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水质生物毒性检测作为传统理化检测方法的补充，不仅能快速检测出水中是否含有毒性污染物，同时还可反映多种有毒物和污染物的综合毒性[1-2]。目前，用于水质生物毒性检测的生物传感器主要利用有毒物或污染物对不同营养级的指示生物(发光细菌、藻类、溞类、大型无脊椎动物和鱼类等)的呼吸作用、生长发育或运动能力的抑制效应来进行检测[2]。其中较高营养级的指示生物更能反映有毒物或污染物对环境质量的影响程度，但其检测成本较高、耗时也较长且需要专业的生物培养技能与装置，这导致该类群指示生物在实际应用时限制性较大；低营养级的指示生物特别是发光细菌因灵敏度高、响应快且生长周期短已被广泛用于水质生物毒性检测，但发光细菌中应用最多的费氏弧菌(Vibrio fischeri)和明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)实为海洋细菌，其生长需在含盐的溶液中，且溶液的浊度和色度会影响检测精度，这也同样限制了其在淡水生境中的广泛应用[3]。因此，寻找一种快速、灵敏、抗干扰能力强且低成本的新型生物毒性传感器成为了现实所需。
近年兴起的微生物燃料电池(microbial fuel cell, MFC)型生物毒性传感器以阳极电活性细菌(Geobacter spp.、Shewanella spp.和Pseudomonas spp.等)为指示生物，当阳极无毒性污染物存在时，电活性细菌通过催化分解有机底物产生电子，电子由胞外电子传递过程转移至阳极，再经电池外电路到达阴极形成稳定电流；当阳极有毒性污染物存在时，电活性细菌的活性或胞外电子传递受到抑制，导致MFC型生物毒性传感器产生的电流降低，通过检测有毒污染物存在时电池产电量的变化则可定量反映水质生物毒性[4-7]。该传感器具有灵敏、抗干扰能力强、无需外加能源、稳定和可自我修复等特点，已被用于检测BOD、COD、挥发性脂肪酸、重金属、氰化物、甲醛和抗生素等[4-7]。然而，目前关于MFC型生物毒性传感器用于检测农药的研究报道较少。KIM等[8]于2007年最早发现，当MFC型生物毒性传感器以1.0 mg·L−1有机磷农药(二嗪磷)为检测物时，所产生的电量降幅高达61%。2012年，王博等[9]利用MFC型生物毒性传感器构建出一套水质生物毒性预警系统，并成功预警了由强降雨导致自来水厂取水区域内农药倒灌引发的饮用水污染事件。2019年，CHOULER等[10]发现，0.3 mg·L−1三嗪类除草剂(莠去津)可使MFC型生物毒性传感器的回路电流下降12%。这些研究结果均表明，MFC型生物毒性传感器可对含农药污水产生毒性响应，但因农药种类多，来源复杂，再加上MFC型生物毒性传感器对不同农药检测的研究匮乏，进而导致MFC型生物毒性传感器检测农药的相关应用极为有限。
为探究MFC型生物毒性传感器对农药污染物的检测性能，本文研究了MFC型生物毒性传感器对溴氰菊酯(菊酯类杀虫剂)、敌百虫(有机磷杀虫剂)、百菌清(有机氯类杀菌剂)、莠去津(三嗪类除草剂)和烟嘧磺隆(磺酰脲类除草剂)5种典型农药检测的剂量-效应关系，评估了MFC型生物毒性传感器中毒后的自我修复能力，并对不同混合农药的生物毒性进行了检测与对比研究。
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实验装置为双室圆柱立方体MFC型生物毒性传感器，材料为有机玻璃，双室中间以阳离子交换膜(CMI-7000 Membranes International，Glen Rock，NJ，USA)隔开，单室内径为3.0 cm，长为4.0 cm，阳极室和阴极室均填充满0.5 cm
⊆ 0.5 cm⊆ 0.5 cm碳毡块(三业碳素有限公司，北京)，碳毡先用1.0 mol·L−1盐酸浸泡24 h，去除表面金属离子，再用1.0 mol·L−1 NaOH浸泡24 h，中和剩余盐酸，最后用去离子水冲洗并浸泡24 h。阳极液和阴极液有效体积均为12 mL。阳极为直径9 mm的碳棒，阴极为直径1.0 mm的铂丝，阴、阳电极用铜导线连接，并与1 000 Ω电阻串联(图1)。MFC型生物毒性传感器的检测单元为阳极，温度控制在(25±2) ℃，平行实验为3组。 -
MFC型生物毒性传感器启动时，以南昌市朝阳污水处理厂氧化沟末端污泥作为阳极菌源，将阳极培养基与污泥等体积混合加入阳极室。阳极培养基参照检测有机磷杀虫剂(二嗪磷)的MFC型生物毒性传感器，以0.2 g·L−1葡萄糖为碳源，其他营养物质以及磷酸缓冲液的组成和浓度参考文献[8]。阴极室为氧饱和的50 mmol·L−1磷酸缓冲液(pH=6.8)。阳极液和阴极液均由蠕动泵周期泵入，流速为6.0 mL·min−1，周期为10 min(包括进样3 min和反应7 min)。待输出电压稳定后，将阴、阳电极与100 Ω电阻串联，待输出电压再次稳定后开始实验，输出电压稳定的判定依据为当前周期的平均输出电压与前5个周期的平均输出电压的差异小于5%。
实验所用的5种典型农药分别为25 g·L−1溴氰菊酯(拜耳作物科学有限公司，浙江)、90%敌百虫(沙隆达股份有限公司，湖北)、75%百菌清(利民化工股份有限公司，浙江)、38%莠去津(长青生物科技有限公司，江苏)和40 g·L−1烟嘧磺隆(长青生物科技有限公司，江苏)，所有试剂均以去离子水配制。
