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自20世纪以来，抗生素对医药的发展具有重要的贡献，极大地保护了人类和动植物免受细菌性疾病的危害[1]. 由于抗生素在临床和养殖业上的滥用，加剧了细菌抗生素抗性（耐药性）的进化和传播[2]. 抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）作为编码细菌抗生素耐药性的功能基因，于2006年被定义为一种新型“污染物”[3]. 致病菌可以通过水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT）获得外源性抗生素抗性基因，并通过食物链或环境接触等途径进入人体，使抗生素药效明显降低，对人类健康造成极大威胁[4].
自然环境中的一些微生物可以生物合成抗生素，抑制其它微生物生长并获得更多的营养物质，这些微生物必然携带抗生素抗性基因以免受抗生素的影响[5]. 此外，与外排泵耐药机理相关的蛋白也参与信号分子的运输或中间代谢产物的排放等过程[6]. 在深海、高原等几乎没有人类活动干扰的地区能检测到抗生素抗性基因[7-9]. 然而，在人类活动影响严重的水、土壤、大气等环境介质中均检测到多样性和丰度更高的抗生素抗性基因[10-13]. 上述研究表明，抗生素耐药性是一种自然现象，但人类活动，特别是抗生素的生产和使用，加速了抗生素抗性基因在环境中的传播和富集.
大陆边缘海是陆源污染物向远洋传输的重要过渡区域. 渤海是处于半封闭状态的内海，水体更新周期较长，易于富集陆源污染物，是中国污染最严重的海域之一[14- 15]. 黄海和南海海域也受到不同程度的人类活动影响[16-19]. 目前，对中国边缘海中抗生素抗性基因和致病菌的研究较少，且缺乏边缘海沉积物中抗生素抗性基因和致病菌的完整图谱信息. 因此，研究我国边缘海中抗生素抗性基因和致病菌的多样性和丰度，不仅有助于认识海洋环境中的抗生素抗性基因的特征，而且对进一步评价陆源污染对边缘海的影响有着重要的意义. 本研究旨在使用宏基因组学方法分析我国边缘海沉积物中抗生素抗性基因的组成、丰度及其潜在致病菌群落，探讨抗生素抗性基因和致病菌的组成特征和污染现状.
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本研究的两个珠江口沉积物样品是于2011年6月在狮子洋通道水域（PRE1）与珠江口中部（PRE2）采集，代表人类活动干扰严重的河口区域. 4个南海沉积物样品（SCS1至SCS4）来源于2011年8月的南海北部航次. 2016年7月采集了3个黄海沉积物样品（YS1至YS3）以及靠近渤海海峡处的1个渤海沉积物样品（BS1）. 所有沉积物样品均使用表层沉积物采样器采集，在采集后都储存在无菌的密封聚乙烯塑料袋中并在4 ℃冰箱保存，运送至实验室后立即进行DNA的提取.
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使用FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedical，Santa Ana，CA）试剂盒提取沉积物中的DNA，提取方法见试剂盒使用手册[20]. 由于海洋沉积物中的DNA丰度低，为减少批次效应或样品异质性产生的误差，对每个沉积物样品进行多次DNA提取后合并. 使用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度计测定DNA的纯度和浓度. 每个样品约5 μg的DNA被超声剪切后使用T4 DNA聚合酶与Klenow酶进行末端修复，随后使用T4多核苷酸激酶进行修复末端的磷酸化. 使用T4 DNA连接酶将接头与DNA片段连接，并通过凝胶电泳得到长度合适的DNA目标片段，随后使用PCR扩增目标片段，以此构建样品的DNA文库. DNA在安诺优达基因科技有限公司（浙江，中国）使用Illumina HiSeq 2500平台完成测序. 所有样品总宏基因组数据约60 Gb，每个样本的测序数据约为2—6 Gb不等. 对所有原始测序数据进行数据过滤，去除低质量碱基序列（含有测序质量值低于20的碱基或者包含不明确碱基的序列）.
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使用BLAST（Linux版本2.2.29）程序将测序数据与相关的数据库进行数据比对[21]. 使用BLASTN将宏基因组测序数据与SILVA数据库（SILVA_132_SSURef_Nr99）进行比对，识别样品中的16S rRNA基因，E-value阈值为10-20[22]. 随后，使用MEGAN（MEGAN community 6.21.16）最低共同祖先（Lowest Common Ancestor）算法来注释沉积物中的细菌群落，其中BLAST的绝对截止值为50[23].
从NCBI RefSeq数据库（NCBI Reference Sequence Database）下载质粒序列并建立质粒数据库，从INTEGRALL数据库中挑选整合酶及基因盒序列建立整合子数据库. 将样品DNA序列与质粒和整合子数据库进行了比对，识别这两种可移动遗传元件（Mobile genetic elements, MGEs）相关的基因序列. 识别质粒序列的阈值是比对长度大于90%且相似度大于95%[24]；识别整合子序列的阈值是比对长度大于70%且相似度大于90%[25].
