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剩余污泥(waste activated sludge，WAS)是在城市污水处理过程中形成的主要副产物。据报道，2019年我国剩余污泥(80%含水率)的产生量超过6 000×104 t[1-2]。剩余污泥中通常含有有毒有害有机物、重金属、病原菌和寄生虫卵等，具有较大的二次污染风险[3]。目前，污泥的处理以堆埋、焚烧、农业堆肥和自然干化为主，所需费用较高(占污水处理厂总运行费用的50%~60%) [4-5]。厌氧发酵是一种重要的环境生物技术，能够利用剩余污泥生产甲烷和短链脂肪酸(VFA)等多种化学品[3, 6-7]。而且，短链脂肪酸可以作为污水处理厂反硝化的碳源，从而进一步降低污水处理厂的运行成本[8]。因此，将混菌厌氧发酵技术应用于市政污泥处置，是实现其资源化的重要手段。
市政污泥的主要有机成分复杂，包括细胞、胞外聚合物(EPS)和少量纤维素等[9-10]，导致了厌氧发酵技术面临生物水解速率慢等诸多问题。例如，厌氧反应器需要较长的水力停留时间(20~30 d)，但其有机物去除率仍然不高(30%~50%)[9]。剩余污泥中的EPS组分占污泥有机质干重的50%~80%，具有维持微生物聚集体结构和保持其功能完整性的作用[10]。因此，一般认为EPS组分是导致市政污泥水解困难的主要因素。目前，主要采用预处理过程(超声波处理、水热处理、酸碱处理和高级氧化处理等)来破坏EPS和细胞壁的结构，以降低污泥生物处置的阻力和提高污泥中有机物的可利用性[9, 11]。例如，ZHANG等[12]发现，通过外源投加钢渣和碱处理，污泥中有机物水解程度随pH的增加而增加，20 d后可溶性有机碳质量浓度比空白组增加了1.0 g·L−1。ARENAS等[13]报道，碱性条件下电氧化预处理后可溶性有机物增量最大，总有机碳和可溶性COD(SCOD)的质量浓度分别为2.8和7.8 g·L−1，而空白组仅为0.4和1.1 g·L−1。然而，上述预处理方法选择性不高，并且增加了装置的额外运行成本。
EPS中的酸性多糖(藻酸盐和半乳糖醛酸等)能够与水中阳离子形成凝胶类物质[14-17]，可维持污泥结构并阻碍微生物的水解作用。其中，藻酸盐是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按(1→4)糖苷键连接而成。LIN等[18]通过鉴定发现，污泥絮体中藻酸盐类似物的质量分数达到7%。然而，目前有关藻酸盐降解及其对污泥发酵影响的报道仍然较少。因此，本研究首先构建以藻酸盐为底物的恒化器，培养稳定的藻酸盐降解菌群(alginate-degrading consortium，ADC)，并通过高通量测序分析菌群结构；其次，利用EPS中存在的典型物质(聚半乳糖醛酸，酪蛋白，纤维素和葡聚糖)作为底物，解析ADC促进EPS水解酸化的功能；最后，将ADC应用到实际剩余污泥体系中，解析3种典型pH(5.0，6.0和7.0)条件下ADC对污泥水解和酸化效率的促进能力，以期为强化污泥产酸提供新的思路。
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本实验所用的剩余污泥取自福建省福州市金山污水处理厂的二沉池，实验前存放于4 ℃冰箱中，污泥基本特性如表1所示。
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1)恒化器长期实验。构建恒化器，总体积为3.2 L，工作体积为2.5 L。接种微生物(50 mL)源于以藻酸盐为底物培养的厌氧菌群[19]。恒化器进水藻酸盐的质量浓度为10 g·L−1，无机培养基的成分与ZHANG等[19]报道的相同，并添加10 mmol·L−1 2-溴乙基磺酸钠(BES)以抑制甲烷生成。利用99%纯度的N2将恒化器曝气20 min。恒化器运行时间为60 d，并监测代谢产物的变化。
2)模拟物质厌氧酸化实验。为了解析ADC以EPS作为底物进行水解和厌氧酸化的功能，以聚半乳糖醛酸、纤维素、葡聚糖和酪蛋白作为EPS的典型代表物质，接种ADC作为底物进行为期14 d的厌氧酸化。每1种底物设置3个重复。在120 mL血清瓶中添加60 mL无机培养基，并加入10 mmol·L−1 BES，底物的质量浓度为5 g·L−1、pH为5.5、接种量为10 mL(转速10 000 r·min−1、离心5 min，弃上清液)。利用纯度为99%的N2曝气10 min，密封后放入37 ℃的振荡培养箱进行培养并分析代谢产物。
3)不同pH剩余污泥厌氧酸化实验。将储存在4 ℃冰箱的污泥取出，利用1 mol·L−1 NaOH和HCl将其pH分别调至5.0、6.0和7.0，每个水平分为对照组和实验组2个处理。其中，对照组为原污泥，实验组中接种20 mL ADC菌群。每个处理分装于120 mL血清瓶中(n = 3)，液相为60 mL，最后曝气密封并放入恒温箱培养。发酵时间持续12 d，分析污泥发酵过程中的产气(H2和CH4)、水解(SCOD)和酸化(VFA)等参数，并计算水解和酸化效率。
4)水解酸化效率的计算。为了量化在经过不同处理之后，对照组和实验组在不同pH下污泥水解和酸化的情况，利用式(1)和公式(2)分别计算厌氧发酵过程中的水解和酸化效率[20]。
