生物洗涤塔内产漆酶苯降解菌的分离鉴定及菌剂制备应用

侯晓松, 李远啸, 谷丹丹, 郭斌, 任爱玲, 王欣, 贺博文. 生物洗涤塔内产漆酶苯降解菌的分离鉴定及菌剂制备应用[J]. 环境工程学报, 2022, 16(8): 2602-2612. doi: 10.12030/j.cjee.202110140
引用本文: 侯晓松, 李远啸, 谷丹丹, 郭斌, 任爱玲, 王欣, 贺博文. 生物洗涤塔内产漆酶苯降解菌的分离鉴定及菌剂制备应用[J]. 环境工程学报, 2022, 16(8): 2602-2612. doi: 10.12030/j.cjee.202110140
HOU Xiaosong, LI Yuanxiao, GU Dandan, GUO Bin, REN Ailing, WANG Xin, HE Bowen. Isolation, identification and preparation of laccase benzene degrading bacteria in biological scrubber tower[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(8): 2602-2612. doi: 10.12030/j.cjee.202110140
Citation: HOU Xiaosong, LI Yuanxiao, GU Dandan, GUO Bin, REN Ailing, WANG Xin, HE Bowen. Isolation, identification and preparation of laccase benzene degrading bacteria in biological scrubber tower[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(8): 2602-2612. doi: 10.12030/j.cjee.202110140

生物洗涤塔内产漆酶苯降解菌的分离鉴定及菌剂制备应用

    作者简介: 侯晓松(1995—),男,硕士研究生,15075168995@163.com
    通讯作者: 郭斌(1960—),男,教授,gbin69@163.com
  • 基金项目:
    河北省重点研发计划项目(21373704D)
  • 中图分类号: X511;X172

Isolation, identification and preparation of laccase benzene degrading bacteria in biological scrubber tower

    Corresponding author: GUO Bin, gbin69@163.com
  • 摘要: 从生物洗涤塔内循环洗涤液中分离鉴定得到3株苯降解菌Kocuria rosea sp. R(玫瑰色考克氏菌属)、Bacillus sp. W(芽孢杆菌属),以及Arthrobacter sp. Y(节杆菌属),通过研究其苯降解动力学,确定苯降解优势菌为Bacillus sp. W,优化其降解条件并探究其代谢途径。结果表明,添加皂角苷可促进苯的生物降解,但根据不同细菌的代谢特点,其影响存在显著差异。在产漆酶菌Bacillus sp. W的降解下,苯的半衰期为8.08 h,而皂角苷与苯共代谢时,苯的半衰期缩短为4.90 h。在最优条件下,即pH为7、起始苯浓度为50 mg·L−1、皂角苷添加量为75 mg·L−1Bacillus sp. W的漆酶酶活最高为490.21 U·L−1。在漆酶等参与下苯存在独特苯降解通路,苯在加氧酶作用下转化为邻苯二酚,漆酶可催化酚羟基邻位发生甲氧基取代,进而分子内加成为呋喃衍生物,再经一系列下游酶的作用降解成小分子。在生物反应器中添加由分离得到3株菌株复合而成的菌剂,苯去除效率在第5 d达最高81.21%,比常规驯化活性污泥提前了17 d,还增强了反应器的抗冲击能力。将菌剂接种到实验室的泡沫生物洗涤反应器中,实现了反应器快速启动,启动期仅为5 d。本研究可为生物技术治理疏水性和难降解性VOCs提供参考。
  • 20世纪50年代美国食品与药物管理局首次批准抗生素用作饲料添加剂,世界各国相继将抗生素应用于畜牧生产,提高了畜牧业的经济效益. 但是,抗生素在养殖业和畜牧业中的广泛使用对环境和人体健康造成了很大危害[1]. 抗生素会加剧细菌的变异,使细菌产生耐药性,甚至可能产生超级细菌[2]. 抗生素还可能使人体发生“二重感染”,对人体的多个器官均有损害,导致过敏反应和药物性耳聋发生[3].

    有研究显示,奶牛在饲养过程中用到的抗生素类药物,主要用于预防乳头发炎和细菌感染,并防止奶制品的细菌污染[4]. 奶牛体内无法被吸收的抗生素会有部分随着乳汁排出体外,并制成液态奶和奶粉等乳制品[5]. 这些奶粉中的抗生素可能会对于易感人群产生一定的危害. 其中婴幼儿因为对奶粉的需求量大、自身免疫力较弱、身体器官尚未发育成熟等原因,可能受到的影响较大. 因此,对于婴幼儿奶粉中抗生素残留的检测值得特别关注.

    目前关于液态奶中抗生素残留的研究较多[6-8]. Zhang等[9]检测了中国市场上的巴氏奶和高温灭菌奶中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物的含量,Wang等[10]检测了牛奶中20种大环内酯、磺胺类和喹诺酮类抗生素残留量,均表明牛奶中含有一定的抗生素残留(μg·L−1). 另一方面,由于奶粉中抗生素残留低,并且含有大量蛋白质和脂肪,基体复杂,可能会干扰抗生素的检测[11],因此关于奶粉尤其是婴幼儿奶粉中的污染特征的研究较少. 张律[12]采用高效液相色谱-串联质谱法进行环丙沙星、氧氟沙星等11种喹诺酮类抗生素的检测,结果在深圳市110份奶粉样品中均未检出. Tian等[13]采用超高效液相色谱-串联质谱法应用于50个市售牛奶和奶粉样品中抗生素的检测,并在部分品牌样品中检出头孢噻呋和环丙沙星残留(μg·kg−1). 陆峥[14]和周显凤等[15]分别采用纸片扩散法对分离自婴幼儿配方奶粉的阪崎肠杆菌进行药敏实验,结果显示该细菌对头孢噻吩100%耐药,对环丙沙星等抗生素高度敏感[14-15],表明婴幼儿配方奶粉中存在抗生素污染. 因此,对常见市售奶粉中抗生素的含量进行检测,并根据检测结果主要对婴幼儿的暴露情况进行研究,这对于保障婴幼儿的健康具有很强的现实意义.

    本研究建立了同时检测22种喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类抗生素的分析方法,并用该方法对市面上常见的婴幼儿奶粉进行检测,根据其检测结果分析婴幼儿奶粉中抗生素的污染水平和分布规律. 通过计算抗生素对婴幼儿的暴露水平,评估奶粉中抗生素的含量对婴幼儿的生长发育的风险.

    大环内酯类(macrolides,MCs):红霉素(ERY,99.1%)、罗红霉素(ROX,90%)、交沙霉素(JOS,98%)、泰乐菌素(TYL,82.4%)、螺旋霉素(SPI,88.9%)(美国Sigma-Aldrich公司).

    磺胺类(sulfonamides,SAs):磺胺噻唑(ST,98%)、磺胺吡啶(SPD,98%)、磺胺甲基异恶唑(SMX,98%)(日本东京化成工业株式会社);磺胺二甲基嘧啶(SMX,99%)(美国Acros Organics公司);磺胺嘧啶(SD,99.7%)、磺胺甲基嘧啶(SMR,99.9%)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM,99.4%)、磺胺二甲基异恶唑(SIA,99.0%)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM,98%)(美国Sigma-Aldrich公司).

    喹诺酮类(quinolones,QNs):诺氟沙星(NOR,99.9%)、恩诺沙星(ENR,99.9%)、环丙沙星(CIP,99.9%)、氧氟沙星(OFL,99.9%)、沙拉沙星(SAR,95.0%)、氟罗沙星(FLE,99.5%)、洛美沙星(LOM,98%)、双氟沙星(DIF,98.0%)(美国Sigma-Aldrich公司).

