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在植物浮床处理污水过程中，植物根系起到至关重要的作用。植物根系具有释氧、释放根系分泌物、拦截、吸附和吸收污染物的能力[1-5]，并与微生物协同作用达到污染物去除的效果。挺水植物根系发达，茎秆粗壮、中空，有发达的通气组织，有利于氧在体内的传输并能传送到根区，形成氧化态的微环境促进根区的氧化还原反应和好氧微生物的活动。植物根系分泌物可以促进某些嗜磷、氮细菌的生长，从而间接提高净化率，有植物的湿地系统植物根部的细菌比介质处高1～2个数量级[6]。成水平等[7]研究发现香蒲和灯心草的存在有利于微生物在人工湿地纵深的扩展。植物浮床中挺水植物根系悬浮在水中，交织成良好的过滤网络，根须之间拦截颗粒物质，并且吸附和吸收溶解态污染物。
氮和磷作为植物营养元素，同时是污水处理中主要的污染物，植物根系类别的不同会影响植物强化脱氮除磷的效果。从植物营养学方面来说，植物的根系类型不同，它们吸收养分的效率就有一定差异。徐冰等[8]通过研究内蒙古锡林河流域草原植物发现双子叶植物根系中氮磷比例（0.379）显著高于单子叶植物（0.192）。WERAGODA et al[9]通过浮床实验认为根的粗细和密度影响植物根系参与污染物去除的作用。植物主要通过根系从介质中获得养分，因此介质和根系状况都影响养分的有效性。挺水植物大多为被子植物，被子植物分为单子叶和双子叶植物2类，他们不仅在子叶和叶脉上存在差异，根系结构也明显不同[10]。单子叶植物的主根不够发达，在与根连接的茎基和茎节等处长出许多不定根，并形成大量粗细差不多的各级侧根，是粗细比较均匀的须根系，根长与表面积也都比较大。双子叶植物的侧根和主根都可进行次生生长，形成粗细悬殊较大的不均匀的直根系结构。直根系在根长与总吸收表面积上都小于须根系。然而，以往的实验研究大多进行单个植物间脱氮除磷能力的比较[11-14]，很少涉及植物根系类别的分析。
本研究通过模拟污水和实际污水分别培养美人蕉和水芹，探究污水中污染物去除效果，考察植物脱氮除磷贡献率和直根系、须根系对污染物的去除能力差异，以期为人工湿地或生物浮床的植物选择上提供新的支撑。
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美人蕉和水芹都是多年生水生植物，在生态环境治理工程中常作为生物塘和表流湿地、人工浮床的配置植物应用。美人蕉株高1～2 m，叶片长披针形，蓝绿色，总状花序顶生，多花，花径约10 cm呈黄色、红色或粉红色；生长适宜温度15～28 ℃，低于10 ℃不利于生长，是单子叶草本植物。水芹茎秆直立有棱，叶片为羽状复叶，互生，叶缘具齿；复伞形花序，顶生，花白色；性喜温凉环境，不耐高温和干旱，每年有2个生长高峰季节，分别为12月~次年4月和9～11月，生长对养分需求量较大，是双子叶草本植物。
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实验用水箱为PP材质，长×宽×高=75 cm×25 cm×50 cm，下部一侧开孔装有阀门便于放水，水箱共12组，每组设置3个平行实验，配置厚5 cm泡沫板，放置于采光通风良好的玻璃房内。选择美人蕉和水芹2种，分别种植在污水和模拟污水中，同时设置不种植植物的污水空白组。根据实际污水特点，模拟污水中COD选用乙酸钠配制，采用尿素和氯化铵配制TN及NH4+-N，磷酸二氢钾配制TP和PO43−-P。模拟污水和实际污水中污染物初始浓度范围为COD（37～43 mg/L），TN（11.7～13.6 mg/L），NH4+-N（7.87～11.80 mg/L），TP（0.99～1.39 mg/L），PO43−-P（0.82～1.36 mg/L），pH 6.5～7.5。
将植株幼苗清洗干净，在自来水中培养1周后量取植株鲜重、茎长、根长、根数和根宽，选择2种植株各3棵进行植株干重及氮磷含量测定。每个植物处理组种植3棵相同植物植株，测量鲜重、根茎长度和根数。水箱用黑色塑料膜覆盖包裹四周，减少水中因光合作用生长的藻类对实验的影响。采水样2次/周，每次采集250 mL，采植物样1次/周，根据实验数据补充污水及模拟污水体积，持续进行5周。实验结束后选择每组生长良好的植株各3棵测量干重及氮磷含量。
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污染物去除率计算，见式（1）：
式中：C0为污染物如TN、NH4+-N、TP和PO43--P的初始浓度值，mg/L；Ce为实验结束时污染物的最终浓度值，mg/L；V1和V2为水箱中水的初始和最终体积，L。分子表示水中污染物总去除量，mg。
植物累积氮或磷总量（mg）计算，见式（2）：
式中：m1为初始植物干重，g；m2为最终植物干重，g；ρ1、ρ2为初始和最终氮或磷含量，mg/kg（干重）。
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经测定，实验中pH在6.5～8之间，适合挺水植物生长。实验前后植物生长平均值汇总，见表1。
表1可知，实验结束时2种植物均有所生长，且茎基处分蘖出新枝和新根。水芹的生物量各项指标增加均比美人蕉增加较少，根数始终比美人蕉多但多为细小短须根。从植物根系角度分析，水芹是双子叶植物，根属于直根系，主要的主干根系都可以进行次生生长，粗细悬殊较大不均匀，根长和表面积都比较小；美人蕉是单子叶植物属须根系，主根不发达，有大量粗细差不多的各级侧根，根长和表面积都较大[15]。
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TN的去除效果随时间变化情况，见图1。