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为了得到MFC型生物毒性传感器检测不同农药的剂量-效应曲线，设置溴氰菊酯的质量浓度分别为0.005、0.05、0.10、0.20、0.30 mg·L−1，敌百虫的质量浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg·L−1，百菌清的质量浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.20、0.30 mg·L−1，莠去津的质量浓度分别为0.003、0.005、0.01、0.03、0.05 mg·L−1，烟嘧磺隆的质量浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.20、0.30 mg·L−1。在检测毒性时，将阳极培养基和农药混合作为阳极液，每个浓度连续测试5个周期(50 min)，以5个周期内最大产电抑制率(coulombic yield inhibition ratio, Ic)作为传感器对农药生物毒性的响应值，每个样品测试3次，最后拟合Ic与农药浓度，并计算引起10% Ic所对应的农药浓度[11]。毒性检测结束后，将阳极液改为单纯的阳极培养基，以使阳极微生物恢复活性，并记录MFC型生物毒性传感器的输出电压恢复至稳定所需的时间。2次测样之间应保证传感器有24 h的恢复时间[6]。
3种混合农药的设置方法如下：混合农药A为2种杀虫剂和1种杀菌剂混合，即0.005 mg·L−1溴氰菊酯+0.05 mg·L−1敌百虫+0.01 mg·L−1百菌清；混合农药B为2种除草剂混合，即0.003 mg·L−1莠去津+0.05 mg·L−1烟嘧磺隆；混合农药C为混合农药A+混合农药B。
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极化曲线和功率密度利用电阻为10~99 999.9 Ω的电阻箱测试，由高到低依次调整MFC型生物毒性传感器外电阻，每次调整后稳定120 min，外电阻两端的电压(输出电压)使用数据采集卡(PISO-813, 研华科技有限公司，中国台湾)连续采集，以连续稳定的3个周期的平均电压作为相应外阻条件下的输出电压，回路电流利用欧姆定律计算，电流密度利用式(1)计算，功率密度利用式(2)计算，电流密度和功率密度均相对于阳离子交换膜几何面积。
式中：I为电流，A；U为外电阻两端的电压，V；R为外电阻，Ω；S为阳离子交换膜几何面积，m2；P为功率密度，W·m−2。
产电抑制率为待测水样(含农药的阳极液)进入MFC型生物毒性传感器前后产电量的差值与待测水样进入MFC型生物毒性传感器前的产电量之比，用以表示待测水样的生物毒性，计算公式如式(3)所示[6,8]。
式中：Ic为产电抑制率；Q0为待测水样进入MFC型生物毒性传感器前5个周期的平均产电量，C；Q为待测水样进入MFC型生物毒性传感器后1个周期的产电量，C。
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MFC型生物毒性传感器在启动时，外接电阻为1 000 Ω，在接种7 d后，输出电压稳定在(312±36) mV，回路电流为(0.31±0.04) mA(图2(a))。前期研究[12-13]已表明，外接电阻的大小可显著影响MFC型生物毒性传感器的检测性能。在外电阻为50~3 000 Ω时，MFC型生物毒性传感器对Cu(II)的毒性响应值随外电阻的降低先增后减，在外电阻约100 Ω时最大[12]。同样，在MFC型生物毒性传感器检测十二烷基硫酸钠时，在100 Ω外电阻下的毒性响应值远高于1 000 Ω外电阻[13]。因此，本研究为了获得更好的农药检测性能，以100 Ω作为实验时的电阻值。当外接电阻由1 000 Ω改变为100 Ω后，经过2 d的运行，输出电压稳定至(57±22) mV，回路电流为(0.57±0.22) mA(图2(a))，这表明MFC型生物毒性传感器已成功启动。
成功启动后，测试MFC型生物毒性传感器的极化曲线和输出功率(图2(b))，发现回路电流密度为0.44 A·m−2时，输出功率密度最大，为138 mW·m−2，远小于检测BOD的MFC型生物传感器的最大输出功率密度897 mW·m−2[5]。导致该现象的可能原因是，本研究中碳源的质量浓度(0.2 g·L−1)远低于检测BOD传感器的1.282 g·L−1，而使用MFC型生物毒性传感器在检测污染物生物毒性时，低浓度的碳源对应更高的毒性响应值[14]。
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MFC型生物毒性传感器对溴氰菊酯(图3(a))、敌百虫(图3(b))、百菌清(图3(c))、莠去津(图3(d))和烟嘧磺隆(图3(e)) 5种典型农药均有明显的毒性响应(产电抑制率表示为Ic)，且Ic随农药浓度增加而增加。当溴氰菊酯的质量浓度为0.005~0.3 mg·L−1时，Ic为(1.0±0.6)%~(38.5±7.2)%；当敌百虫的质量浓度为0.05~0.4 mg·L−1时，Ic为(8.3±6.7)%~(24.5±3.0)%；当百菌清的质量浓度为0.01~0.3 mg·L−1时，Ic为(10.1±5.2)%~(45.5±3.3)%；当莠去津的质量浓度为0.003~0.05 mg·L−1时，Ic为(7.3±3.4)%~(28.7±3.0)%；当烟嘧磺隆的质量浓度为0.01~0.3 mg·L−1时，Ic为(2.9±0.8)%~(29.1±1.8)%。
剂量-效应关系是毒理学的重要概念，通过剂量与效应的线性非阈值模型或阈值模型可对有毒污染物的毒性进行预测和外推。在MFC型生物毒性传感器中，Ic与污染物浓度的线性非阈值模型和阈值模型分别对应线性关系和对数关系[12]。由图3(a)~3(e)可以看出，Ic与农药浓度更符合阈值模型。为了获得10% Ic对应的农药浓度，拟合Ic与农药浓度的对数(图3(a)~3(e))。从5个拟合方程可看出，Ic与溴氰菊酯、敌百虫、百菌清、莠去津和烟嘧磺隆浓度的对数均呈良好的线性关系，可决系数(R2)分别为0.975、0.983、0.960、0.955和0.958。依据如上5个不同拟合方程，溴氰菊酯、敌百虫、百菌清、莠去津和烟嘧磺隆诱导10% Ic时的质量浓度分别为0.016、0.070、0.013、0.005、0.033 mg·L−1，这些质量浓度与GB 3838-2002地表水环境质量标准集中式生活饮用水源地中溴氰菊酯(0.02 mg·L−1)、敌百虫(0.05 mg·L−1)、百菌清(0.01 mg·L−1)、莠去津(0.003 mg·L−1)的质量浓度限值非常接近[15]。以上结果表明MFC型生物毒性传感器可用于预警水环境的低浓度农药污染。
