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复方益母草胶囊是由益母草、当归和熟地3味药材经过一定的工序加工制成的复方制剂，该胶囊主要药味益母草中含有生物碱类、黄酮类、二萜类、苷类、脂肪酸类、挥发油类等成分[1]. 生物碱类盐酸水苏碱是益母草的主要药效成分[2]. 盐酸水苏碱是季胺碱，极性强，无共轭结构，紫外吸收弱，属于末端吸收. 高效液相色谱法是盐酸水苏碱目前最为普遍的检测方法，盐酸水苏碱常用的检测器有紫外检测器 （DAD等） [3]、质谱检测器（MS）[4]、示差检测器（RID）和蒸发光散射检测器 （ELSD） [5]等，目前尚未报道电雾式检测器（CAD）被用于盐酸水苏碱的定量分析. 用紫外检测器测定盐酸水苏碱，存在方法重复性差、溶剂末端吸收干扰、梯度洗脱时容易出现基线漂移检测不稳定等局限性[6]；依据盐酸水苏碱的结构中有旋光性的特点，采用RID检测器测定其含量，无需特殊样品处理方法就有很好的峰形，但专属性不强、灵敏度较低，且不能使用梯度洗脱分离效果不佳，应用相对较少[7-8]；ELSD检测器是目前定量分析盐酸水苏碱最常用的检测器，据报道其灵敏度也较低[9]. 电雾式检测器（CAD）是一种质量相关的通用型检测器，其检测信号不依赖于被测物质的化学结构，更适用于无紫外吸收或只有较弱紫外吸收成分的定量分析.
本研究利用Thermo-fisher AcclaimTM Mixed-Mode WAX-1色谱柱结合HPLC-CAD法分离测定复方益母草胶囊中主要成分盐酸水苏碱含量，探讨该方法对比现行《中国药典》（2020版）一部中ELSD测定盐酸水苏碱的优势，为其质量评价和标准制定提供理论依据，同时为未来推广到其它含益母草类制剂中使用提供科学参考，具有现实应用价值，且目前缺少相关报道.
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试剂：甲酸分析纯（纯度99.9%）（天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲酸铵质谱级（纯度99%）（Roe Scientific Inc公司）；无水乙醇分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；甲醇HPLC级（上海星可高纯溶剂有限公司）；乙腈HPLC级（上海星可高纯溶剂有限公司）；屈臣氏饮用水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；盐酸水苏碱对照品（纯度98.91%）（成都普思生物科技股份有限公司）.
液相色谱（美国赛默飞公司），Vanquish Core系列双三元泵：VC-P33-A-01；自动进样器：VC-A12-A-02；柱温箱：Column compartment VC-C10-A-03；可变波长检测器：Variable Wavelength Detector VC-D40-A-01；CAD检测器：Charged Aerosol Detector H VH-D20-A；变色龙色谱管理软件 Chromeleon CDS 7.3; Waters Acquity超高效液相色谱仪ELS Detector检测器；电子天平 YP30002（上海佑科仪器仪表公司）；分析天平 B931029762（北京艾斯瑞克商贸公司）；超声仪 KQ-250DB（昆山市超声仪器公司）。
色谱柱：AccucoreTM-Amide-HILIC（150 mm × 4.6 mm，5 µm， Thermo-Fisher公司）；AcclaimTM Mixed-Mode WAX-1（250 mm × 4.6 mm，5 µm， Thermo-Fisher公司）; AcclaimTM Mixed-Mode WCX-1（250 mm × 4.6 mm，5 μm， Thermo-Fisher 公司）；Ascentis Express OH5 （150 mm × 4.6 mm，2.7 µm， 美国merck公司）；Polar-Phenyl （250 mm × 4.6 mm，5 µm， 济南赛畅科学仪器有限公司）；ShimNex HE Amide （250 mm × 4.6 mm，5 µm ，岛津中国公司）；Poroshell 120 HILIC-Z （150 mm × 4.6 mm，2.7 µm， 安捷伦公司）；Venusil HILIC （250 mm × 4.6 mm，5 µm，Agelag公司）；XBridge BEH Amide （150 mm × 4.6 mm，5 µm Waters公司）；60-5-HILIC-D （250 mm × 4.6 mm，5 µm Kromasil公司）; XBridge Amide （250 mm × 4.6 mm，5 µm Waters公司）.
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对照品溶液 取盐酸水苏碱对照品适量，精密测定，加入70%乙腈（乙醇）制成每1mL含0.5 mg的溶液，即得.
供试品溶液 按2020版《中国药典》方法制备，取装量差异项下的复方益母草胶囊内容物，混匀，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70% 乙腈（乙醇）25 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用70%乙腈（乙醇）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得.
阴性对照的制备：按照复方益母草胶囊处方药物组成，不加益母草和辅料，同供试品制备方法.
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精密量取盐酸水苏碱对照品储备液1 mL，分别置于5、10、20、50、100 mL容量瓶中，至刻度. 再精密量取1 mL上述50 mL容量瓶溶液置于10 mL、25 mL容量瓶中，加70%乙醇置刻度，摇匀. 按照《中国药典》（2020版）一部复方益母草胶囊方法，采用AccucoreTM-150-Amide-HILIC （150 mm × 4.6 mm, 5 µm）色谱柱，以乙腈-0.2%冰醋酸溶液（80∶20）为流动相，进样量5 μL，分别用ELSD和CAD检测器测定盐酸水苏碱的信噪比，进行灵敏度对比. 按信噪比3∶1及10∶1计算，盐酸水苏碱的检测限（LOD）和定量限（LOQ）结果显示，CAD检测限是ELSD的34倍，定量限是37倍，表明CAD有更好的灵敏度.