    替代物标准品:磺胺甲基异恶唑-d4(SMX-d4,99.0%)、磺胺二甲基嘧啶-d4(SMX-d4,99.0%),红霉素-13C, d3(ERY-13C, d3,98.0 %)和螺旋霉素I-d3(SPI I-d3,98.0 %)(购于加拿大Toronto Research Chemicals公司);氧氟沙星-d3(OFL-d3,99.5 %)、诺氟沙星-d5(NOR-d5,99%)、沙拉沙星-d8(SAR-d8,99.5 %)(美国Sigma-Aldrich公司);

    色谱纯甲醇和乙腈(美国Fisher公司),氨水(50%,V/V)和甲酸铵(99%,美国Alfa Aesar公司),甲酸(98%,美国Fluka公司),乙二胺四乙酸二钠盐(Na2EDTA)(分析纯,国药集团化学试剂有限公司).

    质谱:API3200三重四极杆串联质谱检测系统(美国AB公司),配有电喷雾离子源(ESI)和Analyst 1.4.1工作软件.

    色谱:UltiMate3000液相色谱仪(美国Dionex公司); XTerra MS C18型色谱柱(2.1 mm×100 mm,3.5 μm,美国Waters公司).

    其他:AutoTrace 280全自动固相萃取仪(美国Dionex公司);Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司);氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司);Oasis HLB(6 mL,200 mg)(美国Waters公司);3-15高速离心机(北京松源华兴科技发展有限公司).

    采集23个常见品牌的市售婴幼儿奶粉共41份样品(表1). 样品采集后在4 ℃ 冰箱中冷藏,为了防止其中抗生素的分解造成的损失,在1周内进行处理分析.

    表 1  奶粉样品相关信息
    Table 1.  Information about infant milk powder samples
    序号No.奶粉品牌Brand是否进口Import/Local阶段Stage序号No.奶粉品牌Brand是否进口Import/Local阶段Stage
    1A11段22J12段
    2A22段23K1段
    3B11段24L3段
    4C11段25M12段
    5C23段26M22段
    6C33段27M32段
    7C43段28M41段
    8C53段29N11段
    9C62段30O12段
    10D12段31O33段
    11E11段32P12段
    12E23段33Q12段
    13E31段34Q23段
    14E43段35R11段
    15F11段36S11段
    16F23段37T13段
    17F31段38T23段
    18G12段39X12段
    19H13段40X11段
    20I11段41Y13段
    21A12段
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    优化后抗生素前处理方法如下:称取1.0 g奶粉样品于聚四氟乙烯离心管中,加入10 mL甲醇/乙腈(V/V=8:2)的萃取液,以及20 ng替代物内标(NOR-d5、OFL-d3、SAR-d8、SMX-d4、SMX-d4、ERY-13C, d3 和SPI I-d3)和1.0 g氯化钠,涡旋振荡2 min,于摇床中振荡12 h(转速:350 r·min−1、温度:35 ℃). 之后在5000 r·min−1的条件下离心10 min,取上清液,用5 mL甲醇-乙腈(V/V=8:2)混合溶液清洗,合并上清液. 重复上述步骤2次.

    在35 ℃的条件下氮吹至溶液体积约5 mL,加入3 mL正己烷,涡旋振荡1 min,5000 r·min−1的条件下离心10 min,取上清液继续氮吹至2—3 mL. 转移溶液至100 mL PET小瓶中并加入超纯水稀释溶液至100 mL,使用自动固相萃取技术进行富集净化(5 mL甲醇、5 mL超纯水活化,6 mL氨水-甲醇(V/V=5:95)溶液洗脱). 洗脱液在35 ℃的条件下再次进行氮吹,至小于0.5 mL,定容至1 mL. 转移到1 mL离心管中,冷冻12 h,之后在漩涡振荡后以14500 r·min−1离心5 min,取上层清液经过0.22 μm尼龙滤膜转移到棕色色谱瓶中以备仪器分析.

    采用电喷雾离子源(ESI),分析物在正离子扫描下以多反应监测(MRM)模式,分别进行母离子Q1和子离子Q3扫描,选择丰度最强的2个子离子与分子离子组成离子对作为目标物的监测离子. 信号最强的离子对可以为定量提供高灵敏度,另一个离子对则可提供辅助定性信息. 之后优化质谱参数和色谱条件,使仪器信号稳定且灵敏度最高. 优化的质谱分析条件:气帘气压力0.14 MPa,碰撞气压力0.02 MPa,电喷雾电压5000 V,雾化气温度600 ℃,雾化气:0.38 MPa,加热气及辅助雾化气: 0.45 MPa. 优化的色谱条件:流动相A:0.3%甲酸水溶液(含0.1%(体积分数)甲酸铵,pH=2.9),流动相B:甲醇-乙腈(V/V=1:1);流速:0.2 mL·min−1;进样量:15 μL;梯度洗脱条件:0—2 min,10%B;2—12 min,10%—70% B;12—16 min,70%—100% B,保持3 min;19—19.1 min,100%—10% B;19.1—33 min,10% B.

    在选定的最佳质谱和色谱条件下,进样15 μL,对一系列浓度的混合标准样品(20 ng NOR-d5、OFL-d3、SAR-d8、SMX-d4、SMZ-d4、 ERY-13C, d3和SPI I-d3内标)进行分析,以各分析物和内标离子对的峰面积之比进行定量. 每批样品都要做一个程序空白样品,以保证检测结果的可靠性. 实验中设置方法空白、空白加标、基质加标对数据进行质量控制. 22种抗生素的加标回收率为72.8%—123%,相对标准偏差(RSD)为1.6%—11.2%. 结果表明,22种化合物均在较宽的范围内具有良好的线性,方法检出限(LODs)为0.01—0.10 μg·kg−1 (见表2).

    表 2  22种抗生素的回收率、线性范围和检出限(S/N=3)
    Table 2.  Recoveries (%),linear range, and limits of detection (LODs,S/N=3) of 22 antibiotics
    抗生素Antibiotics替代物Surrogate相关系数r Correlation线性范围/(μg·kg−1)Linear range回收率/%(加标10 μg·kg−1)RecoveryLODs/ (μg·kg−1
    NORNOR-d50.99740.1—50087.5±7.40.09
    CIPNOR-d50.99870.05—50082.7±11.40.08
    DIFOFL-d30.99850.05—50074.3±10.30.08
    ENROFL-d30.99900.05—50097.4±8..90.08
    FLEOFL-d30.99840.1—50097.6±6.80.04
    OFLOFL-d30.99880.1—500104.0±8.50.06
    LOMOFL-d30.99670.05—50072.4±3.30.05
    SARSAR-d80.99920.05—20095.9±4.60.09
    STZSMX-d40.99740.01—50084.2±5.90.04
    SMXSMX-d40.99910.1—500101.0±4.30.06
    SIASMX-d40.99870.02—50088.3±2.70.06
    SPDSMZ-d40.99850.02—50098.0±5.30.04
    SDMSMZ-d40.99960.01—500121.0±5.60.04
    SMZSMZ-d40.99930.01—500102.0±3.70.04
    SDZSMZ-d40.99860.05—500101.0±3.50.04
    SMRSMZ-d40.99770.02—500107.0±7.10.04
    SMMSMZ-d40.99850.02—500112.0±7.30.01
    SPISPI I-d30.99800.1—500104.0±5.20.08
    JOSSPI I-d30.99340.05—20084.4±5.60.04
    TYLSPI I-d30.99340.05—20090.0±7.10.10
    ROXSPI I-d30.99050.05—500101.0±6.10.04
    ERYERY-13C,d30.99920.1—500109.0±5.30.04
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    根据婴幼儿奶粉建议用量计算婴幼儿每天奶粉的实际摄入量,再根据奶粉中抗生素的检测结果,换算出婴幼儿经口对奶粉中抗生素的日平均暴露剂量(Average daily dose, ADD),公式(EPA,2011)[16]如下:

    ADD=C×IR×EF×EDAT×BW (1)

    其中,ADD:抗生素的日平均暴露量,μg (kg d)−1; C:奶粉中抗生素的浓度,μg·kg−1;IR:饮食摄入量,kg d−1;EF:暴露频率,d a−1;ED:暴露持续时间,a;BW:体重,kg;AT:平均暴露时间,d.

