形菌门的Limnohabitans，其在水体中含量更高，但在生物膜上与其他微生物具有更强的联系， Limnohabitans自身参与氮素营养盐还原[41]，可为好氧反硝化细菌如Hydrogenophaga、Aquabacterium和Rhodobacter等提供电子受体[42]，进一步稳定生物膜的菌间关系，强化水环境的氮循环能力。
图9所示的Faprotax预测常用于描述菌群的代谢功能和生态位信息。水体中碳氮代谢的功能基因丰度较高，包括methanotrophy、methylotrophy、methanol_oxidation、nitrate_ammonification、nitrite_ammonification和nitrogen_fixation等，同时，也存在一定的致病风险 (如human_gut、manmal_gut) 。在沉积物中，sulfur_respiration、sulfite_respiration等硫循环功能基因占据主导。相比之下，生物膜中chemoheterotrophy、photoautotrophy和phototrophy等碳循环和nitrate_reduction、nitrogen_respiration、nitrate_respiration等氮循环功能基因丰度明显提高。尽管部分致病基因也得到了富集，但生物膜中未检出chloroplasts等藻类代谢基因，具有较高的功能化特征。
图 9 不同微生物样本中菌群功能基因的Faprotax预测结果Figure 9. Faprotax prediction results of functional genes of flora in different microbial samples生物蜡技术的微生物反应机制如图10所示。生物蜡能富集水体和沉积物的土著菌种，与上述关键物种功能研究一致，各个介质的关键物种介导了各个介质的核心功能，且水体中主要存在的厌氧消化相关碳循环功能和生物膜上的硝态氮还原相关氮循环功能可进行耦合，进行碳和氮的同时去除[43]。沉积物中硫循环基因的主要代谢过程是将水环境中的硫元素转化为H2S，此过程更容易在厌氧或缺氧环境下进行[44]，生物膜的关键物种 Limnohabitans可能会为此过程提供电子受体以促进沉积物硫代谢。功能预测结果表明，生物膜缺少典型的磷循环功能基因，考虑到修复后池体透明度得到改善，推测磷的去除途径主要是生物膜的吸附和含磷颗粒物的沉降，具体磷的去除路径需要在后续研究中进一步阐述。建议种植苦草等水生植物来协同磷元素的去除[45]。研究表明，在园林水体中不同环境介质上微生物功能存在显著的差异性，但水动力、季节更替等自然条件对生物膜功能的影响尚不明确，还需要后续进行研究。
图 10 生物蜡技术的微生物反应机制 (*关键物种)Figure 10. The microbial reaction mechanism of bio-wax technology (*keystone species)3. 结论
投放生物蜡使水体的COD、氨氮、总氮和总磷分别降低了24.12 %、42.11 %、47.25 %和23.53 %，而且可长期保持在较低水平。同时发现：1) 生物蜡表面生物膜中82.4%的OTU都来源于水体和沉积物，以变形菌门为主，占69.36%，其中以Aquabacterium (变形菌门) 和Hydrogenophaga (变形菌门) 为主要的属。相关性分析筛选出水体的pseudarcicella属 (拟杆菌门) 、生物膜的Limnohabitans属 (变形菌门) 、沉积物的Syntrophus属 (脱硫菌门) 是各个介质的关键物种；2) 生物膜上的光能自养、化能异养和亚硝酸盐去除等核心功能呼吸加强了水环境中有机物的降解和氮化合物间的转化，实现了水体的碳氮耦合，能够增强沉积物的硫代谢能力，提高水环境的污染物降解能力。
生物蜡在促进微生物生长的同时可有效截留生物量，显著提高水体透明度和抑制藻类生长。与颗粒物对磷酸盐的吸附作用类似，生物吸附可能是导致水体总磷浓度降低的重要原因。在后续治理中，建议在池底分区种植能与生物蜡协同的苦草、狐尾藻和轮叶黑藻等水生植物，进一步提高水体除磷效能，同时，采取打捞池中落叶和池底淤泥等管理措施，有效削减内外源强，实现水质长效保持目标。
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图 2 不同初始磷浓度条件下的基质吸附表现
Figure 2. Adsorption performance of substrates under different initial phosphorus concentrations
表 1 基质磷吸附特性参数
Table 1. Characteristic parameters of substrates phosphorus adsorption
基质 Kd/L·g−1 P0/mg·kg−1 EPC0/mg·L−1 碎石 0.632 45 0.817 66 0.001 29 陶罐 0.478 62 0.805 76 0.001 68 石灰岩 7.029 38 1.582 57 0.000 23 火山岩 6.100 51 1.354 74 0.000 22 
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表 2 基质化学组成
Table 2. Chemical composition of substrates
基质 化学组成/%a Si Ca O Fe Al Mg 碎石 15.38 7.68 46.89 1.86 4.74 0.75 陶罐 35.67 13.22 20.39 6.62 3.54 0.42 石灰岩 4.39 31.95 37.35 0.76 1.87 1.06 火山岩 21.23 6.96 39.72 11.56 7.04 3.28 注：“a”为该比例为各主要元素的相对质量百分比。
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