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取盐酸水苏碱标准品适量，分别采用10种不同厂家的色谱柱进行测定，其中Poroshell 120 HILIC-Z和AcclaimTM Mixed-Mode WAX-1色谱柱对复方益母草中盐酸水苏碱分离效果最好，前者理论塔板数高达26430，后者理论塔板数18413，且前后无干扰峰，因此本研究最终选择AcclaimTM Mixed-Mode WAX-1柱子作为盐酸水苏碱的定量分析.
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盐酸水苏碱是最简单的吡咯生物碱，其分子结构含有季铵根和羧基，极性较强。实验室尝试了 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 和 WCX-1 两款色谱柱的 RP+IEX 保留模式，保留均较弱。其中 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱键合相为带有叔胺末端的疏水烷基链键合硅胶，除去反相保留（RP）和弱阴离子交换（WAX），还可提供亲水作用（HILIC）保留机制。经试验确定采用 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱的 HILIC 模式进行盐酸水苏碱的分离保留效果优异，因而流动相有机相优先选择乙腈。由于 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱必须始终使用含有缓冲盐的流动相进行活化、分析或保存，在配合 CAD 使用时，须使用挥发性缓冲盐，流动相水相可选用甲酸铵或乙酸铵。
除了色谱柱和流动相的选择外，供试品溶液的制备也需要重点考察。取复方益母草胶囊数粒去壳，将内容物混匀研细，取0.2 g，精密称定，置具塞三角瓶中，分别精密加入30%、50%、70%的甲醇，30%、50%、70%的乙醇和30%、50%、70%的乙腈，超声提取40 min（功率250 W，频率40 kHz），冷却至室温，摇匀. 离心5 min（5000 r·min−1）。转移至25 mL容量瓶并定容至刻度，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得. 进样检测，计算各提取溶剂下盐酸水苏碱的相对含量. 3种不同浓度的乙腈对盐酸水苏碱成分提取效果最好，在 HILIC 模式下，流动相通常推荐使用非质子溶剂乙腈，并且初始流动相为较高比例的乙腈，当对照品或供试品溶液乙腈比例较低时，进样后容易形成溶剂效应，影响水苏碱的峰形和响应。试验表明，采用 70% 乙腈水提取效果较好，因此本研究最终选择70%乙腈作为提取溶剂.
最终确定以CAD为检测器，采用AcclaimTM Mixed-Mode WAX-1（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，以20 mmol·L-1 甲酸铵 (甲酸调节 pH至 4.0) (A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱：0—8 min，10%A；8—12 min，10%—50%A；12—15 min，50%A；15—20 min，50%—10%A. 柱温30 ℃，蒸发温度35 ℃；采集频率 5 Hz，过滤常数 3.6 s；进样体积5 μL. 该色谱条件通过系统考察得到较好的分离效果.
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分别取盐酸水苏碱标准对照品溶液，供试品溶液，缺益母草阴性对照液适量，注入高效液相色谱仪，按2.3节色谱条件进样测定. 供试品色谱图中出现与标准对照品中保留时间相同的峰，且理论塔板数不低于18000，缺益母草阴性对照色谱图中显示阴性样品无干扰，表明该方法专属性较好（图1）.
取盐酸水苏碱对照品溶液，按2.3节色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果峰面积RSD为1.13%. 按上述样品制备方法，制备供试品溶液，分别于0、2、6、10、24 h进样，RSD为1.93%，表明供试品在24 h内稳定性良好. 取同一批号样品（批号：20220301），按2.3节方法平行制备6份供试品溶液，在2.3节色谱条件进样分析，样品中盐酸水苏碱平均含量33.4 mg·g−1，RSD为1.38%.
采用加样回收法，精密称取0.1 g已知含量的复方益母草胶囊样品8份，分别加入适量的盐酸水苏碱标准品，按2.3节供试品制备方式制备供试品. 计算加样回收率在95.70%—99.20%，平均回收率97.37%，RSD为1.14%（表1）.
精密称量盐酸水苏碱对照品9.30 g于20 mL容量瓶中，加70%乙腈水溶液逐级稀释，制成盐酸水苏碱浓度分别为0.465、0.279、0.186、0.093、0.047、0.019 mg·mL−1，按2.3项下色谱条件下进样分析，记录相应峰面积. 以待测组分质量浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，对一次曲线和二次曲线进行了比较，一次曲线函数为Y=52.989X+1.5521，r2为0.9862，二次曲线函数为Y=-54.114X2+78.28X+0.4612，r2为0.9995，二次曲线拟合较好，故选二次曲线进行计算.
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依据前述盐酸水苏碱含量测定方法，分别对随机选取的同批次和不同批次（5批）复方益母草胶囊中盐酸水苏碱含量进行测定，分别计算其批内（PA）和批间（PB）盐酸水苏碱含量的差异值.结果表明，复方益母草胶囊批内差异PA值为6.3%，反映该厂家与益母草相关的生产工艺较稳定. 批间一致性差异较大，每粒含量12.00—16.14 mg不等，PB值为28.98%，推测可能是益母草原料质量差异造成.
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通过对比10种亲水型作用色谱柱（HILIC），最终确定利用Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱键合相的叔胺官能团，在 HILIC 模式下对水苏碱的强保留能力，可有效与供试品杂质峰分离，避免基质干扰。采用乙腈-20 mmol·L−1 甲酸铵缓冲液 （pH=4.0） = 90:10作为初始流动相进行梯度洗脱，配合CAD检测器测定盐酸水苏碱含量， 结果显示CAD具有较高的灵敏度，为定量分析盐酸水苏碱提供了新方法新参考. 本研究所建立用于测定盐酸水苏碱HPLC-CAD方法，专属性强、重复性好、灵敏度高，为复方益母草胶囊及相关制剂中盐酸水苏碱的质量检测提供可行方案.