    本研究中∑QNs、∑SAs和∑MCs分别代表9种喹诺酮、8种磺胺和5种大环内酯抗生素的浓度之和. 所有数据均使用IBM PASW Statistics 20软件进行分析. 如奶粉样品中抗生素浓度低于分析方法检出限,则该检测数据赋予0值参加平均值统计计算. Kolmogorov–Smirnov检验用来验证数据是否呈正态分布,Kruskal–Wallis非参数检验用来比较抗生素的浓度差异. 一般认为当P< 0.05时该检验具有显著性差异.

    婴幼儿配方奶粉中抗生素浓度见表3. 样品共检出19种抗生素,包括8种喹诺酮(NOR、CIP、DIF、ENR、FLE、OFL、LOM和SAR),6种磺胺(SMX、SPD、SMZ、SDZ、SIA和SDM)和3大环内酯(TYL、ROX和ERY). 其他1种磺胺(SPD)和2种大环内酯(SPI和JOS)在所有样品中浓度均低于检测限,可能是这3种抗生素主要应用于人体感染性疾病的治疗,在动物的生长过程中很少使用[1].

    表 3  婴幼儿配方奶粉中抗生素的浓度(n=41, μg·kg−1
    Table 3.  Concentrations of antibiotics in infant milk power
    抗生素Antibiotics最小值Minimum中位数Median最大值Maximum平均值Mean检出率/%Detection rate
    NOR<LOD0.445.780.6890.2
    CIP0.150.479.950.87100
    DIF<LOD<LOD0.540.0412.2
    ENR<LOD0.163.760.4890.2
    FLE<LOD<LOD0.680.0626.8
    OFL<LOD0.081.550.1658.5
    LOM<LOD<LOD0.840.0739.0
    SAR<LOD<LOD0.920.0836.6
    STZ<LOD<LOD0.300.0217.1
    SMX<LOD<LOD0.500.0539.0
    SIA<LOD0.060.770.0751.2
    SPD<LOD<LOD<LOD<LOD<LOD
    SDM<LOD<LOD0.540.037.32
    SMZ<LOD0.040.430.0758.5
    SDZ<LOD<LOD0.240.017.32
    SMR<LOD0.040.300.0558.5
    SMM<LOD<LOD0.530.0541.5
    SPI<LOD<LOD<LOD<LOD<LOD
    JOS<LOD<LOD<LOD<LOD<LOD
    TYL<LOD<LOD0.240.017.32
    ROX<LOD<LOD1.080.0617.1
    ERY<LOD0.040.510.0853.7
    ∑QNs0.491.9620.12.92100
    ∑SAs0.030.272.930.39100
    ∑MCs<LOD0.051.140.1683.0
    Total0.712.3923.13.46100
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    三类抗生素中,喹诺酮类抗生素浓度最高,平均浓度可达2.92 μg·kg−1(0.49—20.1 μg·kg−1),比磺胺(平均浓度0.39 μg·kg−1,0.03—2.93 μg·kg−1)和大环内酯类(平均浓度0.16 μg·kg−1,<LOD—1.14 μg·kg−1)抗生素浓度高1个数量级. 这是因为奶牛在生长过程中喹诺酮类抗生素的使用量远大于磺胺和大环内酯的使用量(见表4),并且喹诺酮类抗生素具有更高的稳定性和生物富集能力[17-19]. 在所有抗生素中,CIP、NOR和ENR的检出率较高(90.2%—100%),浓度分别为0.87、0.68、0.48 μg·kg−1,而其他抗生素检出率(<60%)和浓度均较低(<0.2 μg·kg−1). 有研究报道[1],CIP、NOR和ENR均可作为兽用抗生素使用,并在养殖业中大量使用(表4),因此可在奶粉样品中较多检出.

    表 4  2013年中国部分抗生素的使用情况[1]
    Table 4.  Usage of some antibiotics in China in 2013[1]
    大类Group抗生素Antibiotics简写Abbreviation主要用途Application使用量/tUsage amount
    人Human猪Pig鸡Chicken其他Other汇总Summary
    QNs诺氟沙星NOR医用,兽用101328209616445440
    环丙沙星CIP医用,兽用455311010607125340
    双氟沙星DIF兽用0378172117667
    恩诺沙星ENR兽用0309011509405180
    氟罗沙星FLE医用,兽用11960.621.615.1216
    氧氟沙星OFL医用,兽用128624408325575110
    洛美沙星LOM医用,兽用2286502221491250
    沙拉沙星SARn.a.n.a.n.a.n.a.n.a.n.a.
    Total3101125494419313423203
    SAs磺胺噻唑STZ兽用0.6640.213.79.1863.7
    磺胺甲基异恶唑SMX医用,兽用2.019867.645.3313
    磺胺二甲基异恶唑SIA医用n.a.n.a.n.a.n.a.n.a.
    磺胺吡啶SPDn.a.n.a.n.a.n.a.n.a.n.a.
    磺胺间二甲氧嘧啶SDM兽用n.a.n.a.n.a.n.a.n.a.
    磺胺二甲基嘧啶SMZ医用,兽用68.438813288.7677
    磺胺嘧啶SDZ医用,兽用2386482211481260
    磺胺甲基嘧啶SMR医用n.a.n.a.n.a.n.a.n.a.
    磺胺间甲氧嘧啶SMM兽用9.9314004773202210
    Total31926749116114524
    MCs螺旋霉素SPI医用n.a.n.a.n.a.n.a.n.a.
    交沙霉素JOSn.a.n.a.n.a.n.a.n.a.n.a.
    泰乐菌素TYL兽用0309010507064850
    红霉素ERY医用,兽用124415805653773770
    罗红霉素ROX医用,兽用18411267.322.5386
    Total14284782168211069006
      n.a.: 没有数据来源;其他:包括除猪和鸡之外的牛、羊等其他家畜.
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    不同阶段婴幼儿配方奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的浓度如图1(a)所示. 单因素方差(见表5)结果表明,这三类抗生素浓度在不同阶段的奶粉中无显著差异(P>0.05). 2段奶粉中抗生素残留水平的总体平均值为4.48 μg·kg−1(浓度范围1.18—17.4 μg·kg−1),略高于1段(平均3.77 μg·kg−1,0.89—23.1 μg·kg−1)和3段(平均2.36 μg·kg−1,0.71—6.98 μg·kg−1)奶粉中抗生素的残留水平.

    图 1  婴幼儿配方奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的浓度
    Figure 1.  Concentrations of ∑QNs、∑SAs and ∑MCs in milk power
    (a:不同阶段;b:不同奶源)
    (a: different stages; b: different sources)
    表 5  不同阶段奶粉∑QNs、∑SAS和∑MCs浓度的单因素方差分析
    Table 5.  One-way ANOVA of ∑QNs, ∑SAS and ∑MCs of milk powder at different stages
    P
    1段 vs 2段1段 vs 3段2段 vs 3段
    ∑QNs0.6480.3800.195
    ∑SAs0.6110.3090.642
    ∑MCs0.2630.4830.638
    Total0.6780.3810.210
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    国内外不同奶源奶粉中∑QNs、∑SAs和∑MCs的污染水平如图1(b)所示. 通过对比发现,国内奶源的奶粉的污染水平(平均值3.88 μg·kg−1,1.36—23.1 μg·kg−1)略高于进口奶源(平均值2.41 μg·kg−1,0.71—9.15 μg·kg−1),但并没有显著性差异(P>0.05). 需要指出的是,个别国产奶源的奶粉中抗生素含量较高,可达23.1 μg·kg−1,需要值得关注.

