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盐酸林可霉素（LCM）属于林可酰胺类抗生素，用于治疗各种细菌感染，对革兰氏阳性菌有灭杀作用，因此广泛应用于人类及兽类相关疾病的治疗、预防等等领域[1]. 动物及人体代谢相关研究表明，该药物在体内代谢速度慢，人体有大概5%—15%的LCM以原形排出，而动物体内60%的林可酰胺类药物以原形排出[2-3]，因此相当部分LCM会排泄出体外并进入环境水体. 然而却很少有针对LCM在自然条件及人工强化条件下降解的去除研究，同时对其降解过程的中间产物、降解路径也知之甚少.
在污水处理厂或自来水厂中，UV/H2O2结合是去除水中污染物的有效间接光降解方法之一[4-6]. 其主要原理被认为是通过H2O2的光解产生活性较强的羟基自由基（·OH），羟基自由基（·OH）可以以很高的速率并且非选择性地氧化有机污染物[7-8]，同时在该反应过程中不会引入新的污染物. 因此本文主要研究LCM在UV/H2O2体系中不同条件下的降解情况，同时通过鉴定LCM降解过程的中间产物，提出LCM在该反应中的降解途径，并对反应过程的中间产物进行毒性预测. 为水环境中残留的林可酰胺类的抗生素类药物的去除与控制提供有效思路，为水质安全保障提供理论依据和技术支撑.
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实验材料：盐酸林可霉素（纯度>95%）购自于麦克林试剂（上海），乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）购自于Honeywell试剂（广州），乙酸铵（HPLC）、异丙醇（HPLC）购自于科密欧试剂（上海），30%过氧化氢（H2O2）、硫代硫酸钠、腐殖酸购自于阿拉丁试剂（上海）.
实验仪器及分析软件：岛津TOC-L VCPN、高效液相色谱质谱联用仪（HPLC-MS/MS, 5500 Q-trap, AB Sciex, USA）、高效液相色谱串联飞行时间质谱仪（AB-Triple TOF 5600+, LC20D HPLC, X500R, AB SCIEX, USA）、SCIEXOS（1.3.1）、TEST，version 5.1,EPA,USA、磁力搅拌器、pH计（PHS-3E）、紫外光灯（20 W，254 nm）.
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该实验使在配备有20 W且波长为254 nm的紫外光灯的台式设备下进行，具体实验装置见图1. 在直径为10 cm的结晶皿中加入100 mL初始浓度为10 mg·L−1的LCM和H2O2的混合溶液，研究不同条件下对LCM降解影响. 在一定时间间隔取样1 mL的样品放入离心管中，在实验过程中利用硫代硫酸钠进行淬灭反应，每组实验均设置3组平行样.
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使用HPLC-MS/MS测定实验过程中LCM的浓度变化情况. 使用C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm，SHARPSIL-U）以0.3 mL·min−1的流速分离相关组分，进样量为5 μL. MS/MS检测器的操作参数见表1. 母离子/子离子的选择及碰撞能量见表2.
使用LCMS-TOF 5600+（LC-TOF-MS）分析了LCM在UV/H2O2过程中的降解产物. 使用ZOBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）以0.3 mL·min−1的流速分离相关组分，进样量为5 μL.
使用岛津TOC-L VCPN分析仪测量降解过程中的总有机碳（TOC），通过TC-IC法测量TOC的衰减来评估实验期间LCM的矿化程度，以对LCM的降解程度进行评估.
利用软件工具（TEST, version 5.1,EPA,USA）来预测中间产物的潜在毒性. 该软件是根据化学结构的物理特性预测毒性的数学模型，可提供48 h水蚤LC50预测值、大鼠口服LD50数据集值、Ames诱变值等.
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图2为pH7.3时LCM在不同条件下的降解情况. 结果表明，仅有紫外线照射时LCM几乎不发生分解，该现象与Paola等的研究一致[9]，同时在仅有H2O2条件下LCM也基本不会被氧化. 但在UV/H2O2的共同作用下，LCM可被迅速降解，且反应先快后慢，如反应5 min时即可被去除60%，15 min后反应速率显著降低，至反应结束30 min时去除率可达98%. 这是因为紫外线可以直接激活H2O2产生羟基自由基，如公式（1）和公式（2）所示·OH具有极强的得电子能力，其氧化电位为2.8 V，可以通过寻找氢、加成和电子转移等方式攻击有机化合物[5,10].
