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盐酸林可霉素（LCM）属于林可酰胺类抗生素，用于治疗各种细菌感染，对革兰氏阳性菌有灭杀作用，因此广泛应用于人类及兽类相关疾病的治疗、预防等等领域[1]. 动物及人体代谢相关研究表明，该药物在体内代谢速度慢，人体有大概5%—15%的LCM以原形排出，而动物体内60%的林可酰胺类药物以原形排出[2-3]，因此相当部分LCM会排泄出体外并进入环境水体. 然而却很少有针对LCM在自然条件及人工强化条件下降解的去除研究，同时对其降解过程的中间产物、降解路径也知之甚少.
在污水处理厂或自来水厂中，UV/H2O2结合是去除水中污染物的有效间接光降解方法之一[4-6]. 其主要原理被认为是通过H2O2的光解产生活性较强的羟基自由基（·OH），羟基自由基（·OH）可以以很高的速率并且非选择性地氧化有机污染物[7-8]，同时在该反应过程中不会引入新的污染物. 因此本文主要研究LCM在UV/H2O2体系中不同条件下的降解情况，同时通过鉴定LCM降解过程的中间产物，提出LCM在该反应中的降解途径，并对反应过程的中间产物进行毒性预测. 为水环境中残留的林可酰胺类的抗生素类药物的去除与控制提供有效思路，为水质安全保障提供理论依据和技术支撑.
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实验材料：盐酸林可霉素（纯度>95%）购自于麦克林试剂（上海），乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）购自于Honeywell试剂（广州），乙酸铵（HPLC）、异丙醇（HPLC）购自于科密欧试剂（上海），30%过氧化氢（H2O2）、硫代硫酸钠、腐殖酸购自于阿拉丁试剂（上海）.
实验仪器及分析软件：岛津TOC-L VCPN、高效液相色谱质谱联用仪（HPLC-MS/MS, 5500 Q-trap, AB Sciex, USA）、高效液相色谱串联飞行时间质谱仪（AB-Triple TOF 5600+, LC20D HPLC, X500R, AB SCIEX, USA）、SCIEXOS（1.3.1）、TEST，version 5.1,EPA,USA、磁力搅拌器、pH计（PHS-3E）、紫外光灯（20 W，254 nm）.
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该实验使在配备有20 W且波长为254 nm的紫外光灯的台式设备下进行，具体实验装置见图1. 在直径为10 cm的结晶皿中加入100 mL初始浓度为10 mg·L−1的LCM和H2O2的混合溶液，研究不同条件下对LCM降解影响. 在一定时间间隔取样1 mL的样品放入离心管中，在实验过程中利用硫代硫酸钠进行淬灭反应，每组实验均设置3组平行样.
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使用HPLC-MS/MS测定实验过程中LCM的浓度变化情况. 使用C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm，SHARPSIL-U）以0.3 mL·min−1的流速分离相关组分，进样量为5 μL. MS/MS检测器的操作参数见表1. 母离子/子离子的选择及碰撞能量见表2.
使用LCMS-TOF 5600+（LC-TOF-MS）分析了LCM在UV/H2O2过程中的降解产物. 使用ZOBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）以0.3 mL·min−1的流速分离相关组分，进样量为5 μL.
使用岛津TOC-L VCPN分析仪测量降解过程中的总有机碳（TOC），通过TC-IC法测量TOC的衰减来评估实验期间LCM的矿化程度，以对LCM的降解程度进行评估.
利用软件工具（TEST, version 5.1,EPA,USA）来预测中间产物的潜在毒性. 该软件是根据化学结构的物理特性预测毒性的数学模型，可提供48 h水蚤LC50预测值、大鼠口服LD50数据集值、Ames诱变值等.
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图2为pH7.3时LCM在不同条件下的降解情况. 结果表明，仅有紫外线照射时LCM几乎不发生分解，该现象与Paola等的研究一致[9]，同时在仅有H2O2条件下LCM也基本不会被氧化. 但在UV/H2O2的共同作用下，LCM可被迅速降解，且反应先快后慢，如反应5 min时即可被去除60%，15 min后反应速率显著降低，至反应结束30 min时去除率可达98%. 这是因为紫外线可以直接激活H2O2产生羟基自由基，如公式（1）和公式（2）所示·OH具有极强的得电子能力，其氧化电位为2.8 V，可以通过寻找氢、加成和电子转移等方式攻击有机化合物[5,10].
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在UV/H2O2体系中研究了10—90 mg·L−1的H2O2浓度对LCM分解的影响. 在本研究中，利用准一级动力学方程拟合水该反应的实验数据. 拟合结果表明，投加不同浓度的H2O2，该反应体系的R2均大于0.95，因此该反应过程服从准一级反应动力学，这与大多数药物的光化学降解遵循准一级动力学模型相同[10-12].
