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剩余污泥(waste activated sludge，WAS)是在城市污水处理过程中形成的主要副产物。据报道，2019年我国剩余污泥(80%含水率)的产生量超过6 000×104 t[1-2]。剩余污泥中通常含有有毒有害有机物、重金属、病原菌和寄生虫卵等，具有较大的二次污染风险[3]。目前，污泥的处理以堆埋、焚烧、农业堆肥和自然干化为主，所需费用较高(占污水处理厂总运行费用的50%~60%) [4-5]。厌氧发酵是一种重要的环境生物技术，能够利用剩余污泥生产甲烷和短链脂肪酸(VFA)等多种化学品[3, 6-7]。而且，短链脂肪酸可以作为污水处理厂反硝化的碳源，从而进一步降低污水处理厂的运行成本[8]。因此，将混菌厌氧发酵技术应用于市政污泥处置，是实现其资源化的重要手段。
市政污泥的主要有机成分复杂，包括细胞、胞外聚合物(EPS)和少量纤维素等[9-10]，导致了厌氧发酵技术面临生物水解速率慢等诸多问题。例如，厌氧反应器需要较长的水力停留时间(20~30 d)，但其有机物去除率仍然不高(30%~50%)[9]。剩余污泥中的EPS组分占污泥有机质干重的50%~80%，具有维持微生物聚集体结构和保持其功能完整性的作用[10]。因此，一般认为EPS组分是导致市政污泥水解困难的主要因素。目前，主要采用预处理过程(超声波处理、水热处理、酸碱处理和高级氧化处理等)来破坏EPS和细胞壁的结构，以降低污泥生物处置的阻力和提高污泥中有机物的可利用性[9, 11]。例如，ZHANG等[12]发现，通过外源投加钢渣和碱处理，污泥中有机物水解程度随pH的增加而增加，20 d后可溶性有机碳质量浓度比空白组增加了1.0 g·L−1。ARENAS等[13]报道，碱性条件下电氧化预处理后可溶性有机物增量最大，总有机碳和可溶性COD(SCOD)的质量浓度分别为2.8和7.8 g·L−1，而空白组仅为0.4和1.1 g·L−1。然而，上述预处理方法选择性不高，并且增加了装置的额外运行成本。
EPS中的酸性多糖(藻酸盐和半乳糖醛酸等)能够与水中阳离子形成凝胶类物质[14-17]，可维持污泥结构并阻碍微生物的水解作用。其中，藻酸盐是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按(1→4)糖苷键连接而成。LIN等[18]通过鉴定发现，污泥絮体中藻酸盐类似物的质量分数达到7%。然而，目前有关藻酸盐降解及其对污泥发酵影响的报道仍然较少。因此，本研究首先构建以藻酸盐为底物的恒化器，培养稳定的藻酸盐降解菌群(alginate-degrading consortium，ADC)，并通过高通量测序分析菌群结构；其次，利用EPS中存在的典型物质(聚半乳糖醛酸，酪蛋白，纤维素和葡聚糖)作为底物，解析ADC促进EPS水解酸化的功能；最后，将ADC应用到实际剩余污泥体系中，解析3种典型pH(5.0，6.0和7.0)条件下ADC对污泥水解和酸化效率的促进能力，以期为强化污泥产酸提供新的思路。
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本实验所用的剩余污泥取自福建省福州市金山污水处理厂的二沉池，实验前存放于4 ℃冰箱中，污泥基本特性如表1所示。
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1)恒化器长期实验。构建恒化器，总体积为3.2 L，工作体积为2.5 L。接种微生物(50 mL)源于以藻酸盐为底物培养的厌氧菌群[19]。恒化器进水藻酸盐的质量浓度为10 g·L−1，无机培养基的成分与ZHANG等[19]报道的相同，并添加10 mmol·L−1 2-溴乙基磺酸钠(BES)以抑制甲烷生成。利用99%纯度的N2将恒化器曝气20 min。恒化器运行时间为60 d，并监测代谢产物的变化。
2)模拟物质厌氧酸化实验。为了解析ADC以EPS作为底物进行水解和厌氧酸化的功能，以聚半乳糖醛酸、纤维素、葡聚糖和酪蛋白作为EPS的典型代表物质，接种ADC作为底物进行为期14 d的厌氧酸化。每1种底物设置3个重复。在120 mL血清瓶中添加60 mL无机培养基，并加入10 mmol·L−1 BES，底物的质量浓度为5 g·L−1、pH为5.5、接种量为10 mL(转速10 000 r·min−1、离心5 min，弃上清液)。利用纯度为99%的N2曝气10 min，密封后放入37 ℃的振荡培养箱进行培养并分析代谢产物。
3)不同pH剩余污泥厌氧酸化实验。将储存在4 ℃冰箱的污泥取出，利用1 mol·L−1 NaOH和HCl将其pH分别调至5.0、6.0和7.0，每个水平分为对照组和实验组2个处理。其中，对照组为原污泥，实验组中接种20 mL ADC菌群。每个处理分装于120 mL血清瓶中(n = 3)，液相为60 mL，最后曝气密封并放入恒温箱培养。发酵时间持续12 d，分析污泥发酵过程中的产气(H2和CH4)、水解(SCOD)和酸化(VFA)等参数，并计算水解和酸化效率。