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在UV/H2O2体系中研究了10—90 mg·L−1的H2O2浓度对LCM分解的影响. 在本研究中，利用准一级动力学方程拟合水该反应的实验数据. 拟合结果表明，投加不同浓度的H2O2，该反应体系的R2均大于0.95，因此该反应过程服从准一级反应动力学，这与大多数药物的光化学降解遵循准一级动力学模型相同[10-12].
其中，C0（mg·L−1）为LCM初始浓度，C（mg·L−1）为t时刻LCM浓度；k（min−1）为拟一级降解速率常数；t（min）是反应时间. 检测反应中LCM浓度随时间的变化情况，拟合–ln（C/C0）—t绘制图3.
当H2O2浓度从10 mg·L−1逐渐增加时，由于更多的紫外线被H2O2吸收，产生的羟基自由基也随之增加，导致反应速率加快. 因此，当H2O2浓度为10 mg·L−1时，一级反应速率常数为0.0615 min−1，随着H2O2浓度增大，反应速率常数也随之增加，在浓度为50 mg·L−1时，速率常数达到0.1286 min−1，这时再增加H2O2的浓度，反应速率开始降低，当浓度为90 mg·L−1时，反应速率为0.0875 min−1. 这种现象是因为在较高的H2O2浓度下，羟基自由基会与过量的H2O2反应生成过氧自由基，并且新生成的过氧自由基也会与H2O2反应，导致H2O2的利用率降低. 从而造成了投加高浓度的H2O2时，该反应的降解速率反而降低，在利用UV/H2O2体系降解药物的许多研究中都出现了类似的情况[10,12-13].
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为了探究环境条件对LCM降解的影响，研究了LCM在不同pH和不同浓度腐殖酸时的降解情况（如图4）. 在pH较低的时候发现LCM表现出了极好的降解速率，随着pH的增大，降解速率逐渐降低. 这可能是由以下原因造成的，一方面是LCM在酸性条件下的不稳定性，导致其在酸性条件下更容易被分解，导致降解速率较高[14]. 另一方面是在碱性条件下·OH容易与OH-发生反应形成O·－，如公式（4），而O·-的氧化能力比·OH低；并且HO2-与H2O2反应，降低了H2O2的利用率，从而间接减少了羟基自由基的形成，如公式（5）；此外H2O2在碱性条件下会加快自我分解，也会导致产生的羟基自由基减少，如公式（6）[12-13,15]. 因此在天然水体中利用UV/H2O2去除LCM可以通过调节pH至酸性或中性，以加快反应速率.
由于腐殖酸是地表水体中常见的溶解性有机物，并且会清除自由基，从而降低反应速率[16-17]；也有报道称，腐殖酸可以与水生环境中的污染物反应形成光氧化剂来促进反应[18]. 因此，为了研究腐殖酸对LCM降解过程的影响，投加不同浓度的腐殖酸到UV/H2O2体系中. 实验结果表明，即使少量的腐殖酸也会对该反应产生抑制效果，并且随着腐殖酸的添加，LCM的降解速率不断降低. 因此，该体系中存在腐殖酸会降低LCM的降解速率，如果在天然水体中去除LCM，应该先去除腐殖酸以达到较好的降解效果.
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LCM是一种抗生素，属于林可酰胺类，由吡喃糖环、酰胺部分和吡咯烷环组成，LCM中有两个可能的氧化攻击位点：硫甲基和吡咯烷氮[9,19]. 为了研究LCM在UV/H2O2体系中的降解机理，以及对LCM降解过程中产生的中间产物进行毒性预测，使用LC-TOF-MS分析和电喷雾电离（ESI）检测来鉴定降解过程中的中间产物.
根据保留时间、分子离子、质量碎片离子和经验公式，在LCM降解过程中共鉴定出22种主要副产物（TPs），其中16种为比较确定的产物结构，6种为猜测可能存在的产物结构. LCM的C—S键容易受到·OH的攻击，造成硫甲基的脱离[20]；LCM的酰胺部分和吡喃糖环上会失去羟基和丢失一分子水，吡咯烷环上会失去一分子水，并且还会发生吡喃糖环的裂解[19]. 根据鉴定的中间产物的结构式，提出了以下LCM的6种降解途径（图5）.