此外，与其他不同营养级指示生物的水质生物毒性检测方法对比，发现莠去津的质量浓度达到15.2 mg·L−1才能使斑马鱼的死亡率达到10%[16]，烟嘧磺隆的质量浓度超过1.17 mg·L−1才可使大型溞的急性活动抑制率达10%[17]，百菌清的质量浓度达到4.3 mg·L−1时才使微藻(Skeletonema costatum)的96 h荧光抑制率达10%[18]，而敌百虫的质量浓度需高达1 452 mg·L−1时才能对明亮发光杆菌(P. phosphoreum)产生10%的发光抑制率[19-20]。另外，HERNANDO等[21]以费氏弧菌(V. fischeri)为指示生物检测莠去津和溴氰菊酯时，发现莠去津的质量浓度升高至6 mg·L−1仍未观察到抑制作用，溴氰菊酯的质量浓度高达5 mg·L−1才可产生30%的发光抑制率。这些产生10%抑制效应的农药质量浓度均远高于本研究所得的结果，表明MFC型生物毒性传感器相比传统的生物毒性传感器对这5种典型农药的检出限更低。
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为了使MFC型生物毒性传感器在实际预警水质污染时能长期稳定运行，要求阳极微生物在中毒后能快速并完全恢复活性[6,13,22]。本研究在检测每种农药后，通过向阳极连续注入新鲜无农药营养液的方式使阳极微生物快速恢复活性。在这个过程中，残留在阳极的农药被稀释和排出，部分未被排出的农药通过阳极微生物的代谢作用降解消除[10]，同时，受损的微生物利用营养液修复繁殖并再生阳极微生物膜[23]。
MFC型生物毒性传感器在检测这5种典型的农药后，输出电压恢复稳定的时间均随农药浓度的增加而延长(图4)。其中检测百菌清后的恢复时间明显高于其他农药。导致该现象的可能原因是：在检测百菌清时MFC型生物毒性传感器的Ic更大(图3)，即电活性细菌的活性受抑制最严重，恢复所需的时间更长。这与KIM等[8]用MFC型生物毒性传感器检测高浓度有机磷杀虫剂(1 mg·L−1二嗪磷, Ic: 61%)时，恢复时间(10 h)更长的结果一致。另外，由图4可看出，MFC型生物毒性传感器检测这5种典型农药后的恢复时间均在240 min内。这表明MFC型生物毒性传感器的阳极微生物被这5种农药抑制后可快速恢复活性。
实验中还观察到，这5种典型农药在较低浓度条件下，MFC型生物毒性传感器的输出电压可恢复至未染毒前的水平，而随着农药浓度的升高，输出电压的恢复时间逐渐加长，甚至不能恢复至未染毒前的水平。这表明，当5种典型农药在较低浓度时，对MFC型生物毒性传感器阳极微生物活性的抑制是可逆的，而在高浓度时是不可逆的。这与MFC型生物毒性传感器检测十二烷基硫酸钠[13]和甲醛[24]时，输出电压在低浓度下可恢复至染毒前水平，在高浓度下不能恢复至染毒前水平的结果一致。在高浓度条件下，农药会对阳极微生物代谢过程中酯酶的磷酸化产生不可逆的影响[8]，从而导致微生物活性受到不可逆的抑制。
在预警高浓度农药污染时，为了使MFC型生物毒性传感器能长期稳定在线监测，当部分阳极微生物发生不可逆失活时，可通过延长恢复时间使生物活性恢复至初始水平。如LI等[23]在利用MFC型生物毒性传感器检测0.1%甲醛时，发现阳极微生物部分失活，输出电压只能恢复到初始60%的水平，通过更换阳极液并延长恢复时间至33 h，可使阳极微生物再生，输出电压恢复至初始水平，且再次检测时获得了可重复的毒性响应；当全部阳极微生物发生不可逆失活时，可利用多个MFC型生物毒性组成的平行传感器组，及时更换失活的传感器[6]。
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MFC型生物毒性传感器检测混合农药A和混合农药B的Ic分别为(14.6±1.3)%和(12.2±2.5)%，均高于各单一农药的毒性响应(图5)，表明混合农药比单一农药具有更强的生物毒性。这与文献中报道的使用混合农药增强药效的现象类似。例如，敌百虫或溴氰菊酯与有机磷杀虫剂混合可增强杀虫作用[25-26]，莠去津和烟嘧磺隆混合可提高灭藻效果[27]。进一步将混合农药A和B混合，得到含这5种典型农药的混合农药C，检测得Ic为(30.5±4.7)%(图5)，该响应值高于这5种典型农药单一条件时的Ic之和，表明这5种典型农药通过协同作用强化了混合农药的联合毒性。这可能与莠去津可强化有机磷杀虫剂杀虫效果的现象类似[28]。混合农药C中的莠去津可通过增加阳极微生物细胞膜的通透性，促使更多农药进入细胞，从而导致更强的生物毒性。以上这些结果表明，在这5种典型农药浓度满足GB 3838-2002中集中式生活饮用水源地水质要求时，MFC型生物毒性传感器对以这5种典型农药所配制的不同混合农药均有明显的毒性响应。这说明该型生物毒性传感器具有检测低于集中式生活饮用水源地水质标准的混合农药生物毒性的能力，可弥补传统理化检测方法只能检测单一农药浓度不能反应混合农药综合毒性的不足，适用于预警水源地多种农药的混合污染。
MFC型生物毒性传感器在检测毒性污染物时，短期高浓度或长期低浓度染毒基本不改变阳极微生物菌群的组成，但电活性菌的相对丰度通常会降低[29-32]。XING等[29]发现，MFC型生物毒性传感器在检测高质量浓度Cu(II)(10 mg·L−1)、2,4-二氯苯酚(1 000 mg·L−1)或吡啶(1 000 mg·L−1)1次后，阳极微生物菌群组成基本无变化，电活性菌Geobacter、Azoarcus、Arcobacter和Desulfovibrio的相对丰度明显降低。长期低浓度染毒也有类似现象。例如，ZHOU等[32]用1.5 mmol·L−1呼吸链抑制剂叠氮化物使MFC阳极染毒13个月后，发现阳极微生物菌群结构未明显改变，优势菌仍为Geobacter和Ignavibacterium。长期高浓度染毒可改变阳极微生物菌群的结构。MFCs阳极经高质量浓度农药硝磺草酮(50 mg·L−1)、吡唑醚菌酯(30 mg·L−1)、乙氧氟草醚(50 mg·L−1)和异丙甲草胺(8 mg·L−1)染毒20~180 d后，阳极优势菌由电活性菌变为能够降解这些农药的微生物[33-36]。本研究中，MFC型生物毒性传感器阳极检测的农药质量浓度较低(<0.5 mg·L−1)，染毒时间短(约50 min·d−1)且染毒后均在240 min内恢复。因此，可推测MFC型生物毒性传感器在检测这5种典型农药后，阳极微生物菌群的组成可能未发生变化，仅电活性菌相对丰度有所降低，经新鲜阳极液冲洗后可再生恢复。