4)水解酸化效率的计算。为了量化在经过不同处理之后，对照组和实验组在不同pH下污泥水解和酸化的情况，利用式(1)和公式(2)分别计算厌氧发酵过程中的水解和酸化效率[20]。
式中：Eh为水解效率；SCODi为对应各个时间点的溶解性COD，g·L−1；TCOD为污泥总COD，g·L−1。
式中：Ea为酸化效率；TVFAi为对应各个时间点总挥发性有机物的质量浓度，g·L−1。
5)分析方法。CH4和H2的体积分数采用气相色谱仪(SP7890，山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司)测定。短链脂肪酸样品用0.45 μm 滤膜过滤，之后保存于4℃冰箱中。短链脂肪酸的质量浓度由气相色谱仪(7890，安捷伦科技有限公司)测定。恒化器中藻酸盐的质量浓度采用硫酸-咔唑法测定[21]。TCOD和SCOD用重铬酸钾法测定[22]。污泥中多糖的质量浓度采用硫酸-蒽酮法测定，蛋白的质量浓度则采用Lowry 法分析[23]。pH采用pH计(PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司)测定。
6)DNA提取和Illumina Miseq高通量测序。2个DNA样本分别提取自剩余污泥和恒化器中培养60 d的菌群，命名为WAS和ADC。DNA序列扩增(引物341F-806R[19])由ABI GeneAmp® 9700进行，之后使用Illumina Miseq PE 300测序仪进行测序。基于上述测序结果分析菌群的多样性。
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恒化器运行时间为60 d，运行期间水力停留时间(HRT)通过调控稳定在(4.4 ± 0.2) d，pH维持在酸性(5.5 ± 0.2)条件。如图1(a)所示，恒化器出水藻酸盐的质量浓度远小于进水(10 g·L−1)，仅为(0.10 ± 0.06)g·L−1。这说明，在长期培养中，ADC菌群具有良好的藻酸盐降解功能。TSS和VSS分别为(1.4 ± 0.2)和(0.80 ± 0.04)g·L−1。恒化器运行期间，每日产气量小于50 mL(产气速率为(17.2~48.6) mL·d−1)，其中，H2在气相中的体积分数为1.6% ± 0.8%。H2的消耗归因于同型产乙酸菌群的作用[8, 24]。为了保证厌氧酸化阶段运行的稳定，期间持续添加BES以抑制产甲烷菌群活性，因此仅监测到痕量的CH4(体积分数于0.1%)。图1(b)显示了恒化器中ADC菌群厌氧产酸情况，VFA的组成成分主要为乙酸、丙酸和丁酸，质量浓度分别为(2.1 ± 0.2)、(0.8 ± 0.1)和(0.6 ± 0.2)g·L−1。根据COD平衡的计算，恒化器的COD转化率为80.0% ± 9.6%。上述结果说明，在长期培养中，ADC具有高效的藻酸盐降解能力。
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剩余污泥EPS中主要的可生物降解有机组分含有多糖(包括中性糖和酸性糖)和蛋白质[11]。因此，以聚半乳糖醛酸、酪蛋白、纤维素和葡聚糖4种典型有机底物，探究ADC菌群利用不同有机底物产气和产酸的情况。在整个反应期间，4组实验的H2体积分数最高为7.9% ± 0.1%，这与恒化器运行(图1)的结果相似。由于添加了BES，故4组实验均未检测出CH4。
ADC菌群利用4种模拟底物厌氧产酸情况如图2所示，其中分别采用聚半乳糖醛酸(图2(a))代表酸性糖，以葡聚糖(图2(b))和纤维素(图2(c))代表中性糖，以酪蛋白(图2(d))代表蛋白质。结果表明，ADC菌群降解模拟物质中的代谢产物主要以乙酸、丙酸和丁酸为主。其中，代谢聚半乳糖醛酸和葡聚糖生产乙酸的质量浓度最终分别为(0.6 ± 0.03)和(0.9 ± 0.05)g·L−1，而利用酪蛋白和纤维素生产乙酸的质量浓度仅为(0.2 ± 0.01)和(0.4 ± 0.04)g·L−1。以葡聚糖作为底物时，丙酸的最大质量浓度为(0.6 ± 0.04)g·L−1；其余底物中生成丙酸的质量浓度相对稳定。ADC以酪蛋白和葡聚糖为底物时的主要产物是丁酸，质量浓度分别为0.5和0.7 g·L−1。以聚半乳糖醛酸和纤维素为底物时产生了较少的丁酸，质量浓度分别为(0.3 ± 0.05)和(0.3 ± 0.001)g·L−1。上述结果表明，ADC菌群具有降解EPS中各类典型有机质生产短链脂肪酸的能力。