其中，C0（mg·L−1）为LCM初始浓度，C（mg·L−1）为t时刻LCM浓度；k（min−1）为拟一级降解速率常数；t（min）是反应时间. 检测反应中LCM浓度随时间的变化情况，拟合–ln（C/C0）—t绘制图3.
当H2O2浓度从10 mg·L−1逐渐增加时，由于更多的紫外线被H2O2吸收，产生的羟基自由基也随之增加，导致反应速率加快. 因此，当H2O2浓度为10 mg·L−1时，一级反应速率常数为0.0615 min−1，随着H2O2浓度增大，反应速率常数也随之增加，在浓度为50 mg·L−1时，速率常数达到0.1286 min−1，这时再增加H2O2的浓度，反应速率开始降低，当浓度为90 mg·L−1时，反应速率为0.0875 min−1. 这种现象是因为在较高的H2O2浓度下，羟基自由基会与过量的H2O2反应生成过氧自由基，并且新生成的过氧自由基也会与H2O2反应，导致H2O2的利用率降低. 从而造成了投加高浓度的H2O2时，该反应的降解速率反而降低，在利用UV/H2O2体系降解药物的许多研究中都出现了类似的情况[10,12-13].
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为了探究环境条件对LCM降解的影响，研究了LCM在不同pH和不同浓度腐殖酸时的降解情况（如图4）. 在pH较低的时候发现LCM表现出了极好的降解速率，随着pH的增大，降解速率逐渐降低. 这可能是由以下原因造成的，一方面是LCM在酸性条件下的不稳定性，导致其在酸性条件下更容易被分解，导致降解速率较高[14]. 另一方面是在碱性条件下·OH容易与OH-发生反应形成O·－，如公式（4），而O·-的氧化能力比·OH低；并且HO2-与H2O2反应，降低了H2O2的利用率，从而间接减少了羟基自由基的形成，如公式（5）；此外H2O2在碱性条件下会加快自我分解，也会导致产生的羟基自由基减少，如公式（6）[12-13,15]. 因此在天然水体中利用UV/H2O2去除LCM可以通过调节pH至酸性或中性，以加快反应速率.
由于腐殖酸是地表水体中常见的溶解性有机物，并且会清除自由基，从而降低反应速率[16-17]；也有报道称，腐殖酸可以与水生环境中的污染物反应形成光氧化剂来促进反应[18]. 因此，为了研究腐殖酸对LCM降解过程的影响，投加不同浓度的腐殖酸到UV/H2O2体系中. 实验结果表明，即使少量的腐殖酸也会对该反应产生抑制效果，并且随着腐殖酸的添加，LCM的降解速率不断降低. 因此，该体系中存在腐殖酸会降低LCM的降解速率，如果在天然水体中去除LCM，应该先去除腐殖酸以达到较好的降解效果.
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LCM是一种抗生素，属于林可酰胺类，由吡喃糖环、酰胺部分和吡咯烷环组成，LCM中有两个可能的氧化攻击位点：硫甲基和吡咯烷氮[9,19]. 为了研究LCM在UV/H2O2体系中的降解机理，以及对LCM降解过程中产生的中间产物进行毒性预测，使用LC-TOF-MS分析和电喷雾电离（ESI）检测来鉴定降解过程中的中间产物.
根据保留时间、分子离子、质量碎片离子和经验公式，在LCM降解过程中共鉴定出22种主要副产物（TPs），其中16种为比较确定的产物结构，6种为猜测可能存在的产物结构. LCM的C—S键容易受到·OH的攻击，造成硫甲基的脱离[20]；LCM的酰胺部分和吡喃糖环上会失去羟基和丢失一分子水，吡咯烷环上会失去一分子水，并且还会发生吡喃糖环的裂解[19]. 根据鉴定的中间产物的结构式，提出了以下LCM的6种降解途径（图5）.
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使用TOC-L VCPN分析仪测定了LCM在UV/H2O2处理过程中总有机碳（TOC）的变化. 如图6所示，反应20 min后，LCM的去除率为92%，但TOC基本保持不变. 反应30 min后，LCM的去除率达到98.4%时，TOC仅下降0.8%；在继续反应过程中，当反应时间为60 min时，TOC去除率为28.4%.
由此可见，在短时间内大部分LCM在降解过程中分解为中间有机产物，仅有少部分LCM完全矿化，然而在长时间的反应过程后，LCM可能最终会被完全矿化，但该过程缓慢，在环丙羧酸和双氯芬酸降解过程中也有类似的报告[10,21]. 因此，研究LCM降解过程中产生的中间产物并评价中间产物的毒性就显得尤为重要，利用QSAR对LCM的中间产物进行毒性预测. Ames致畸性
LCM和其转化产物的QSAR毒性预测结果可见于表3. 对于大型蚤48 hLC50，LCM属于没有急性毒性，而LCM的转化产物LCM-280、LCM-374、LCM-170和LCM-127的大型蚤LC50落在10—100 mg·L−1的范围内，在全球化学品统一分类和标签制度的规定中，被判定为对大型蚤具有有害效应，LCM-356的预测值为8.61 mg·L−1，被判定为具有中等毒性. 而在小鼠经口染毒LD50预测中，LCM的预测值为1291.60 mg·kg−1，在全球化学品统一分类和标签制度的规定中，属于4类（300 mg·kg−1<LD50<2000 mg·kg−1）具有轻微危害作用，而LCM的转化产物LCM-280、LCM-340和LCM-356的LD50的预测值落在50—300 mg·L−1的范围内，属于具有中度危害的物质. 在Ames致畸性预测方面，LCM及其产物均呈阴性，显示没有致畸风险.