高效液相色谱-电雾式检测法测定复方益母草胶囊中盐酸水苏碱
Determination of stachydrine hydrochloride in compound leonurus japonicus capsules by high performance liquid chromatography-charged aerosol detector
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摘要: 盐酸水苏碱是复方益母草胶囊的主要质控成分，目前主要使用高效液相色谱-蒸发光散检测法（HPLC-ELSD）测定其含量. 本文采用高效液相色谱-电雾式检测器法（HPLC-CAD），建立定量测定复方益母草胶囊中盐酸水苏碱的新分析方法，快速有效的评价复方益母草胶囊的质量. 对比ELSD和CAD不同检测器的检测限（LOD）和定量限（LOQ），考察市场不同型号色谱柱对复方益母草胶囊中盐酸水苏碱的分离效果，以及提取溶剂对盐酸水苏碱提取效率的影响。结果表明，盐酸水苏碱浓度在9.3—465.0 μg·mL−1范围内具有良好的线性关系，相关系数（r）为0.9995. 方法精密度、重复性和24 h稳定性RSD值均小于2.0%（n=6），盐酸水苏碱加样回收率在95.7%—99.2%范围内，RSD值为1.1%. 5批复方益母草胶囊盐酸水苏碱含量每粒14.94—15.92 mg，均符合《中国药典》（2020版）一部复方益母草胶囊含量要求. 批内一致性PA为6.5%，批间一致性PB为28.9%.
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关键词:
- 高效液相色谱-电雾式检测器 /
- 高效液相色谱-蒸发光散检测器 /
- 益母草 /
- 复方益母草胶囊 /
- 盐酸水苏碱
Abstract: Stachydrine hydrochloride is the main quality control component of compound Leonurus japonicus capsules. Due to its non conjugated structure and weak ultraviolet absorption, the content of stachydrine hydrochloride is mainly determined by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector(HPLC-ELSD). In this study, a new method for the quantitative determination of stachydrine hydrochloride in compound Leonurus japonicus capsule was established by high performance liquid chromatography-charged aerosol detector(HPLC-CAD), and the quality of compound Leonurus japonicus capsule was evaluated rapidly and effectively. Firstly, the detection limit (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of different detectors in ELSD and CAD were compared, and the detector with better sensitivity was selected; Secondly, the separation effect of stachydrine hydrochloride in compound Leonurus japonicus capsules by different types of chromatographic columns in the market was investigated to select the best chromatographic column for subsequent experiments; Thirdly, the influence of extraction solvent on the extraction efficiency of stachydrine hydrochloride was also investigated; Results indicated that the concentration of stachydrine hydrochloride had a linear relationship with the concentration of stachydrine hydrochloride in the range of 9.3—465.0 μg·mL−1, and the correlation coefficient (r) was 0.9995. The RSD values of the precision, 24 h stability and repeatability of the method were less than 2.0% (n=6). The recovery of stachydrine hydrochloride was 95.7%—99.2%, and the RSD value was 1.1%. The content of stachydrine hydrochloride in 5 batches of compound motherwort capsules was 14.94—15.92 mg/capsule, which was in line with the requirements of compound Leonurus japonicus in the Chinese Pharmacopoeia 2020 (VolumI). The intra assay consistency was 6.5%, and the inter assay consistency was 28.9%. -
水体中的微量元素具有难降解性和较强的生物毒性[1]，对人体健康造成不可估量的损伤[2]. 随着采煤活动的不断进行，我国采煤沉陷区域面积逐年递增[3]，开采所产生的副产物释放微量元素进入沉陷水体中，对采煤沉陷区的水体及土壤造成严重的生态威胁[4]. 近年来，不少研究发现，采煤沉陷塘出现了微量元素富集现象，如刘旭[5]发现淮南沉陷水体的重金属受煤矸石堆积、公路干道等人为因素影响，导致沉陷塘水体部分点位出现重金属富集现象. 此外，任永乐等[6]发现淮南沉陷塘水体微量元素Cd、Pb、Cu、Ni富集，陈同等[7]对研究发现，淮南潘集采煤沉陷水体底泥中微量元素Cu、Zn、Cd 富集，其中Cd富集程度最高. 以上研究表明，采煤沉陷塘出现了Cd、Pb、Cu、Ni、Zn元素富集，同时，Cd元素在稳沉、非稳沉沉陷塘富集，且富集程度较高.