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使用TOC-L VCPN分析仪测定了LCM在UV/H2O2处理过程中总有机碳（TOC）的变化. 如图6所示，反应20 min后，LCM的去除率为92%，但TOC基本保持不变. 反应30 min后，LCM的去除率达到98.4%时，TOC仅下降0.8%；在继续反应过程中，当反应时间为60 min时，TOC去除率为28.4%.
由此可见，在短时间内大部分LCM在降解过程中分解为中间有机产物，仅有少部分LCM完全矿化，然而在长时间的反应过程后，LCM可能最终会被完全矿化，但该过程缓慢，在环丙羧酸和双氯芬酸降解过程中也有类似的报告[10,21]. 因此，研究LCM降解过程中产生的中间产物并评价中间产物的毒性就显得尤为重要，利用QSAR对LCM的中间产物进行毒性预测. Ames致畸性
LCM和其转化产物的QSAR毒性预测结果可见于表3. 对于大型蚤48 hLC50，LCM属于没有急性毒性，而LCM的转化产物LCM-280、LCM-374、LCM-170和LCM-127的大型蚤LC50落在10—100 mg·L−1的范围内，在全球化学品统一分类和标签制度的规定中，被判定为对大型蚤具有有害效应，LCM-356的预测值为8.61 mg·L−1，被判定为具有中等毒性. 而在小鼠经口染毒LD50预测中，LCM的预测值为1291.60 mg·kg−1，在全球化学品统一分类和标签制度的规定中，属于4类（300 mg·kg−1<LD50<2000 mg·kg−1）具有轻微危害作用，而LCM的转化产物LCM-280、LCM-340和LCM-356的LD50的预测值落在50—300 mg·L−1的范围内，属于具有中度危害的物质. 在Ames致畸性预测方面，LCM及其产物均呈阴性，显示没有致畸风险.
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（1）UV/H2O2体系是污水处理厂中降解LCM的一种有效途径，在该反应体系中，30 min后LCM（10 mg·L−1）的去除率达到98%以上，且降解过程服从准一级反应动力学模型.
（2）该反应在酸性和中性条件下是有利的，但在强碱性条件下反应明显被抑制，腐殖酸等共存有机物的存在可明显降低反应速率.
（3）中间产物的鉴定以及毒性预测的结果表明，LCM在降解过程中会产生生物毒性大于母体的中间产物，对水质安全存在潜在威胁.
UV/H2O2对盐酸林可霉素的光催化降解及生物毒性分析
Photocatalytic degradation and biotoxicity evaluation of lincomycin hydrochloride by the UV/H2O2 process
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摘要: 本文以盐酸林可霉素（LCM）为研究对象，探究其在UV/H2O2降解作用下的降解情况，探讨了H2O2浓度、初始pH值和有机物等影响因素对LCM的影响及机制. 实验结果表明，当H2O2浓度为50 mg·L−1，pH=7.3，LCM浓度为10 mg·L−1，反应30 min后，LCM去除率达到98%，且反应过程遵循准一级动力学. 利用高效液相色谱串联飞行时间质谱仪（LCMS-TOF 5600+）鉴别出其在UV/H2O2降解过程中主要产物的分子结构式，进而推导出可能的降解路径. 利用TEST对降解过程中的产物进行毒性预测，结果表明，中间产物的毒性高于母体，对水质安全保障造成潜在风险.Abstract: In the present study, main degradation of Lincomycin hydrochloride (LCM) was investigated by UV/H2O2 process; the effects of H2O2 concentration, initial pH value and organic matter on the degradation were also investigated. The results showed that 98% of LCM can be degraded as the reaction time was 30 min, in order to get this optimal result we should keep H2O2 concentration was 50 mg·L−1, pH =7.3 and LCM concentration was 10 mg·L−1 at the same time, the degradation process follows the rule of quasi-first-grade dynamics. The molecular structure formula of the main products in the degradation process was identified by high-performance liquid chromatography tandem time-of-flight mass spectrometry (LCMS-TOF5600+), and transformation pathways were proposed. TEST was used to predict the toxicity of the products in the degradation process. The prediction indicated that the intermediates with higher toxicity than the parent would be generated during the UV/H2O2 process, which had the potential ecological risks to the water quality security.