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（1）UV/H2O2体系是污水处理厂中降解LCM的一种有效途径，在该反应体系中，30 min后LCM（10 mg·L−1）的去除率达到98%以上，且降解过程服从准一级反应动力学模型.
（2）该反应在酸性和中性条件下是有利的，但在强碱性条件下反应明显被抑制，腐殖酸等共存有机物的存在可明显降低反应速率.
（3）中间产物的鉴定以及毒性预测的结果表明，LCM在降解过程中会产生生物毒性大于母体的中间产物，对水质安全存在潜在威胁.
UV/H2O2对盐酸林可霉素的光催化降解及生物毒性分析
Photocatalytic degradation and biotoxicity evaluation of lincomycin hydrochloride by the UV/H2O2 process
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摘要: 本文以盐酸林可霉素（LCM）为研究对象，探究其在UV/H2O2降解作用下的降解情况，探讨了H2O2浓度、初始pH值和有机物等影响因素对LCM的影响及机制. 实验结果表明，当H2O2浓度为50 mg·L−1，pH=7.3，LCM浓度为10 mg·L−1，反应30 min后，LCM去除率达到98%，且反应过程遵循准一级动力学. 利用高效液相色谱串联飞行时间质谱仪（LCMS-TOF 5600+）鉴别出其在UV/H2O2降解过程中主要产物的分子结构式，进而推导出可能的降解路径. 利用TEST对降解过程中的产物进行毒性预测，结果表明，中间产物的毒性高于母体，对水质安全保障造成潜在风险.Abstract: In the present study, main degradation of Lincomycin hydrochloride (LCM) was investigated by UV/H2O2 process; the effects of H2O2 concentration, initial pH value and organic matter on the degradation were also investigated. The results showed that 98% of LCM can be degraded as the reaction time was 30 min, in order to get this optimal result we should keep H2O2 concentration was 50 mg·L−1, pH =7.3 and LCM concentration was 10 mg·L−1 at the same time, the degradation process follows the rule of quasi-first-grade dynamics. The molecular structure formula of the main products in the degradation process was identified by high-performance liquid chromatography tandem time-of-flight mass spectrometry (LCMS-TOF5600+), and transformation pathways were proposed. TEST was used to predict the toxicity of the products in the degradation process. The prediction indicated that the intermediates with higher toxicity than the parent would be generated during the UV/H2O2 process, which had the potential ecological risks to the water quality security.
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Key words:
- UV/H2O2 /
- biotoxicity evaluation /
- Lincomycin hydrochloride /
- degradation mechanism.
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我国是世界上畜禽养殖第一大国，畜禽养殖业排放化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)、氨氮和总氮的量占农业污染排放总量的比例分别达到了95.2%、76.8%和62.4%[1]。畜禽养殖过程产生大量高氨氮有机废水，已成为水体污染的最主要来源，对这部分废水的有效处理成为畜禽养殖业污染控制的关键[2]。对于畜禽养殖废水的处理通常采用除碳+脱氮的耦合工艺，其中除碳过程通过厌氧消化将有机物转化为甲烷回收，而脱氮过程往往采用生物脱氮方法。传统的生物脱氮技术需要结合自养菌的好氧硝化作用和异养菌的缺氧反硝化作用，但是，当硝化和反硝化在2个独立单元中进行时(如A/O工艺)，需要进行混合液回流，通常具有占地面积大和建设投资成本高等缺点。虽然当硝化和反硝化在同一个反应器内(SBR工艺)进行时，能够节省占地和成本，但需要分时段控制曝气和投加碳源，增加了操作复杂性。在处理畜禽养殖废水的厌氧消化液时，一方面，高氨氮质量浓度易对自养硝化产生抑制；另一方面，厌氧消化处理后出水中仍会残留很多有机物，这将进一步抑制自养硝化效果。因此，十分有必要开发更适宜的高氨氮有机废水处理技术。