DeepARG数据库（deepARG-DB，v1.0.2）是将CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）、ARDB（Antibiotic Resistance Genes Database）以及UNIPROT（Universal Protein）合并后去除重复序列得到的抗生素抗性基因数据库[26]. 使用BLASTX将样品测序数据与deepARG数据库进行比对，抗生素抗性基因序列的识别阈值是序列相似度大于90%且比对长度大于75%的测序读长. 此外，从测序宏基因组数据中提取抗生素抗性基因序列，再与质粒数据库比对，识别质粒携带的抗生素抗性基因[27]. 通过PHI-base和VFDB提供的致病菌分类和NCBI参考序列，从SILVA数据库中提取致病菌16S rRNA基因序列，建立非冗余的致病菌16S rRNA基因数据库. 使用BLASTN算法将样品测序数据与致病菌16S rRNA基因数据库进行比对，识别致病菌16S rRNA序列的E-value阈值为10-20，比对结果也使用MEGAN进行物种注释.
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使用RStudio（版本4.1.3）中的vegan软件包（版本2.6-2）进行Pearson相关性分析与ANOSIM检验，置换检验次数为999次，P < 0.05被认为具有统计学意义. 使用OriginPro 2021（版本9.8.0.200）绘制直方图、韦恩图与主成分分析图.
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通过数据比对和MEGAN注释中国边缘海沉积物样品中的16S rRNA基因，并输出在门、种水平上的细菌分类结果，如图1所示. 图1A是各采样点种水平上的细菌多样性，所有中国边缘海沉积物中共发现542种细菌，各样品的检出率从12.7%（SCS2和SCS4，69种）到28.4%（YS2，154种）不等. 南海的细菌物种多样性显著低于其他边缘海，可能由于南海沉积物的采样深度大，深海极端环境中细菌多样性较低. 在我国边缘海沉积物中占比最高的是变形菌门（Proteobacteria, 42.5%），随后是浮霉菌门（Planctomycetes, 8.0%），拟杆菌门（Bacteroidetes，7.8%），厚壁菌门（Firmicutes，5.8%），绿弯菌门（Chloroflexi，5.2%），如图1B所示.
有研究报道，渤海沉积物中变形菌门、拟杆菌门、放线菌门（Actinobacteria）和浮霉菌门是渤海海域的优势菌门[28]. 也有研究发现，变形菌门与浮霉菌门在渤海、黄海和南海的沉积物中相对丰度都是最高的[29]. 这些研究与本研究的分析结果一致，说明变形菌门和浮霉菌门是中国边缘海沉积物中的优势菌门. 在沉积物细菌群落的相对组成上，黄渤海的拟杆菌门占比显著高于其他海域，南海的浮霉菌门占比显著高于其他海域. 绿弯菌门是一类通过光合作用产能的细菌，该菌门在珠江口沉积物的占比明显高于边缘海沉积物.
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各海域沉积物中的抗生素抗性基因总丰度以及比对上的抗性基因参考序列数和亚型数如图2A所示. 南海沉积物中抗生素抗性基因总丰度约是黄渤海的2倍. 与珠江口相比，边缘海沉积物中的抗生素抗性基因总丰度较低. 沉积物中抗生素抗性基因亚型与序列多样性在各区域的分布趋势与其总丰度相似. 其中，5个抗生素抗性基因亚型在渤海、黄海和南海沉积物中均被检出，包括多黏菌素（arnA）、多重耐药（mexF, rpoB2, smeR）、硝基咪唑（msbA）抗性基因（图2B）. 同时，上述5个抗生素抗性基因亚型在珠江口沉积物中也均有检出.
各个区域沉积物中的抗生素抗性基因按照抗性类型分类，相对百分比如图2C所示. 在我国边缘海沉积物中多重耐药基因的丰度最高，其平均相对占比为89.1%（南海：85.9%；黄海：93.6%；渤海：88.0%）. 在人类活动干扰严重的珠江口水域，沉积物中多重耐药基因的相对丰度仅为64.4%，但对人类常用抗生素（如磺胺类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类等）相关的抗性基因相对占比显著提高，与人类常用抗生素相关的抗性基因普遍具有单一耐药特性. 比较我国边缘海和珠江口，发现珠江口沉积物中表达单一抗性的抗性基因平均相对占比是边缘海沉积物的约3倍，平均总丰度比边缘海高约13倍.