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在整个反应期间，3组实验的H2体积分数始终低于0.4% ± 0.1%，这与恒化器运行(图1)的结果相似。由于添加了产甲烷抑制剂BES，故4组实验中均未检测出CH4。图3显示了在不同pH处理中空白组和添加ADC组的厌氧产酸情况。在3组pH条件下，WAS的代谢产物以乙酸、丙酸和丁酸为主，并且添加ADC组的产酸质量浓度均高于空白组。在pH=7时，ADC组最终的乙酸、丙酸和丁酸的质量浓度分别累积到(0.9 ± 0.02)、(0.4 ± 0.02)和(0.5 ± 0.03)g·L−1，而对照组仅为(0.4 ± 0.08)、(0.2 ± 0.04)和(0.1 ± 0.01)g·L−1。在pH=6和pH=5的条件下也出现了类似的结果，在厌氧酸化第11 d时测得对照组中乙酸质量浓度分别为(0.4 ± 0.05)和(0.4 ± 0.01)g·L−1，丙酸质量浓度均为(0.2 ± 0.01)g·L−1；而在实验组中的VFA产量得到了明显的提升，其中，乙酸质量浓度为(1.1 ± 0.01)和(0.9 ± 0.02)g·L−1，丙酸质量浓度为(0.4 ± 0.03)和(0.4 ± 0.02)g·L−1。因此，结合第2.2节的实验结果可知，ADC可以通过破坏EPS结构以加速WAS的水解和厌氧产酸。
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WAS絮体结构的破坏可导致胞外和胞内有机物的释放和溶解[25-26]。因此，通过测定厌氧酸化过程中的SCOD可以量化ADC菌群对WAS水解和酸化阶段的促进作用。图4(a)~图4(c)显示了在ADC组和空白组中不同pH条件下SCOD的变化情况，在pH分别为7.0、6.0和5.0时，空白组中厌氧酸化最终SCOD分别为(3.1±0.12)、(4.4±0.07)和(3.2±0.03)g·L−1；而在ADC组中，相应pH条件下的SCOD均有所提升。图4(d)~图4(f)显示了利用式(1)和式(2)计算得出的WAS水解和厌氧酸化的效率。结果表明，在不同pH条件下，ADC组中的水解和酸化效率均高于空白组。其中，ADC组的水解效率在pH为7.0、6.0、5.0时分别提升了25.4%、13.2%和12.1%，酸化效率分别提升了138.5%、184.0%和103.4%。例如，pH=5.0时，添加ADC后，污泥的水解效率由30.5%±0.3%增加至41.8%±1.6%，酸化效率由34.8%±7.0%增加至70.8%±4.4%。因此，ADC菌群可通过提高EPS中典型大分子有机物的水解和酸化得效率，实现强化WAS厌氧发酵生产VFA。
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图5显示了经过60 d培养的ADC菌群和WAS菌群的二代测序结果。其中，OTU指数和Shannon指数(图5(a)和图5(b))表明测序结果具有较高的覆盖度，能够体现菌群的多样性。经过恒化器的长期培养，ADC的菌群多样性明显低于WAS菌群。在门水平上(图5(c))，WAS菌群包含绿弯菌门(Chloroflexi，丰度为11.8%)、放线菌门(Actinobacteriota，丰度为17.7%)、拟杆菌门(Bacteroidota，丰度为20.5%)、变形菌门(Proteobacteria，丰度为24.0%)等。而ADC菌群(图5(c))则主要以拟杆菌门(Bacteroidota，丰度为52.7%)和厚壁菌门(Firmicutes，丰度为36.7%)为主。同样，在属水平上(图5(d))也表现出了同样的结果。WAS中属水平下菌群种类更多，而ADC中主要以拟杆菌属(Bacteroides，丰度为37.3%)、颤杆菌克属(Oscillibacter，丰度为18.6%)和厌氧棍状菌属(Anaerotruncus，丰度为10.5%)为主要菌属。ZHANG等[19]发现，拟杆菌属具有藻酸盐降解的功能，但其百分比低于1%。而在本研究中，通过恒化器的长期培养，可以得到拟杆菌属(丰度为37.3%)相对丰度较高的ADC菌群。
有研究表明，EPS的主要组分是蛋白和多糖类物质，并且已有较多采用蛋白酶和多糖水解酶促进污泥水解的研究案例[27-28]。以藻酸盐为代表的酸性多糖是EPS中新分离的组分[16, 29]。本研究中所富集的ADC菌群，具有降解多种典型WAS有机质的能力(图2)，能够明显地促进WAS水解和酸化(图3和图4)。综合分析可知，采用ADC菌群与蛋白酶、多糖水解酶联合处理可以促进WAS的资源化，不过仍需要进一步研究。综上所述，ADC菌群是对生物法加速污泥水解和酸化的补充，可为促进污泥资源化提供了新的思路。
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1)经恒化器培养出的高活性ADC菌群具有较高的藻酸盐转化能力，COD的转化率达到80.0% ± 9.6%。
