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石油、化工、印刷、制药等工业生产会产生大量含芳香族化合物废气[1]。苯是一种芳香族化合物,是大气光化学污染的重要反应物,亦是臭氧和二次有机气溶胶(secondary organic aerosols,SOA)的关键前体物[2]。生物技术因其绿色安全、处理效果好、运行费用低、操作简单等优点,已成为近年来大气污染控制技术的研究热点[3-4]。相比于生物滴滤和生物过滤技术,生物洗涤技术具有压降小、驯化周期短、不易酸化、不易堵塞、高污染物负荷、抗负荷冲击能力强等优点[5-8]。生物洗涤器内含微生物的活性污泥对降解污染物起关键作用。将活性污泥驯化后可提升其降解能力,然而针对目标污染物的有效微生物比例和活性一般较低,缓慢的演替过程亦会导致反应器启动时间长、处理难降解物质的能力有限[9]。因此,筛选高效降解菌株,探究其降解能力、适宜条件及代谢途径十分重要。
目前,已发现Pseudomonas sp.,Rhodococcus sp.,Klebsiella sp.,Alcaligenes xylosoxidans Y234.和Pseudomonas putida.等菌株对苯具良好的降解能力[10-13]。然而,在单一苯降解高效菌株降解复杂疏水性化合物时,由于代谢途径单一、反应速率有限,积累的中间代谢产物易毒害微生物[14-15]。混合菌群内的不同种群间代谢酶与代谢途径互补,可减少中间产物的积累效应,且污染物易矿化完全[16-18],从而使得复合菌系统具有降解效率高、抗冲击能力强、可实现多元污染物共处理等优势[19-20]。因此,可研究复合菌系统降解苯的菌落结构及降解条件,为苯的生物法处理提供参考。
在有氧情况下,好氧菌对苯系物代谢途径一般为,先在氧分子及加氧酶的作用下形成邻苯二酚或其衍生物的代谢中间体,然后在过氧分子及开环酶的作用下进行邻位切割或间位切割,使其形成直链分子,最后再进入三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环[21]。在降解较复杂化合物时,中间代谢产物容易积累,降低反应速率且易对微生物造成毒害[14-15]。本研究拟通过筛选出高效苯降解优势菌,考察其最佳苯降解条件,探究其降解能力与代谢途径,以配制人工复合菌剂,并研究复合菌剂对活性污泥以及本实验室设计的泡沫生物洗涤反应器的影响,达到缩短反应器启动时间、提高去除效率、优化运行参数等目的,以期为人工复合菌剂强化生物洗涤法处理含苯废气提供参考。
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1)固体培养基:蛋白胨10 g·L−1,牛肉膏3 g·L−1,氯化钠5 g·L−1,琼脂17 g·L−1,用5 mol·L−1 NaOH调pH为7.0。2)液体培养基:蛋白胨10 g·L−1,酵母提取物5 g·L−1,氯化钠10 g·L−1,用5 mol·L−1 NaOH调pH为7.0。3)液体无机盐培养基:(NH4)2SO4 1 g·L−1,K2HPO4 3.2 g·L−1,KH2PO4 0.4 g·L−1,MgSO4 0.2 g·L−1,NaCl 0.1 g·L−1,CaCl2 0.01 g·L−1,5 mol·L−1 NaOH调pH为7.0。4)营养液:尿素1 g·L−1,K2HPO4 3 g·L−1,CaCl2 5.5 g·L−1,MgSO4 4.5 g·L−1[22~25]。
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采用处理含苯废气的生物洗涤塔内循环洗涤液作为菌种来源。生物洗涤塔运行条件:停留时间60~70 s、pH为6.8、气体流量为0.14 m3·h−1(气液比7∶1)。为从驯化污泥中筛选出功能细菌,以传代培养的方式进行菌群富集,取洗涤液200 mL加入装有营养液的1 L细口瓶中。以苯作为唯一碳源和能源进行驯化[26-27],苯的初始质量浓度为10 mg·L−1。在37℃的振荡培养箱中保存,以一定时间间隔取样,当苯的质量浓度降至起始质量浓度的50%以下时,进行下一代培养。同时,加大苯的初始质量浓度直至100 mg·L−1。富集后分别将驯化中的菌液稀释涂布在无机盐固体培养基中,获取单菌落后进行分离,以平板划线法对单菌落进行纯化。在无菌环境下,挑取试管中的一种菌接种到装有无机盐培养基的锥形瓶内,将接种好的锥形瓶塞好无菌棉,放在温度为30 ℃、转速120 r·min−1的条件下进行培养。当一种菌接种完毕后,进行下一个菌种的接种实验。重复以上操作直至所有菌种接种完毕。菌种富集、分离与纯化步骤较多,细节参考文献[25,28-29]。
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1)形态学鉴定。菌株采用革兰氏染色后,利用显微镜进行形态观察。
2)分子生物学鉴定[29-30]。分别对100 mL液体培养基接种,接种量2%,置于30℃、转速150 r·min−1的恒温培养箱中培养至对数期,取4 mL菌液于离心管中,置于转速1 000 r·min−1的离心机中离心10 min,移去上层清液,留下菌体于−80℃冰箱中冷冻保存。每种细菌样本均有3个平行样。最后交由上海美吉生物医药科技有限公司进行菌种鉴定。
以菌株细胞基因组DNA为模板扩增16SrDNA。扩增采用细菌通用引物,PCR反应体系(20 μL)为:10 × Taq buffer 2.0 μL,5U Ex Taq 0.2 μL,2.5 mmol·L−1 dNTP Mix 1.6 μL,5P Primer1 1 μL,5P Primer2 1 μL,DNA 0.5 μL,ddH2O 13.7 μL。PCR 反应条件为:95℃预变性5 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min 30 s;第2步25次循环;72℃延伸10 min;4 ℃保存。在美国国立生物技术信息中心(nationalcenter for biotechnology information,NCBI)上通过使用BLAST (N)同源比对分析,并利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。