异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, HN-AD)菌能够适应高质量浓度的氨氮和有机物，通过异养硝化与好氧反硝化作用的耦合，在好氧条件下能够将废水中的氨氮转化为氮气，实现高效脱氮，整个代谢过程几乎没有亚硝态氮/硝态氮的积累，同时有机物也得到了降解和去除。1984年，ROBERTSON等[3]将首株HN-AD菌Thiosphaera pantotropha从硫氧化脱硝废水处理装置中分离出来。近年来，越来越多的HN-AD菌被发现，它们大多具有世代时间短和耐受性强等优势，对高质量浓度的氨氮和有机物有较好的耐受和处理效果[4]。HN-AD菌Comamonas WXZ-17可耐受817 mg·L−1的氨氮质量浓度，Acinetobacter sp. TN-14能在氨氮质量浓度高达1 200 mg·L−1的环境下生长[5]。HN-AD菌耐受高氨氮的同时能实现对其转化脱除，如Thauera sp. SND5的平均氮去除速率约为2.85 mg·(L·h)−1[6]；Bacillus methylotrophicus L7在初始氨氮质量浓度为1 121.2 mg·L−1的条件下，总氮去除速率可达3.8 mg·(L·h)−1[7]。因此，HN-AD技术可以适应高氨氮有机废水的脱氮处理，反应速率高、处理时间短，同时能够在同一个处理单元中在好氧条件下实现有机物和氨氮、总氮的同步去除，降低工艺复杂度，有望为高氨氮有机废水提供一种具有更高效率和更低成本的新技术。目前相关的研究以纯菌HN-AD系统较多，而实际工程中很难做到纯菌环境，那么具有HN-AD功能的污泥驯化就非常重要，是实现技术应用的关键，然而相关的研究仍然较为缺乏。SONG等[8]针对高盐榨菜废水的处理，经过105 d驯化建立了HN-AD混菌系统，COD和总氮去除率分别达到了93.2%和82.4%。但是，上述方法的驯化时间长，系统启动较慢，迫切需要一种在实际应用场景中低成本、快速、有效驯化具有HN-AD功能活性污泥的方法以及有机碳源对系统运行的影响及其优化相关的研究。
因此，本研究考察了在固定C/N比条件下驯化HN-AD活性污泥的方法，并进行了HN-AD效果验证，选择了3种碳源以探究碳源种类和C/N比对系统运行效果的影响，分析了系统中有机物降解和脱氮的动力学特征，揭示了系统中的优势功能菌，以期为实际工程中畜禽养殖废水厌氧消化液等高氨氮有机废水的高效处理提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 实验装置与材料
本研究采用间歇式反应器，材质为有机玻璃，内径为150 mm，主体高170 mm，有效容积为3.0 L。在反应器底部放置曝气盘，外接空气曝气泵，同时，在反应器上方设搅拌桨充分混合活性污泥和废水，以确保溶解氧(DO)分布均匀。反应器中插有pH和DO电极，用于在线监测pH和DO。
实验用水选用模拟配水，以NH4Cl(100~600 mg·L−1, 以氮浓度计)作为氮源，添加KH2PO4(20 mg·L−1, 以磷浓度计)补充磷源，添加微量元素(1 mL·L−1)，添加乙酸钠、柠檬酸钠、丁二酸钠的混合碳源(溶液中三者的COD比=1:1:1)作为生物可利用有机碳源(2 000~12 000 mg·L−1,以COD计)。通过调整进水碳源和氮源质量浓度以控制配水的碳氮比。
1.2 实验装置运行实验
反应器采用序批式运行模式，每个周期分为5个阶段：进水(10 min)、曝气加搅拌运行、沉降(20 min)、出水(10 min)、空闲(1 h)。反应在室温下运行，通过实时监测DO来控制曝气阶段的运行时长，采用蠕动泵进水和排水，出水阶段排水比为0.25。实验装置共运行175 d，设置了系统启动、进水负荷提升和C/N比优化3个阶段。
第Ⅰ阶段：启动HN-AD系统，将北京某污水厂二沉池的活性污泥投入反应器，通过定期排泥(污泥龄12~15 d)排出部分死菌和细胞分泌物，以维持微生物的新陈代谢活性。初始进水COD和氨氮质量浓度分别为2 000 mg·L−1 和100 mg·L−1。根据自养氨氧化过程，每氧化1 g氨氮需要消耗7.14 g碱度(以碳酸钙计)，在进水中投加NaHCO3补充至所需碱度。保持C/N比为20，逐步提高进水氨氮质量浓度(每5个周期提升100 mg·L−1)来驯化HN-AD菌群。验证HN-AD系统，当系统启动成功后不再额外补充碱度。第Ⅱ阶段：HN-AD系统的进水氨氮质量浓度进一步提升到300 mg·L−1，待系统运行稳定后，每5个周期提升100 mg·L−1，逐步将进水氨氮提升至600 mg·L−1。第Ⅲ阶段：保持进水氨氮质量浓度为600 mg·L−1，探究不同C/N比(15、20、25)对HN-AD系统脱氮效率的影响，优化出最佳运行条件。
1.3 异养硝化-好氧反硝化验证实验
从反应器中取出50 mL活性污泥，移至250 mL锥形瓶，随后加入50 mL模拟配水进行实验。设置模拟配水中C/N=20，采用混合碳源(乙酸钠、丁二酸钠和柠檬酸钠的COD比=1:1:1)。模拟配水中进水氨氮质量浓度为100 mg·L−1。在实验组中添加自养硝化抑制剂3,4-二甲基吡唑磷酸盐(C5H8N2·H3O4P，DMPP)，于25 ℃、160 r·min−1振荡培养36 h，每间隔一段时间取水样测试氨氮、硝态氮、亚硝态氮的质量浓度。