2) ADC菌群对聚半乳糖醛酸、葡聚糖和酪蛋白等WAS的典型成分均具有较好的厌氧降解能力。
3)在不同的pH条件下，ADC对WAS的水解和酸化过程均存在促进作用。ADC组的水解效率在pH为7.0、6.0、5.0时分别提升了25.4%、13.2%和12.1%，酸化效率分别提升了138.5%、184.0%和103.4%。pH为6.0是ADC菌群促进剩余污泥酸化的最佳工艺条件。
4)经过恒化器的长期富集，ADC菌群以拟杆菌属(Bacteroides，丰度为37.3%)为主。
藻酸盐降解菌群强化剩余污泥厌氧发酵产酸
Enhanced acidogenesis of waste activated sludge fermentation by an alginate-degrading consortium
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摘要: 厌氧发酵是实现剩余污泥(WAS)资源化的重要技术，而其中的水解阶段是剩余污泥(WAS)厌氧资源化的限速步骤。WAS中的酸性多糖(藻酸盐和半乳糖醛酸等)能够与水中阳离子形成凝胶类物质，从而维持污泥结构并阻碍微生物的水解。利用藻酸盐为底物，经过恒化器培养得到了高效的藻酸盐降解菌群(ADC)。该菌群对WAS的典型有机成分(聚半乳糖醛酸、葡聚糖和酪蛋白等)均具有较好的厌氧降解能力，其代谢产物以乙酸等短链脂肪酸为主。而且，ADC菌群对WAS的水解和酸化过程均存在促进作用；在pH为7.0、6.0、5.0的条件下，水解效率分别提升了25.4%、13.2%和12.1%，酸化效率则分别提升了138.5%、184.0%和103.4%。Illumina Miseq高通量测序结果表明，该菌群以拟杆菌属(Bacteroides，37.3%)为主。本研究结果可为剩余污泥厌氧资源化提供参考。Abstract: Anaerobic fermentation is an important biotechnology to convert the waste activated sludge to valuable biochemicals. But, hydrolysis is known as the rate-limiting step of WAS fermentation. The uronic acids (such as alginate and polygalacturonic acid) in WAS can form hydrogels with cationic ions in wastewater, which maintain sludge structure and retard the microbial hydrolysis. An alginate-degrading consortium (ADC) with high activity was enriched in a mesophilic chemostat using alginate as the substrate. The results showed that the typical organic components of WAS, including polygalacturonic acid, dextran, and casein, could be utilized by the enriched ADC, and the metabolites were volatile fatty acids, like acetate. Moreover, hydrolysis and acidification of WAS were also enhanced by dosing ADC, of which, the hydrolytic efficiency at pH 7.0, 6.0, and 5.0 increased by 25.4%, 13.2%, and 12.1%, respectively, and the acidification efficiency increased by 138.5%, 184.0%, and 103.4%, respectively. The genus Bacteroides (37.3%) was identified as the dominant bacteria in ADC by an Illumina Miseq high-throughput sequencing. The results of this study can provide references for anaerobic resource utilization of WAS.