在几乎不受到人类活动影响的海洋环境中，微生物抗生素抗性基因组有其自身特征，这些抗性基因除抗生素耐药性之外，还具有其他生物学功能. 例如，在我国边缘海沉积物中都检出的rpoB2基因所编码的蛋白能参与碳和氮循环，mexF和mexW两种多重耐药基因编码的蛋白可参与磷循环[30]. 相比自然环境，受到人类活动影响大的区域中对人类常用抗生素具有单一抗性的抗性基因丰度大，占比高，且出现了许多抗生素的新型抗性基因[31-32]. 这一差异可能是由于抗生素的使用污染周边环境，诱导产生新型抗生素抗性基因并加速抗性基因在微生物之间传播[33]. 区域性抗生素抗性基因的组成特征说明了人类活动和环境抗性基因污染之间的关系，其中一些抗生素抗性基因亚型可以作为基因标志物指示环境受人类影响的程度[34].
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在中国边缘海沉积物中可广泛检测到可移动遗传元件相关的基因，包括质粒和整合子基因. 如图3A所示，中国边缘海沉积物中整合子基因丰度在1.44 × 10−6—5.31 × 10−6之间，显著低于珠江口沉积物中整合子基因的平均丰度（1.75 × 10−5）；中国边缘海沉积物中质粒基因丰度远高于整合子基因，其丰度范围是2.29 × 10−4—8.68 × 10−4，质粒基因丰度在中国边缘海和珠江口之间差异并不显著. 此外，中国边缘海沉积物中可能由质粒携带的抗生素抗性基因如图3B所示. 结果表明，各边缘海沉积物中检出的质粒携带的抗性基因极少，并且主要是多重耐药基因；珠江口沉积物中可能由质粒携带的抗生素抗性基因在所有抗性基因中的占比约是20%，主要与磺胺类、氨基糖苷类、大环内酯-林可酰胺-链阳菌素类（MLS）和四环素类等常用抗生素相关，其比例和丰度均显著高于边缘海（P < 0.01）.
质粒、整合子等可移动遗传元件是功能基因在微生物之间水平转移的重要载体[35]. 在自然环境中（如西藏高原和南极）均可检测到与质粒、整合子相关的基因片段，结合中国边缘海沉积物的分析结果，说明可移动遗传元件在环境中是广泛存在的[9,36]. 但是，自然环境中的可移动遗传元件与抗生素抗性基因传播的关系不大，在中国边缘海沉积物中极少检出可能由质粒携带的抗生素抗性基因. 而珠江口沉积物中可能由质粒携带的抗生素抗性基因的多样性和丰度的显著提高，表明在污染环境中可移动遗传元件有助于抗生素抗性基因的传播，即抗生素抗性基因的高传播性是其在污染环境中的一个重要特征.
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中国边缘海沉积物中人类致病菌的群落结构如图4所示. 图4A是各采样点沉积物中门水平上致病菌的相对组成，属于变形菌门的致病菌在中国边缘海沉积物中平均相对占比最高（60.5%），其次是厚壁菌门（27.5%）、放线菌门（7.6%）等. 图4B是各采样点沉积物种水平上致病菌的相对百分比. 在种水平上，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是中国边缘海沉积物中相对丰度最高的致病菌种（24.4%），随后是肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, 19.9%）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae, 9.2%）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, 6.9%）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, 3.4%）. 渤海的肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌和牙龈卟啉单胞菌占比均高于其他区域. 中国边缘海沉积物中检出的相对占比超过1%的致病菌共有16种，其中有3种是生物安全等级为Ⅲ级的高风险致病菌，分别是贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）以及结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）. 研究报道，海洋沉积物中有高丰度的肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，亚穆纳河中也发现了大量肺炎链球菌和铜绿假单胞菌，这些研究与本文的分析结果一致[37-38].
使用16S rRNA基因总丰度对人类致病菌进行归一化处理，并对中国边缘海沉积物样品进行主成分分析，如图4C所示. 前两个主成分可以解释不同区域间人类致病菌总方差的65.7%. 根据人类致病菌的组成特征，沉积物样品可以聚为3类，即黄渤海、南海和珠江口. 与其它区域相比，4种致病菌（包括肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌和铜绿假单胞菌）在黄渤海沉积物中的占比相对较高. 肺炎链球菌是引起败血症、脑膜炎、肺炎等侵袭性疾病的重要病原体，无论是在发达国家还是欠发达国家，其给幼儿以及老年人带来的疾病负担都是最高的[39]. 南海沉积物中的特征人类致病菌是沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）和土拉弗朗西斯菌. 土拉弗朗西斯菌作为生物安全等级为Ⅲ级的高风险人类致病菌，可以通过空气传播，具有高度传染性[40]. 珠江口沉积物中的特征人类致病菌则为副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）. 研究表明河口副溶血性弧菌丰度显著高于近海[41]. 空肠弯曲杆菌能引起食源性细菌感染，可以由水生动物通过食物链感染人类[42]. 空肠弯曲杆菌具有微需氧、适宜中等盐度、低温下难以存活的特性，这可能导致其在珠江口沉积物中含量比边缘海高[43]. 总的来说，各区域人类致病菌群落结构的差异可归因于人类活动、环境因子等多方面因素共同作用[44].