然而，近年来，不少沉陷塘上铺设了太阳能光伏面板，包括漂浮型和立柱型两大类，如2017年淮南市潘集
6000 亩采煤沉陷水域上建设的漂浮型光伏电站和李郢孜采煤沉陷水域的立柱型光伏电站. 国际上少数研究表明，光伏电站的建设对水生态环境的影响并不大[8 − 9]，甚至从长远看可以实现良性向好发展，但也有研究表明光伏电站的建设降低了沉水植物对浮游植物的竞争力，导致浮游植物生物量的增加和沉水植物量的减少，进而使整个水生态环境恶化[10]. 因此，探究不同类型光伏面板是否对采煤沉陷水域微量元存在不利影响势在必行.对采煤沉陷塘微量元素的含量特征、形态分布和风险评估等方面进行研究的主要方法包括单因子污染指数法[11]、综合污染指数法[12]、内梅罗指数法[13]、相关性分析[14]、主成分分析[15 − 16]和健康风险评价法[17]，这些方法对水体微量元素的研究发展具有重要意义. 目前学界对采煤沉陷塘的研究主要集中在微量元素时空变化特征及健康风险评价、来源分析以及水体理化性质和微量元素的相关性分析[15, 17 − 18]，对采煤沉陷塘和非沉陷塘微量元素分布特征的研究很少. 因此本研究选取淮南矿区光伏沉陷塘、和无光伏沉陷塘作为研究对象，以淮南市中央公园湖泊（非沉陷塘）作为对照区，分析沉陷塘水体中Cr、Ni、Cd、Pb、Cu、Mn、Zn的浓度分布特征，并运用内梅罗指数法、健康风险评价模型、相关性和聚类分析对水体微量元素进行评价，以期为沉陷塘光伏项目的发展、采煤沉陷塘的综合治理和居民饮水和用水安全提供科学依据.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 研究区概况
淮南矿区位于安徽省北部的淮河两岸，位置属华北板块南缘，东起郯庐断裂带，西至阜阳断层，北接蚌埠隆起，南以老人仓-寿县断层与合肥坳陷相邻，由老矿区（谢家集区）和新矿区（潘谢矿区）组成，面积约
3200 km2[19]，是我国14个大型煤炭基地和6大煤电基地之一，不但煤种丰富，且资源保有量为324亿吨，是国家煤炭资源开采与利用的重大工程建设区[20]. 随着煤炭资源的不断开采，矿区沉陷区域面积逐年递增，目前已超300 km2.研究区域年均气温为15. 5 ℃，年均降水量为900.1 mm，年均蒸发量为747.0 mm. 区域内四季分明，全年主导风向为东南风和东北风，降雨主要集中在夏季，秋冬季节干燥寒冷，降雨量少[21].
1.2 样品采集与测试
选取顾桥矿区的漂浮光伏沉陷塘和无光伏沉陷塘、李郢孜矿区的立柱光伏沉陷塘作为研究水域，淮南矿区光伏电站于2017年至2018年期间建设完成，淮南中央公园位于淮南市高新区，北邻政务中心，南邻奥林匹克公园，总面积约
900000 m2，中心湖面面积达420000 m2，周边建设尚未完成，仍然保持苗圃林地原生状态，受污染程度小，因此，为排除部分外部因素影响，选取淮南市中央公园非沉陷塘水样作为对照，于2021年6月进行船只采样.依照《水和废水监测分析方法（第4版）》，在沉陷塘和中央公园非沉陷塘上分别设置6个采样点（漂浮光伏沉陷塘采样点编号为P1—P6，立柱光伏沉陷塘采样点编号为L1—L6，无光伏沉陷塘采样点编号为W1—W6，中央公园非沉陷塘采样点编号为F1—F6），采样点尽可能均匀分布在整个采样空间内，在采样点水面下0.5 m处采集多点混合瞬时水样500 mL，现场加入硝酸酸化，4 ℃保存，带回实验室持续低温保存，采样点具体位置分布如图1所示.
水样用0.45 μm醋酸纤维素滤膜过滤，采用《水质重金属总量消解硝酸法（HJ677—2013）》进行消解，利用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，NexION300X）测定Cr、Ni、Cd、Pb、Cu、Mn、Zn含量，并实行质控控制，试验设置１个空白样和３个平行样.
1.3 污染评价
采用单因子污染指数（Pi）和内梅罗指数（Ni）综合评价地下水中重金属污染水平，公式如（1—2）.
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2) 式中，i为不同重金属，ci为水中重金属实测浓度，si为地表水质量标准（GB3838—2002）的Ⅲ类浓度阈值，ci、si单位为μg·L−1，其划分标准如表1.
表 1 污染水平平均标准Table 1. Average pollution level standards单因子评价标准Single factor evaluation criteria 内梅罗评价标准Nemerow evaluation criteria Pi 污染水平Level of pollutant Ni 污染水平Level of pollutant Pi≤1 清洁 Ni＜1 清洁 1＜Pi≤2 轻度污染 1≤Ni＜2.5 轻度污染 2＜Pi≤3 中度污染 2.5≤Ni＜7 中度污染 Pi＞3 重度污染 Ni≥7 重度污染 | Show Table
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1.4 人体健康风险评价方法
微量致癌物可能对人体健康产生危害，非致癌物（又称为躯体毒物质）对人体健康产生的危害也不容忽视，其危害主要表现在对人体器官或系统的危害. 因此对采煤沉陷塘水体致癌物质和非致癌物质都应该进行健康风险评价.
人体健康风险模型（HHR）以风险度为评价指标，将环境污染与人体健康结合，定量描述环境污染对人体健康的危害. 根据EPA标准，环境介质中的有毒金属可通过饮水摄入、皮肤接触和口鼻吸入三种暴露途径危害人体健康，并成人和儿童两种暴露人群分开考虑. 根据沉陷塘水体特点，仅考虑饮水摄入和皮肤接触暴露途径造成的健康风险[22].
非致癌物质的暴露量通常用日均暴露剂量表征，致癌物质的暴露量通常用终生日均暴露剂量表征. 饮水摄入途径暴露的健康风险计算公式如（3—5）：
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (3) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (4) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (5) 皮肤接触途径暴露的健康风险计算公式如（6—8）：
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (6) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (7) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (8) 非致癌物风险值公式如（9）：
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (9) 健康风险评价模型参数如表2所示.