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气相中苯的浓度通过气相色谱-质谱(GC-MS)(7890B-5977 Agilent Technologies,US)进行浓度测定和产物定性分析。色谱柱型号规格HP-5MS(15 m length,0.250 mm ID)。色谱条件:样品进口温度为200°C;载气为氦气;分流比为5:1;柱流速(恒流模式)为1.2 mL·min−1;升温程序为初始温度30°C,保持3.2 min,以11°C·min−1升至200°C保持3 min。质谱条件:扫描模式为全扫描;扫描范围为35~270 amu;电离能为70 eV;界面温度为280°C。用微量进样器取样,进样量为0.1 mL。
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为明确菌株降解苯能力,利用摇瓶实验法[31]考察在有无表面活性剂皂角苷促进下菌株对苯的降解能力。部分表面活性剂在适宜浓度下对憎水污染物苯增溶的同时与之共降解,会大大促进微生物对苯的利用[32]。本研究选择表面活性剂为来自植物且环境友好的非离子表面活性剂皂角苷[33~35]。调节液体无机盐培养基在600 nm下的吸光度为0,分别接种纯菌液使之吸光度均为0.015,从而制备成菌悬液。取5%(体积分数,下同)的菌悬液、定量的液体无机盐培养基、0.5 mL苯、50 mg·L−1皂角苷于250 mL的血清瓶中,使反应体系保持在100 mL,记为体系1。体系2的制备过程与体系1类似,但菌悬液内无皂角苷的添加。血清瓶采用塑料盖和橡胶塞双重密封(下同),然后放入温度为30℃、转速150 r·min−1的恒温培养箱中,每隔2 h用微量进样器从瓶口橡胶塞穿刺取得顶空气体样品进行检测。每个时间点重复3次取平均值。
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采用正交实验探究菌株Bacillus sp. W降解苯的最佳条件,阐明皂角苷添加量、pH、苯质量浓度对菌株Bacillus sp. W生长的影响。设计3因素(皂角苷添加量、pH及苯浓度) 4水平正交实验,均在250 mL的血清瓶中进行。实验因素与水平设计见表1,步骤为分先后加入30 mL菌悬液、70 mL液体无机盐培养基,测定不同条件下Bacillus sp. W对苯的去除效率,均重复3次取平均值。
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移取10%的菌悬液接种于盛有无机盐培养基的血清瓶中,按正交实验设置调节无机盐培养基pH为7,起始苯质量浓度为50 mg·L−1,皂角苷添加量为75 mg·L−1后,置于30℃、摇床转速150 r·min−1的恒温培养箱中振荡培养。定时取适量菌液至比色皿中,以蒸馏水为空白对照利用UV1102型分光光度计测定测其OD600,每个时间点重复测定3次取平均值。
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采用丁香醛连氮(SGZ)为底物定时监测菌液漆酶活性[36],3 mL底物的反应体系中含1 mL的菌株漆酶悬液,1 mL的0.1 mol·L−1柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 7.0),1 mL的0.1 mmol·L−1 的SGZ,于30 ℃下反应3 min后在525 nm处测定吸光值。以1 min内催化氧化1 μmol底物所需的酶量为1个酶活单位(U),每20 h检测1次,每次检测均设3次重复取平均值。
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以文献[37-38]中对苯系物代谢产物的研究为基础,将5%的Bacillus sp. W菌悬液分别接种于以苯、苯酚、邻苯二酚为唯一碳源的250 mL密封血清瓶内的液体无机盐培养基中,并设置以邻苯二酚为唯一碳源但添加浓度为1.0 mmol·L−1的漆酶抑制剂半胱氨酸[36]同体系对照组。通过固相萃取(SPE)和GC-MS测定发酵液中的代谢产物,每种发酵菌液均有3个平行样。固相萃取方法:用5 mL二氯甲烷活化C18SPE柱(Waters,US),弃去流出物,然后通过5 mL甲醇和5 mL超纯水。在柱清空之前,连接200 mL样品储存装置并以5 mL·min−1的泵送速度过滤。泵出所有水样后,用5 mL超纯水清洗柱床,干燥后用10 mL二氯甲烷洗脱。将洗脱液氮吹浓缩至1 mL,取1 μL用于GC-MS分析。色谱条件:样品入口温度为250℃;载气为氦气;分流比为10:1;柱流速(恒流模式)为1.0 mL·min−1。加热程序:初始温度40℃,保持2 min,以4℃·min−1升温至120℃保持3 min,然后以10℃·min−1升温至230℃,并保持5 min。质谱条件:扫描模式为全扫描;扫描范围为35~300 amu;电离能为70 eV;界面温度为280℃。用微量进样器取样,进样量为1 μL。
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将前期纯化培养得到的纯菌Kocuria rosea sp. R、Bacillus sp. W及Arthrobacter sp. Y分别接种至无机盐培养基中,置于30℃、转速150 r·min−1的恒温培养箱中培养至对数期,获得菌种菌悬液。将优势菌种Kocuria rosea sp. R、Bacillus sp. W及Arthrobacter sp. Y的菌悬液以体积比1:2:1配制复合菌剂。活性污泥取自石家庄某药厂污水处理站,混合液悬浮物浓度(MLSS)为3 500 mg·L−1。活性污泥中投加10%的复合菌剂(即1 L)作为实验组,对照组为未添加复合菌剂的活性污泥。总反应体系为10 L,控制液相中皂角苷为50 mg·L−1,苯质量浓度为300~500 mg·L−1。将配好含复合菌剂的活性污泥加入到驯化初期的生物洗涤反应器中,每24 h测定液相苯质量浓度,运行22 d,并观察苯的去除效率。将复合菌剂接种至本实验室设计的泡沫生物洗涤反应器[39]中,在含苯废气质量浓度为13 000 mg·m−3、MLSS约3 300 mg·L−1、泡沫层高40 cm、废气体积流量为0.39 m3·h−1、回淋比为1.5、pH 6.5~7.0、皂角苷质量浓度不低于40.40 mg·L−1的条件下长期运行。计算苯去除率、MLSS和液相中苯质量浓度,均重复3次取平均值。期间每2 d用等体积营养液(1 L)置换体系内上清液。