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中国边缘海沉积物中广泛检测到抗生素抗性基因，其中南海沉积物中的抗性基因丰度和多样性比黄渤海高，这些边缘海环境中抗生素抗性基因水平传播能力低. 与边缘海沉积物相比，珠江口沉积物中的抗生素抗性基因具有丰度、多样性以及传播能力高的特征，说明抗生素的使用能引起抗生素抗性基因的进化和传播. 不同区域沉积物中人类致病菌群落结构显著不同，边缘海沉积物中发现3种高风险致病菌，包括贝氏柯克斯体、土拉弗朗西斯菌等，将产生较高的潜在环境健康风险.
中国边缘海沉积物中抗生素抗性基因和致病菌的组成特征
Compositional characteristics of antibiotic resistance genes and putative pathogenic bacteria in sediments of Chinese marginal seas
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摘要: 抗生素抗性基因作为一种新型“污染物”已经受到广泛关注. 研究边缘海中抗生素抗性基因和人类致病菌的组成特征，有助于深入认识海洋环境中抗生素抗性基因的起源和海洋致病菌的潜在健康风险. 使用基于高通量测序的宏基因组学分析方法在中国边缘海沉积物中发现了多种抗生素抗性基因，主要以多重耐药基因为主，其中南海沉积物中抗生素抗性基因的总丰度约是黄渤海的2倍. 与中国边缘海相比，珠江口沉积物中抗生素抗性基因丰度更高，与人类常用抗生素（如磺胺类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类等）的耐药性更为相关. 此外，中国边缘海沉积物中几乎没有发现质粒携带的抗性基因，而珠江口有约20%的抗性基因由质粒携带. 中国边缘海沉积物中主要人类致病菌种包括肺炎链球菌（24.4%）、肺炎克雷伯菌（19.9%）、无乳链球菌（9.2%）、铜绿假单胞菌（6.9%）等. 珠江口沉积物中致病菌群落组成与中国边缘海显著不同，副溶血性弧菌和空肠弯曲杆菌的丰度相对更高. 上述研究表明，中国边缘海沉积物中存在高多样性的抗生素抗性基因和人类致病菌，人类活动干扰可导致其污染水平提高.Abstract: Antibiotic resistance genes (ARGs) are highly concerned as a group of emerging “contaminants”. Characterization of ARGs and putative human pathogenic bacteria (HPB) in the marginal sea is essential for understanding the origin of ARGs and the potential health risks posed by oceanic pathogenic bacteria. Multiple ARGs were found in the sediments of Chinese marginal seas using high-throughput sequencing-based metagenomic approaches, with multidrug being the predominant resistance type. Herein, total ARG abundance in the sediments of South China Sea were approximately 2 times higher than those in the sediments collected from the Bohai Sea and Yellow Sea. Compared to Chinese marginal seas, ARGs in the sediments of the Pearl River Estuary (PRE) are more abundant and closely associated with anthropogenic antibiotics such as sulfonamides, aminoglycosides, β-lactams, tetracyclines, etc. ARGs possibly carried by plasmids were hardly detected in the sediments of Chinese marginal seas, but could account for approximately 20% of the total ARGs in the PRE sediments. The prevalent putative HPB in the sediments of Chinese marginal seas were Streptococcus pneumoniae (24.4%), Klebsiella pneumoniae (19.9%), Streptococcus agalactiae (9.2%), Pseudomonas aeruginosa (6.9%), etc. The community composition of putative HPB in the PRE sediments was substantially different from those in the Chinese marginal seas, which were featured with the relatively higher ratios of Vibrio parahaemolyticus and Campylobacter jejuni. Our results suggest that diverse ARGs and putative HPB occur in the sediments of Chinese marginal seas, and anthropogenic impacts may increase their pollution levels.
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Key words:
- Chinese marginal seas /
- antibiotic resistance genes /
- pathogenic bacteria /
- metagenomics /
- sediments.