参数Parameter 含义Implication 值Value 单位Unit CW 微量元素浓度 — mg·L−1 IR 日均饮水摄入量 儿童1.14、成人1.70 L·d−1 EF 暴露频率 350 d·a−1 ED 暴露持续时间 儿童9、成人30 a BW 人群体重 儿童24、成人57 kg AT 平均接触时间 非致癌物30×365、致癌物70×365 d CF 体积转换因子 0.001 L·cm−3 SA 皮肤接触面积 儿童 9300 、成人16000 cm2 PC 皮肤渗透系数 0.002（Cr）、 0.0001 （Mn）、0.0006 （Zn）、0.0005 （Cu）、0.001（Cd）、0.000004 （Pb）cm·h−1 ET 暴露时间 0.12 h·d−1 | Show TableDownLoad:
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RfD为微量元素直接摄入的参考剂量[mg·（kg·d）−1]；SF为直接摄入暴露的致癌系数[mg·（kg·d）−1]，具体参数详见表3.
Table 3. 2 Reference doses and carcinogenic factors of trace elements RfD and SF微量元素Microelement 途径Pathway Cr Cd Pb Cu Mn Zn RfD 饮水摄入途径 0.003 0.005 0.0014 0.04 0.046 0.3 皮肤接触途径 0.003 0.005 0.0014 0.012 0.0018 0.01 SF 饮水摄入途径 0.5 6.1 — — — — 皮肤接触途径 0.5 0.38 — — — — “—”表示无参照标准. “—” indicates no reference standard. | Show TableDownLoad:
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1.5 数据分析与处理
运用SPSS27对数据进行平均值、标准差、Pearson相关性分析和聚类分析，采用Origin2021进行图形绘制.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 微量元素浓度特征
由图2、表4可知，漂浮光伏沉陷塘中微量元素浓度从大到小排序为：Zn>Mn>Ni>Cu>Cr>Cd>Pb，其中Cd浓度为19.35 μg·L−1，是《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）Ⅲ类水环境质量标准1.97倍，其他微量元素浓度均小于Ⅲ类水环境质量标准，立柱光伏沉陷塘中微量元素浓度从大到小排序为：Zn>Mn>Ni>Cr>Cu> Cd>Pb，其中Cd浓度为13.94 μg·L−1，是Ⅲ类水环境质量标准2.36倍，其他微量元素浓度均小于Ⅲ类水环境质量标准，无光伏沉陷塘中微量元素浓度从大到小排序为：Mn>Zn>Ni>Cu>Cd>Cr>Pb，其中Cd浓度为6.42 μg·L−1，是Ⅲ类水环境质量标准1.95倍，其他微量元素浓度均小于Ⅲ类水环境质量标准，非沉陷塘中微量元素浓度从大到小排序为：Mn>Zn>Cu>Ni> Cd>Cr>Pb，其中Cd浓度为6.71 μg·L−1，是Ⅲ类水环境质量标准1.87倍，其他微量元素浓度均小于Ⅲ类水环境质量标准，淮南矿区沉陷塘Cd浓度是皖北某矿区沉陷水体的4.44—5.60倍. 整体上看，Cd富集程度从大到小排序为：立柱光伏沉陷塘>漂浮光伏沉陷塘>无光伏沉陷塘>非沉陷塘.
图 2 淮南矿区沉陷塘和中央公园非沉陷塘微量元素浓度占比Figure 2. Proportion of trace element concentration in submerged pond and non-submerged pond in Central Park in Huainan mining area与长江河源区作为未受人类活动影响的背景区水丰度[25]相比，淮南矿区沉陷塘和中央公园非沉陷塘微量元素Cd、Cu、Zn呈现富集现象，其中漂浮光伏沉陷塘、立柱光伏沉陷塘、无光伏沉陷塘和中央公园非沉陷塘Zn浓度分别为222.62 μg·L−1、116.87 μg·L−1、34.85 μg·L−1、45.23 μg·L−1，是长江河源区背景值的5—37倍，是皖北某矿区沉陷水体的0.69—4.40倍，Zn的浓度从大到小的排序为：漂浮光伏沉陷塘>立柱光伏沉陷塘>非沉陷塘>无光伏沉陷塘.
前人研究可知，Cu、Zn可能与地区地质条件、矿产资源开采等人为因素有关[26]，Cu、Zn浓度较高并不能说明微量元素Cu、Zn对水体造成了污染，因为Cu、Zn是正常生理代谢所必须的微量元素，只有当微量元素超过生物所必须的量时，才能对生物体产生毒性效应[27]，所以Cu、Zn浓度是否对生态环境造成损害，还需进一步分析. 此外，经实地调查发现，淮南矿区沉陷塘出现Cd富集现象是由于多年煤炭开采、煤矸石经雨水淋溶进入沉陷水体导致的.