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经4次富集筛选得到8株苯降解菌株,根据观察其相对丰度大小及对降解能力进行检测,复筛出3株高效苯降解优势菌株R、W和Y。R、W和Y革兰氏染色均为阳性,如800倍镜检图1所示。菌株R在固体培养基上菌落呈粉红色,边缘整齐凸起呈圆形,表面湿润、不透明、无褶皱、无绒毛、质地粘稠;光学显微镜观察发现为球形菌体。菌株W在固体培养基上菌落呈灰白色,近似圆形,表面较粗糙呈毛玻璃状,其边缘向四周不规则扩散,质地较软;镜检发现其为首尾联结成链的杆菌。菌株Y在固体平板培养后可见黄色圆形、中间凸起、边缘规则不向四周扩散、表面光滑、不透明、无皱褶、无绒毛、质地粘稠的菌落;镜检发现,其细胞呈不规则米粒状,相互黏连成堆。
根据16S rDNA 序列比对结果和细菌的系统发育树(图2)发现,筛选出的3株高效苯降解优势菌R、W和Y分别属玫瑰色考克氏菌属 (Kocuria rosea sp.)、芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.),BLAST (N)同源比对分析同源性分别达到98 %、99 % 和98 %。优势菌R、W、Y分别命名为Kocuria rosea sp. R、Bacillus sp. W以及Arthrobacter sp. Y。
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生物降解过程为单反应物反应体系,拟定选用一级动力学模型进行降解动力学研究[23,40],一级动力学方程为式(1)。
式中:t表示时间,h;c0表示初始底物的质量浓度,mg·L−1;ct表示时间t时的底物质量浓度,mg·L−1。
根据
ln(ctc0) 和时间t的斜率可求出k值。原始基质浓度减低到二分之一所花费的时间称为半衰期[41]。半衰期(t1/2)见式(2)。菌株Kocuria rosea sp. R、菌株Bacillus sp. W及菌株Arthrobacter sp. Y分别在体系1与体系2(即添加50 mg·L−1皂角苷与不添加皂角苷)苯降解的一级动力学拟合结果如图3,其拟合方程见表2。
半衰期越短,比降解速率K(绝对值)就越大,故菌株降解速率也就越快,其降解能力越强。Bacillus sp. W在2个体系中半衰期均最短,且比降解速率K(绝对值)最大,因此,其对苯的降解能力最强,其次是Kocuria rosea sp. R与Arthrobacter sp. Y。质量浓度为50 mg·L−1的皂角苷对Kocuria rosea sp. R和Bacillus sp. W的苯降解有明显促进作用;而Arthrobacter sp. Y在2种条件下拟合曲线斜率相差不大,半衰期变化也较小,故50 mg·L−1皂角苷对其苯降解能力的影响较弱。无论有无皂角苷,Bacillus sp. W对苯的降解能力均为最优,故认定Bacillus sp. W为研究目标进行最佳降解条件、生长特点及代谢途径等的研究。当皂角苷存在时,对 Kocuria rosea sp. R、Bacillus sp. W降解苯有明显促进作用,然而对Arthrobacter sp. Y的促进作用不明显。由于不同菌种中降解酶存在不同代谢通路,且降解通路种类多样,因此,推测这是由于皂角苷与苯共代谢时不同菌株间代谢通路的差异所致[42]。
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以皂角苷添加量、pH、苯浓度3个因素作为自变量,苯去除率为因变量进行正交实验优化分析,根据单因素实验结果确定水平范围,因素水平实验设计及正交实验结果见表3。根据均值分析得Bacillus sp. W的最佳苯降解条件为:pH 为7,起始苯质量浓度为50 mg·L−1,皂角苷添加量为75 mg·L−1。根据极差分析各因素影响强度依次为:pH>苯浓度>皂角苷添加量。
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Bacillus sp. W生长曲线见图4。接种后0~3 h内增殖缓慢,此时为Bacillus sp. W的停滞期。3 h后OD600 迅速上升,进入对数生长期;在70~132 h时,曲线平缓趋于一条直线,处于稳定期。由此说明,该条件下Bacillus sp. W滞期较短,很快进入对数期,且稳定期较长。漆酶活性随着生长曲线趋势先上升后下降,在对数增长中后期达最高,为490.21 U·L−1。
漆酶对于酚类和芳香胺类等多种有机化合物具有较好催化氧化性能[43-44],具有较高酶活。其中,真菌漆酶的活性要高于细菌漆酶,但真菌漆酶对反应条件较为苛刻,而细菌漆酶稳定性更好,适用于实际工业生产环境中。通过研究漆酶活性,为考察菌株应用潜力,以推动细菌漆酶的工业化应用提供参考[29,45]。