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好氧颗粒污泥(aerobic granular sludge, AGS)是微生物细胞在一定选择压下自凝聚形成的一种规则而紧密的颗粒状污泥[1]。与普通活性污泥相比，AGS具有结构紧密、沉降性优良、微生物量高、同步脱氮除磷、耐有机负荷等优点[2-3]，AGS形成机制日益成为污水处理领域的研究热点。污泥中的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)是微生物在一定环境条件下分泌的高分子物质，其主要成分是蛋白质(protein, PN)和多糖(polysaccharides, PS)，还有少量的腐殖酸、脂质、核酸以及富里酸类物质[4]。EPS作为细胞菌胶团的重要组分，其含量变化可改变微生物细胞表面特性，影响细胞间的相互凝聚能力[5]，促进AGS形成和维持其颗粒状立体结构[6]，对好氧污泥颗粒化具有重要作用。
目前，有关AGS的EPS成分的研究结果具有较大差异。OLIVERIRA等[7]认为，在好氧污泥颗粒化过程中PN是EPS的主要成分，而LIN等[8]则发现EPS中PS含量最高。TAY等[9]认为，EPS中的PS可提高微生物细胞间的凝聚力，具有强化AGS结构稳定性的功能。WANG等[10]和ADAV等[11]也证明 PS作为AGS的核心并构成内部骨架以支撑整个颗粒状立体结构。但Liu等[12]和MCSWAIN等[13]声明PN是AGS的核心，CHEN等[14]亦发现PN是维持AGS结构稳定的关键物质。因此，在EPS对好氧污泥颗粒化的影响研究方面仍存在分歧。
本研究考察了污泥EPS中PN含量和污泥表面特性的相关性，采用三维荧光光谱(three-dimensional fluorescence spectrum, 3D-EEM)和傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)等技术对接种污泥和AGS EPS组分和官能团进行了比较，明确接种污泥和好氧颗粒污泥中EPS组成成分的差异，同时使用激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)确定AGS EPS的分布情况，进一步了解EPS中PN对好氧污泥颗粒化的影响，以期为AGS形成机理研究及其技术发展提供参考。
1. 材料与方法
1.1 接种污泥和实验用水
实验所用的接种污泥取自广州市猎德污水处理厂四期二沉池的回流污泥，接种污泥的理化特性为：接种污泥为絮状，污泥浓度为7 588 mg·L−1，污泥沉降比为84%，污泥容积指数为110.7 mL·g−1，污泥沉降速度为12.36 m·h−1。接种前淘洗掉污泥中的杂质，并对其进行曝气24 h。接种污泥的体积为3.7 L，约占序批式反应器(sequencing batch reactor, SBR)有效容积的1/2。
实验用水采用人工配制的模拟废水，以C6H12O6和CH3COONa为混合碳源，NH4Cl为氮源，KH2PO4为磷源，用NaHCO3调节进水pH至7.5左右，并向进水中添加1 mL·L−1的微量元素溶液。人工配置的模拟废水水质组成如表1所示。
表 1 模拟废水质组成Table 1. Water quality of simulated wastewater成分 质量浓度/(mg·L−1) 成分 质量浓度/(mg·L−1) C6H12O6 500~1 200 FeCl3·6H2O 500 CH3COONa 300~600 CuCl2·2H2O 30 NH4Cl 40~90 MnCl2·4H2O 120 KH2PO4 8~18 ZnCl2·6H2O 120 [CH2N(CH2COOH)2]2 100 H3BO3 150 MgSO4·7H2O 30 KI 30 FeSO4·7H2O 30 Na2MoO4·2H2O 60 EDTA 20 CoCl2·6H2O 150 表1右列成分为微量元素溶液组成。 | Show Table
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1.2 实验装置及其运行方式
1)实验装置。在SBR中培养AGS，反应器主体为有机玻璃制成的圆柱体，其内径为9.8 cm，总高度为100 cm，有效高度为98 cm，有效高径比为10，反应器有效容积为 7.39 L。装置如图1所示。
2)运行方式。在好氧污泥颗粒化过程中，SBR运行过程包括进水、曝气、沉淀、排水和闲置5个阶段，运行周期为6 h，包括进水4 min，曝气338~351 min，沉淀2~15 min，排水1 min，闲置2 min。反应器液体表面上升气速为0.86~4.64 cm·s−1，进水有机物浓度(以COD计)为800~1 800 mg·L−1，容积交换率为50%，通过水浴加热使SBR温度维持在25 ℃。采用调控COD、表面上升气速和污泥沉降时间以培养AGS。SBR运行的具体参数见表2。