表 4 淮南矿区沉陷塘和中央公园非沉陷塘微量元素浓度统计（μg·L−1）Table 4. Statistics of trace element concentrations in submerged ponds and non-submerged ponds in Central Park in Huainan mining areaCr Ni Cd Pb Cu Mn Zn 淮南漂浮光伏沉陷塘 19.35 22.35 9.83 0.24 20.63 25.42 222.62 淮南立柱光伏沉陷塘 13.94 17.10 11.78 0.28 13.75 17.93 116.87 淮南无光伏沉陷塘 6.42 32.68 9.73 0.33 14.82 66.65 34.85 淮南中央公园非沉陷塘 6.71 12.13 9.33 0.27 17.12 49.62 45.23 长江河源背景值 12.60 / 0.046 3.18 3.01 50.19 6.46 地表水环境质量标准GB3838-2002 ≤50.00 / ≤5.00 ≤10.00 ≤ 1000.00 ≤100.00 ≤ 1000.00 USEPA（2009）标准 — ≤70.00 — — — — — 皖北某矿沉陷区地表水[28] 72.80 60.80 2.10 / 8.60 / 50.60 蒙陕某矿沉陷区地表水[29] 1.11 7.40 / / / / / 山东某矿沉陷区地表水[30] 4.90 / / 129.00 190.00 / / Nowa Ruda沉陷区地表水[31] 15.00 56.00 / / / 87.00 / “—”表示未取参照标准；“/”表示无对应标准. “—”indicates that no reference standard has been taken; “/” indicates that there is no corresponding standard. | Show TableDownLoad:
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2.2 微量元素浓度分布特征
由图3可知，淮南矿区不同沉陷塘Cr、Ni、Mn、Zn等4种微量元素分布特征较明显，其中Cr、Zn的浓度分布特征表现为：漂浮光伏沉陷塘>立柱光伏沉陷塘>非沉陷塘、无光伏沉陷塘，Ni、Mn浓度分布存在差异，Ni表现为：无光伏沉陷塘>漂浮光伏沉陷塘、立柱光伏沉陷塘>非沉陷塘，Mn表现为：无光伏沉陷塘、非沉陷塘>漂浮沉陷塘沉陷塘>立柱光伏沉陷塘.
图 3 研究区不同水体微量元素浓度分布Figure 3. Box diagram of trace element concentration in different water bodies in the study area注：FPSP为漂浮光伏沉陷塘（（Floating photovoltaic subsidence pond），PPSP为立柱光伏沉陷塘（Pillaring photovoltaic subsidence pond），NSP为无光伏沉陷塘（Non-photovoltaic subsidence pond），NP为非沉陷塘（Non- subsidence pond）.整体上看，沉陷塘Ni浓度高于非沉陷塘，其他元素无明显差别；光伏沉陷塘Cr、Zn浓度高于无光伏沉陷塘，但Mn浓度却低于无光伏沉陷塘，其他元素无明显差别；漂浮型光伏沉陷塘Cr、Mn、Zn浓度明显高于立柱型光伏沉陷塘，但Cd浓度却低于立柱型光伏沉陷塘，其他元素无明显差别.
综上，有、无光伏面板覆盖水域的微量元素浓度没有明显差别，表明淮南矿区沉陷塘水体本身微量元素浓度很低，且没有受到光伏面板FPV材料的污染，这与宋鑫[9]等的研究结果一致，宋鑫等通过监测沉陷塘高光伏覆盖率、低光伏覆盖率和无光伏覆盖率的沉陷塘重金属浓度，没有发现高覆盖率的光伏板浸泡导致水域重金属浓度升高的迹象. 此外，不同类型光伏电站的建设可能会导致沉陷塘中微量元素Cr、Mn、Zn呈现明显浓度差异，其大小顺序为：漂浮型光伏电站>立柱型光伏电站设置立柱光伏电站的沉陷塘水深较浅，适合最高洪水位时应小于5 m的水域，漂浮型光伏电站适合最高洪水位大于5 m且最低枯水位大于1 m的水域，因此，立柱型光伏沉陷塘Cr、Mn、Zn浓度较低可能是由于立柱型光伏面板一般用于水深较浅的水体中，较浅水体悬浮物沉降速率较高，内源性污染较低[16].
2.3 微量元素污染评价
由图4可知，漂浮光伏沉陷塘微量元素单因子污染指数Pi在0.01—2.36之间，平均值约为0.48，立柱光伏沉陷塘微量元素Pi在0.01—3.08之间，平均值约为0.50，无光伏沉陷塘微量元素Pi在0.01—2.36之间，平均值约为0.47，非沉陷塘Pi在0.01—2.00之间，平均值约为0.43，根据单因子污染指数分类标准，沉陷塘与非沉陷塘的污染因子均为Cd，漂浮光伏沉陷塘和立柱光伏沉陷塘无明显差别，整体上看，光伏沉陷塘PCr、PZn>非光伏沉陷塘PCr、PZn，光伏沉陷塘PMn<非光伏沉陷塘PMn.
图 4 沉陷塘与非沉陷塘微量元素单因子污染指数（Pi）堆积图Figure 4. Accumulation of microelement single-factor pollution index in subsidence pond由表5可知，各微量元素内梅罗污染指数大小排序为Cd>Cr>Zn>Mn>Pb>Cu，根据内梅罗污染水平分类标准，立柱光伏沉陷塘的重金属Cd的污染水平处于中度污染，漂浮光伏沉陷塘、无光伏沉陷塘和非沉陷塘的Cd处于轻度污染水平，其他元素均处于清洁水平. 整体上看，光伏沉陷塘NCr、NZn>非光伏沉陷塘NCr、NZn，光伏沉陷塘NMn<非光伏沉陷塘NMn，与单因子污染指数发评价结果一致，从污染程度上看，本研究中的无光伏沉陷经过多年综合治理，污染程度与淮南中央公园非沉陷塘相差无几.
表 5 沉陷塘与非沉陷塘微量元素内梅罗指数（Ni）Table 5. Mero index of trace elements in subsidence pondsCr Cd Pb Cu Mn Zn 漂浮光伏 0.44 2.17 0.03 0.02 0.28 0.30 立柱光伏 0.32 2.74 0.05 0.02 0.22 0.14 无光伏 0.19 2.16 0.05 0.02 0.79 0.05 非沉陷塘 0.19 2.07 0.04 0.02 0.60 0.06 | Show TableDownLoad:
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综上，淮南矿区沉陷塘的污染因子为Cd，微量元素污染指数平均值从大到小的顺序为：立柱型光伏沉陷塘>无光伏沉陷塘>漂浮型光伏沉陷塘>非沉陷塘.