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Key words:
- UV/H2O2 /
- biotoxicity evaluation /
- Lincomycin hydrochloride /
- degradation mechanism.
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图 2 不同条件下LCM的降解
Figure 2. Degradation of Lincomycin hydrochloride during different treatment method
图 3 不同初始H2O2浓度下的降解动力学
Figure 3. Decomposition kinetics at different initial H2O2 concentrations
图 4 不同的pH值（a）和腐殖酸（b）浓度下LCM在UV/H2O2氧化过程中的降解曲线
Figure 4. Decomposition curves of LCM in UV/H2O2 oxidation process under different pH（a）and humic acid（b）
图 5 UV/H2O2氧化过程中LCM的降解途径
Figure 5. Proposed decomposition pathways of LCM during UV/H2O2 oxidation process.
图 6 UV/H2O2过程中LCM分解过程中的矿化情况
Figure 6. Mineralization during the decomposition of LCM during the UV/H2O2 process
表 1 MS/MS检测器的运行参数
Table 1. Operation parameters of the MS/MS detector
参数
Parameter离子化方式
Ionisation扫描模式
Scan type离子源温度
TEM气帘气
CUR雾化气
GS1辅助气
GS2CAD 电喷雾电压
IS扫描时间
Total scan time分析条件
Analytical conditionsESI MRM 500 ℃ 30 psi 45 psi 30 psi 8 psi 5500 10 min 
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表 2 化合物的MRM参数和保留时间
Table 2. MRM parameters and retention times of compounds
分析物
Analyte母离子
Precursor ion （m/z）子离子
Product ion （m/z）DP/ V CE/ eV Lincomycin 1 407.0 126.0 50 33.12 Lincomycin 2 407.0 359.0 30 24.72
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表 3 T.E.S.T.软件计算的药品和中间产物的毒性评估
Table 3. Toxicity assessment for pharmaceuticals and transformation products calculated by T.E.S.T. software.
化合物名称
Compound name大型蚤/（mg·L−1）
Daphnia magna LC50（48 h）小鼠经口给毒/（mg·kg−1）
Oral rat LD50Ames致畸性
Ames MutagenicityLCM 771.87 1291.60 0.07（Mutagenicity Negative） LCM-TP390 345.29 557.28 0.08（Mutagenicity Negative） LCM-TP344 523.57 2056.44 0.03（Mutagenicity Negative） LCM-TP328 221.90 2117.80 0.16（Mutagenicity Negative） LCM-TP346 1598.07 2459.67 0.01（Mutagenicity Negative） LCM-TP312 163.37 538.60 −0.07（Mutagenicity Negative） LCM-TP260 735.75 2201.19 0.23（Mutagenicity Negative） LCM-TP316 579.49 2862.69 0.18（Mutagenicity Negative） LCM-TP298 127.12 985.53 0.08（Mutagenicity Negative） LCM-TP280 89.41 143.37 0.07（Mutagenicity Negative） LCM-TP256 124.69 3396.18 0.16（Mutagenicity Negative） LCM-TP388 171.95 370.50 0.04（Mutagenicity Negative） LCM-TP374 67.52 N/A 0.36（Mutagenicity Negative） LCM-TP340 136.19 296.22 0.02（Mutagenicity Negative） LCM-TP322 42.59 211.30 0.17（Mutagenicity Negative） LCM-TP268 68.86 N/A 0.04（Mutagenicity Negative） LCM-TP356 8.61 N/A 0.40（Mutagenicity Negative） LCM-TP288 619.73 3949.44 0.25（Mutagenicity Negative） LCM-TP170 27.87 1037.97 0.07（Mutagenicity Negative） LCM-TP127 20.30 540.60 −0.04（Mutagenicity Negative） LCM-TP358 477.89 2233.90 0.01（Mutagenicity Negative） LCM-TP326 129.21 364.75 −0.01（Mutagenicity Negative） LCM-TP360 1380.21 2113.15 −0.02（Mutagenicity Negative） LCM-TP328 221.90 2117.80 0.16（Mutagenicity Negative）
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