传统生物传感器检测农药的原理归为2点：一是利用微生物的代谢作用，将农药作为底物检测；二是利用微生物的呼吸作用，将农药作为呼吸抑制剂检测[22,37]。利用MFC型生物毒性传感器检测农药时，阳极微生物的响应机制目前尚不清楚。在MFCs中，多种农药如六氯苯、涕滴伊、硝磺草酮、异丙甲草胺、吡唑醚菌酯、乙氧氟草醚和莠去津等已被证实可作为底物通过阳极微生物的共代谢作用降解[33-36,38-39]。这表明MFC型生物毒性传感器的阳极微生物可能通过代谢作用对农药产生响应。此外，农药种类多且不同农药产生生物毒性的机制不同，因此，MFC型生物毒性传感器的阳极微生物对不同农药的响应机制可能有所不同。KIM等[8]利用MFC型生物毒性传感器检测有机磷农药(二嗪磷)时，推测二嗪磷是通过抑制阳极微生物代谢过程中酯酶的磷酸化，直接引起响应。而CHOULER等[10]利用MFC型生物毒性传感器检测三嗪类除草剂(莠去津)时，推测莠去津被吸附在阳极表面，通过阻碍有机底物向阳极电活性菌的传质，间接引起响应。因此，MFC型生物毒性传感器的阳极微生物对这5种典型农药的具体响应机制有待后续进一步研究。
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1) MFC型生物毒性传感器对5种典型农药具有明显的毒性响应且检测限较低，溴氰菊酯、百菌清、敌百虫、莠去津和烟嘧磺隆的质量浓度分别低至0.016、0.070、0.013、0.005和0.033 mg·L−1时即可使传感器的Ic达到10%。
2) MFC型生物毒性传感器检测这5种典型农药后，阳极微生物可快速恢复活性，输出电压恢复稳定的时间随农药浓度增加而延长，基本可在240 min内恢复。
3)以5种典型农药所配制的不同混合农药的生物毒性明显高于单一农药，包含这5种典型农药且浓度满足集中式生活饮用水源地水质标准的混合农药的Ic，可达(30.5±4.7)%。
微生物燃料电池型生物毒性传感器对5种典型农药的毒性检测
Detection of five typical agrichemicals using a microbial fuel cell-based biotoxicity sensor
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摘要: 目前，微生物燃料电池(microbial fuel cell, MFC)型生物毒性传感器被广泛用于检测重金属、氰化物和抗生素等污染物，但将其应用于检测农药的研究极少。为此，探究了MFC型生物毒性传感器对溴氰菊酯、敌百虫、百菌清、莠去津和烟嘧磺隆5种典型农药的检测性能。实验结果表明：这5种典型农药的响应(产电抑制率)均与其浓度的对数呈良好的线性关系，且溴氰菊酯、敌百虫、百菌清、莠去津和烟嘧磺隆使MFC型生物毒性传感器产电抑制率达到10%的质量浓度分别低至0.016、0.070、0.013、0.005和0.033 mg·L−1；中毒后，MFC型生物毒性传感器的恢复时间随农药浓度的增加而延长，但240 min内均可快速恢复稳定；另外，这5种典型农药所配制的不同混合农药的生物毒性均高于单一农药。以上结果表明，MFC型生物毒性传感器对这5种典型农药的响应灵敏，检出限较低且中毒后恢复速度快，具有快速检测和预警水体农药污染的应用潜力。Abstract: At present, microbial fuel cell (MFC)-based biotoxicity sensors were widely attended to detect heavy metals, cyanide and antibiotics in water, while the detection of agrichemicals was rarely discussed. In this paper, five typical agrichemicals including deltamethrin, trichlorfon, chlorothalonil, atrazine, and nicosulfuron were detected using an MFC-based biotoxicity sensor. The results showed that the response (coulombic yield inhibition ratio) of each of these five agrichemicals was in a good linear relationship with the logarithm of its concentration. As low as 0.016 mg·L−1 deltamethrin, 0.070 mg·L−1 trichlorfon, 0.013 mg·L−1 chlorothrin, 0.005 mg·L−1 atrazine or 0.033 mg·L−1 nicotsulfuron could result in a coulombic yield inhibition ratio of 10% for MFC-based biotoxicity sensors. After the biotoxicity detection, the recovery time of MFC-based biotoxicity sensors increased with the increase