除空白对照组以外，TN浓度均有所减少，美人蕉组TN浓度降至最低。经过美人蕉处理后模拟污水TN浓度为1.14 mg/L，实际污水TN浓度为1.62 mg/L，水芹处理后模拟污水和实际污水TN浓度分别为5.85 和5.00 mg/L。从3方面分析原因：首先，种植植物后TN浓度较空白组明显下降，主要是挺水植物对氮的吸收增强了TN的去除效果，同时植物根系周围为微生物生存提供了好氧和缺氧环境，加强了硝化反硝化脱氮[16]。其次，实验中美人蕉较水芹TN去除量多，这与植物生长状况相对应，实验中美人蕉生长较水芹显著占优势，茎干挺拔，根系发达，而水芹生长缓慢。最后，同一植物处理组中模拟水和污水TN浓度相差较小，说明实验中植物吸收去除TN发挥主要作用，而不是污水中微生物反硝化脱氮。这可能是实验初始COD含量和植物根系分泌物较少[17]，不能提供足够的碳源供反硝化细菌正常生长，导致实验中微生物反硝化脱氮效果微弱。
NH4+-N的去除效果，见图2。
模拟污水中NH4+-N在第1周浓度平均升高了约1.78 mg/L；2种污水中第2周NH4+-N浓度缓慢下降；第3周和4周植物组浓度下降迅速，空白组也呈下降趋势；第5周植物组浓度降至最低，空白组继续缓慢减少。最终，经过水芹和美人蕉处理后模拟污水NH4+-N浓度分别为0.09和0.07 mg/L，实际污水NH4+-N浓度分别为0.09和0.12 mg/L，空白组NH4+-N浓度分别为5.63和9.36 mg/L。对比可见，种植挺水植物有助于加快水中NH4+-N的去除。实验中NH4+-N浓度变化的几个原因如下：（1）污水中氮的形态主要是有机氮和NH4+-N，前期水中部分有机氮的氨化作用转化为NH4+-N使得浓度有所升高；（2）在植物处理组，植物根系吸收NH4+-N作为氮营养元素为生长养分，根据动力学原理[18]可知反应速率与底物浓度呈正相关，前期水中NH4+-N浓度迅速下降，后期由于水中NH4+-N浓度太低植物根系的吸收也相应减弱，浓度变化变缓；（3）污水中微生物同样参与了NH4+-N的转化去除，植物根系将光合作用产生的氧气传递到根际周围，为微生物创造有氧环境将NH4+-N硝化氧化为NO3−-N，而且由于植物根系的存在充当微生物附着载体，植物组微生物较空白组多，所以植物组NH4+-N去除效果较好。2种植物对NH4+-N去除效果无明显差异，进一步证实本实验中NH4+-N浓度对于美人蕉和水芹生长所需太低，达不到奢侈吸收的程度[19-20]，最终植物生物量增长不明显。
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不同处理组中TP的去除效果，见图3。
TP浓度在不同处理组出现不同变化形式：种植美人蕉和水芹的实验中TP浓度下降明显，且美人蕉较水芹去除更多，空白对照中TP浓度几乎不变。TP初始浓度在1.02～1.39 mg/L范围内，最终美人蕉处理模拟污水和实际污水中浓度分别为0.07和0.08 mg/L。由此可见，种植水生植物对TP的去除有较大影响。
PO43--P浓度随时间变化的情况，见图4。
图4 中PO43--P与图3中TP相似的浓度变化曲线，说明TP以水溶态磷酸根形式存在并被去除，植物根系吸收PO43--P并通过导管运往地上部，参与体内代谢活动。另外，可能也存在PO43--P沉淀于水底而从水中去除的效果，与模拟污水相比，在污水空白组浓度也有所减少，减少了0.25 mg/L。实际污水取自污水处理厂过格栅进入沉砂池的污水，含有部分颗粒物质，在颗粒物下沉过程中会吸附、络合磷酸根，另外，污水中携带的铁和铝等金属离子会与水溶态磷酸根结合形成难溶磷酸盐化合物同颗粒物质一起下沉而去除部分PO43--P[21]。总的来说，TP的去除主要是通过植物吸收和沉淀作用，这与葛铜岗等[22]的串联式菖蒲浮床实验研究结果相似，该研究认为植物吸收对水体氮磷去除的贡献度在串联浮床系统中呈空间分布规律。
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植物处理后TN、TP的去除率和植物氮磷去除贡献率，见表2。
模拟污水空白中TN、TP减少率分别为20.06%和19.52%，实际污水空白组分别为14.73%和38.68%，证明美人蕉和水芹的种植都明显提高了污水中TN、TP的去除，并且不论是去除率还是植物贡献率的数值都表明美人蕉显然比水芹更适合浮床种植，TN去除率分别增加了31.99%和22.56%，TP去处理分别增加了12.43%和3.42%。同时，表2中显示水芹的TN去除贡献率显著低于美人蕉，仅26.60%～29.17%，可能是实验中反硝化脱氮效率低，水芹本身吸收积累的氮量少而导致TN去除率低。结合表1中植物生物量变化，植物生物量越大吸收的氮磷越多，植物脱氮除磷贡献率相应提高。如，实际污水种植的美人蕉生物量增长最大，其植物贡献率均超过90%，为所有实验中最大值。
美人蕉吸收贡献率占氮磷去除率均超过75%，是浮床实验的脱氮除磷主要途径；水芹吸收是磷去除的主要途径，氮去除率较低，对磷的贡献率分别为66.52%和76.82%，氮的贡献率分别为29.17%和26.60%。总的来说，实验中种植的美人蕉和水芹的氮磷去除效果，除了水芹对氮的处理，植物吸收均占主要作用，反硝化脱氮和微生物吸磷作用效果较差，而且须根系的美人蕉吸收作用更加明显。
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根据叶创兴等[23]的《植物学》可知，水生植物的根系一般由主根、侧根和不定根等组成。主根是在种子萌发后首先生长出的向下垂直的根，随着主根长到一定长度后会在主根上产生分枝状的侧根，而不定根则是在茎的基部发出的根。单子叶植物对应的须根系植株，主根在植株幼苗期吸收水分并起支撑作用，但在不定根形成后就停止生长，进而形成以主根为端点、周围辐射以须状侧根和不定根的庞大类似球状的根系结构。须根系不定根的数量巨大，如，一株成熟的黑麦草的根有1 500万条，总长度能达到640 km，表面积相当于一个排球场面积，具有强大的吸附能力。双子叶植物的根是直根系，也称主根系，主根和侧根在粗度和长度方面差异很大。直根系主次分明，表现出发达的主根，在主根周围分布着匍匐状的侧根和不定根，表面积较须根系小。从根系特征分析，美人蕉属于须根系，水芹属于直根系。