式中：Eh为水解效率；SCODi为对应各个时间点的溶解性COD，g·L−1；TCOD为污泥总COD，g·L−1。
式中：Ea为酸化效率；TVFAi为对应各个时间点总挥发性有机物的质量浓度，g·L−1。
5)分析方法。CH4和H2的体积分数采用气相色谱仪(SP7890，山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司)测定。短链脂肪酸样品用0.45 μm 滤膜过滤，之后保存于4℃冰箱中。短链脂肪酸的质量浓度由气相色谱仪(7890，安捷伦科技有限公司)测定。恒化器中藻酸盐的质量浓度采用硫酸-咔唑法测定[21]。TCOD和SCOD用重铬酸钾法测定[22]。污泥中多糖的质量浓度采用硫酸-蒽酮法测定，蛋白的质量浓度则采用Lowry 法分析[23]。pH采用pH计(PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司)测定。
6)DNA提取和Illumina Miseq高通量测序。2个DNA样本分别提取自剩余污泥和恒化器中培养60 d的菌群，命名为WAS和ADC。DNA序列扩增(引物341F-806R[19])由ABI GeneAmp® 9700进行，之后使用Illumina Miseq PE 300测序仪进行测序。基于上述测序结果分析菌群的多样性。
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恒化器运行时间为60 d，运行期间水力停留时间(HRT)通过调控稳定在(4.4 ± 0.2) d，pH维持在酸性(5.5 ± 0.2)条件。如图1(a)所示，恒化器出水藻酸盐的质量浓度远小于进水(10 g·L−1)，仅为(0.10 ± 0.06)g·L−1。这说明，在长期培养中，ADC菌群具有良好的藻酸盐降解功能。TSS和VSS分别为(1.4 ± 0.2)和(0.80 ± 0.04)g·L−1。恒化器运行期间，每日产气量小于50 mL(产气速率为(17.2~48.6) mL·d−1)，其中，H2在气相中的体积分数为1.6% ± 0.8%。H2的消耗归因于同型产乙酸菌群的作用[8, 24]。为了保证厌氧酸化阶段运行的稳定，期间持续添加BES以抑制产甲烷菌群活性，因此仅监测到痕量的CH4(体积分数于0.1%)。图1(b)显示了恒化器中ADC菌群厌氧产酸情况，VFA的组成成分主要为乙酸、丙酸和丁酸，质量浓度分别为(2.1 ± 0.2)、(0.8 ± 0.1)和(0.6 ± 0.2)g·L−1。根据COD平衡的计算，恒化器的COD转化率为80.0% ± 9.6%。上述结果说明，在长期培养中，ADC具有高效的藻酸盐降解能力。
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剩余污泥EPS中主要的可生物降解有机组分含有多糖(包括中性糖和酸性糖)和蛋白质[11]。因此，以聚半乳糖醛酸、酪蛋白、纤维素和葡聚糖4种典型有机底物，探究ADC菌群利用不同有机底物产气和产酸的情况。在整个反应期间，4组实验的H2体积分数最高为7.9% ± 0.1%，这与恒化器运行(图1)的结果相似。由于添加了BES，故4组实验均未检测出CH4。
ADC菌群利用4种模拟底物厌氧产酸情况如图2所示，其中分别采用聚半乳糖醛酸(图2(a))代表酸性糖，以葡聚糖(图2(b))和纤维素(图2(c))代表中性糖，以酪蛋白(图2(d))代表蛋白质。结果表明，ADC菌群降解模拟物质中的代谢产物主要以乙酸、丙酸和丁酸为主。其中，代谢聚半乳糖醛酸和葡聚糖生产乙酸的质量浓度最终分别为(0.6 ± 0.03)和(0.9 ± 0.05)g·L−1，而利用酪蛋白和纤维素生产乙酸的质量浓度仅为(0.2 ± 0.01)和(0.4 ± 0.04)g·L−1。以葡聚糖作为底物时，丙酸的最大质量浓度为(0.6 ± 0.04)g·L−1；其余底物中生成丙酸的质量浓度相对稳定。ADC以酪蛋白和葡聚糖为底物时的主要产物是丁酸，质量浓度分别为0.5和0.7 g·L−1。以聚半乳糖醛酸和纤维素为底物时产生了较少的丁酸，质量浓度分别为(0.3 ± 0.05)和(0.3 ± 0.001)g·L−1。上述结果表明，ADC菌群具有降解EPS中各类典型有机质生产短链脂肪酸的能力。
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在整个反应期间，3组实验的H2体积分数始终低于0.4% ± 0.1%，这与恒化器运行(图1)的结果相似。由于添加了产甲烷抑制剂BES，故4组实验中均未检测出CH4。图3显示了在不同pH处理中空白组和添加ADC组的厌氧产酸情况。在3组pH条件下，WAS的代谢产物以乙酸、丙酸和丁酸为主，并且添加ADC组的产酸质量浓度均高于空白组。在pH=7时，ADC组最终的乙酸、丙酸和丁酸的质量浓度分别累积到(0.9 ± 0.02)、(0.4 ± 0.02)和(0.5 ± 0.03)g·L−1，而对照组仅为(0.4 ± 0.08)、(0.2 ± 0.04)和(0.1 ± 0.01)g·L−1。在pH=6和pH=5的条件下也出现了类似的结果，在厌氧酸化第11 d时测得对照组中乙酸质量浓度分别为(0.4 ± 0.05)和(0.4 ± 0.01)g·L−1，丙酸质量浓度均为(0.2 ± 0.01)g·L−1；而在实验组中的VFA产量得到了明显的提升，其中，乙酸质量浓度为(1.1 ± 0.01)和(0.9 ± 0.02)g·L−1，丙酸质量浓度为(0.4 ± 0.03)和(0.4 ± 0.02)g·L−1。因此，结合第2.2节的实验结果可知，ADC可以通过破坏EPS结构以加速WAS的水解和厌氧产酸。