表 2 SBR运行参数Table 2. Operating parameters of SBR运行时间/d 进水/min 曝气/min 沉淀/min 排水/min 闲置/min 表面上升气速/(cm·s−1) COD/(mg·L−1) 1~13 4 338 15 1 2 0.86 800 14~28 4 341 12 1 2 1.25 1 000 29~43 4 343 10 1 2 1.86 1 200 44~57 4 345 8 1 2 2.65 1 600 58~75 4 348 5 1 2 3.87 1 600 76~110 4 351 2 1 2 4.64 1 800 | Show TableDownLoad:
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1.3 分析方法
1)常规指标分析。采用热提取法[15]提取EPS，EPS含量由PN和PS总含量表示；PS含量采用苯酚-硫酸法[16]测定；PN含量采用BCA(bicinchoninic acid)分光光度法[17]测定，其中EPS、PN和PS含量均以MLSS计；污泥Zeta 电位采用Zeta 电位分析仪(Zetasizer Nano ZS, Malvern)测定。
以RH表征污泥表面相对疏水性。RH的具体测定过程如下：取泥水混合液10 mL，用 pH为7的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液清洗2次；置于冰水浴中，用超声波细胞破碎仪(JY92-IIN, SCIENTZ)在 48 W 条件下超声 2 min；将超声后的悬浮液与10 mL正十六烷在分液漏斗中混合、摇匀 5min；静置 30 min后测定相关污泥浓度，污泥浓度采用国家标准方法[18]进行测定。RH根据式(1) [19]进行计算。
RH=(1−Q1Q0)×100% (1) 式中：Q0为原污泥浓度，mg·L−1；Q1为分液后水相中的污泥浓度，mg·L−1。
2) 3D-EEM分析。采用荧光光谱仪(FluoroMax-4, HORIBA Jobin Yvon)对EPS进行分析。激发波长(excitation wavelength，Ex)和发射波长(emission wavelength, Em)分别为220~400 nm和290~500 nm，增量均为 5 nm，激发和发射狭缝宽度为3.6 nm，扫描速度为1 200 nm·min−1，响应时间为0.1 s。采用origin 8.0软件进行数据处理。
3) FTIR分析。采用傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet IS50, Thermofisher)对EPS溶液进行官能团测定。操作过程如下：将提取的EPS溶液置于−80 ℃的冷冻干燥机(Virtis 4K, VIRTIS)内冷冻干燥至无水；将干燥后的EPS和溴化钾以质量比为1∶100的比例研磨并混合均匀，混合粉末压片成型后用红外光谱仪以分辨率为4 cm−1，扫描次数为32次，在4 000~500 cm−1内进行扫描，用origin 8.0软件进行数据处理。
4)荧光染色和CLSM分析。用荧光染料对AGS进行染色，以观察AGS样品中PN、PS、活细胞和死细胞的分布，选用的荧光染料如表2[20-21]所示。染色后的AGS样品使用激光共聚焦显微镜(LSM 800 with Airyscan, Carl Zeiss)进行观察。
2. 结果和讨论
2.1 AGS形成过程
污泥在SBR不同运行阶段的外观变化如图2所示。接种污泥为灰褐色、絮状，结构松散。当SBR运行到第30 天时出现少量细小的污泥颗粒，但絮状污泥占主体；在第50天，初期AGS形成，粒径较小。随着SBR持续运行，沉降性能较差的颗粒状污泥进一步被筛选出反应器，第70 天时AGS呈淡黄色，表面有一层绒毛，颗粒粒径主要集中在1.0~1.5 mm。第110 天时AGS培养成功，其外观为橙黄色，表面光滑，整体呈球状或椭球状的立体结构，颗粒粒径集中分布在1.43~2.26 mm。
2.2 EPS、PN和PS含量以及PN/PS变化
好氧污泥颗粒化过程中EPS、PN和PS含量以及PN/PS变化情况如图3所示，接种污泥的EPS、PN和PS含量分别为29.86、13.98、15.88 mg·g−1，PN/PS为0.88。在SBR运行初期，EPS、PN和PS含量均逐渐增加，PS含量略高于PN含量，这是因为污泥中的微生物在选择压的刺激下需分泌大量PS来维持正常的生命活动[22]。随后因选择压加强，干扰了微生物细胞间的信息交流和信号分子传递，打破了污泥中微生物生理活动的平衡，导致微生物新陈代谢活动受到抑制，因此，EPS、PN和PS含量从第45 天起均呈下降趋势，PN/PS出现明显波动。从第65 天起，可能是因为SBR中有大量细小颗粒污泥，微生物量较大且活性较高；另一方面，因为SBR长期运行，污泥中的部分微生物细胞自溶，所以EPS中的PN和PS含量增加。但微生物的代谢活动可消耗EPS中的PS，而PS含量的增加可能与其消耗近似处于平衡状态，所以PN/PS值随着PN含量的增加而增大[23]。第110 天时AGS培养成功，AGS的EPS、PN和PS的含量分别为68.60、41.86和26.74 mg·g−1，PN/PS为1.57，约是SBR启动时的2倍。在整个好氧污泥颗粒化过程中，EPS和PN含量及PN/PS变化整体均呈增大趋势，而PS维持在15.88~26.74 mg·g−1，说明AGS EPS成分以PN占主导，这与CHEN等[20]研究结果相同。