从植物营养来看，氮是植物生长必需的常量营养元素，在植物细胞结构、新陈代谢和光合作用等生理活动中发挥重要作用，通过植物根系从周围介质中摄取而来[24]。然而，植物根系只能吸收铵根、硝酸根等无机态氮和部分小分子氨基酸，其他有机氮必须经过分解降解才能被植物吸收。根系不断从水中吸收氮素，植物生物量不断增加，水中TN浓度则逐渐较少。美人蕉的须根系根须在水中分布体积更大，表面形成的生物膜相互之间影响较小，能够更加有效地降解污染物；相对来说，水芹的根是直根系，根与根之间孔隙较小，容易形成厌氧空间，污染物降解可能受到影响。和氮素一样，磷素也是植物的必需常量元素，在植物生长发育、新陈代谢等生理活动中发挥着不可替代的重要作用，同时还参与植物细胞和组织、器官结构中的组成。植物根系对磷的吸收是主动吸收，可逆浓度吸收，需要消耗能量，其吸收速率受磷在介质中浓度高低影响，浓度越低吸收速率越低[25]。另外，须根系的美人蕉根系宽幅较直根系的水芹的根系宽幅大，细而长的根毛比表面积大能够吸收更大范围营养物，生长速率更快，生物量大，因此TP去除效果更加明显。
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根系类型分别为须根系和直根系的美人蕉和水芹在污水中均能正常生长，在复合生态处理中具有强化脱氮除磷的能力，且美人蕉优于水芹。单子叶植物由于其须根系根部结构，根系表面积大于双子叶植物的直根系，且单子叶植物根系细且长，形成错综复杂的根系网络，能够吸收拦截较多营养元素，同时为微生物创造更大的栖息场所，较双子叶植物更有利于污染物的去除。所以，在污水复合生态治理工程中可以优先考虑单子叶植物种植。由于条件受限，本研究仅从水中污染物去除量方面分析认为单子叶植物的须根系较双子叶植物的直根系更适合污水复合生态治理，对植物根系结构和微生物生长状态如生物量和生物种类等缺少微观分析，后续将进一步从微观角度论证这一观点，为生态修复提供充分的理论支撑。
2种不同根系类型植物脱氮除磷对比研究
Research on nitrogen and phosphorus removal by two plants with different root systems
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摘要: 选取美人蕉和水芹2种根系类型不同的挺水植物为研究对象，对其生长情况、脱氮除磷效果和植物贡献率进行研究。结果表明，在实际污水中2种植物增长较模拟污水多，美人蕉生物量较水芹增长多。2种污水中TN、NH4+-N、TP和PO43--P的去除效果相当，种植植物能明显强化脱氮除磷效果，且美人蕉脱氮除磷能力强于水芹。实际污水经美人蕉处理后TN和TP最终浓度分别为1.62和0.08 mg/L，去除率为88.14%和92.59%，相应植物贡献率为94.34%和97.34%；经水芹处理后分别为5.00和0.13 mg/L，去除率为65.18%和89.17%，植物贡献率为26.60%和76.82%。须根系的美人蕉吸收氮磷贡献率较直根系的水芹高，在污水处理中应用更具优势。Abstract: Two emergent plants with different root types, Canna and Cress were selected as the research objects, and their growth, nitrogen and phosphorus removal effects and plant contribution rate were studied. Research showed that the growth of two plants in actual sewage was greater than that of simulated sewage, and the biomass of Canna was more than that of Cress. The removal effects of TN, NH4+-N, TP and PO43--P in the two kinds of sewage were equivalent. Plants could enhance the effect of nitrogen and phosphorus removal, and the ability of Canna to remove nitrogen and phosphorus was stronger than that of Cress. The final concentrations of TN and TP in the actual wastewater after Canna treatment were 1.62 mg/L and 0.08 mg/L, respectively, the removal rates were 88.14% and 92.59%, and the plant contribution rates were 94.34% and 97.34%. After the Cress treatment, they were 5.00 mg/L and 0.13 mg/L, 65.18% and 89.17%, 26.60% and 76.82%. Canna with fibrous root system had a higher nitrogen and phosphorus contribution rate than Cress with straight root system. More advantages in sewage treatment and could be used first.
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20世纪50年代美国食品与药物管理局首次批准抗生素用作饲料添加剂，世界各国相继将抗生素应用于畜牧生产，提高了畜牧业的经济效益. 但是，抗生素在养殖业和畜牧业中的广泛使用对环境和人体健康造成了很大危害[1]. 抗生素会加剧细菌的变异，使细菌产生耐药性，甚至可能产生超级细菌[2]. 抗生素还可能使人体发生“二重感染”，对人体的多个器官均有损害，导致过敏反应和药物性耳聋发生[3].