    目前,国内还尚未出台关于奶粉中抗生素残留限量的相关规定,因此本研究参考农业部于2019年修订发布了最新的《动物源性食品中兽药最高残留限量》(GB 31650-2019)中的最高残留限量(maximum residue limit,MRL)和日允许摄入量(acceptable daily intake, ADI)对婴幼儿的暴露风险进行研究[20-22]. 通过比较发现,抗生素在婴幼儿奶粉中的检出浓度均较低,41个婴幼儿奶粉中抗生素的含量比国家规定的动物性食品中兽药最高残留限量低1—3个数量级,符合食品安全(见表6).

    表 6  动物性食品中部分兽药最大残留限量(μg·kg−1 [22]
    Table 6.  Maximum residue limits of some veterinary drugs in animal foods (μg·kg−1 [22]
    抗生素 Antibiotics标志残留物 Marker residue动物种类 Animal species靶组织 Target tissueMRLADI
    DIFDIF所有食品动物肌肉脂肪3001000—10
    ENRENR与CIP总量所有食品动物肌肉脂肪1001000—2
    SARSAR肌肉脂肪10200—0.3
    ERYERY A所有食品动物400—5
    TYLTYL A500—6
    SPISPI总量1000—6
    SAsSAs总量牛/羊1000—50
      MRL:最高残留限量,μg·kg−1;ADI: 日允许摄入量,ng·kg−1·d−1·bw.
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    进一步根据奶粉中抗生素的检测结果换算婴幼儿经口对奶粉中抗生素的日平均暴露剂量. 婴幼儿暴露水平计算公式中婴幼儿体重参照《中国7岁以下儿童生长发育参照标准》[23]. 其中0—2周男孩体重为3.6 kg、女孩为2.7 kg,2—4周男孩体重为5.0 kg、女孩为3.6 kg,2个月男孩体重为5.2 kg、女孩为4.0 kg,3—4月男孩体重为6.3 kg、女孩为5.1 kg,5—6月男孩体重为7.6 kg、女孩为6.7 kg,7—12月男孩体重为10.6 kg、女孩为9.9 kg,13—24月男孩体重为12.7 kg、女孩为12.0 kg,25—36月男孩体重为15.3 kg、女孩为14.7 kg. 婴幼儿对奶粉的吸收率约为94%[24]. 0—6个月,7—12个月以及13—36个月月龄段婴幼儿配方奶粉消费量,按照样品标签上的推荐量求平均值计算,分别为102、109和 91 g d−1 [25].

    婴幼儿对抗生素的日暴露水平如表7所示,结果表明婴幼儿对于喹诺酮类抗生素的暴露水平相对最高,其最大暴露浓度达到了430 ng·kg−1·d−1·bw,均值在3.40—13.2 ng·kg−1·d−1·bw. 对于大环内酯类抗生素的暴露水平较低,其最高暴露浓度为31.2 ng·kg−1·d−1·bw,均值在1.07—4.14 ng·kg−1·d−1·bw. 对于磺胺类抗生素的暴露水平最低,最高值也仅为是57.3 ng·kg−1·d−1·bw,均值在1.04—4.05 ng·kg−1·d−1·bw.

    表 7  奶粉中抗生素对婴幼儿的日暴露水平(ng·kg−1·d−1·bw)
    Table 7.  Daily exposure to antibiotics in powdered milk for infants(ng·kg−1·d−1·bw )
    抗生素Antibiotics年龄Age男Male女Female
    最小值Minimum最大值Maximum均值Mean最小值Minimum最大值Maximum均值Mean
    喹诺酮类0—2周0.001438.220.0019010.9
    2—4周0.001377.880.0018210.4
    2月0.0033110.20.0043013.2
    3—4月0.001397.980.001397.98
    5—6月0.001127.240.001278.21
    7—12月0.001655.960.001776.38
    13—24月0.0047.93.940.0050.84.17
    25—36月0.0039.83.270.0041.43.40
    磺胺类0—2周0.0019.02.520.0025.33.36
    2—4周0.0018.22.420.0024.23.21
    2月0.0044.13.120.0057.34.05
    3—4月0.0018.62.450.0018.62.45
    5—6月0.0015.02.220.0017.02.52
    7—12月0.008.341.830.008.931.96
    13—24月0.005.731.210.006.061.28
    25—36月0.004.761.000.004.951.04
    大环内酯类0—2周0.0010.42.580.0013.83.44
    2—4周0.009.952.470.0013.22.39
    2月0.0024.13.190.0031.24.14
    3—4月0.0010.22.500.0010.12.50
    5—6月0.008.182.270.009.282.57
    7—12月0.0018.01.870.0019.32.00
    13—24月0.006.791.230.007.191.31
    25—36月0.005.641.020.005.871.07
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    对于这41个婴幼儿配方奶粉来说,婴幼儿对喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类抗生素的的暴露水平比《动物性食品中兽药最高残留限量》中ADI值低2—3个数量级(见表6). 因此,婴幼儿奶粉中抗生素残留对儿童的暴露水平均处在较低的水平,不会对婴幼儿的成长发育造成明显的危害. 需要注意的是,本研究参考的《动物源性食品中兽药最高残留限量》(GB 31650-2019)仅对部分抗生素的最高残留限量和日允许摄入量做了限定,因此也仅对部分抗生素进行了风险评估,其评估结果可能会低于实际风险值. 考虑到不同抗生素之间的毒性协同作用,奶粉中低水平抗生素长期暴露对人体健康造成潜在的危害不能忽视.

    本文研究了婴幼儿配方奶粉样品中抗生素的污染特征和暴露水平. 研究表明奶粉中存在抗生素残留,其中主要组分是喹诺酮,其次是磺胺和大环内酯. 研究表明不同阶段和不同奶源婴幼儿配方奶粉中抗生素残留水平无显著性差异. 三类抗生素的日暴露水平均低于《动物性食品中兽药最高残留限量》中ADI值. 总体来看,婴幼儿的暴露水平均处在较低的水平. 因此,婴幼儿配方奶粉中所残留的抗生素尚不会对婴幼儿的成长发育造成明显的危害.