本研究中芽孢杆菌Bacillus sp. W产生的漆酶应为芽孢漆酶,其活性在对数增长期的中后期达最高,为490.21 U·L−1。此时菌的增长速率减缓,芽孢大量产生又未完全休眠,而是利用苯生长,故此时漆酶活性最强。在稳定期,形成的芽孢大部分进入休眠,故漆酶活性明显降低。芽孢的产生并非仅仅是芽孢杆菌为应对逆境所产生的休眠体,也是其生命周期的一部分,可通过介体强化、酶固定化等手段有效诱导并高效利用芽孢漆酶[46-47]。目前,对于芽孢杆菌(Bacillus sp.)降解苯的研究很少,KUREEL等[28]从石油污染土壤中分离纯化出芽孢杆菌(Bacillus sp.),在pH为7、温度为37 oC及接种量为6.0×108 CFU·mL−1时,苯最高去除率达到90%,其中苯酚、1,2苯二醇、对苯二酚和苯甲酸盐作为代谢物存在。LIU等[48]从多种微生物菌株中筛选出6种芽孢杆菌属的分离株,并将其进行组合,发现分离株的所有组合均具备苯降解能力。芽孢杆菌对石油、烷基酚、苯并(a)芘,以及蒽和萘等多环芳烃[49-52]具有突出的降解能力。芽孢杆菌在工业、农业及医学等领域都有十分广泛的应用与研究价值[53-55]。芽孢杆菌是多种新型酶的来源,也是复杂底物生物加工的理想候选者[56]。芽孢杆菌分泌的芽孢漆酶比真菌漆酶的催化活性与稳定性更好,更具工业化前景[57-58]。
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Bacillus sp. W在pH为7、苯的质量浓度为50 mg·L−1的降解条件下,得到相关代谢产物如图5,其中以甲氧基取代酚(3, 4-二羟基-5-甲氧基苯甲醛、2-甲氧基苯酚)与苯酚聚合物(2-苯氧基苯酚)为主,另有呋喃衍生物(5, 5-二甲基-2(5H)-呋喃酮、2, 5-二氢-2, 2, 4-三甲基-呋喃)与开环后直连化合物(乙酸异丁酯、2-羟基-2-甲基-甲酯丁酸)。
苯系物的好氧代谢途径共同点是在加氧酶等作用下形成邻苯二酚或其衍生物,通过裂解酶再进一步开环[59]。而在漆酶等催化下,苯将进入不同代谢通路。陈明等[60]研究了漆酶催化下邻苯二酚的氧化与转化,半醌自由基是邻苯二酚在催化反应中的初始氧化产物,随后主要途径有2种:1)发生分子间加成,产生二聚体和三聚体;2)分子内加成,产生呋喃衍生物。漆酶是一种多功能酶,能氧化多种芳香族和非芳香族化合物,如多酚、芳基二胺、苯胺、甲氧基取代酚、有机/无机金属化合物等[61]。另有研究表明,漆酶可催化难溶降解酚类污染物,从而促进酚类和二元胺的甲氧基取代;且在漆酶介导的催化作用下可产生多种酚类聚合物[62]。发现的一些呋喃衍生物,如2, 5-二氢-2, 2 ,4-三甲基-呋喃、5, 5-二甲基-2(5H)-呋喃酮等,为Bacillus sp. W经上述途径1)在分子内加成的产物。2-苯氧基苯酚等则是通过上述途径2)产生的二聚体。这些代谢产物再经一系列下游酶的代谢作用成为小分子。
Bacillus sp. W通过加氧酶等将苯转化为邻苯二酚后,在其分泌的漆酶作用下,生成多种甲氧基取代物(2-甲氧基苯酚、3, 4-二羟基-5-甲氧基苯甲醛等)和酚类聚合物(2-苯氧基苯酚等)。为排除干扰,将底物苯换为其次级物质代谢产物邻苯二酚,仍检测出2-甲氧基苯酚;将底物苯换为其次级物质代谢产物苯酚,则检测得到邻苯二酚与2-甲氧基苯酚;当添加漆酶抑制剂半胱氨酸后三者(苯、邻苯二酚、苯酚),则均未检测到代谢中间产物2-甲氧基苯酚的存在。这表明漆酶可催化酚羟基邻位的甲氧基取代,生成2-甲氧基苯酚、3, 4-二羟基-5-甲氧基苯甲醛等甲氧基取代物。因此,推测Bacillus sp. W漆酶的降解途径如图5所示。
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添加复合菌剂可在短时间内大幅提升苯的去除率,相关对比效果如图6所示。在运行的第1天,添加菌剂实验组的苯去除效率明显比对照组高8.80%。实验组苯去除效率在第5天达到最高81.21%后逐步下降,渐近对照组。在第10天补加同剂量菌剂,苯去除效率在补加后攀升,于第5天达到峰值81.42%;随后稍见下降趋势并逐渐稳定在81.01%,与对照组重合。对照组的苯去除效率变化同常规驯化规律,活性污泥经短暂适应后对苯的去除效率缓慢上升,在运行22 d后达到81.12%。
添加菌剂可使活性污泥提前17 d达到80%以上的苯去除效率,因此,本研究中人工配制的复合菌剂可在短时间内大幅提升活性污泥对苯的去除效率,但该菌剂不能在初期活性污泥群落中稳定维持,在第5天即呈衰退趋势,故合理补加菌剂即可保持其较高的苯去除效率。随着活性污泥驯化成熟,可不必再持续添加菌剂。因此,可将该菌剂用于活性污泥驯化初期以提升苯降解效率,并改善系统的抗冲击负荷能力,最终缩短反应器启动时间。体系中芳香族化合物等污染物是以微生物共代谢的方式降解[63]。
确定高效生物反应器中活性污泥的群落结构,能快速驯化污泥并缩短反应器启动时间。将复合菌剂接种至本实验室设计的泡沫生物洗涤反应器中[39](图7),实现了为期5 d的反应器快速启动。在液相中,前5 d内MLSS迅速增长,洗涤液中的苯质量浓度随之降低,稳定在约500 mg·L−1,去除率也稳定在99%以上。因此,通过接种拥有合理菌群结构的活性污泥,可实现反应器的快速启动,简便且经济。
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1)筛选出的株苯降解菌株,分别鉴定为玫瑰色考克氏菌属(Kocuria rosea sp. R)、芽孢杆菌属(Bacillus sp. W)和节杆菌属(Arthrobacter sp. Y);3种菌株对苯降解效果较好,其中Bacillus sp. W降解苯的能力最强,在皂角苷促进下半衰期为4.90 h。
2)菌株Bacillus sp. W菌酶系丰富,是产芽孢漆酶的高效菌株,更具工业化前景。Bacillus sp. W苯降解最优条件为:pH 7、苯质量浓度50 mg·L−1、皂角苷添加量75 mg·L−1。菌群在约3 h可进入对数生长期,60 h后进入稳定期,漆酶酶活在对数增长中后期达最高,为490.21 U·L−1。分析Bacillus sp. W降解苯的代谢产物,明确其漆酶等降解苯的部分代谢途径,苯在加氧酶的作用下转化为邻苯二酚,漆酶可催化酚羟基邻位发生甲氧基取代,进而分子内加成为呋喃衍生物,再经一系列下游酶的作用降解成小分子。
3)以3种菌株配置的复合菌剂可用于生物反应器驯化初期提升苯降解效率,增强抗冲击能力,缩短反应器启动时间。
生物洗涤塔内产漆酶苯降解菌的分离鉴定及菌剂制备应用