有研究显示，奶牛在饲养过程中用到的抗生素类药物，主要用于预防乳头发炎和细菌感染，并防止奶制品的细菌污染[4]. 奶牛体内无法被吸收的抗生素会有部分随着乳汁排出体外，并制成液态奶和奶粉等乳制品[5]. 这些奶粉中的抗生素可能会对于易感人群产生一定的危害. 其中婴幼儿因为对奶粉的需求量大、自身免疫力较弱、身体器官尚未发育成熟等原因，可能受到的影响较大. 因此，对于婴幼儿奶粉中抗生素残留的检测值得特别关注.
目前关于液态奶中抗生素残留的研究较多[6-8]. Zhang等[9]检测了中国市场上的巴氏奶和高温灭菌奶中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物的含量，Wang等[10]检测了牛奶中20种大环内酯、磺胺类和喹诺酮类抗生素残留量，均表明牛奶中含有一定的抗生素残留（μg·L−1）. 另一方面，由于奶粉中抗生素残留低，并且含有大量蛋白质和脂肪，基体复杂，可能会干扰抗生素的检测[11]，因此关于奶粉尤其是婴幼儿奶粉中的污染特征的研究较少. 张律[12]采用高效液相色谱-串联质谱法进行环丙沙星、氧氟沙星等11种喹诺酮类抗生素的检测，结果在深圳市110份奶粉样品中均未检出. Tian等[13]采用超高效液相色谱-串联质谱法应用于50个市售牛奶和奶粉样品中抗生素的检测，并在部分品牌样品中检出头孢噻呋和环丙沙星残留（μg·kg−1）. 陆峥[14]和周显凤等[15]分别采用纸片扩散法对分离自婴幼儿配方奶粉的阪崎肠杆菌进行药敏实验，结果显示该细菌对头孢噻吩100％耐药，对环丙沙星等抗生素高度敏感[14-15]，表明婴幼儿配方奶粉中存在抗生素污染. 因此，对常见市售奶粉中抗生素的含量进行检测，并根据检测结果主要对婴幼儿的暴露情况进行研究，这对于保障婴幼儿的健康具有很强的现实意义.
本研究建立了同时检测22种喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类抗生素的分析方法，并用该方法对市面上常见的婴幼儿奶粉进行检测，根据其检测结果分析婴幼儿奶粉中抗生素的污染水平和分布规律. 通过计算抗生素对婴幼儿的暴露水平，评估奶粉中抗生素的含量对婴幼儿的生长发育的风险.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 试剂
大环内酯类（macrolides，MCs）：红霉素（ERY，99.1%）、罗红霉素（ROX，90%）、交沙霉素（JOS，98%）、泰乐菌素（TYL，82.4%）、螺旋霉素（SPI，88.9%）（美国Sigma-Aldrich公司）.
磺胺类（sulfonamides，SAs）：磺胺噻唑（ST，98%）、磺胺吡啶（SPD，98%）、磺胺甲基异恶唑（SMX，98%）（日本东京化成工业株式会社）；磺胺二甲基嘧啶（SMX，99%）（美国Acros Organics公司）；磺胺嘧啶（SD，99.7%）、磺胺甲基嘧啶（SMR，99.9%）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM，99.4%）、磺胺二甲基异恶唑（SIA，99.0%）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM，98%）（美国Sigma-Aldrich公司）.
喹诺酮类（quinolones，QNs）：诺氟沙星（NOR，99.9%）、恩诺沙星（ENR，99.9%）、环丙沙星（CIP，99.9%）、氧氟沙星（OFL，99.9%）、沙拉沙星（SAR，95.0%）、氟罗沙星（FLE，99.5%）、洛美沙星（LOM，98%）、双氟沙星（DIF，98.0%）（美国Sigma-Aldrich公司）.
替代物标准品：磺胺甲基异恶唑-d4（SMX-d4，99.0%）、磺胺二甲基嘧啶-d4（SMX-d4，99.0%），红霉素-13C, d3（ERY-13C, d3，98.0 %）和螺旋霉素I-d3（SPI I-d3，98.0 %）（购于加拿大Toronto Research Chemicals公司）；氧氟沙星-d3（OFL-d3，99.5 %）、诺氟沙星-d5（NOR-d5，99%）、沙拉沙星-d8（SAR-d8，99.5 %）（美国Sigma-Aldrich公司）；
色谱纯甲醇和乙腈（美国Fisher公司），氨水（50%，V/V）和甲酸铵（99%，美国Alfa Aesar公司），甲酸（98%，美国Fluka公司），乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）.
1.2 仪器
质谱：API3200三重四极杆串联质谱检测系统（美国AB公司），配有电喷雾离子源（ESI）和Analyst 1.4.1工作软件.
色谱：UltiMate3000液相色谱仪（美国Dionex公司）； XTerra MS C18型色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，美国Waters公司）.
其他：AutoTrace 280全自动固相萃取仪（美国Dionex公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）；Oasis HLB（6 mL，200 mg）（美国Waters公司）；3-15高速离心机（北京松源华兴科技发展有限公司）.
1.3 样品采集
采集23个常见品牌的市售婴幼儿奶粉共41份样品（表1）. 样品采集后在4 ℃ 冰箱中冷藏，为了防止其中抗生素的分解造成的损失，在1周内进行处理分析.