1.4 有机碳源影响实验
相比于糖类等大分子物质，乙酸钠、柠檬酸钠和丁二酸钠等小分子更容易被HN-AD菌所利用，能够直接参与三羧酸循环代谢过程。考虑到畜禽养殖废水厌氧消化液中常含有小分子挥发性脂肪酸的特点，因此，本研究选用乙酸钠、柠檬酸钠和丁二酸钠作为实验所用碳源，以研究碳源种类的影响。
从反应器中取出50 mL活性污泥，移至250 mL锥形瓶，随后加入50 mL模拟配水(含氨氮200 mg·L−1)进行实验。在模拟配水中，分别采用乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠及3种有机物作为混合碳源，以确保锥形瓶内在进水后的初始COD和氨氮质量浓度分别为2 000 mg·L−1和100 mg·L−1，于25 ℃、160 r·min−1振荡培养36 h，每间隔一段时间取水样测试氨氮、硝态氮、亚硝态氮的质量浓度。
1.5 氨氮和有机物去除动力学
HN-AD系统启动成功并稳定运行后，在初始有机物和氨氮质量浓度分别为3 000 mg·L−1和150 mg·L−1的单个周期，实时监测COD值、氮质量浓度变化。采用修正的Gompertz模型[9](式(1))对底物去除过程进行拟合，解析底物质量浓度与反应时间的关系。
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) 式中：S为t时刻底物质量浓度，mg·L−1；S0为初始底物质量浓度，mg·L−1；Rm为最大去除速率，mg·(L·h)−1；t0为迟滞时间，h。
1.6 分析检测方法
1)常规水质分析方法。COD值和各种氮化合物的质量浓度用标准方法测定。用纳氏分光光度法在425 nm处测定氨氮，用比色法在540 nm处测定亚硝态氮，用紫外分光光度法在220 nm和275 nm处测量硝态氮。用手持便携式分析仪测量pH和溶解氧(德国WTW Multi 3320)。铵(NH4+-N)由于水解反应会转化为分子态氨，也称为游离氨(free ammonia, FA)，FA质量浓度由NH4+-N、pH和温度确定，根据式(2)[10]进行计算。
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2) 式中：ρFA为游离氨质量浓度，mg·L−1；
CNH+4-N 2)微生物群落结构测定。从反应器中取一定量的活性污泥，根据E.Z.N.A.® soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross，美国)说明书进行微生物群落总DNA抽提，用NanoDrop2000(赛默飞世尔科技，美国)测定DNA的浓度和纯度。使用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)对16S rRNA基因V3~V4可变区进行PCR扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。使用Illumina MiSeq平台(美吉生物医药科技有限公司，上海)对纯化的聚合酶链反应产物进行测序。
2. 结果与讨论
2.1 异养硝化系统的启动与验证
在C/N比为20的条件下，通过进水氨氮质量浓度的梯度提升来驯化活性污泥，增加HN-AD菌的相对丰度，进而构建HN-AD脱氮系统，结果如图1所示。结果表明，系统启动初始，进水氨氮质量浓度为100 mg·L−1，逐步提升进水氨氮质量浓度，在1~10周期(进水氨氮≤200 mg·L−1)，氨氮去除率(>95%)较高，出水中亚硝态氮质量浓度(<0.1 mg·L−1)较低，但积累了一定质量浓度的硝态氮(>20 mg·L−1)，推测系统中发生了以自养硝化为主的硝化过程，此时总氮去除率只有约38%。由图2(a)可见，在系统启动初期(第7周期)的反应过程可以看出，随着氨氧化的进行，亚硝态氮质量浓度先升高后降低，硝态氮质量浓度逐步升高并出现积累。在该周期的反应过程中，游离氨质量浓度在6 h时升至20 mg·L−1，高于抑制亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria, NOB)的FA阈值(0.1~5.0 mg·L−1)，亚硝态氮出现积累且质量浓度到达峰值(9 mg·L−1)，但随着反应的进行，FA质量浓度迅速降低至5 mg·L−1以下，亚硝态氮积累消失且硝态氮质量浓度不断上升。
图 1 HN-AD系统启动过程的脱氮效果Figure 1. The efficiency of nitrogen removal at the start-up of the HN-AD process