of agrichemical concentrations, and stable voltage output could be achieved within 240 min for all tested concentrations of these five typical agrichemicals. In addition, compared with the single agrichemical, joint biotoxicities of different mixed agrichemicals prepared by the five typical agrichemicals were apparently higher. This study confirmed that MFC-based biotoxicity sensors possessed sensitive response, low detection limits to these five agrichemicals and robust recovery ability after being poisoned, thus providing an alternative and promising method for fast water quality monitoring and early warning of agrichemical pollutions in water.
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Key words:
- microbial fuel cell /
- biosensor /
- biotoxicity /
- agrichemical /
- recovery time
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随着社会经济的发展，柴油的使用量增加，但是柴油在生产、运输、装卸、加工及使用过程中的泄露会对土壤环境造成一定的污染，直接或间接地危害人类的生命与健康[1-2]。因此，解决柴油污染土壤问题已成为世界各国所共同面临的问题[3]。
目前，针对柴油污染土壤修复的方法主要包括机械、物理、化学和生物修复方法等[4]。其中，机械、物理、化学修复方法具有费用高、容易产生二次污染等不足[5-7]。而生物修复技术是一种高效、环境友好、低成本的技术，能够将柴油等污染物通过微生物代谢转化成无毒的终产物[8-9]，因而被广泛应用于修复柴油污染土壤之中[10]。刘沙沙等[11]已成功利用醋酸钙不动杆菌降解柴油以及污染物，经过62 d的生物修复实验，柴油去除率为69.8%。然而，柴油组成的复杂性决定了其降解需要有不同菌株的参与[12]，TAO等[13]研究了土著细菌联合体与外源芽孢杆菌(Bacillus subtilis)共同培养降解原油的实验，细菌群落分析结果表明，在确定的共培养条件下，细菌多样性降低，降解效率提高，同时证明芽孢杆菌对长链烷烃有很好的降解效果。
大量的研究证明，微生物在修复有机物污染土壤的过程中具有良好的应用前景，但目前对于构建微生物菌群的研究较少，本研究从柴油污染土壤中筛选、分离出能够降解柴油污染物的微生物，采用组合实验构建优势菌群，探究了其柴油生物降解特性，研究分析了该菌群中各菌种之间的互作机制，为构建降解柴油的菌群提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器与原料
紫外分光光度计(UV-2102C，中国上海)，GC-MS(Agilent6890/5975I，安捷伦)，台式高速冷冻离心机(H-2050R，中国长沙)，恒温振荡培养箱(HZQ-X160，中国太仓)。实验所用试剂均为分析纯。
柴油污染土壤取自上海金山卫金山大道城河路；柴油为市售0#柴油(密度：0.84 kg·L−1)；菌种：实验所用菌种均为从柴油污染土壤样品中筛选分离得到。
1.2 实验方法
1)微生物菌种生物量的测定方法。将菌落接种于灭菌的种子培养基中，每2 h取样，采用分光光度计在波长600 nm下测定吸光度值，绘制柴油降解细菌的生长曲线。
2)微生物菌种对柴油降解能力的测定方法。残余柴油浓度采用分光光度法[14]进行测定。菌株对柴油的降解能力采用柴油降解率表示。降解率计算公式如式(1)所示。
R=C0−CtC0×100% (1) 式中：R为柴油降解率；C0为柴油的初始浓度，mg·mL−1；Ct为柴油的降解过程测定浓度，mg·mL−1。
3)微生物高效降解柴油的条件优化实验。以构建好的柴油污染物降解菌群为研究对象，考察了初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、初始柴油浓度(1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL·L−1)、初始接种量(体积比5.0%、10.0%、15.0%)对柴油降解率和细菌生物量的影响结果。在30 ℃，150 r·min−1条件下培养5 d，定时取样并测定其中的柴油降解率以及生物量的变化，每组实验重复3次，取其平均值。
4)微生物多样性测试。将培养24 h的菌群混合液按10%的接种量接种到无机盐培养基中，柴油浓度为7.0 mL·L−1，pH=7.0，在30 ℃，150 r·min−1条件下培养，14 d后，将混合菌进行收集，离心弃上清液，收集菌体，测试微生物多样性，该工作由上海美吉医药科技有限公司完成。
5)微生物降解柴油产物的检测。将筛选获得的高效单菌种分别接种到种子培养基中，培养24 h后，离心收集菌体，稀释使其OD600=1.50，并按照最佳的体积比混合后接种于无机盐培养基中，以不加细菌为对照组，柴油浓度为7.0 mL·L−1，在30 ℃、150 r·min−1的恒温振荡培养箱中培养14 d。然后将培养基取出加入1∶1(体积比)硫酸5.0 mL酸化水样，继续加入0.2 g·L−1的氯化钠破乳[15]，然后加入石油醚20.0 mL(60~90 ℃)超声10 min。将上述溶液8 000 r·min−1离心10 min，将上清液转移至另一干净的三角瓶中，下层溶液倒入原三角瓶并用石油醚重新提取1次。合并2次提取液，过膜，利用GC-MS测定培养基内降解产物组成及含量。