Isolation, identification and preparation of laccase benzene degrading bacteria in biological scrubber tower
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摘要: 从生物洗涤塔内循环洗涤液中分离鉴定得到3株苯降解菌Kocuria rosea sp. R(玫瑰色考克氏菌属)、Bacillus sp. W(芽孢杆菌属),以及Arthrobacter sp. Y(节杆菌属),通过研究其苯降解动力学,确定苯降解优势菌为Bacillus sp. W,优化其降解条件并探究其代谢途径。结果表明,添加皂角苷可促进苯的生物降解,但根据不同细菌的代谢特点,其影响存在显著差异。在产漆酶菌Bacillus sp. W的降解下,苯的半衰期为8.08 h,而皂角苷与苯共代谢时,苯的半衰期缩短为4.90 h。在最优条件下,即pH为7、起始苯浓度为50 mg·L−1、皂角苷添加量为75 mg·L−1,Bacillus sp. W的漆酶酶活最高为490.21 U·L−1。在漆酶等参与下苯存在独特苯降解通路,苯在加氧酶作用下转化为邻苯二酚,漆酶可催化酚羟基邻位发生甲氧基取代,进而分子内加成为呋喃衍生物,再经一系列下游酶的作用降解成小分子。在生物反应器中添加由分离得到3株菌株复合而成的菌剂,苯去除效率在第5 d达最高81.21%,比常规驯化活性污泥提前了17 d,还增强了反应器的抗冲击能力。将菌剂接种到实验室的泡沫生物洗涤反应器中,实现了反应器快速启动,启动期仅为5 d。本研究可为生物技术治理疏水性和难降解性VOCs提供参考。Abstract: Three strains of benzene degrading bacteria, Kocuria rosea sp. R, Bacillus sp. W and Arthrobacter sp. Y were isolated from the circulating scrubbing liquid in a bioscrubber. Bacillus sp. W was identified as the highly efficient strain for benzene-degrading by studying the kinetics of benzene degradation. the degradation conditions of wich were optimized and the metabolic pathways were explored. The results showed that the existence of saponin could promote benzene biodegradation, but the effects were significantly different depending on the metabolic properties of different bacteria. The half-life of benzene was 8.08 h under degradation by laccase producing bacteria Bacillus sp. W, while the half-life of benzene was shortened to 4.90 h under the cometabolism of saponin and benzene. Bacillus sp. W showed a maximum laccase enzyme activity of 490.21 U·L−1 under optimal conditions with the pH at 7, an initial benzene concentration of 50 mg·L−1 and a saponin addition of 75 mg·L−1 . There was a unique benzene degradation pathway with the participation of laccase. Benzene was converted to catechol by the action of oxygenase, and laccase catalyzed methoxy substitution of phenol hydroxyl ortho positions, and then furan derivatives were generated by intramolecular addition, which were then degraded to small molecules by the action of a series of downstream enzymes. With the addition of microbial agent compounded with 3 strains, the removal efficiency of benzene reached 81.21 % on the fifth day, which was 17 days earlier than the conventional domesticated activated sludge, the shock resistance of the reactor was also enhanced . A rapid reactor start-up with a start-up period of only 5 d was achieved by inoculation of the bacterial agent into the laboratory foam bioscrubber reactor. This study can provide a reference for biotechnological treatment of hydrophobic and non-degradable VOCs.