2.4 微量元素相关性分析和聚类分析
为分析淮南矿区沉陷塘和中央公园非沉陷塘中的7种微量元素的相关关系，计算了pearson相关系数，结果如表6所示，漂浮光伏沉陷塘和立柱光伏沉陷塘水体微量元素Cr-Pb呈显著正相关，相关系数分别为0.944、0.860，表明随着Cr和Pb的污染来源相同[32]. 无光伏沉陷塘中Mn-Cd显著负相关，相关系数为−0.829，Zn-Pb极显著正相关，相关系数为0.961. 淮南矿区沉陷塘微量元素之间存在显著或极显著的相关性，表明这些元素之间可能存在复合污染或者同源关系[33].
表 6 不同类型水体中微量元素的相关性分析Table 6. Correlation analysis of trace elements in different types of water区域 元素 Cr Ni Cd Pb Cu Mn Zn 漂浮光伏沉陷塘 Cr 1 Ni 0.019 1 Cd 0.599 0.255 1 Pb 0.944* −0.257 0.394 1 Cu −0.497 0.189 −0.102 −0.666 1 Mn 0.201 −0.366 0.311 0.568 −0.559 1 Zn −0.141 0.221 −0.123 −0.04 −0.037 0.511 1 立柱光伏沉陷塘 Cr 1 Ni −0.506 1 Cd 0.211 −0.498 1 Pb 0.860* −0.275 0.276 1 Cu 0.741 −0.692 −0.103 0.582 1 立柱光伏沉陷塘 Mn 0.032 −0.494 −0.397 −0.114 0.67 1 Zn 0.733 0.011 −0.09 0.713 0.422 −0.284 1 无光伏沉陷塘 Cr 1 Ni −0.174 1 Cd −0.1 0.363 1 Pb 0.302 0.185 0.68 1 Cu 0.634 −0.433 0.034 0.242 1 Mn 0.062 0.171 −0.829* −0.684 −0.338 1 Zn 0.306 0.196 0.512 0.961** 0.304 −0.554 1 非沉陷塘 Cr 1 Ni −0.174 1 Cd −0.06 −0.211 1 Pb −0.08 −0.266 0.11 1 Cu 0.359 −0.707 0.445 0.355 1 Mn −0.622 0.37 −0.201 0.032 −0.057 1 Zn 0.241 −0.314 0.664 0.336 0.183 −0.769 1 * 在 0.05 级别（双尾），相关性显著. ** 在 0.01 级别（双尾），相关性显著. | Show TableDownLoad:
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为进一步探求淮南矿区沉陷塘中Cr、Ni、Cd、Pb、Cu、Mn、Zn的来源，分别对每个沉陷塘的微量元素进行聚类分析. 由图5可以看出，可将漂浮光伏沉陷中的Cr、Ni、Cd、Pb、Cu、Mn、Zn归为3类，第一类元素为Cr、Cd、Pb，第二类元素为Mn、Zn，第三类元素为Ni、Cu，有研究表明，Pb、Cd可能来源于冶炼化工行业（如铅蓄电池）生产过程中产生废水和固体废物[34]，也可能是燃煤产生的，Cr主要源于冶炼化工、矿业开采等人为活动[35]，Cu、Zn来源于农药、有机肥、化肥、畜禽粪便，Ni、Cu、Zn可能来源于工业源和交通源[36]，Mn来源于道路降尘、采矿扬尘和建筑扬尘，此外，地表水中Mn不易被氧化，因此可能来源于内源性污染[37]，Zn来源于汽车排放，Pb也可能来自交通和工业垃圾堆肥等[38]，Cd可能来自燃煤、施肥过程. 综上，漂浮光伏沉陷塘的污染源为冶金化工、汽车排放.
图 5 淮南矿区沉陷塘和中央公园非沉陷塘微量元素聚类分析Figure 5. Cluster analysis of trace elements in submerged ponds and non-submerged ponds in Central Park in Huainan mining area立柱光伏沉陷塘中微量元素可分为4类，第一类元素是Cr、Pb、Zn，第二类元素是Cu、Mn，第三类元素是Cd，第四类元素是Ni，根据本研究相关性和聚类分析，可推测立柱光伏沉陷塘的污染源为矿业开采、道路交通、燃煤和农业肥料；无光伏沉陷塘中微量元素可分为3类，第一类元素是Cr、Cu，第二类元素是Ni、Cd、Pb、Zn，第三类元素是Mn，可推测无光伏沉陷塘的污染源为工业生产、交通运输和内源污染；非沉陷塘中的微量元素可归为3类，第一类元素为Cr、Cu，第二类元素为Cd、Pb、Zn，第三类元素为Ni、Mn，可推测非沉陷塘的污染源为工业生产、农业肥料和道路交通.
2.5 微量元素健康风险评价
由图6所示，淮南矿区沉陷塘非致癌物质Cr、Cd、Mn、Cu、Zn、Pb对成人和儿童的非致癌风险变化趋势一致，饮水摄入途径下为：Cr>Cd>Mn>Cu>Zn>Pb，对成人的平均风险值在1.42×10−3—8.21×10−2之间，对儿童的平均风险值在6.80×10−4—3.92×10−2之间；皮肤接触途径下，非致癌物质对成人和儿童的平均风险值变化趋势为Mn>Zn>Cr>Cd>Cu>Pb，对成人的风险值在4.30×10−6—1.03×10−3之间，对儿童的风险值在1.78×10−6—4.25×10−4之间. 由此，饮水摄入途径和皮肤接触途径下微量元素对成人和儿童的非致癌风险值均处于可接受水平，整体表现为成人>儿童，且饮水摄入途径>皮肤接触途径. 两种途径的非致癌总风险值如表7所示，漂浮光伏沉陷塘、立柱光伏沉陷塘、无光伏沉陷塘和非沉陷塘微量元素对成人和儿童的非致癌总风险HI小于1，均处于人体可接受水平. 整体上看，微量元素对成人和儿童的非致癌总风险值表现为：漂浮光伏沉陷塘>立柱光伏沉陷塘>无光伏沉陷塘>非沉陷塘.