6)微生物降解十五烷产物的检测。将本研究所构建的混合菌群接种于添加了十五烷(7.0 mL·L−1)的无机盐培养基中，在30 ℃、150 r·min−1的振荡箱里培养14 d，分别取降解3、6、14 d的培养液，按照上述方法处理并检测。
2. 结果与讨论
2.1 柴油降解菌的富集驯化结果
从柴油污染土壤中筛选获得4株具有较强柴油降解能力的菌株，其菌落形态和柴油降解能力结果见表1。
表 1 菌株的菌落形状及柴油降解能力Table 1. Colony shape and diesel degradability of strains菌株号 菌落形态 菌体形态 菌落颜色 降解率/% 1# 菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙皱褶 杆状 白色 27.0 2# 菌落透明、光滑、有光泽 球形 白色 29.0 3# 菌落微黄、表面光滑、边缘整齐 杆状 微黄色 32.0 4# 菌落淡红色、湿润、不规则 杆状 淡红色 35.0 | Show Table
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2.2 高效降解菌的初步鉴定
微生物初步鉴定结果如表2所示。通过16S rRNA测序结果可知，1#、2#、3#、4#菌株分别与Bacillus sp. VOC18、Enterococcus faecalis、Lysinibacillus、Rhodococcus equi有97%、98%、99%、99%的相似性。本研究分别对1#、2#、3#、4#菌株命名为Bacillus sp. VOC18-L1，Enterococcus faecalis-L2，Lysinibacillus-L3，Rhodococcus equi-L4(简称L1，L2，L3和L4)。
表 2 4种柴油降解菌株的生理生化实验结果Table 2. Physiological and biochemical characteristics of four diesel degrading bacteria实验类型 菌株号 1# 2# 3# 4# 淀粉水解实验 − − − − 明胶实验 + − + + 尿素实验 − + − − 甲基红实验 + − + + V-P实验 + − + − 吲哚实验 − − − − 柠檬酸盐实验 − − − − 硫化氢实验 − − − + 触酶实验 − + − + 葡萄糖发酵实验 + − + + 乳糖发酵实验 − − − − 木糖发酵实验 − − − − 麦芽糖发酵实验 + − + + 蔗糖发酵实验 + − − − 注：“+”表示显阳性，“−”表示显阴性。 | Show TableDownLoad:
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2.3 菌株的生长曲线分析结果
每种菌的生长曲线如图1所示。由图1可知，4种细菌在24 h均进入指数生长阶段，在该阶段，微生物生长速度快，活性较强，因此，后续实验均采用培养24 h的菌液为接种液。
图 1 柴油降解菌L1、L2、L3和L4的生长曲线Figure 1. Growth curves of diesel oil degrading bacteria L1, L2, L3 and L42.4 菌群构建的结果分析
菌群构建的结果如表3所示。由表3可知，编号11的菌群组合在5 d内对柴油的降解率最高，可达到39.6%，这可能是由于不同菌种之间的协同作用，使得混合培养的菌群对于柴油污染物的降解效果要优于单菌，因此，选用该混合菌群作为最佳降解菌群进行后续的研究。
表 3 菌种组合对柴油降解效率的实验结果Table 3. Experimental results of degradation efficiency of diesel oil by species strain combination编号 组合 降解率/% 1 L1+L2 20.9 2 L1+L3 26.2 3 L1+L4 26.1 4 L2+L3 25.8 5 L2+L4 30.9 6 L3+L4 29.3 7 L1+L2+L3 23.5 8 L1+L2+L4 31.5 9 L1+L3+L4 25.0 10 L2+L3+L4 21.1 11 L1+L2+L3+L4 39.6 12 空白 10.9 | Show TableDownLoad:
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2.5 柴油降解菌群的混合配比及降解柴油的条件优化
1)采用正交实验法确定柴油降解菌群的最佳菌种混合比例。菌群中各菌种的相对含量对柴油等有机物的降解效率有显著的影响。因此，本研究通过正交实验研究了不同混合比例的菌种对柴油降解效率的影响关系，结果如表4所示。由表4可知，降解效果最好的菌种比例为L1∶L2∶L3∶L4=3∶1∶3∶4，在5 d时，降解柴油效率为52.5%，本研究将此比例的微生物组合命名为OCDL-3134。由于该菌群中的每种细菌都具有特定的作用，因此，柴油降解效率明显得到提高[16-17]。然而，将培养了14 d的微生物进行多样性分析结果如图2所示，由图2可以看出，OCDL-3134经过14 d的培养后，菌种之间的比例变为2∶6∶5∶1，这说明在降解过程中，4种菌根据环境的变化发挥着协同作用，并自行调整他们之间的相对丰度，以实现充分利用柴油污染物的目的。此时L2和L3菌种变为优势菌种，说明在培养后期，L2和L3菌种发挥了重要作用，这与其自身的功能是相一致的。同时也表明确定各种微生物的初始接种比例的菌群构建方案具有一定的合理性。有研究[18]表明，一旦长链烷烃耗尽，就会缺乏碳源和能量用于其生长，而由长链烷烃降解形成的短链烃类化合物则被其他菌种继续代谢利用而进一步降解。