表 1 奶粉样品相关信息Table 1. Information about infant milk powder samples序号No. 奶粉品牌Brand 是否进口Import/Local 阶段Stage 序号No. 奶粉品牌Brand 是否进口Import/Local 阶段Stage 1 A1 是 1段 22 J1 否 2段 2 A2 是 2段 23 K 否 1段 3 B1 否 1段 24 L 是 3段 4 C1 是 1段 25 M1 是 2段 5 C2 否 3段 26 M2 是 2段 6 C3 是 3段 27 M3 是 2段 7 C4 是 3段 28 M4 是 1段 8 C5 是 3段 29 N1 是 1段 9 C6 是 2段 30 O1 是 2段 10 D1 是 2段 31 O3 是 3段 11 E1 否 1段 32 P1 否 2段 12 E2 否 3段 33 Q1 否 2段 13 E3 否 1段 34 Q2 否 3段 14 E4 否 3段 35 R1 是 1段 15 F1 是 1段 36 S1 是 1段 16 F2 是 3段 37 T1 是 3段 17 F3 是 1段 38 T2 是 3段 18 G1 是 2段 39 X1 否 2段 19 H1 是 3段 40 X1 否 1段 20 I1 否 1段 41 Y1 是 3段 21 A1 是 2段 | Show Table
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1.4 样品前处理
优化后抗生素前处理方法如下：称取1.0 g奶粉样品于聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL甲醇/乙腈（V/V=8:2）的萃取液，以及20 ng替代物内标（NOR-d5、OFL-d3、SAR-d8、SMX-d4、SMX-d4、ERY-13C, d3 和SPI I-d3）和1.0 g氯化钠，涡旋振荡2 min，于摇床中振荡12 h（转速:350 r·min−1、温度:35 ℃）. 之后在5000 r·min−1的条件下离心10 min，取上清液，用5 mL甲醇-乙腈（V/V=8:2）混合溶液清洗，合并上清液. 重复上述步骤2次.
在35 ℃的条件下氮吹至溶液体积约5 mL，加入3 mL正己烷，涡旋振荡1 min，5000 r·min−1的条件下离心10 min，取上清液继续氮吹至2—3 mL. 转移溶液至100 mL PET小瓶中并加入超纯水稀释溶液至100 mL，使用自动固相萃取技术进行富集净化（5 mL甲醇、5 mL超纯水活化，6 mL氨水-甲醇（V/V=5:95）溶液洗脱）. 洗脱液在35 ℃的条件下再次进行氮吹，至小于0.5 mL，定容至1 mL. 转移到1 mL离心管中，冷冻12 h，之后在漩涡振荡后以14500 r·min−1离心5 min，取上层清液经过0.22 μm尼龙滤膜转移到棕色色谱瓶中以备仪器分析.
1.5 仪器分析
采用电喷雾离子源（ESI），分析物在正离子扫描下以多反应监测（MRM）模式，分别进行母离子Q1和子离子Q3扫描，选择丰度最强的2个子离子与分子离子组成离子对作为目标物的监测离子. 信号最强的离子对可以为定量提供高灵敏度，另一个离子对则可提供辅助定性信息. 之后优化质谱参数和色谱条件，使仪器信号稳定且灵敏度最高. 优化的质谱分析条件：气帘气压力0.14 MPa，碰撞气压力0.02 MPa，电喷雾电压5000 V，雾化气温度600 ℃，雾化气：0.38 MPa，加热气及辅助雾化气: 0.45 MPa. 优化的色谱条件：流动相A：0.3%甲酸水溶液（含0.1%（体积分数）甲酸铵，pH=2.9），流动相B：甲醇-乙腈（V/V=1:1）；流速：0.2 mL·min−1；进样量：15 μL；梯度洗脱条件：0—2 min，10%B；2—12 min，10%—70% B；12—16 min，70%—100% B，保持3 min；19—19.1 min，100%—10% B；19.1—33 min，10% B.
1.6 质量控制与保证
在选定的最佳质谱和色谱条件下，进样15 μL，对一系列浓度的混合标准样品（20 ng NOR-d5、OFL-d3、SAR-d8、SMX-d4、SMZ-d4、 ERY-13C, d3和SPI I-d3内标）进行分析，以各分析物和内标离子对的峰面积之比进行定量. 每批样品都要做一个程序空白样品，以保证检测结果的可靠性. 实验中设置方法空白、空白加标、基质加标对数据进行质量控制. 22种抗生素的加标回收率为72.8%—123%，相对标准偏差（RSD）为1.6%—11.2%. 结果表明，22种化合物均在较宽的范围内具有良好的线性，方法检出限（LODs）为0.01—0.10 μg·kg−1 （见表2）.