  • 图 1  革兰氏染色后R、W和Y的800倍光学显微镜图

    Figure 1.  Optical microscopy of R, W and Y at 800x after Gram staining

    图 2  基于16S rDNA 序列构建的优势菌传统系统发育树

    Figure 2.  Traditional phylogenetic trees of dominat bacteria based on 16S rDNA sequences

    图 3  菌株R、W和Y降解苯动力学拟合

    Figure 3.  Kinetic simulation of benzene degradation by R, W and Y

    图 4  生长曲线与漆酶酶活变化

    Figure 4.  Growth curve and laccase activity change

    图 5  Bacillus sp. W漆酶降解苯途径

    Figure 5.  Benzene degradation pathway of Bacillus sp. W by laccase

    图 6  添加菌剂对活性污泥驯化影响

    Figure 6.  Effect of bacterial additive on acclimation of activated sludge

    图 7  添加菌剂对液相中MLSS、苯质量浓度及气相苯去除率的变化

    Figure 7.  Changes of MLSS, benzene mass concentration in liquid phase and benzene removal rate in gas phase by adding bacteria agent

    表 1  正交实验的因素与水平的设置

    Table 1.  Factors of orthogonal experiment and level Settings

    水平因素
    皂角苷添加量/(mg·L−1)pH苯质量浓度/(mg·L−1)
    125520
    250650
    3757100
    41008200
    水平因素
    皂角苷添加量/(mg·L−1)pH苯质量浓度/(mg·L−1)
    125520
    250650
    3757100
    41008200
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    表 2  动力学拟合结果对比表

    Table 2.  Comparison of kinetic simulation Results

    菌株体系模拟方程比降解速率|K|R2半衰期/h
    RR2lnc=−0.073 8t+0.090 70.073 80.931 69.39
    R1lnc=−0.116 1t+0.106 60.116 10.984 65.97
    WW2lnc=−0.085 8t+0.004 10.085 80.974 68.08
    W1lnc=−0.141 6t+0.233 90.141 60.944 24.90
    YY2lnc=−0.054 5t+0.040 30.054 50.976 512.72
    Y1lnc=−0.063 8t+0.066 60.063 80.958 810.86
    菌株体系模拟方程比降解速率|K|R2半衰期/h
    RR2lnc=−0.073 8t+0.090 70.073 80.931 69.39
    R1lnc=−0.116 1t+0.106 60.116 10.984 65.97
    WW2lnc=−0.085 8t+0.004 10.085 80.974 68.08
    W1lnc=−0.141 6t+0.233 90.141 60.944 24.90
    YY2lnc=−0.054 5t+0.040 30.054 50.976 512.72
    Y1lnc=−0.063 8t+0.066 60.063 80.958 810.86
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    表 3  正交实验结果分析表

    Table 3.  Analysis table of orthogonal experiment results

    序号皂角苷添加量/(mg·L−1)pH苯质量浓度/(mg·L−1)去除效率%
    实验110065078.98
    实验25062078.80
    实验310082062.59
    实验42575079.98
    实验57572080.10
    实验6100510070.62
    实验72552072.02
    实验850520068.26
    实验9100720071.75
    实验107555074.70
    实验115085069.76
    实验1275820062.74
    实验1325620073.68
    实验1450710080.42
    实验1525810066.82
    实验1675610080.63
    序号皂角苷添加量/(mg·L−1)pH苯质量浓度/(mg·L−1)去除效率%
    实验110065078.98
    实验25062078.80
    实验310082062.59
    实验42575079.98
    实验57572080.10
    实验6100510070.62
    实验72552072.02
    实验850520068.26
    实验9100720071.75
    实验107555074.70
    实验115085069.76
    实验1275820062.74
    实验1325620073.68
    实验1450710080.42
    实验1525810066.82
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-10-27
  • 录用日期:  2022-05-06
  • 刊出日期:  2022-08-31
侯晓松, 李远啸, 谷丹丹, 郭斌, 任爱玲, 王欣, 贺博文. 生物洗涤塔内产漆酶苯降解菌的分离鉴定及菌剂制备应用[J]. 环境工程学报, 2022, 16(8): 2602-2612. doi: 10.12030/j.cjee.202110140
引用本文: 侯晓松, 李远啸, 谷丹丹, 郭斌, 任爱玲, 王欣, 贺博文. 生物洗涤塔内产漆酶苯降解菌的分离鉴定及菌剂制备应用[J]. 环境工程学报, 2022, 16(8): 2602-2612. doi: 10.12030/j.cjee.202110140
HOU Xiaosong, LI Yuanxiao, GU Dandan, GUO Bin, REN Ailing, WANG Xin, HE Bowen. Isolation, identification and preparation of laccase benzene degrading bacteria in biological scrubber tower[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(8): 2602-2612. doi: 10.12030/j.cjee.202110140
Citation: HOU Xiaosong, LI Yuanxiao, GU Dandan, GUO Bin, REN Ailing, WANG Xin, HE Bowen. Isolation, identification and preparation of laccase benzene degrading bacteria in biological scrubber tower[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(8): 2602-2612. doi: 10.12030/j.cjee.202110140

生物洗涤塔内产漆酶苯降解菌的分离鉴定及菌剂制备应用

    通讯作者: 郭斌(1960—),男,教授,gbin69@163.com
    作者简介: 侯晓松(1995—),男,硕士研究生,15075168995@163.com
  • 1. 河北科技大学环境科学与工程学院,石家庄 050018
  • 2. 挥发性有机物与恶臭污染防治技术国家地方联合工程研究中心,石家庄 050018
  • 3. 河北省大气污染防治推广中心,石家庄 050018
  • 4. 沧州市生态环境局,沧州 061001
基金项目:
河北省重点研发计划项目(21373704D)

摘要: 从生物洗涤塔内循环洗涤液中分离鉴定得到3株苯降解菌Kocuria rosea sp. R(玫瑰色考克氏菌属)、Bacillus sp. W(芽孢杆菌属),以及Arthrobacter sp. Y(节杆菌属),通过研究其苯降解动力学,确定苯降解优势菌为Bacillus sp. W,优化其降解条件并探究其代谢途径。结果表明,添加皂角苷可促进苯的生物降解,但根据不同细菌的代谢特点,其影响存在显著差异。在产漆酶菌Bacillus sp. W的降解下,苯的半衰期为8.08 h,而皂角苷与苯共代谢时,苯的半衰期缩短为4.90 h。在最优条件下,即pH为7、起始苯浓度为50 mg·L−1、皂角苷添加量为75 mg·L−1Bacillus sp. W的漆酶酶活最高为490.21 U·L−1。在漆酶等参与下苯存在独特苯降解通路,苯在加氧酶作用下转化为邻苯二酚,漆酶可催化酚羟基邻位发生甲氧基取代,进而分子内加成为呋喃衍生物,再经一系列下游酶的作用降解成小分子。在生物反应器中添加由分离得到3株菌株复合而成的菌剂,苯去除效率在第5 d达最高81.21%,比常规驯化活性污泥提前了17 d,还增强了反应器的抗冲击能力。将菌剂接种到实验室的泡沫生物洗涤反应器中,实现了反应器快速启动,启动期仅为5 d。本研究可为生物技术治理疏水性和难降解性VOCs提供参考。

English Abstract

  • 石油、化工、印刷、制药等工业生产会产生大量含芳香族化合物废气[1]。苯是一种芳香族化合物,是大气光化学污染的重要反应物,亦是臭氧和二次有机气溶胶(secondary organic aerosols,SOA)的关键前体物[2]。生物技术因其绿色安全、处理效果好、运行费用低、操作简单等优点,已成为近年来大气污染控制技术的研究热点[3-4]。相比于生物滴滤和生物过滤技术,生物洗涤技术具有压降小、驯化周期短、不易酸化、不易堵塞、高污染物负荷、抗负荷冲击能力强等优点[5-8]。生物洗涤器内含微生物的活性污泥对降解污染物起关键作用。将活性污泥驯化后可提升其降解能力,然而针对目标污染物的有效微生物比例和活性一般较低,缓慢的演替过程亦会导致反应器启动时间长、处理难降解物质的能力有限[9]。因此,筛选高效降解菌株,探究其降解能力、适宜条件及代谢途径十分重要。