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Key words:
- saponin /
- laccase /
- Bacillus /
- degradation /
- metabolic pathway /
- microbial agent
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近年来,随着城市化规模的扩大和工业化的迅速发展,大气环境日益恶化,环境空气质量问题越来越被广大人民群众所关注[1-3]。2013年起国家实施环境空气质量新标准,完善了污染物项目和监测规范,提高了数据有效性要求,有利于进一步保护公众健康,环境空气质量管理由一次污染物控制向二次污染物为主的复合污染控制转变。同年,国家颁布并实施《大气污染防治行动计划》[4]明确提出重点省市需要建立重污染天气监测预警体系,提升空气质量监测预警能力,环境空气质量预报工作作为大气污染防控及重污染预警的基础工作,已成为环境监测部门核心业务之一,而预报方法的准确性决定了其可用性,对预报模式效果评估是实现预报预警的前提。
目前应用范围较广的环境空气质量预报方法有统计预报法[5]和数值预报法[6-7]。统计预报法[8-10]简单易行、成本低,适合短期预报,但缺少确定性污染机理,难以捕捉重污染过程且重污染预报准确率偏低;数值预报法对于区域性长期预报有一定优势,但在技术及硬件设施方面投入较大。其中,集合预报法同时运行多个空气质量预报模式,准确率较高。目前数值预报是包括沈阳市在内新疆[11]、江苏[12]和河南[13]省多城市预报工作选择的主要预报手段。沈阳市2018年建立环境空气质量多模式预报预警系统,现选取系统中国际主流预报模式中第三代空气质量预报和评估系统空气质量模式(congestion mitigation and air quality, CMAQ)及国内应用较多的嵌套网格空气质量模式系统(nested air quality prediction model system, NAQPMS)空气质量预报模式的预报数据,进行定量评估,对比2种预报模式在沈阳市2019年采暖季(1~3月、11月和12月)的预报效果,以期为东北地区城市大气污染变化和空气质量预报工作的发展提供经验借鉴。
1. 资料与方法
1.1 资料来源
研究监测数据来自沈阳市11个环境空气自动监测国控站,仪器监测、数据分析统计严格参照《环境空气质量标准:GB 3095—2012》[14]《环境空气质量指数(AQI)技术规定(试行):HJ 633—2012》[15]《环境空气质量技术评价规范(试行):HJ 663—2013》[16]等相关标准执行。
数值预报模式为嵌套网格空气质量预报系统NAQPMS模式及区域多尺度空气质量模型CMAQ模式。2种模式均为前一日20时发布未来3日预报,包括污染物浓度、AQI和首要污染物。本研究选取2种模式的24 h、48 h和72 h预报结果进行评估。
1.2 预报方法介绍
区域多尺度空气质量模型(CMAQ)是由美国环境保护局(Environmental Protection Agency, EPA)开发的第三代空气质量预报和评估系统,被广泛应用于区域环境质量评估、污染成因分析、决策研究和空气质量预报等方面。CMAQ模式突破了传统模式针对单一物种和单相物种的模拟,是一种适用于模拟城市或区域尺度臭氧、酸沉降、能见度和气溶胶等的多尺度综合空气质量模式,模式以WRF等中尺度气象模式作为气象驱动模型,以SMOKE等源排放处理模型作为源处理模型。主要由边界条件模块、初始条件模块、光分解速率模块、气象-化学预处理模块和化学传输模块构成[17]。化学转化模块是CMAQ模式的核心模块,其综合考虑了污染物在大气中的空气动力学过程、气象化学过程、气溶胶过程和云化学与动力过程。
嵌套网格空气质量预报模式系统(NAQPMS)由中国科学院大气物理研究所研制,是区域和城市尺度三维欧拉化学传输模式[18]。可模拟细颗粒物、臭氧、氮氧化物、二氧化硫和一氧化碳等大气痕量气体和大气气溶胶。被广泛应用于多尺度污染问题的研究,不但可以研究区域尺度的空气污染(沙尘、酸雨等污染物的跨区域传输),还可以研究城市尺度的空气质量的发生机理及变化规律,和不同尺度区域间空气质量变化的相互影响。
1.3 预报评估方法
1.3.1 评估指标
目前常用的空气质量评估指标很多,本研究选择平均偏差(MB)、均方根误差(RMSE)、平均分数偏差(MFB)、平均分数误差(MFE)和相关系数(r)等统计指标,具体公式见文献[19]。对2种数值预报模式污染物浓度预报值预报准确率进行检验,通过衡量预报值与实况值的偏离来评价预报结果的稳定性及可行度。其中,MB的大小主要表示样本总体预报值比实况值偏大或偏小的数值;RMSE 反应了预报值与实况值的差值,其值越接近0,表明预报效果越好;r表示预报值与实况值逐渐变化趋势的吻合程度,其值越接近1,表示预报效果越好;MFB、MFE是2个无量纲的统计量,合理预报范围为−60%≤MFB≤60%、MFE≤75%;理想水平范围−30%≤MFB≤30%、MFE≤50%。
1.3.2 城市预报评估
依据《环境空气质量预报成效评估方法指南》[20]要求,常规业务预报评估可使用城市AQI范围准确率、AQI级别准确率及首要污染物准确率。
AQI范围准确率评估,当预报级别为优、良、轻度污染、中度污染时,预报范围以实况值±15为正确;当预报级别为重度污染、严重污染时,预报范围以实况值±30为正确,见式(1):
AQI范围准确率CAQI=nN×100% (1) 式(1)中,n表示AQI范围预报准确的天数,N表示评估预报总天数。
AQI级别准确率评估,当实况AQI级别在预报结果范围内,包含跨级别预报,则预报正确,否则错误,见式(2):
AQI级别准确率CG=nN×100% (2) 式(2)中,n表示AQI级别预报准确的天数,N表示评估预报总天数。