表 4 4种柴油降解菌的接种比例和对应的柴油降解效率表Table 4. Inoculation ratio of four diesel oil degrading bacteria and their diesel oil biodegradation efficiency接种比例(L1∶L2∶L3∶L4) 降解率/% 接种比例(L1∶L2∶L3∶L4) 降解率/% 3∶3∶1∶2 16.5 2∶4∶3∶2 14.8 1∶1∶1∶1 39.3 4∶1∶4∶2 18.5 2∶1∶2∶3 15.3 2∶2∶1∶4 15.7 4∶4∶1∶3 21.4 4∶3∶2∶4 19.1 3∶4∶2∶1 15.6 1∶2∶2∶2 25.5 2∶3∶4∶1 13.7 3∶1∶3∶4 52.5 1∶4∶4∶4 22.3 3∶2∶4∶3 13.2 1∶3∶3∶3 13.1 4∶2∶3∶1 11.7 | Show TableDownLoad:
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图 2 OCDL-3134降解柴油14 d后的菌群结构示意图Figure 2. Analysis of microbial community structure of OCDL-3134 for diesel oil degradation after 14 d2)初始pH对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。环境pH可引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，改变营养物质的可给性和有害物质的毒性。本研究探讨了初始pH对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。由图3(a)可知，当环境pH过高或过低时，会对微生物产生抑制，这可能是由于此条件严重影响了细菌利用柴油的能量和物质代谢进程，从而影响菌体生长，因此会显著降低柴油的生物降解效率。当pH为7.0时，OCDL-3134对柴油降解的效率达到最佳，此时生物量也达到最高，如图3(b)所示。因此，OCDL-3134对柴油的降解效率和生物量的最佳初始pH均为7.0。
图 3 初始pH对OCDL-3134的柴油降解效率和细菌生物量影响Figure 3. Effect of initial pH on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134 and bacteria biomass3)柴油浓度对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。柴油浓度是微生物代谢过程的一个重要因素，对微生物降解性能有一定影响[19]。柴油浓度较低时，碳源不足，细菌生长缓慢，对柴油降解效果不佳。随着柴油浓度的增加，碳源可以满足微生物生长，微生物的降解效果也随之增大。但随着柴油浓度继续增加，柴油降解菌的活性受到抑制，同时培养基表面形成一层油膜，使得溶液内的溶解氧浓度降低，抑制微生物的生长繁殖，从而影响对柴油的降解。如图4(a)所示，随着柴油浓度的增大，微生物的柴油降解率呈先上升后下降的趋势，在柴油浓度为7.0 mL·L−1时，降解效果最好，达到50.0%以上。同时，图4(b)为初始柴油浓度对生物量的影响结果，随着柴油初始浓度的增加，生物量呈先增后降的趋势，结果表明OCDL-3134在初始柴油浓度为7.0 mL·L−1时生物量最佳。
图 4 初始柴油浓度对OCDL-3134降解柴油效率及细菌生物量的影响Figure 4. Effect of initial diesel oil concentration on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134 and bacteria biomass4)接种量对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。如图5所示，接种量在体积比为10.0%时，微生物对柴油的降解率较高。此后，再增加接种量反而导致新增细胞减少，进而使菌株整体活性下降，降解柴油的后劲不足。15.0%的接种量虽然生物量最多，但由于微生物大量繁殖，造成菌株集中，短时间内消耗了培养基中大量营养成分，不利于新菌株的持续生长，从而影响了菌株对柴油的降解率，因此，根据实验结果最佳接种量为10.0%。
图 5 接种量对OCDL-3134降解柴油效率及细菌生物量的影响Figure 5. Effect of inoculation on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134and bacteria biomass2.6 菌群OCDL-3134降解柴油及十五烷过程中的产物分析
1)菌群OCDL-3134降解柴油过程中的产物分析。各单菌种和OCDL-3134对柴油降解的产物结果如图6所示。图6(a)是原始柴油的组分，由此可知，原始柴油的组分非常复杂，主要包括C13~C24的烷烃。图6(b)是L1培养14 d后的产物，通过与图6(a)对比可发现，L1对短链烷烃降解效果好，推测可能是由于该菌在生长代谢过程中产生了相应的表面活性剂[13]，促进了微生物与柴油的接触，从而对短链烷烃具有较好的降解效果；图6(c)是L2培养14 d后的产物，通过与图6(a)对比可发现，整体烃类的含量降低。该菌株具有利用该有机物代谢产酸的能力[20]，可以将柴油降解的一些产物分解成小分子的酸，因此，在柴油降解过程中发挥着重要作用；图6(d)是L3培养14 d后的产物。与图6(a)对比可发现，短链以及长链烷烃的含量菌有所减少。该菌能够在好氧条件下代谢简单的碳水化合物，因此，在小分子烃类物质的降解过程具有重要作用，同时在柴油降解的后期可能会具有重要贡献，这一点与图3的结果是一致的；图6(e)是L4培养14 d后产物，与图6(a)对比可发现，整体的烃类含量降低，而环苜蓿烯的含量也有明显的下降。有研究[20]表明，该菌株的主要特性是能够有效降解芳香烃，因此，对于柴油中芳香烃的降解具有重要作用。