    目前,已发现Pseudomonas sp.Rhodococcus sp.Klebsiella sp.Alcaligenes xylosoxidans Y234.Pseudomonas putida.等菌株对苯具良好的降解能力[10-13]。然而,在单一苯降解高效菌株降解复杂疏水性化合物时,由于代谢途径单一、反应速率有限,积累的中间代谢产物易毒害微生物[14-15]。混合菌群内的不同种群间代谢酶与代谢途径互补,可减少中间产物的积累效应,且污染物易矿化完全[16-18],从而使得复合菌系统具有降解效率高、抗冲击能力强、可实现多元污染物共处理等优势[19-20]。因此,可研究复合菌系统降解苯的菌落结构及降解条件,为苯的生物法处理提供参考。

    在有氧情况下,好氧菌对苯系物代谢途径一般为,先在氧分子及加氧酶的作用下形成邻苯二酚或其衍生物的代谢中间体,然后在过氧分子及开环酶的作用下进行邻位切割或间位切割,使其形成直链分子,最后再进入三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环[21]。在降解较复杂化合物时,中间代谢产物容易积累,降低反应速率且易对微生物造成毒害[14-15]。本研究拟通过筛选出高效苯降解优势菌,考察其最佳苯降解条件,探究其降解能力与代谢途径,以配制人工复合菌剂,并研究复合菌剂对活性污泥以及本实验室设计的泡沫生物洗涤反应器的影响,达到缩短反应器启动时间、提高去除效率、优化运行参数等目的,以期为人工复合菌剂强化生物洗涤法处理含苯废气提供参考。

    • 1)固体培养基:蛋白胨10 g·L−1,牛肉膏3 g·L−1,氯化钠5 g·L−1,琼脂17 g·L−1,用5 mol·L−1 NaOH调pH为7.0。2)液体培养基:蛋白胨10 g·L−1,酵母提取物5 g·L−1,氯化钠10 g·L−1,用5 mol·L−1 NaOH调pH为7.0。3)液体无机盐培养基:(NH4)2SO4 1 g·L−1,K2HPO4 3.2 g·L−1,KH2PO4 0.4 g·L−1,MgSO4 0.2 g·L−1,NaCl 0.1 g·L−1,CaCl2 0.01 g·L−1,5 mol·L−1 NaOH调pH为7.0。4)营养液:尿素1 g·L−1,K2HPO4 3 g·L−1,CaCl2 5.5 g·L−1,MgSO4 4.5 g·L−1[22~25]

    • 采用处理含苯废气的生物洗涤塔内循环洗涤液作为菌种来源。生物洗涤塔运行条件:停留时间60~70 s、pH为6.8、气体流量为0.14 m3·h−1(气液比7∶1)。为从驯化污泥中筛选出功能细菌,以传代培养的方式进行菌群富集,取洗涤液200 mL加入装有营养液的1 L细口瓶中。以苯作为唯一碳源和能源进行驯化[26-27],苯的初始质量浓度为10 mg·L−1。在37℃的振荡培养箱中保存,以一定时间间隔取样,当苯的质量浓度降至起始质量浓度的50%以下时,进行下一代培养。同时,加大苯的初始质量浓度直至100 mg·L−1。富集后分别将驯化中的菌液稀释涂布在无机盐固体培养基中,获取单菌落后进行分离,以平板划线法对单菌落进行纯化。在无菌环境下,挑取试管中的一种菌接种到装有无机盐培养基的锥形瓶内,将接种好的锥形瓶塞好无菌棉,放在温度为30 ℃、转速120 r·min−1的条件下进行培养。当一种菌接种完毕后,进行下一个菌种的接种实验。重复以上操作直至所有菌种接种完毕。菌种富集、分离与纯化步骤较多,细节参考文献[25,28-29]。

    • 1)形态学鉴定。菌株采用革兰氏染色后,利用显微镜进行形态观察。

      2)分子生物学鉴定[29-30]。分别对100 mL液体培养基接种,接种量2%,置于30℃、转速150 r·min−1的恒温培养箱中培养至对数期,取4 mL菌液于离心管中,置于转速1 000 r·min−1的离心机中离心10 min,移去上层清液,留下菌体于−80℃冰箱中冷冻保存。每种细菌样本均有3个平行样。最后交由上海美吉生物医药科技有限公司进行菌种鉴定。

      以菌株细胞基因组DNA为模板扩增16SrDNA。扩增采用细菌通用引物,PCR反应体系(20 μL)为:10 × Taq buffer 2.0 μL,5U Ex Taq 0.2 μL,2.5 mmol·L−1 dNTP Mix 1.6 μL,5P Primer1 1 μL,5P Primer2 1 μL,DNA 0.5 μL,ddH2O 13.7 μL。PCR 反应条件为:95℃预变性5 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min 30 s;第2步25次循环;72℃延伸10 min;4 ℃保存。在美国国立生物技术信息中心(nationalcenter for biotechnology information,NCBI)上通过使用BLAST (N)同源比对分析,并利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

    • 气相中苯的浓度通过气相色谱-质谱(GC-MS)(7890B-5977 Agilent Technologies,US)进行浓度测定和产物定性分析。色谱柱型号规格HP-5MS(15 m length,0.250 mm ID)。色谱条件:样品进口温度为200°C;载气为氦气;分流比为5:1;柱流速(恒流模式)为1.2 mL·min−1;升温程序为初始温度30°C,保持3.2 min,以11°C·min−1升至200°C保持3 min。质谱条件:扫描模式为全扫描;扫描范围为35~270 amu;电离能为70 eV;界面温度为280°C。用微量进样器取样,进样量为0.1 mL。

    • 为明确菌株降解苯能力,利用摇瓶实验法[31]考察在有无表面活性剂皂角苷促进下菌株对苯的降解能力。部分表面活性剂在适宜浓度下对憎水污染物苯增溶的同时与之共降解,会大大促进微生物对苯的利用[32]。本研究选择表面活性剂为来自植物且环境友好的非离子表面活性剂皂角苷[33~35]。调节液体无机盐培养基在600 nm下的吸光度为0,分别接种纯菌液使之吸光度均为0.015,从而制备成菌悬液。取5%(体积分数,下同)的菌悬液、定量的液体无机盐培养基、0.5 mL苯、50 mg·L−1皂角苷于250 mL的血清瓶中,使反应体系保持在100 mL,记为体系1。体系2的制备过程与体系1类似,但菌悬液内无皂角苷的添加。血清瓶采用塑料盖和橡胶塞双重密封(下同),然后放入温度为30℃、转速150 r·min−1的恒温培养箱中,每隔2 h用微量进样器从瓶口橡胶塞穿刺取得顶空气体样品进行检测。每个时间点重复3次取平均值。

    • 采用正交实验探究菌株Bacillus sp. W降解苯的最佳条件,阐明皂角苷添加量、pH、苯质量浓度对菌株Bacillus sp. W生长的影响。设计3因素(皂角苷添加量、pH及苯浓度) 4水平正交实验,均在250 mL的血清瓶中进行。实验因素与水平设计见表1,步骤为分先后加入30 mL菌悬液、70 mL液体无机盐培养基,测定不同条件下Bacillus sp. W对苯的去除效率,均重复3次取平均值。

    • 移取10%的菌悬液接种于盛有无机盐培养基的血清瓶中,按正交实验设置调节无机盐培养基pH为7,起始苯质量浓度为50 mg·L−1,皂角苷添加量为75 mg·L−1后,置于30℃、摇床转速150 r·min−1的恒温培养箱中振荡培养。定时取适量菌液至比色皿中,以蒸馏水为空白对照利用UV1102型分光光度计测定测其OD600,每个时间点重复测定3次取平均值。

    • 采用丁香醛连氮(SGZ)为底物定时监测菌液漆酶活性[36],3 mL底物的反应体系中含1 mL的菌株漆酶悬液,1 mL的0.1 mol·L−1柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 7.0),1 mL的0.1 mmol·L−1 的SGZ,于30 ℃下反应3 min后在525 nm处测定吸光值。以1 min内催化氧化1 μmol底物所需的酶量为1个酶活单位(U),每20 h检测1次,每次检测均设3次重复取平均值。