首要污染物准确率评估,当实况首要污染物为单一时,预报首要污染物为1个,且与实况相同,则预报正确;若预报首要污染物为2个,且其中1个与实况一致,则预报正确。当实况首要污染物为多个,若预报首要污染物与预报一致,则预报正确;若预报首要污染物为1个,与实况出现首要污染物中1个相同,也记为预报正确。当实况为优,无首要污染物,不做首要污染物预报评估,见式(3):
首要污染物准确率CPP=nN×100% (3) 式(3)中,n表示首要污染物预报准确的天数,N表示评估时段内非优预报总天数。
2. 沈阳市采暖期空气质量特征
2019年1~3月、11月和12月为沈阳市采暖期,占全年总天数41.4%。对比6项主要污染物,采暖期仅臭氧浓度低于非采暖期,由于臭氧作为二次污染物,主要受温度、太阳辐射影响,由于冬季气温及太阳辐射较夏季均偏低,臭氧光化学反应减弱,臭氧浓度明显低于夏季,见图1。
其他5项污染物浓度均高于非采暖季,其中,细颗粒物(PM2.5)浓度升高幅度最大,达到100%,二氧化硫(SO2)、二氧化氮(NO2)、一氧化碳(CO)和可吸入颗粒物(PM10)浓度上升幅度分别为75.0%、50.0%、57.1%和47.0%。2019年采暖期与非采暖期不同空气质量类别天数占比,采暖期优良天数占全年优良天数的39.8%,中度及以上污染天数占全年80%,见图2。进一步对比采暖期不同污染类别首要污染物变化,见图3。
当AQI ﹥50时(良,轻度及以上污染),出现3种首要污染物分别为NO2、PM10和PM2.5,PM2.5为首要污染物天数占总天数55.9%;AQI ﹥100(轻度及以上污染)出现2种首要污染物(PM10和PM2.5),PM2.5为首要污染物天数占总天数94.7%;AQI ﹥150(中度及以上污染)仅出现PM2.5一种首要污染,占总天数100%。
空气质量类别及污染物浓度对比结果均显示出采暖期空气质量差于非采暖季。当污染程度越重,首要污染物逐渐单一且集中表现为PM2.5,PM2.5成为采暖季的主要污染物。因此本文以PM2.5来分析采暖季的2种预报模式及其预报效果。
3. 预报结果评估分析
3.1 AQI预报效果评估
沈阳市采暖期中CAMQ、NAQPMS模式未来24、48和72 h的AQI范围预报、AQI级别预报及首要污染物预报准确率,见表1。
表 1 CAMQ、NAQPMS模式AQI预报效果评估对比预报时次 范围准确率/% 级别准确率/% 首要污染物准确率/% CAMQ NAQPMS CAMQ NAQPMS CAMQ NAQPMS 24 h 43.7 27.8 74.2 66.2 60.3 58.9 48 h 31.8 21.9 74.2 61.6 59.6 60.9 72 h 34.4 20.5 67.5 55.6 60.3 57.0 表1可知,2种模式的AQI范围预报、AQI级别预报均表现出预报准确率随预报时次延长准确率下降,即24 h准确率高于48、72 h。首要污染物预报准确率表现为各预报时次准确率相差不大。AQI范围预报、AQI级别预报准率最高的为CAMQ模式的24 h预报,准确率分别为43.7%、74.2%;首要污染物预报准确率最高的为NAQPMS模式48 h预报,准确率为60.9%。
2种预报模式中仅48 h首要污染物预报NAQPMS模式略高于CAMQ模式,其他各预报时次的AQI范围预报、AQI级别预报及首要污染物预报均表现为CAMQ模式准确率高于NAQPMS模式。综合3种评估分析,CAMQ模式预报准确率优于NAQPMS模式。
3.2 PM2.5预报效果评估
3.2.1 时间序列对比
分别利用未来24、48 和72 h PM2.5预报浓度值与PM2.5实况浓度进行2019年采暖季PM2.5日均浓度对比分析。通过预报及实况浓度时间序列对比,来评估预报模式对污染物浓度累积及清除的预报能力。CAMQ、NAQPMS模式在3种预报时次中对PM2.5浓度预测值与实况值的变化趋势基本相似,说明2种模式对PM2.5浓度累积及清除过程具有一定的预报能力,但预报值与实况值仍存在一定偏差,预报模式均有优化空间,见图4。
2种预报模式在24、48和72 h预报中,在11月19~21日、12月7~8日、12月13~15日和12月20~21日均出现明显预报偏高情况,且预报趋势与实况相反。2种模式还存在对PM2.5浓度的峰值预判过度情况,1月10~12日、3月19~21日和11月19~20日出现预报浓度过高情况。
3.2.2 散点图分析
散点图用于对比成对的数值,对模型的模拟值与实况监测值间时空配对后,用来分析模式预报值与实况值的吻合程度,并可反映出预报值对实况值的高估或低估。设预报值处于实况值的0.5~2倍范围内认定为预报值可接受,采用FAC表示预报值在实况值0.5~2倍范围内的比例。
2019年采暖期CAMQ模式PM2.5浓度预报效果优于NAQPMS模式,CAMQ模式PM2.5浓度预报值基本集中在y=x附近,且呈收敛趋势;而NAQPMS模式PM2.5浓度预报值呈现明显偏高情况,多数集中在y=x于y=2x间,且随预报时间延长,预报高估情况愈加明显。2019年采暖期CAMQ模式的PM2.5浓度预报值FAC整体高于NAQPMS模式,随预报时长增加而降低。CAMQ模24 h预报FAC最高,达到88.7%,NAQPMS模式48 h、72 h 的FAC最低,为65.6%,见图5。
3.2.3 统计分析
通过统计分析对CAMQ、NAQPMS模式PM2.5日均浓度预测能力进行定量评估。2种预报模式的预报效果,见表2。