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WAS絮体结构的破坏可导致胞外和胞内有机物的释放和溶解[25-26]。因此，通过测定厌氧酸化过程中的SCOD可以量化ADC菌群对WAS水解和酸化阶段的促进作用。图4(a)~图4(c)显示了在ADC组和空白组中不同pH条件下SCOD的变化情况，在pH分别为7.0、6.0和5.0时，空白组中厌氧酸化最终SCOD分别为(3.1±0.12)、(4.4±0.07)和(3.2±0.03)g·L−1；而在ADC组中，相应pH条件下的SCOD均有所提升。图4(d)~图4(f)显示了利用式(1)和式(2)计算得出的WAS水解和厌氧酸化的效率。结果表明，在不同pH条件下，ADC组中的水解和酸化效率均高于空白组。其中，ADC组的水解效率在pH为7.0、6.0、5.0时分别提升了25.4%、13.2%和12.1%，酸化效率分别提升了138.5%、184.0%和103.4%。例如，pH=5.0时，添加ADC后，污泥的水解效率由30.5%±0.3%增加至41.8%±1.6%，酸化效率由34.8%±7.0%增加至70.8%±4.4%。因此，ADC菌群可通过提高EPS中典型大分子有机物的水解和酸化得效率，实现强化WAS厌氧发酵生产VFA。
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图5显示了经过60 d培养的ADC菌群和WAS菌群的二代测序结果。其中，OTU指数和Shannon指数(图5(a)和图5(b))表明测序结果具有较高的覆盖度，能够体现菌群的多样性。经过恒化器的长期培养，ADC的菌群多样性明显低于WAS菌群。在门水平上(图5(c))，WAS菌群包含绿弯菌门(Chloroflexi，丰度为11.8%)、放线菌门(Actinobacteriota，丰度为17.7%)、拟杆菌门(Bacteroidota，丰度为20.5%)、变形菌门(Proteobacteria，丰度为24.0%)等。而ADC菌群(图5(c))则主要以拟杆菌门(Bacteroidota，丰度为52.7%)和厚壁菌门(Firmicutes，丰度为36.7%)为主。同样，在属水平上(图5(d))也表现出了同样的结果。WAS中属水平下菌群种类更多，而ADC中主要以拟杆菌属(Bacteroides，丰度为37.3%)、颤杆菌克属(Oscillibacter，丰度为18.6%)和厌氧棍状菌属(Anaerotruncus，丰度为10.5%)为主要菌属。ZHANG等[19]发现，拟杆菌属具有藻酸盐降解的功能，但其百分比低于1%。而在本研究中，通过恒化器的长期培养，可以得到拟杆菌属(丰度为37.3%)相对丰度较高的ADC菌群。
有研究表明，EPS的主要组分是蛋白和多糖类物质，并且已有较多采用蛋白酶和多糖水解酶促进污泥水解的研究案例[27-28]。以藻酸盐为代表的酸性多糖是EPS中新分离的组分[16, 29]。本研究中所富集的ADC菌群，具有降解多种典型WAS有机质的能力(图2)，能够明显地促进WAS水解和酸化(图3和图4)。综合分析可知，采用ADC菌群与蛋白酶、多糖水解酶联合处理可以促进WAS的资源化，不过仍需要进一步研究。综上所述，ADC菌群是对生物法加速污泥水解和酸化的补充，可为促进污泥资源化提供了新的思路。
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1)经恒化器培养出的高活性ADC菌群具有较高的藻酸盐转化能力，COD的转化率达到80.0% ± 9.6%。
2) ADC菌群对聚半乳糖醛酸、葡聚糖和酪蛋白等WAS的典型成分均具有较好的厌氧降解能力。
3)在不同的pH条件下，ADC对WAS的水解和酸化过程均存在促进作用。ADC组的水解效率在pH为7.0、6.0、5.0时分别提升了25.4%、13.2%和12.1%，酸化效率分别提升了138.5%、184.0%和103.4%。pH为6.0是ADC菌群促进剩余污泥酸化的最佳工艺条件。
4)经过恒化器的长期富集，ADC菌群以拟杆菌属(Bacteroides，丰度为37.3%)为主。
藻酸盐降解菌群强化剩余污泥厌氧发酵产酸
Enhanced acidogenesis of waste activated sludge fermentation by an alginate-degrading consortium