表 2 22种抗生素的回收率、线性范围和检出限（S/N=3）Table 2. Recoveries （%）,linear range, and limits of detection （LODs，S/N=3） of 22 antibiotics抗生素Antibiotics 替代物Surrogate 相关系数r Correlation 线性范围/（μg·kg−1）Linear range 回收率/%（加标10 μg·kg−1）Recovery LODs/ （μg·kg−1） NOR NOR-d5 0.9974 0.1—500 87.5±7.4 0.09 CIP NOR-d5 0.9987 0.05—500 82.7±11.4 0.08 DIF OFL-d3 0.9985 0.05—500 74.3±10.3 0.08 ENR OFL-d3 0.9990 0.05—500 97.4±8..9 0.08 FLE OFL-d3 0.9984 0.1—500 97.6±6.8 0.04 OFL OFL-d3 0.9988 0.1—500 104.0±8.5 0.06 LOM OFL-d3 0.9967 0.05—500 72.4±3.3 0.05 SAR SAR-d8 0.9992 0.05—200 95.9±4.6 0.09 STZ SMX-d4 0.9974 0.01—500 84.2±5.9 0.04 SMX SMX-d4 0.9991 0.1—500 101.0±4.3 0.06 SIA SMX-d4 0.9987 0.02—500 88.3±2.7 0.06 SPD SMZ-d4 0.9985 0.02—500 98.0±5.3 0.04 SDM SMZ-d4 0.9996 0.01—500 121.0±5.6 0.04 SMZ SMZ-d4 0.9993 0.01—500 102.0±3.7 0.04 SDZ SMZ-d4 0.9986 0.05—500 101.0±3.5 0.04 SMR SMZ-d4 0.9977 0.02—500 107.0±7.1 0.04 SMM SMZ-d4 0.9985 0.02—500 112.0±7.3 0.01 SPI SPI I-d3 0.9980 0.1—500 104.0±5.2 0.08 JOS SPI I-d3 0.9934 0.05—200 84.4±5.6 0.04 TYL SPI I-d3 0.9934 0.05—200 90.0±7.1 0.10 ROX SPI I-d3 0.9905 0.05—500 101.0±6.1 0.04 ERY ERY-13C,d3 0.9992 0.1—500 109.0±5.3 0.04 | Show TableDownLoad:
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1.7 健康风险评价
根据婴幼儿奶粉建议用量计算婴幼儿每天奶粉的实际摄入量，再根据奶粉中抗生素的检测结果，换算出婴幼儿经口对奶粉中抗生素的日平均暴露剂量（Average daily dose, ADD），公式（EPA，2011）[16]如下:
ADD=C×IR×EF×EDAT×BW (1) 其中，ADD：抗生素的日平均暴露量，μg （kg d）−1; C：奶粉中抗生素的浓度，μg·kg−1；IR：饮食摄入量，kg d−1；EF：暴露频率，d a−1；ED：暴露持续时间，a；BW：体重，kg；AT：平均暴露时间，d.
1.8 数据分析
本研究中∑QNs、∑SAs和∑MCs分别代表9种喹诺酮、8种磺胺和5种大环内酯抗生素的浓度之和. 所有数据均使用IBM PASW Statistics 20软件进行分析. 如奶粉样品中抗生素浓度低于分析方法检出限，则该检测数据赋予0值参加平均值统计计算. Kolmogorov–Smirnov检验用来验证数据是否呈正态分布，Kruskal–Wallis非参数检验用来比较抗生素的浓度差异. 一般认为当P< 0.05时该检验具有显著性差异.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 奶粉中抗生素的污染水平
婴幼儿配方奶粉中抗生素浓度见表3. 样品共检出19种抗生素，包括8种喹诺酮（NOR、CIP、DIF、ENR、FLE、OFL、LOM和SAR），6种磺胺（SMX、SPD、SMZ、SDZ、SIA和SDM）和3大环内酯（TYL、ROX和ERY）. 其他1种磺胺（SPD）和2种大环内酯（SPI和JOS）在所有样品中浓度均低于检测限，可能是这3种抗生素主要应用于人体感染性疾病的治疗，在动物的生长过程中很少使用[1].
表 3 婴幼儿配方奶粉中抗生素的浓度（n=41, μg·kg−1）Table 3. Concentrations of antibiotics in infant milk power抗生素Antibiotics 最小值Minimum 中位数Median 最大值Maximum 平均值Mean 检出率/%Detection rate NOR <LOD 0.44 5.78 0.68 90.2 CIP 0.15 0.47 9.95 0.87 100 DIF <LOD <LOD 0.54 0.04 12.2 ENR <LOD 0.16 3.76 0.48 90.2 FLE <LOD <LOD 0.68 0.06 26.8 OFL <LOD 0.08 1.55 0.16 58.5 LOM <LOD <LOD 0.84 0.07 39.0 SAR <LOD <LOD 0.92 0.08 36.6 STZ <LOD <LOD 0.30 0.02 17.1 SMX <LOD <LOD 0.50 0.05 39.0 SIA <LOD 0.06 0.77 0.07 51.2 SPD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD SDM <LOD <LOD 0.54 0.03 7.32 SMZ <LOD 0.04 0.43 0.07 58.5 SDZ <LOD <LOD 0.24 0.01 7.32 SMR <LOD 0.04 0.30 0.05 58.5 SMM <LOD <LOD 0.53 0.05 41.5 SPI <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD JOS <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD TYL <LOD <LOD 0.24 0.01 7.32 ROX <LOD <LOD 1.08 0.06 17.1 ERY <LOD 0.04 0.51 0.08 53.7 ∑QNs 0.49 1.96 20.1 2.92 100 ∑SAs 0.03 0.27 2.93 0.39 100 ∑MCs <LOD 0.05 1.14 0.16 83.0 Total 0.71 2.39 23.1 3.46 100 | Show TableDownLoad:
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三类抗生素中，喹诺酮类抗生素浓度最高，平均浓度可达2.92 μg·kg−1（0.49—20.1 μg·kg−1），比磺胺（平均浓度0.39 μg·kg−1，0.03—2.93 μg·kg−1）和大环内酯类（平均浓度0.16 μg·kg−1，＜LOD—1.14 μg·kg−1）抗生素浓度高1个数量级. 这是因为奶牛在生长过程中喹诺酮类抗生素的使用量远大于磺胺和大环内酯的使用量（见表4），并且喹诺酮类抗生素具有更高的稳定性和生物富集能力[17-19]. 在所有抗生素中，CIP、NOR和ENR的检出率较高（90.2%—100%），浓度分别为0.87、0.68、0.48 μg·kg−1，而其他抗生素检出率（<60%）和浓度均较低（<0.2 μg·kg−1）. 有研究报道[1]，CIP、NOR和ENR均可作为兽用抗生素使用，并在养殖业中大量使用（表4），因此可在奶粉样品中较多检出.