对比多种统计指标,CAMQ、NAQPMS模式对PM2.5的预报能力均表现出预报时次越短,预报效果更优,24 h预报效果最优,48 h次之,72 h最差。从2种预报模式预报值与实况值的MB来看,CAMQ、NAQPMS模式预报值均高于实况值,偏离程度随预报时长增加而增大,CAMQ模式PM2.5浓度预报偏高在1.25~11.38 μg/m3之间,NAQPMS模式预报偏高在26.52~35.19 μg/m3之间。NAQPMS模式预报值的偏离程度大于CAMQ模式。2种预报模式对PM2.5浓度预报的NMB、NME和R2均符合−50%<NMB<80%,NME<150%,R2>0.3要求,CAMQ模式的NMB、NME均﹤50%,预报效果优于NAQPMS模式。2种预报模式对PM2.5浓度预报的RMSE表现为CAMQ模式每个预报时次的RMSE均小于NAQPMS模式,CAMQ模式预报值与实况值偏差小于NAQPMS模式。2种预报模式MFB及MFE评估结果显示,CAMQ模式3个预报时次的MFB及MFE均处于理想范围内,NAQPMS模式的MFB及MFE则落于合理范围。综合多种统计指标,CAMQ模式对PM2.5浓度预报效果优于NAQPMS模式。
表 2 2019年采暖期CAMQ、NAQPMS模式PM2.5浓度预报统计分析统计指标 CAMQ NAQPMS 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h MB 1.25 8.6 11.38 26.52 32.75 35.19 NMB/% 2.1 14.1 18.4 43.9 54.3 58.3 NME/% 37.7 45.1 48.7 54.4 62.6 66.6 r2 0.469 0.422 0.466 0.478 0.425 0.451 RMSE 30.92 36.83 38.33 42.11 49.94 50.98 MFB/% 3.7 13.5 15.9 42 48.3 50.9 MFE/% 37.2 44.2 48 47.5 52.7 54.9 注:平均偏差(MB)、标准化平均偏差(NMB)、标准化平均误差(NME)、和相关系数(r)、均方根误差(RMSE)、平均分数偏差(MFB)、平均分数误差(MFE)。 4. 结论
本研究基于2019年采暖期(2019年1~3月、11月和12月)空气质量实况值,采用CAMQ、NAQPMS模式模拟了沈阳市PM2.5浓度,评估了2种模式对单一污染物的预报能力。以统计等级、范围和首要污染物准确率评估了预报模式对污染物综合预报能力。以上结果均表现出CAMQ模式优于NAQPMS 模式,可为人工订正预报提供参考。
(1)沈阳市采暖期环境空气质量污染程度重于非采暖期,采暖期除臭氧外其他5项污染物浓度均高于非采暖季,采暖期细颗粒物浓度较非采暖期上升幅度达到100%。采暖期中度及以上污染占全年80%,首要污染物以细颗粒物为主。
(2)CAMQ、NAQPMS模式等级、范围和首要污染物准确率均为24 h预报准确率最高,而CAMQ模式的24 h等级、范围和首要污染物准确率高于NAQPMS模式,CAMQ模式综合预报能力更优。
(3)时间序列对比结果显示2种预报模式预报值与实况值总体时间变化趋势一致,但仍存在偏差,均表现为预报值明显高估。散点图对比结果显示2种模式对细颗粒物浓度预报均存在不同程度高估,随预报时次增加,偏高程度增大。CAMQ模式24 h预报的可接受度最高,为88.7%。
(4)利用统计分析对比2种模式对细颗粒物预报效果进行定量评估,CAMQ、NAQPMS模式对PM2.5的预报能力均表现出预报时次越短,预报效果更优。CAMQ模式预报效果优于NAQPMS模式。CAMQ模式3个预报时次预报效果均达到理想水平。
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表 1 正交实验的因素与水平的设置
Table 1. Factors of orthogonal experiment and level Settings
水平 因素 皂角苷添加量/(mg·L−1) pH 苯质量浓度/(mg·L−1) 1 25 5 20 2 50 6 50 3 75 7 100 4 100 8 200 表 2 动力学拟合结果对比表
Table 2. Comparison of kinetic simulation Results
菌株 体系 模拟方程 比降解速率|K| R2 半衰期/h R R2 lnc=−0.073 8t+0.090 7 0.073 8 0.931 6 9.39 R1 lnc=−0.116 1t+0.106 6 0.116 1 0.984 6 5.97 W W2 lnc=−0.085 8t+0.004 1 0.085 8 0.974 6 8.08 W1 lnc=−0.141 6t+0.233 9 0.141 6 0.944 2 4.90 Y Y2 lnc=−0.054 5t+0.040 3 0.054 5 0.976 5 12.72 Y1 lnc=−0.063 8t+0.066 6 0.063 8 0.958 8 10.86 表 3 正交实验结果分析表
Table 3. Analysis table of orthogonal experiment results
序号 皂角苷添加量/(mg·L−1) pH 苯质量浓度/(mg·L−1) 去除效率% 实验1 100 6 50 78.98 实验2 50 6 20 78.80 实验3 100 8 20 62.59 实验4 25 7 50 79.98 实验5 75 7 20 80.10 实验6 100 5 100 70.62 实验7 25 5 20 72.02 实验8 50 5 200 68.26 实验9 100 7 200 71.75 实验10 75 5 50 74.70 实验11 50 8 50 69.76 实验12 75 8 200 62.74 实验13 25 6 200 73.68 实验14 50 7 100 80.42 实验15 25 8 100 66.82 实验16 75 6 100 80.63 -
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