图 6 微量元素经饮水摄入途径和皮肤接触途径对儿童和成人的非致癌风险Figure 6. Non-carcinogenic risk of trace elements to children and adults through drinking water intake and skin contact表 7 微量元素饮水摄入途径和皮肤接触途径非致癌总风险值Table 7. Total non-carcinogenic risk values of trace element drinking water intake route and skin contact routeHI 儿童 漂浮光伏沉陷塘 6.35×10−2 立柱光伏沉陷塘 4.91×10−2 无光伏沉陷塘 3.72×10−2 非沉陷塘 3.53×10−2 成人 漂浮光伏沉陷塘 1.33×10−1 立柱光伏沉陷塘 1.03×10−1 无光伏沉陷塘 7.80×10−2 非沉陷塘 7.40×10−2 | Show TableDownLoad:
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由图7可知，致癌物Cr、Cd的致癌风险值CR通过饮水摄入途径和皮肤接触途径暴露的健康风险变化规律与非致癌健康风险一致，整体表现为：成人>儿童，这与程晓静[15]、师环环[24]等的研究结果一致，说明虽然儿童对重金属的敏感性高于成人，但其饮水量、暴露时间和体重相对成人较少，因此非致癌风险值较低[22, 39]，此外，致癌风险值均表现为Cd>Cr. 根据USEPA公布的分类标准，淮南矿区沉陷塘和对照区非沉陷塘中致癌物质Cr、Cd对儿童和成人的致癌风险CR低于1×10−6，认为无致癌风险或致癌风险较低.
图 7 微量元素经饮水摄入途径和皮肤接触途径对儿童和成人的致癌风险Figure 7. Carcinogenic risk of trace elements to children and adults through drinking water intake and skin contact2.6 不确定性分析
完整的健康风险评估应包括饮水摄入、口鼻吸入和皮肤接触的途径吸入空气、土壤和水中的污染物造成的健康风险[40]. 本研究仅通过饮水摄入途径对研究区沉陷塘和非沉陷塘的Cr、Cd进行健康风险评价，暴露途径和暴露浓度可能因所处环境的改变随时间发生变化，且采样区域和统计模型本身具有局限性，健康风险模型的参数选择也存在不确定性，并不能准确反映研究区健康风险现状[41]. 此外，考虑到该矿区居民的流动性，暴露在沉陷塘中的人群在时间、生活方式、体重、体质等方面存在差异[13]，并且考虑到本研究采集的样品数较少，目前的评估结果应被视为初步评估.
3. 结论（Conclusion）
1）淮南矿区沉陷塘中Cd超出《中国地表水环境质量标准》（GB3838-2002）中Ⅲ类水环境质量标准，Cd、Cu、Zn明显大于长江河源区背景值，呈现一定富集现象，其中Zn富集程度最高.
2）浓度分布特征表明沉陷塘微量元素浓度较低，没有受到光伏面板材料的影响或光伏面板影响较小，且不同类型光伏电站的建设可能会导致沉陷塘中微量元素Cr、Mn、Zn呈现明显浓度差异，一般表现为：漂浮型光伏电站>立柱型光伏电站.
3）立柱光伏沉陷塘污染水平较高，污染因子为Cd，污染水平整体表现为：立柱光伏沉陷塘>漂浮光伏沉陷塘，光伏沉陷塘>无光伏沉陷塘，沉陷塘>非沉陷塘.
4）相关性和聚类分析显示，漂浮光伏沉陷塘的污染源为冶金化工、汽车排放，立柱光伏沉陷塘的污染源为矿业开采、道路交通、燃煤和农业肥料，无光伏沉陷塘的污染源为工业生产、交通运输和内源污染，非沉陷塘的污染源为工业生产、农业肥料和道路交通.
5）沉陷塘中非致癌物质通过饮水摄入途径和皮肤接触途径对成人和儿童造成的非致癌总风险HI小于1，处于人体可接受水平，致癌物质Cr、Cd对儿童和成人的致癌风险CR低于1×10−6，认为无致癌风险或致癌风险较低.
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图 1 盐酸水苏碱对照品、供试品、阴性对照HPLC-CAD色谱图 （A）盐酸水苏碱对照品 (B)供试品 （C）阴性对照
Figure 1. HPLC-CAD chromatogram of stachydrine hydrochloride reference, test and negative control (A) stachydrine hydrochloride control (B) test article (C) negative control
表 1 盐酸水苏碱回收率（n=2)
Table 1. Recovery rate of stachydrine hydrochloride(n=2)
序号 取样量/g 样品含有量/mg 加标量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/% 相对标准偏差/% 1 0.1042 3.4821 3.3420 6.7972 99.1953 97.37 1.14 2 0.1095 3.5389 3.3420 6.7904 97.2901 3 0.1079 3.6058 3.3420 6.8040 95.6998 4 0.1031 3.4454 3.3420 6.6717 96.5381 5 0.1096 3.6626 3.3420 6.9328 97.8527 6 0.1062 3.5489 3.3420 6.8387 98.4361 7 0.1040 3.4754 3.3420 6.7093 96.7638 8 0.1047 3.4988 3.3420 6.7481 97.2262
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