图 3 EPS、PN和PS含量以及PN/PS随时间的变化Figure 3. Changes of EPS, PN, PS contents and PN/PS with time2.3 PN含量和污泥Zeta电位的相关性
污泥Zeta电位变化及PN含量与Zeta电位之间的关系如图4所示。由图4(a)可知，接种污泥的Zeta电位为−27.64 mV，在SBR运行前30 d内，因接种污泥要适应新的环境，其生长状态不稳定，所以污泥Zeta电位有一定波动。随后污泥Zeta电位开始下降，在第100天，污泥Zeta电位下降到−18.27 mV。在第110天时AGS培养成功，其Zeta电位为−18.31 mV。如图4(b)所示，PN含量和污泥Zeta电位呈负相关，相关系数(r)为0.950。由于PN可与水中的金属离子发生离子键作用，压缩双电层，降低污泥Zeta电位[24]。此外，PN中带有正电荷的氨基类物质能够中和部分羟基和磷酸根基团中的负电荷，进一步降低污泥Zeta电位[25]。因此，污泥Zeta电位的降低可促进微生物间的相互凝聚，最终形成AGS。在本次实验过程中，PN含量基本处于增加趋势，而污泥Zeta电位趋于下降趋势，这说明EPS中PN含量增加，污泥Zeta电位降低。
图 4 污泥Zeta电位变化及PN含量与Zeta电位的关系Figure 4. Change of Zeta potential of sludge and the relationship between PN content and Zeta potential2.4 PN含量和RH的相关性
RH变化及PN含量与RH之间的关系如图5所示。在好氧污泥颗粒化过程中，RH整体呈增加趋势。接种污泥的RH为27.27%，在SBR运行初期，RH基本呈缓慢增加趋势，在第70天RH达到60.01%。随后因为初期AGS大量形成，反应器中絮状污泥被颗粒状污泥代替，所以RH开始显著增加，在第100天时RH为77.58%。随着AGS逐渐成熟稳定，第110 天时AGS的RH为76.80%，约是接种污泥的2.8倍(图5(a))。LIU等[26]发现RH和SBR运行期间的选择压密切相关，因此，其在好氧污泥颗粒化过程中具有重要作用。同样，DIGANCE等[27]的研究表明, 污泥EPS中的PN是污泥的主要疏水成分。在本实验中发现PN含量变化与RH变化存在密切关系，如图5(b)所示。PN含量和RH呈正相关关系，r为0.934。此外，张丽丽等[28]发现AGS的PN含量与RH密切相关，污泥RH随PN含量的增加而增大。结合第2.4节的结果可知，在好氧污泥颗粒化过程中，PN含量增加，污泥Zeta电位降低且RH升高，有利于微生物细胞间的相互聚集，促进AGS形成。
图 5 RH变化及PN含量与RH的关系Figure 5. Change of RH and the relationship between PN content and RH2.5 EPS的3D-EEM图谱分析
采用3D-EEM技术对接种污泥和AGS的EPS组分进行比较。接种污泥和AGS的EPS的3D-EEM如图6所示。接种污泥和AGS的EPS的3D-EEM中均出现荧光峰A(Ex: 270~285 nm，Em: 295~320 nm)、荧光峰B(Ex: 270~295 nm，Em: 325~390 nm)和荧光峰 C(Ex: 310~380 nm，Em: 400~470 nm)，其中荧光峰A和荧光峰B分别代表酪氨酸和色氨酸类蛋白质，均属于溶解性微生物代谢产物，酪氨酸类蛋白质是AGS形成的重要成分，可促进絮状污泥颗粒化[29-30]；而色氨酸类蛋白质为疏水性物质，其与EPS中芳环氨基酸结构共同作用，可提高AGS结构稳定性[31]。AGS的EPS的荧光峰A和荧光峰B的荧光强度明显高于接种污泥，这表明在好氧污泥颗粒化过程中，污泥EPS中酪氨酸和色氨酸类蛋白质含量有所增加。AGS的EPS的3D-EEM出现2个新荧光峰：即代表芳香族蛋白类物质的荧光峰D(Ex: 220~230 nm，Em: 290~310 nm)和代表富里酸类物质的荧光峰E(Ex: 220~240 nm，Em: 400~470 nm)，而芳香族蛋白类物质的存在有利于AGS的形成[28]。
2.6 EPS的FT-IR分析
为了确定接种污泥和AGS的EPS官能团的差异，在4000~500 cm−1内进行了EPS的FT-IR分析，结果如图7所示。1 650~1 600 cm−1吸收峰是由蛋白质二级结构(酰胺Ⅰ)中的C=O拉伸震动引起的β-折叠和α-螺旋，1 550 cm−1吸收峰是由酰胺Ⅱ中的N—H弯曲产生[32-33]。AGS EPS在1 650~1600 cm−1和1 550 cm−1处的吸收峰面积分别为133.87、52.51(见表3)。有研究[34-35]发现，酰胺Ⅰ中的蛋白质二级结构具有促进微生物絮凝，加快推进好氧污泥颗粒化进程的作用，而从接种污泥提取的 EPS中未出现相似的吸收峰。