大类Group 抗生素Antibiotics 简写Abbreviation 主要用途Application 使用量/tUsage amount 人Human 猪Pig 鸡Chicken 其他Other 汇总Summary QNs 诺氟沙星 NOR 医用,兽用 1013 2820 961 644 5440 环丙沙星 CIP 医用,兽用 455 3110 1060 712 5340 双氟沙星 DIF 兽用 0 378 172 117 667 恩诺沙星 ENR 兽用 0 3090 1150 940 5180 氟罗沙星 FLE 医用,兽用 119 60.6 21.6 15.1 216 氧氟沙星 OFL 医用,兽用 1286 2440 832 557 5110 洛美沙星 LOM 医用,兽用 228 650 222 149 1250 沙拉沙星 SAR n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Total 3101 12549 4419 3134 23203 SAs 磺胺噻唑 STZ 兽用 0.66 40.2 13.7 9.18 63.7 磺胺甲基异恶唑 SMX 医用,兽用 2.0 198 67.6 45.3 313 磺胺二甲基异恶唑 SIA 医用 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 磺胺吡啶 SPD n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 磺胺间二甲氧嘧啶 SDM 兽用 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 磺胺二甲基嘧啶 SMZ 医用,兽用 68.4 388 132 88.7 677 磺胺嘧啶 SDZ 医用,兽用 238 648 221 148 1260 磺胺甲基嘧啶 SMR 医用 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 磺胺间甲氧嘧啶 SMM 兽用 9.93 1400 477 320 2210 Total 319 2674 911 611 4524 MCs 螺旋霉素 SPI 医用 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 交沙霉素 JOS n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 泰乐菌素 TYL 兽用 0 3090 1050 706 4850 红霉素 ERY 医用,兽用 1244 1580 565 377 3770 罗红霉素 ROX 医用,兽用 184 112 67.3 22.5 386 Total 1428 4782 1682 1106 9006 n.a.: 没有数据来源；其他：包括除猪和鸡之外的牛、羊等其他家畜. | Show TableDownLoad:
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2.2 奶粉中抗生素的分布特征
不同阶段婴幼儿配方奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的浓度如图1（a）所示. 单因素方差（见表5）结果表明，这三类抗生素浓度在不同阶段的奶粉中无显著差异（P>0.05）. 2段奶粉中抗生素残留水平的总体平均值为4.48 μg·kg−1（浓度范围1.18—17.4 μg·kg−1），略高于1段（平均3.77 μg·kg−1，0.89—23.1 μg·kg−1）和3段（平均2.36 μg·kg−1，0.71—6.98 μg·kg−1）奶粉中抗生素的残留水平.
图 1 婴幼儿配方奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的浓度Figure 1. Concentrations of ∑QNs、∑SAs and ∑MCs in milk power（a:不同阶段；b：不同奶源）（a: different stages; b: different sources）表 5 不同阶段奶粉∑QNs、∑SAS和∑MCs浓度的单因素方差分析Table 5. One-way ANOVA of ∑QNs, ∑SAS and ∑MCs of milk powder at different stagesP 1段 vs 2段 1段 vs 3段 2段 vs 3段 ∑QNs 0.648 0.380 0.195 ∑SAs 0.611 0.309 0.642 ∑MCs 0.263 0.483 0.638 Total 0.678 0.381 0.210 | Show TableDownLoad:
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国内外不同奶源奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的污染水平如图1（b）所示. 通过对比发现，国内奶源的奶粉的污染水平（平均值3.88 μg·kg−1，1.36—23.1 μg·kg−1）略高于进口奶源（平均值2.41 μg·kg−1，0.71—9.15 μg·kg−1），但并没有显著性差异（P>0.05）. 需要指出的是，个别国产奶源的奶粉中抗生素含量较高，可达23.1 μg·kg−1，需要值得关注.
2.3 暴露风险评价
目前，国内还尚未出台关于奶粉中抗生素残留限量的相关规定，因此本研究参考农业部于2019年修订发布了最新的《动物源性食品中兽药最高残留限量》（GB 31650-2019）中的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）和日允许摄入量（acceptable daily intake, ADI）对婴幼儿的暴露风险进行研究[20-22]. 通过比较发现，抗生素在婴幼儿奶粉中的检出浓度均较低，41个婴幼儿奶粉中抗生素的含量比国家规定的动物性食品中兽药最高残留限量低1—3个数量级，符合食品安全（见表6）.
表 6 动物性食品中部分兽药最大残留限量（μg·kg−1） [22]Table 6. Maximum residue limits of some veterinary drugs in animal foods （μg·kg−1） [22]抗生素 Antibiotics 标志残留物 Marker residue 动物种类 Animal species 靶组织 Target tissue MRL ADI DIF DIF 所有食品动物 肌肉脂肪 300100 0—10 ENR ENR与CIP总量 所有食品动物 肌肉脂肪 100100 0—2 SAR SAR 鸡 肌肉脂肪 1020 0—0.3 ERY ERY A 所有食品动物 奶 40 0—5 TYL TYL A 牛 奶 50 0—6 SPI SPI总量 牛 奶 100 0—6 SAs SAs总量 牛/羊 奶 100 0—50 MRL：最高残留限量，μg·kg−1；ADI: 日允许摄入量，ng·kg−1·d−1·bw. | Show TableDownLoad:
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进一步根据奶粉中抗生素的检测结果换算婴幼儿经口对奶粉中抗生素的日平均暴露剂量. 婴幼儿暴露水平计算公式中婴幼儿体重参照《中国7岁以下儿童生长发育参照标准》[23]. 其中0—2周男孩体重为3.6 kg、女孩为2.7 kg，2—4周男孩体重为5.0 kg、女孩为3.6 kg，2个月男孩体重为5.2 kg、女孩为4.0 kg，3—4月男孩体重为6.3 kg、女孩为5.1 kg，5—6月男孩体重为7.6 kg、女孩为6.7 kg，7—12月男孩体重为10.6 kg、女孩为9.9 kg，13—24月男孩体重为12.7 kg、女孩为12.0 kg，25—36月男孩体重为15.3 kg、女孩为14.7 kg. 婴幼儿对奶粉的吸收率约为94%[24]. 0—6个月，7—12个月以及13—36个月月龄段婴幼儿配方奶粉消费量，按照样品标签上的推荐量求平均值计算，分别为102、109和 91 g d−1 [25].