    • 以文献[37-38]中对苯系物代谢产物的研究为基础,将5%的Bacillus sp. W菌悬液分别接种于以苯、苯酚、邻苯二酚为唯一碳源的250 mL密封血清瓶内的液体无机盐培养基中,并设置以邻苯二酚为唯一碳源但添加浓度为1.0 mmol·L−1的漆酶抑制剂半胱氨酸[36]同体系对照组。通过固相萃取(SPE)和GC-MS测定发酵液中的代谢产物,每种发酵菌液均有3个平行样。固相萃取方法:用5 mL二氯甲烷活化C18SPE柱(Waters,US),弃去流出物,然后通过5 mL甲醇和5 mL超纯水。在柱清空之前,连接200 mL样品储存装置并以5 mL·min−1的泵送速度过滤。泵出所有水样后,用5 mL超纯水清洗柱床,干燥后用10 mL二氯甲烷洗脱。将洗脱液氮吹浓缩至1 mL,取1 μL用于GC-MS分析。色谱条件:样品入口温度为250℃;载气为氦气;分流比为10:1;柱流速(恒流模式)为1.0 mL·min−1。加热程序:初始温度40℃,保持2 min,以4℃·min−1升温至120℃保持3 min,然后以10℃·min−1升温至230℃,并保持5 min。质谱条件:扫描模式为全扫描;扫描范围为35~300 amu;电离能为70 eV;界面温度为280℃。用微量进样器取样,进样量为1 μL。

    • 将前期纯化培养得到的纯菌Kocuria rosea sp. R、Bacillus sp. W及Arthrobacter sp. Y分别接种至无机盐培养基中,置于30℃、转速150 r·min−1的恒温培养箱中培养至对数期,获得菌种菌悬液。将优势菌种Kocuria rosea sp. R、Bacillus sp. W及Arthrobacter sp. Y的菌悬液以体积比1:2:1配制复合菌剂。活性污泥取自石家庄某药厂污水处理站,混合液悬浮物浓度(MLSS)为3 500 mg·L−1。活性污泥中投加10%的复合菌剂(即1 L)作为实验组,对照组为未添加复合菌剂的活性污泥。总反应体系为10 L,控制液相中皂角苷为50 mg·L−1,苯质量浓度为300~500 mg·L−1。将配好含复合菌剂的活性污泥加入到驯化初期的生物洗涤反应器中,每24 h测定液相苯质量浓度,运行22 d,并观察苯的去除效率。将复合菌剂接种至本实验室设计的泡沫生物洗涤反应器[39]中,在含苯废气质量浓度为13 000 mg·m−3、MLSS约3 300 mg·L−1、泡沫层高40 cm、废气体积流量为0.39 m3·h−1、回淋比为1.5、pH 6.5~7.0、皂角苷质量浓度不低于40.40 mg·L−1的条件下长期运行。计算苯去除率、MLSS和液相中苯质量浓度,均重复3次取平均值。期间每2 d用等体积营养液(1 L)置换体系内上清液。

    • 经4次富集筛选得到8株苯降解菌株,根据观察其相对丰度大小及对降解能力进行检测,复筛出3株高效苯降解优势菌株R、W和Y。R、W和Y革兰氏染色均为阳性,如800倍镜检图1所示。菌株R在固体培养基上菌落呈粉红色,边缘整齐凸起呈圆形,表面湿润、不透明、无褶皱、无绒毛、质地粘稠;光学显微镜观察发现为球形菌体。菌株W在固体培养基上菌落呈灰白色,近似圆形,表面较粗糙呈毛玻璃状,其边缘向四周不规则扩散,质地较软;镜检发现其为首尾联结成链的杆菌。菌株Y在固体平板培养后可见黄色圆形、中间凸起、边缘规则不向四周扩散、表面光滑、不透明、无皱褶、无绒毛、质地粘稠的菌落;镜检发现,其细胞呈不规则米粒状,相互黏连成堆。

      根据16S rDNA 序列比对结果和细菌的系统发育树(图2)发现,筛选出的3株高效苯降解优势菌R、W和Y分别属玫瑰色考克氏菌属 (Kocuria rosea sp.)、芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.),BLAST (N)同源比对分析同源性分别达到98 %、99 % 和98 %。优势菌R、W、Y分别命名为Kocuria rosea sp. R、Bacillus sp. W以及Arthrobacter sp. Y。

    • 生物降解过程为单反应物反应体系,拟定选用一级动力学模型进行降解动力学研究[23,40],一级动力学方程为式(1)。

      式中:t表示时间,h;c0表示初始底物的质量浓度,mg·L−1ct表示时间t时的底物质量浓度,mg·L−1

      根据ln(ctc0)和时间t的斜率可求出k值。原始基质浓度减低到二分之一所花费的时间称为半衰期[41]。半衰期(t1/2)见式(2)。

      菌株Kocuria rosea sp. R、菌株Bacillus sp. W及菌株Arthrobacter sp. Y分别在体系1与体系2(即添加50 mg·L−1皂角苷与不添加皂角苷)苯降解的一级动力学拟合结果如图3,其拟合方程见表2

      半衰期越短,比降解速率K(绝对值)就越大,故菌株降解速率也就越快,其降解能力越强。Bacillus sp. W在2个体系中半衰期均最短,且比降解速率K(绝对值)最大,因此,其对苯的降解能力最强,其次是Kocuria rosea sp. R与Arthrobacter sp. Y。质量浓度为50 mg·L−1的皂角苷对Kocuria rosea sp. R和Bacillus sp. W的苯降解有明显促进作用;而Arthrobacter sp. Y在2种条件下拟合曲线斜率相差不大,半衰期变化也较小,故50 mg·L−1皂角苷对其苯降解能力的影响较弱。无论有无皂角苷,Bacillus sp. W对苯的降解能力均为最优,故认定Bacillus sp. W为研究目标进行最佳降解条件、生长特点及代谢途径等的研究。当皂角苷存在时,对 Kocuria rosea sp. R、Bacillus sp. W降解苯有明显促进作用,然而对Arthrobacter sp. Y的促进作用不明显。由于不同菌种中降解酶存在不同代谢通路,且降解通路种类多样,因此,推测这是由于皂角苷与苯共代谢时不同菌株间代谢通路的差异所致[42]

    • 以皂角苷添加量、pH、苯浓度3个因素作为自变量,苯去除率为因变量进行正交实验优化分析,根据单因素实验结果确定水平范围,因素水平实验设计及正交实验结果见表3。根据均值分析得Bacillus sp. W的最佳苯降解条件为:pH 为7,起始苯质量浓度为50 mg·L−1,皂角苷添加量为75 mg·L−1。根据极差分析各因素影响强度依次为:pH>苯浓度>皂角苷添加量。

    • Bacillus sp. W生长曲线见图4。接种后0~3 h内增殖缓慢,此时为Bacillus sp. W的停滞期。3 h后OD600 迅速上升,进入对数生长期;在70~132 h时,曲线平缓趋于一条直线,处于稳定期。由此说明,该条件下Bacillus sp. W滞期较短,很快进入对数期,且稳定期较长。漆酶活性随着生长曲线趋势先上升后下降,在对数增长中后期达最高,为490.21 U·L−1

      漆酶对于酚类和芳香胺类等多种有机化合物具有较好催化氧化性能[43-44],具有较高酶活。其中,真菌漆酶的活性要高于细菌漆酶,但真菌漆酶对反应条件较为苛刻,而细菌漆酶稳定性更好,适用于实际工业生产环境中。通过研究漆酶活性,为考察菌株应用潜力,以推动细菌漆酶的工业化应用提供参考[29,45]