图 2 HN-AD系统成功启动前后的单周期过程特征Figure 2. Characteristics of a single-cycle before and after the successful start-up of the HN-AD system由图1可见，在第11周期，将进水氨氮质量浓度提升至300 mg·L−1，对应进水FA达到76.8 mg·L−1，已高于大多数研究报道的自养氨氧化菌(ammonia oxidizing bacteria, AOB)和NOB的抑制阈值。虽然该周期氨氮去除率降低至76%，但出水中不再有硝态氮累积(<2 mg·L−1)，总氮去除率达到67.8%，从这一周期开始，系统不再额外补充碱度。当FA质量浓度为20~40 mg·L−1时，自养AOB的氨氧化性能会受到严重影响[11]，而HN-AD菌属，如Acinetobacter YB、Bacillus WXZ-8和Zobellella DN-7等，在较高质量浓度FA时(>100 mg·L−1)仍能正常发挥氨氧化功能[12-13]。由此可知，异养硝化菌对FA的耐受能力远高于自养硝化菌，推断此时系统中较高质量浓度的FA抑制了自养AOB，硝化作用主要由HN-AD菌贡献。随着反应器运行，HN-AD系统脱氮性能不断提升。由图2(b)可见，第15周期的氨氮去除率和总氮去除率分别提升至92%和83%，有机物和氨氮实现了同步降解，并且未出现硝态氮和亚硝态氮的积累。在该周期FA质量浓度始终维持在40 mg·L−1以上，且在6 h时达到70.5 mg·L−1，从而较稳定地实现对自养AOB和NOB的抑制，有利于HN-AD菌的富集。当第16周期进水氨氮质量浓度进一步提升至400 mg·L−1，氨氮去除率和总氮去除率依然保持在91%和85%，至此认为HN-AD系统启动成功。
通过投加抑制剂DMPP抑制自养硝化，根据氨氮转化性能验证了系统中发生的主要硝化反应类型。由图3(a)可知，驯化前，投加DMPP实验组氨氮质量浓度基本没有下降，而空白组则正常进行氨氧化过程，这表明抑制剂显著抑制了氨氮的转化。由图3(b)可知，驯化后，投加DMPP实验组与空白组的氨氮质量浓度呈现相似下降趋势，表明氨氧化过程并未受到抑制。综上所述，系统启动成功后，体系中硝化反应的主要类型是异养硝化。
图 3 硝化抑制剂对异养硝化脱氮系统的影响Figure 3. Effect of nitrification inhibitors on the heterotrophic nitrification and denitrification system2.2 有机碳源对异养硝化脱氮的影响
选择合适的碳源有利于实现最佳的菌体生长和脱氮性能，可以提高反应效率并缩短反应时间。本研究选用乙酸钠、柠檬酸钠和丁二酸钠作为实验所用碳源，在混菌系统中研究了有机碳源种类的影响。从图4可以看出，用乙酸钠、柠檬酸钠、丁二酸钠作唯一碳源时，48 h的氨氮去除率分别达到了79.5%、83.3%和87.9%；而将上述3种碳源混合使用时，48 h的氨氮去除率达到了96.1%。不同种类碳源的分子构成和氧化还原电位存在差异，因此，HN-AD菌对他们的利用程度各不相同[13]。有研究表明，以丁二酸钠为碳源时，Thauera sp. SND5菌株对氮的去除效果较好[6]；利用柠檬酸钠为碳源时，Alcaligenes faecalis C16菌株的脱氮效率最高[14]；而对于Paracoccus pantotrophus菌株，乙酸钠是发挥最佳脱氮性能的碳源[15]。因此，在本研究的HN-AD系统中，不同的单一碳源会表现出脱氮性能的差异，而混合碳源可以更好地满足混菌体系中不同种HN-AD菌属的需求，从而使系统具有更好的脱氮性能。由于畜禽养殖废水中存在大量乙酸等小分子有机酸，所以当用HN-AD系统处理该类废水时，有望能够保证较高的脱氮效率。
图 4 不同有机碳源下的氨氮去除效果Figure 4. Removal efficiency of ammonium with different organic carbon sources2.3 C/N比对异养硝化脱氮的影响
在HN-AD系统采用混合碳源的基础上，进一步研究了系统进水C/N比的影响。结果表明，C/N比对HN-AD菌的脱氮效率有显著影响。
如图5(a)所示，当C/N比为15时，系统的氨氮去除率为80.3%，同时出水中几乎没有硝态氮或亚硝态氮积累；将C/N比提升为20后，HN-AD系统脱氮效率明显上升，随着系统运行，HN-AD系统运行稳定，氨氮去除率提高到了95%；将C/N比提高到25后，脱氮性能有所下降，氨氮去除率降低为90%。总氮的去除率也随着C/N比的优化而发生变化，在C/N比为20时，总氮去除率达到了89.6%，之后继续提升C/N比并不能显著提升总氮去除率。不同HN-AD菌的最优C/N比不同，Aliidiomarina在C/N比为9时，氨氮去除率达到93.7%[16]；Thauera sp.TN9在C/N比为22时氮去除效率最高，达到99.2%[17]；Paracoccus versutus LYM在C/N比为20时，氮去除率达到97.09%[18]。一方面，C/N比过低会导致碳源不足，使得细胞生长受限以及缺乏电子供体，进而导致脱氮效率下降；另一方面，C/N比过高可在一定程度上抑制脱氮效果[19]。因此，合适的C/N比对于HN-AD系统的低耗高效运行至关重要，后续可将C/N比设为20~25进一步优化，以确定HN-AD系统的最佳C/N比。
图 5 不同C/N比对模拟废水中NH4+-N、TN、COD的去除效果Figure 5. Removal efficiencies of NH4+-N, TN and COD from the simulated wastewater at different C/N ratios如图5(b)所示，随着进水C/N比的提高，系统出水的COD值不断增加，由于出水中没有检测到进水所用碳源，因此推测出水中的COD来源于微生物的细胞分泌物。对出水进行三维荧光测试，结果显示较明显的荧光峰(Ex/Em=260~300 nm/300~370 nm)为色氨酸荧光蛋白峰，同时，另一个较明显的荧光峰(Ex/Em=330~370 nm/400~475 nm)为类腐殖酸的峰，表明蛋白质和腐殖酸是出水中有机物的组成部分。这可能是由于高C、N质量浓度环境刺激了微生物产生大量细胞代谢产物，形成高浓度的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)，EPS主要由多糖和蛋白质组成，可分为溶解态和结合态2种形态，其中大部分溶解态EPS可以随出水排出系统[20]。WANG等[21]研究表明，在微生物处于极端的生存环境时，EPS中色氨酸和芳香类蛋白荧光强度会显著增强。