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摘要: 厌氧发酵是实现剩余污泥(WAS)资源化的重要技术，而其中的水解阶段是剩余污泥(WAS)厌氧资源化的限速步骤。WAS中的酸性多糖(藻酸盐和半乳糖醛酸等)能够与水中阳离子形成凝胶类物质，从而维持污泥结构并阻碍微生物的水解。利用藻酸盐为底物，经过恒化器培养得到了高效的藻酸盐降解菌群(ADC)。该菌群对WAS的典型有机成分(聚半乳糖醛酸、葡聚糖和酪蛋白等)均具有较好的厌氧降解能力，其代谢产物以乙酸等短链脂肪酸为主。而且，ADC菌群对WAS的水解和酸化过程均存在促进作用；在pH为7.0、6.0、5.0的条件下，水解效率分别提升了25.4%、13.2%和12.1%，酸化效率则分别提升了138.5%、184.0%和103.4%。Illumina Miseq高通量测序结果表明，该菌群以拟杆菌属(Bacteroides，37.3%)为主。本研究结果可为剩余污泥厌氧资源化提供参考。Abstract: Anaerobic fermentation is an important biotechnology to convert the waste activated sludge to valuable biochemicals. But, hydrolysis is known as the rate-limiting step of WAS fermentation. The uronic acids (such as alginate and polygalacturonic acid) in WAS can form hydrogels with cationic ions in wastewater, which maintain sludge structure and retard the microbial hydrolysis. An alginate-degrading consortium (ADC) with high activity was enriched in a mesophilic chemostat using alginate as the substrate. The results showed that the typical organic components of WAS, including polygalacturonic acid, dextran, and casein, could be utilized by the enriched ADC, and the metabolites were volatile fatty acids, like acetate. Moreover, hydrolysis and acidification of WAS were also enhanced by dosing ADC, of which, the hydrolytic efficiency at pH 7.0, 6.0, and 5.0 increased by 25.4%, 13.2%, and 12.1%, respectively, and the acidification efficiency increased by 138.5%, 184.0%, and 103.4%, respectively. The genus Bacteroides (37.3%) was identified as the dominant bacteria in ADC by an Illumina Miseq high-throughput sequencing. The results of this study can provide references for anaerobic resource utilization of WAS.
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图 1 以藻酸盐为底物的恒化器厌氧运行状况
Figure 1. Performance of a mesophilic chemostat with alginate as substrate
图 2 ADC菌群利用模拟物质厌氧酸化的情况
Figure 2. Distribution of produced VFAs from typical organics by dosing ADC
图 3 不同pH条件下ADC菌群强化剩余污泥厌氧酸化
Figure 3. Enhanced VFAs production by dosing ADC bacteria under different pH conditions
图 4 不同pH条件下剩余污泥的SCOD值及水解和酸化的效率
Figure 4. Released SCOD and hydrolysis and acidification efficiency of WAS under different pH conditions
表 1 剩余污泥基本特性
Table 1. Basic characteristics of WAS
pH TSS/
(g·L−1)VSS/
(g·L−1)TCOD/
(g·L−1)SCOD/
(g·L−1)PS/
(mg·L−1)PN/
(mg·L−1)7.2 ± 0.1 21.7 ± 2.2 10.2 ± 0.1 10.4 ± 1.6 0.10 ± 0.01 2.7 ± 0.1 237.3 ± 4.9 
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