婴幼儿对抗生素的日暴露水平如表7所示，结果表明婴幼儿对于喹诺酮类抗生素的暴露水平相对最高，其最大暴露浓度达到了430 ng·kg−1·d−1·bw，均值在3.40—13.2 ng·kg−1·d−1·bw. 对于大环内酯类抗生素的暴露水平较低，其最高暴露浓度为31.2 ng·kg−1·d−1·bw，均值在1.07—4.14 ng·kg−1·d−1·bw. 对于磺胺类抗生素的暴露水平最低，最高值也仅为是57.3 ng·kg−1·d−1·bw，均值在1.04—4.05 ng·kg−1·d−1·bw.
表 7 奶粉中抗生素对婴幼儿的日暴露水平（ng·kg−1·d−1·bw）Table 7. Daily exposure to antibiotics in powdered milk for infants（ng·kg−1·d−1·bw ）抗生素Antibiotics 年龄Age 男Male 女Female 最小值Minimum 最大值Maximum 均值Mean 最小值Minimum 最大值Maximum 均值Mean 喹诺酮类 0—2周 0.00 143 8.22 0.00 190 10.9 2—4周 0.00 137 7.88 0.00 182 10.4 2月 0.00 331 10.2 0.00 430 13.2 3—4月 0.00 139 7.98 0.00 139 7.98 5—6月 0.00 112 7.24 0.00 127 8.21 7—12月 0.00 165 5.96 0.00 177 6.38 13—24月 0.00 47.9 3.94 0.00 50.8 4.17 25—36月 0.00 39.8 3.27 0.00 41.4 3.40 磺胺类 0—2周 0.00 19.0 2.52 0.00 25.3 3.36 2—4周 0.00 18.2 2.42 0.00 24.2 3.21 2月 0.00 44.1 3.12 0.00 57.3 4.05 3—4月 0.00 18.6 2.45 0.00 18.6 2.45 5—6月 0.00 15.0 2.22 0.00 17.0 2.52 7—12月 0.00 8.34 1.83 0.00 8.93 1.96 13—24月 0.00 5.73 1.21 0.00 6.06 1.28 25—36月 0.00 4.76 1.00 0.00 4.95 1.04 大环内酯类 0—2周 0.00 10.4 2.58 0.00 13.8 3.44 2—4周 0.00 9.95 2.47 0.00 13.2 2.39 2月 0.00 24.1 3.19 0.00 31.2 4.14 3—4月 0.00 10.2 2.50 0.00 10.1 2.50 5—6月 0.00 8.18 2.27 0.00 9.28 2.57 7—12月 0.00 18.0 1.87 0.00 19.3 2.00 13—24月 0.00 6.79 1.23 0.00 7.19 1.31 25—36月 0.00 5.64 1.02 0.00 5.87 1.07 | Show TableDownLoad:
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对于这41个婴幼儿配方奶粉来说，婴幼儿对喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类抗生素的的暴露水平比《动物性食品中兽药最高残留限量》中ADI值低2—3个数量级（见表6）. 因此，婴幼儿奶粉中抗生素残留对儿童的暴露水平均处在较低的水平，不会对婴幼儿的成长发育造成明显的危害. 需要注意的是，本研究参考的《动物源性食品中兽药最高残留限量》（GB 31650-2019）仅对部分抗生素的最高残留限量和日允许摄入量做了限定，因此也仅对部分抗生素进行了风险评估，其评估结果可能会低于实际风险值. 考虑到不同抗生素之间的毒性协同作用，奶粉中低水平抗生素长期暴露对人体健康造成潜在的危害不能忽视.
3. 结论（Conclusion）
本文研究了婴幼儿配方奶粉样品中抗生素的污染特征和暴露水平. 研究表明奶粉中存在抗生素残留，其中主要组分是喹诺酮，其次是磺胺和大环内酯. 研究表明不同阶段和不同奶源婴幼儿配方奶粉中抗生素残留水平无显著性差异. 三类抗生素的日暴露水平均低于《动物性食品中兽药最高残留限量》中ADI值. 总体来看，婴幼儿的暴露水平均处在较低的水平. 因此，婴幼儿配方奶粉中所残留的抗生素尚不会对婴幼儿的成长发育造成明显的危害.
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表 1 实验前后植物生长平均值
植物生长情况 M-水芹 M-美人蕉 W-水芹 W-美人蕉 茎长/cm 始 33 42 34 42 末 45 66 48 64 根长/cm 始 8 8 10 12 末 13 14 19 25 根数/个 始 47 14 55 17 末 60 36 87 48 分蘖数/个 始 0 0 0 0 末 7 7 7 8 鲜重/g 始 16.5 48.5 19.0 55 末 49.0 135.0 58.5 189 注：M表示模拟污水，W表示实际污水。
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表 2 氮磷去除率及植物贡献率
植物 氮 磷 去除率/% 去除量/mg 植物全氮量/mg 植物贡献率/% 去除率/% 去除量/mg 植物全磷量/mg 植物贡献率/% M-水芹 58.77 354.38 103.37 29.17 82.95 51.70 34.392 66.52 M-美人蕉 90.76 475.80 361.74 76.03 95.38 57.09 44.070 77.19 W-水芹 65.18 397.46 105.71 26.60 89.17 43.74 33.600 76.82 W-美人蕉 88.14 511.65 482.67 94.34 92.59 42.50 41.370 97.34
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