本研究进一步对出水中的蛋白质和多糖进行了测定，结果如图6(b)所示，发现其含量随着C/N比提高而不断增加，换算成COD当量后发现，蛋白质和多糖分别占出水总COD的60%~70%。当对高碳质量浓度有机废水进行脱氮处理时，HN-AD菌的繁殖速度远远快于自养硝化菌，但其生长过程产生的大量溶解态EPS很可能导致出水有机物超标，后续可以通过增加膜组件构成膜-生物反应器对这些大分子物质截留，从而保证出水水质达到排放标准。
图 6 反应器出水三维荧光图及不同C/N比出水蛋白质和多糖质量浓度Figure 6. Three-dimensional fluorescence pattern of reactor effluent and protein and polysaccharide concentrations of effluent at different C/N ratios2.4 异养硝化系统的动力学研究
HN-AD系统具有同步除碳脱氮的特性，通过修正的Gompertz模型[9]来进一步解析底物去除过程。针对典型周期，分别对COD和氨氮质量浓度随时间的变化进行动力学拟合，结果如图7所示。COD的最大去除速率为174.1 mg·(L·h)−1(R2=0.992)，氨氮的最大去除速率为8.66 mg·(L·h)−1 (R2=0.999)。已有研究[22]表明，大部分HN-AD纯菌的氨氮去除速率为3~8 mg·(L·h)−1，而本研究所构建HN-AD系统显示出比纯菌体系更高的氨氮去除速率。此外，对典型周期各时间点的COD和氨氮质量浓度进行相关性拟合。如图7(c)所示，反应过程中两者呈现出较好的相关性(R2=0.997)，从而间接证明了HN-AD过程氨氮转化需要碳源，有助于实现碳氮协同降解。上述拟合结果有助于深入了解系统性能，并优化HN-AD系统在实际应用时的设计和运行参数，以实现高质量浓度含氮有机废水处理过程高效稳定的除碳脱氮。
图 7 异养硝化系统COD和氨氮去除的动力学拟合曲线Figure 7. Kinetic fitting curves of the removal of COD and ammonium in the heterotrophic nitrification and denitrification system2.5 微生物群落结构分析
在属水平上的污泥物种组成分析结果如图8所示，HN-AD系统中的优势菌为Thauera(69.7%)，而自养硝化菌的丰度较低(<1%)。已有研究[6,17]表明，Thauera细菌可以参与氮循环过程，具有异养硝化-好氧反硝化功能，通常存在于极端环境中，对高COD和高氨氮环境具有较强的适应能力，Thauera细菌具有降解有机物的能力，特别是一些具有环境污染潜力的有机污染物，如芳香烃类化合物和氯化有机化合物，其代谢能力可以用于生物修复和废水处理等环境应用。相对丰度第2高的Propioniciclava(8.3%)，该菌属是一种潜在聚磷菌，能够在厌氧阶段完成聚磷代谢[23]。属水平微生物群落分析结果表明，在驯化过程中，Thauera相对丰度显著增加，成为主导性的菌种。以上结果对于深入了解HN-AD系统的微生物群落动态和功能特性具有重要意义。
图 8 HN-AD系统在0、90和180 d细菌属水平的相对丰度Figure 8. Relative abundances of microbes in the HN-AD system at genus levels on the 0, 90 and 180 d3. 结论
1)通过逐渐提升进水COD和氨氮质量浓度的方法可以快速实现HN-AD污泥的驯化，并通过单个周期的COD和氨氮质量浓度监测证实了HN-AD功能的启动。
2)有机碳源对系统的脱氮效果有重要影响，柠檬酸钠、乙酸钠和丁二酸钠的混合碳源更有利于异养硝化脱氮，当C/N比为20时，HN-AD系统的脱氮效率最高。采用Gompertz动力学模型分别拟合了氨氮和COD底物的去除过程，模型相关系数R2均在0.9以上，证实了氨氮去除和有机物去除的相关性。
3)在优化条件下，HN-AD系统实现了95%的氨氮去除率、89.6%的总氮去除效率和92%的COD去除率，这表明该工艺可同步实现高效脱氮和有机物的去除。高通量分析结果表明，Thauera相对丰度显著增加，并成为了HN-AD系统中的优势菌种。
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图 2 不同条件下LCM的降解
Figure 2. Degradation of Lincomycin hydrochloride during different treatment method
图 3 不同初始H2O2浓度下的降解动力学
Figure 3. Decomposition kinetics at different initial H2O2 concentrations
图 4 不同的pH值（a）和腐殖酸（b）浓度下LCM在UV/H2O2氧化过程中的降解曲线
Figure 4. Decomposition curves of LCM in UV/H2O2 oxidation process under different pH（a）and humic acid（b）