      本研究中芽孢杆菌Bacillus sp. W产生的漆酶应为芽孢漆酶,其活性在对数增长期的中后期达最高,为490.21 U·L−1。此时菌的增长速率减缓,芽孢大量产生又未完全休眠,而是利用苯生长,故此时漆酶活性最强。在稳定期,形成的芽孢大部分进入休眠,故漆酶活性明显降低。芽孢的产生并非仅仅是芽孢杆菌为应对逆境所产生的休眠体,也是其生命周期的一部分,可通过介体强化、酶固定化等手段有效诱导并高效利用芽孢漆酶[46-47]。目前,对于芽孢杆菌(Bacillus sp.)降解苯的研究很少,KUREEL等[28]从石油污染土壤中分离纯化出芽孢杆菌(Bacillus sp.),在pH为7、温度为37 oC及接种量为6.0×108 CFU·mL−1时,苯最高去除率达到90%,其中苯酚、1,2苯二醇、对苯二酚和苯甲酸盐作为代谢物存在。LIU等[48]从多种微生物菌株中筛选出6种芽孢杆菌属的分离株,并将其进行组合,发现分离株的所有组合均具备苯降解能力。芽孢杆菌对石油、烷基酚、苯并(a)芘,以及蒽和萘等多环芳烃[49-52]具有突出的降解能力。芽孢杆菌在工业、农业及医学等领域都有十分广泛的应用与研究价值[53-55]。芽孢杆菌是多种新型酶的来源,也是复杂底物生物加工的理想候选者[56]。芽孢杆菌分泌的芽孢漆酶比真菌漆酶的催化活性与稳定性更好,更具工业化前景[57-58]

    • Bacillus sp. W在pH为7、苯的质量浓度为50 mg·L−1的降解条件下,得到相关代谢产物如图5,其中以甲氧基取代酚(3, 4-二羟基-5-甲氧基苯甲醛、2-甲氧基苯酚)与苯酚聚合物(2-苯氧基苯酚)为主,另有呋喃衍生物(5, 5-二甲基-2(5H)-呋喃酮、2, 5-二氢-2, 2, 4-三甲基-呋喃)与开环后直连化合物(乙酸异丁酯、2-羟基-2-甲基-甲酯丁酸)。

      苯系物的好氧代谢途径共同点是在加氧酶等作用下形成邻苯二酚或其衍生物,通过裂解酶再进一步开环[59]。而在漆酶等催化下,苯将进入不同代谢通路。陈明等[60]研究了漆酶催化下邻苯二酚的氧化与转化,半醌自由基是邻苯二酚在催化反应中的初始氧化产物,随后主要途径有2种:1)发生分子间加成,产生二聚体和三聚体;2)分子内加成,产生呋喃衍生物。漆酶是一种多功能酶,能氧化多种芳香族和非芳香族化合物,如多酚、芳基二胺、苯胺、甲氧基取代酚、有机/无机金属化合物等[61]。另有研究表明,漆酶可催化难溶降解酚类污染物,从而促进酚类和二元胺的甲氧基取代;且在漆酶介导的催化作用下可产生多种酚类聚合物[62]。发现的一些呋喃衍生物,如2, 5-二氢-2, 2 ,4-三甲基-呋喃、5, 5-二甲基-2(5H)-呋喃酮等,为Bacillus sp. W经上述途径1)在分子内加成的产物。2-苯氧基苯酚等则是通过上述途径2)产生的二聚体。这些代谢产物再经一系列下游酶的代谢作用成为小分子。

      Bacillus sp. W通过加氧酶等将苯转化为邻苯二酚后,在其分泌的漆酶作用下,生成多种甲氧基取代物(2-甲氧基苯酚、3, 4-二羟基-5-甲氧基苯甲醛等)和酚类聚合物(2-苯氧基苯酚等)。为排除干扰,将底物苯换为其次级物质代谢产物邻苯二酚,仍检测出2-甲氧基苯酚;将底物苯换为其次级物质代谢产物苯酚,则检测得到邻苯二酚与2-甲氧基苯酚;当添加漆酶抑制剂半胱氨酸后三者(苯、邻苯二酚、苯酚),则均未检测到代谢中间产物2-甲氧基苯酚的存在。这表明漆酶可催化酚羟基邻位的甲氧基取代,生成2-甲氧基苯酚、3, 4-二羟基-5-甲氧基苯甲醛等甲氧基取代物。因此,推测Bacillus sp. W漆酶的降解途径如图5所示。

    • 添加复合菌剂可在短时间内大幅提升苯的去除率,相关对比效果如图6所示。在运行的第1天,添加菌剂实验组的苯去除效率明显比对照组高8.80%。实验组苯去除效率在第5天达到最高81.21%后逐步下降,渐近对照组。在第10天补加同剂量菌剂,苯去除效率在补加后攀升,于第5天达到峰值81.42%;随后稍见下降趋势并逐渐稳定在81.01%,与对照组重合。对照组的苯去除效率变化同常规驯化规律,活性污泥经短暂适应后对苯的去除效率缓慢上升,在运行22 d后达到81.12%。

      添加菌剂可使活性污泥提前17 d达到80%以上的苯去除效率,因此,本研究中人工配制的复合菌剂可在短时间内大幅提升活性污泥对苯的去除效率,但该菌剂不能在初期活性污泥群落中稳定维持,在第5天即呈衰退趋势,故合理补加菌剂即可保持其较高的苯去除效率。随着活性污泥驯化成熟,可不必再持续添加菌剂。因此,可将该菌剂用于活性污泥驯化初期以提升苯降解效率,并改善系统的抗冲击负荷能力,最终缩短反应器启动时间。体系中芳香族化合物等污染物是以微生物共代谢的方式降解[63]

      确定高效生物反应器中活性污泥的群落结构,能快速驯化污泥并缩短反应器启动时间。将复合菌剂接种至本实验室设计的泡沫生物洗涤反应器中[39](图7),实现了为期5 d的反应器快速启动。在液相中,前5 d内MLSS迅速增长,洗涤液中的苯质量浓度随之降低,稳定在约500 mg·L−1,去除率也稳定在99%以上。因此,通过接种拥有合理菌群结构的活性污泥,可实现反应器的快速启动,简便且经济。

    • 1)筛选出的株苯降解菌株,分别鉴定为玫瑰色考克氏菌属(Kocuria rosea sp. R)、芽孢杆菌属(Bacillus sp. W)和节杆菌属(Arthrobacter sp. Y);3种菌株对苯降解效果较好,其中Bacillus sp. W降解苯的能力最强,在皂角苷促进下半衰期为4.90 h。

      2)菌株Bacillus sp. W菌酶系丰富,是产芽孢漆酶的高效菌株,更具工业化前景。Bacillus sp. W苯降解最优条件为:pH 7、苯质量浓度50 mg·L−1、皂角苷添加量75 mg·L−1。菌群在约3 h可进入对数生长期,60 h后进入稳定期,漆酶酶活在对数增长中后期达最高,为490.21 U·L−1。分析Bacillus sp. W降解苯的代谢产物,明确其漆酶等降解苯的部分代谢途径,苯在加氧酶的作用下转化为邻苯二酚,漆酶可催化酚羟基邻位发生甲氧基取代,进而分子内加成为呋喃衍生物,再经一系列下游酶的作用降解成小分子。

      3)以3种菌株配置的复合菌剂可用于生物反应器驯化初期提升苯降解效率,增强抗冲击能力,缩短反应器启动时间。

    参考文献 (63)

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