图 6 L1、L2、L3、L4和OCDL-3134降解柴油的产物气相色谱图Figure 6. Gas chromatographic charts of products from diesel oil degradation by L1, L2, L3, L4 and OCDL-3134综上所述，L1、L2、L3、L4对柴油污染物中的有机烃类物质具有一定的降解效果，并且不同的菌种对不同链长的烃类物质降解效果也有显著差异。然而，L1、L2、L3、L4却不能将柴油完全降解。而L1、L2、L3、L4混合形成的菌群OCDL-3134对柴油降解效果显著，如图6(f)所示，相同时间内，柴油几乎被完全降解，转化成无毒无害的酸类小分子、二氧化碳和水。这表明混合菌对柴油的降解效率显著优于单菌株。
2)菌群OCDL-3134降解十五烷过程中的产物分析。使用GC-MS检测了以柴油作为碳源的微生物降解的产物，实验结果表明，混合菌群对柴油的降解效果显著优于单菌种的效果。对此已有大量研究[21]证明了微生物对柴油等有机污染物的降解作用，但是生物降解长链烷烃的机理研究报道并不多见，而且对其降解途径也缺乏了解。由于柴油属于混合物，且主要的烷烃为十五烷和十六烷，因此，本研究选择十五烷作为研究对象，初步探讨微生物降解十五烷的机理，如图7所示。由图7(a)可知，第3天样品中的主要成分是十五烷，这表明在前3 d菌种要先适应新环境，降解效率低。而到第6天，OCDL-3134中的各菌种在协同作用下将十五烷降解为C13H28、C13H26O2等化合物，如图7(b)所示。据报道[15]，微生物对直链烷烃最常见的降解途径为烷烃末端氧化，微生物攻击直链烷烃的末端甲基，由加氧酶、脱氢酶、水化酶等混合功能氧化酶催化，生成伯醇，再进一步氧化为醛和脂肪酸，脂肪酸接着通过氧化进一步代谢，被彻底氧化成二氧化碳和水。如图7(c)所示，在第15天，十五烷以及产物被OCDL-3134彻底降解为水和二氧化碳等小分子物质。
图 7 OCDL-3134降解十五烷在不同时间的产物气相色谱图Figure 7. Gas chromatographic charts of degradation of pentadecane by OCDL-3134 at different time3) OCDL-3134降解柴油过程中细菌代谢功能的预测。图8是从KEGG数据库中获得的代谢丰度图，碳水化合物代谢的丰度最好，表明微生物一开始是对柴油的代谢，而氨基酸的代谢功能丰度是其次的，可能发挥的作用是对中间代谢产物脱氨基，从而进一步代谢成醛、酮、酸等小分子物质，因此，细菌首先利用柴油，并将柴油分解成中间代谢产物，然后经过代谢途径分解成酸类小分子物质。其他的代谢途径如能量代谢、辅因子和维生素的代谢、核酸代谢等也参与进来，最终一起合作完成降解柴油的任务。而且可以发现，4种菌种的异质降解和代谢丰度较好，这一代谢丰度说明微生物具有增强降解柴油的能力，这与TAO等[13]的研究结果相一致，但由于是混合菌，故不能判断是哪一种菌种产生的作用。代谢功能预测进一步证明了混合菌在柴油完全降解方面优于单种菌种。
图 8 OCDL-3134代谢柴油的功能预测Figure 8. Metabolic function prediction of OCDL-3134 metabolizing diesel3. 结论
1)通过排列组合的方式将筛选出的微生物菌种进行组合，得出高效柴油降解菌群OCDL-3134，通过正交实验得出它们之间接种量最优比例为3∶1∶3∶4，同时对混合菌柴油降解性能进行优化，实验测得微生物降解柴油的最优条件为pH=7.0，初始柴油的浓度为7.0 mL·L−1，初始接种量为10.0%，在此优化条件下，测得第14天柴油的最佳降解率为89.0%，这说明所筛选的混合菌种具有较高的应用价值。
2)通过GC-MS检测和微生物多样性功能预测分析证明了微生物对柴油以及十五烷的协同作用高于单菌株的降解效果，4种菌种之间存在协同作用，能够将长链烷烃降解为短链烷烃和小分子物质，并获得自身生长与代谢的能源和碳源。KEGG数据库中获得的代谢丰度图也进一步证明了混合菌在柴油完全降解方面优单种菌种。
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图 1 微生物燃料电池型生物毒性传感器的示意图
Figure 1. Schematic diagram of a microbial fuel cell-based biotoxicity sensor
图 2 微生物燃料电池型生物毒性传感器启动时的输出电压和启动后的产电性能
Figure 2. Voltage outputs during the start-up and power generations after the start-up of a microbial fuel cell-based biotoxicity sensor
图 3 微生物燃料电池型生物毒性传感器检测5种典型农药
Figure 3. Detection of five typical agrichemicals using microbial fuel cell-based biotoxicity sensors
图 4 微生物燃料电池型生物毒性传感器检测不同浓度农药后的恢复时间
Figure 4. Recovery time of microbial fuel cell-based biotoxicity sensors after the detection of different concentrations of the five typical agrichemicals
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