图 5 UV/H2O2氧化过程中LCM的降解途径
Figure 5. Proposed decomposition pathways of LCM during UV/H2O2 oxidation process.
图 6 UV/H2O2过程中LCM分解过程中的矿化情况
Figure 6. Mineralization during the decomposition of LCM during the UV/H2O2 process
表 1 MS/MS检测器的运行参数
Table 1. Operation parameters of the MS/MS detector
参数 Parameter 离子化方式Ionisation 扫描模式Scan type 离子源温度TEM 气帘气CUR 雾化气GS1 辅助气GS2 CAD 电喷雾电压IS 扫描时间 Total scan time 分析条件 Analytical conditions ESI MRM 500 ℃ 30 psi 45 psi 30 psi 8 psi 5500 10 min 
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表 2 化合物的MRM参数和保留时间
Table 2. MRM parameters and retention times of compounds
分析物 Analyte 母离子 Precursor ion （m/z） 子离子 Product ion （m/z） DP/ V CE/ eV Lincomycin 1 407.0 126.0 50 33.12 Lincomycin 2 407.0 359.0 30 24.72
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表 3 T.E.S.T.软件计算的药品和中间产物的毒性评估
Table 3. Toxicity assessment for pharmaceuticals and transformation products calculated by T.E.S.T. software.
化合物名称Compound name 大型蚤/（mg·L−1）Daphnia magna LC50（48 h） 小鼠经口给毒/（mg·kg−1）Oral rat LD50 Ames致畸性Ames Mutagenicity LCM 771.87 1291.60 0.07（Mutagenicity Negative） LCM-TP390 345.29 557.28 0.08（Mutagenicity Negative） LCM-TP344 523.57 2056.44 0.03（Mutagenicity Negative） LCM-TP328 221.90 2117.80 0.16（Mutagenicity Negative） LCM-TP346 1598.07 2459.67 0.01（Mutagenicity Negative） LCM-TP312 163.37 538.60 −0.07（Mutagenicity Negative） LCM-TP260 735.75 2201.19 0.23（Mutagenicity Negative） LCM-TP316 579.49 2862.69 0.18（Mutagenicity Negative） LCM-TP298 127.12 985.53 0.08（Mutagenicity Negative） LCM-TP280 89.41 143.37 0.07（Mutagenicity Negative） LCM-TP256 124.69 3396.18 0.16（Mutagenicity Negative） LCM-TP388 171.95 370.50 0.04（Mutagenicity Negative） LCM-TP374 67.52 N/A 0.36（Mutagenicity Negative） LCM-TP340 136.19 296.22 0.02（Mutagenicity Negative） LCM-TP322 42.59 211.30 0.17（Mutagenicity Negative） LCM-TP268 68.86 N/A 0.04（Mutagenicity Negative） LCM-TP356 8.61 N/A 0.40（Mutagenicity Negative） LCM-TP288 619.73 3949.44 0.25（Mutagenicity Negative） LCM-TP170 27.87 1037.97 0.07（Mutagenicity Negative） LCM-TP127 20.30 540.60 −0.04（Mutagenicity Negative） LCM-TP358 477.89 2233.90 0.01（Mutagenicity Negative） LCM-TP326 129.21 364.75 −0.01（Mutagenicity Negative） LCM-TP360 1380.21 2113.15 −0.02（Mutagenicity Negative） LCM-TP328 221.90 2117.80 0.16（Mutagenicity Negative）
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