表 3 荧光染料Table 3. Fluorescent dye荧光染料 Em/nm Ex/nm 标记目标 染色时间/min 异硫氰酸荧光素 488 500~550 PN 60 刀豆蛋白A 543 550~600 PS 30 碘化丙啶 535 615 死细胞 30 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 346 454 活细胞 10 | Show TableDownLoad:
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接种污泥和AGS的EPS分别在1 400 cm−1和1 410 cm−1处出现与C=O对称拉伸有关的吸收峰[36]。接种污泥的EPS中存在与PN(酰胺Ⅲ)有关的C—N拉伸所产生的1 260 cm−1吸收峰，吸收峰面积为36.43(见表3)，而从AGS中提取的EPS中并未出现类似吸收峰。因PS中C—O伸缩震动和C—OH变形震动造成在1 140 cm−1和1 100 cm−1处出现吸收峰，2处吸收峰面积分别为85.89、108.65(见表3)，表明好氧污泥颗粒化过程中PS含量没有明显变化，这与PS含量测定结果(图3)相一致。
表 4 EPS中各类物质吸收峰面积Table 4. Absorption peak area of various substances in EPSEPS来源 PN PS(1 140~1 100 cm−1) 核酸(993~893 cm−1) 酰胺Ⅰ(1 650~1 660 cm−1) 酰胺Ⅱ(1 550 cm−1) 酰胺Ⅲ(1 260 cm−1) 接种污泥 — — 36.43 85.89 3.93 AGS 133.87 52.51 — 108.65 7.10 | Show TableDownLoad:
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2.7 EPS的CLSM分析
为确定AGS EPS分布情况，采用CLSM对AGS EPS分布进行了研究。如图8所示，AGS表面附着PN(绿色区域)和PS(蓝色区域)。EPS分布在AGS外表层，从而将微生物细胞包裹在EPS中。一方面，EPS在AGS表面形成保护层，在一定程度上可用来抵御环境恶化以及有毒物质对微生物细胞的危害；另一方面，在营养物质匮乏时，微生物将EPS作为新的能源物质来维持自身的生命活动。AGS表面的PS为高分子粘性物质，可以作为细胞间的连接基质，与丝状菌嵌合形成交叉的网状骨架结构(图8(b))，为微生物细胞与其他微小颗粒间形成架桥。在外界选择压的改变下，附着在AGS表面的PN改变细胞表面的特性，进一步促进微生物细胞间以及微生物与污泥微粒间的相互凝聚并形成微生物聚集体，最终形成好氧颗粒污泥。由图8(b)和图8(d)图发现，绿色区域面积大于蓝色区域面积，表明AGS EPS中PN含量高于PS含量，与图3测定结果相符合。
3. 结论
1)在好氧污泥颗粒化过程中，EPS中PN含量增加明显，由接种污泥的13.98 mg·g−1增加到AGS的41.86 mg·g−1，PS含量维持在15.88~26.74 mg·g−1，PN/PS整体呈增大趋势，由0.88增加到1.57，表明AGS EPS成分以PN为主导。
2) PN含量和污泥Zeta电位、RH分别呈负相关和正相关，r分别为0.950、0.934。PN含量增加，污泥Zeta电位降低，污泥RH升高，有利于微生物细胞间的相互聚集，促进好氧污泥颗粒化。
3) EPS中代表酪氨酸和色氨酸类蛋白质的荧光强度增强，AGS EPS中出现芳香族蛋白和富里酸类物质以及含有N—H官能团的蛋白质，为好氧污泥颗粒化奠定物质基础。
4)EPS分布在AGS表层并包裹微生物细胞。
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图 1 中国边缘海沉积物中细菌的多样性（A）和群落结构（B）
Figure 1. The diversity （A） and structure （B） of bacterial communities in the sediments of Chinese marginal seas
图 2 中国边缘海沉积物中抗生素抗性基因的丰度和多样性（A）、抗生素抗性基因亚型数韦恩图（B）以及抗生素抗性基因的相对组成（C）
Figure 2. Total abundance and diversity of ARGs （A）, Venn diagram of ARG subtypes （B） and relative composition of ARGs （C） in the sediments of Chinese marginal seas
图 3 中国边缘海沉积物中质粒基因和整合子基因的丰度（A）和质粒携带的抗生素抗性基因丰度（B）
Figure 3. Total abundance of plasmid and integron genes （A） and ARGs possibly carried by plasmids （B） in the sediments of Chinese marginal seas
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