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随着社会经济的发展，柴油的使用量增加，但是柴油在生产、运输、装卸、加工及使用过程中的泄露会对土壤环境造成一定的污染，直接或间接地危害人类的生命与健康[1-2]。因此，解决柴油污染土壤问题已成为世界各国所共同面临的问题[3]。
目前，针对柴油污染土壤修复的方法主要包括机械、物理、化学和生物修复方法等[4]。其中，机械、物理、化学修复方法具有费用高、容易产生二次污染等不足[5-7]。而生物修复技术是一种高效、环境友好、低成本的技术，能够将柴油等污染物通过微生物代谢转化成无毒的终产物[8-9]，因而被广泛应用于修复柴油污染土壤之中[10]。刘沙沙等[11]已成功利用醋酸钙不动杆菌降解柴油以及污染物，经过62 d的生物修复实验，柴油去除率为69.8%。然而，柴油组成的复杂性决定了其降解需要有不同菌株的参与[12]，TAO等[13]研究了土著细菌联合体与外源芽孢杆菌(Bacillus subtilis)共同培养降解原油的实验，细菌群落分析结果表明，在确定的共培养条件下，细菌多样性降低，降解效率提高，同时证明芽孢杆菌对长链烷烃有很好的降解效果。
大量的研究证明，微生物在修复有机物污染土壤的过程中具有良好的应用前景，但目前对于构建微生物菌群的研究较少，本研究从柴油污染土壤中筛选、分离出能够降解柴油污染物的微生物，采用组合实验构建优势菌群，探究了其柴油生物降解特性，研究分析了该菌群中各菌种之间的互作机制，为构建降解柴油的菌群提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器与原料
紫外分光光度计(UV-2102C，中国上海)，GC-MS(Agilent6890/5975I，安捷伦)，台式高速冷冻离心机(H-2050R，中国长沙)，恒温振荡培养箱(HZQ-X160，中国太仓)。实验所用试剂均为分析纯。
柴油污染土壤取自上海金山卫金山大道城河路；柴油为市售0#柴油(密度：0.84 kg·L−1)；菌种：实验所用菌种均为从柴油污染土壤样品中筛选分离得到。
1.2 实验方法
1)微生物菌种生物量的测定方法。将菌落接种于灭菌的种子培养基中，每2 h取样，采用分光光度计在波长600 nm下测定吸光度值，绘制柴油降解细菌的生长曲线。
2)微生物菌种对柴油降解能力的测定方法。残余柴油浓度采用分光光度法[14]进行测定。菌株对柴油的降解能力采用柴油降解率表示。降解率计算公式如式(1)所示。
R=C0−CtC0×100% (1) 式中：R为柴油降解率；C0为柴油的初始浓度，mg·mL−1；Ct为柴油的降解过程测定浓度，mg·mL−1。
3)微生物高效降解柴油的条件优化实验。以构建好的柴油污染物降解菌群为研究对象，考察了初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、初始柴油浓度(1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL·L−1)、初始接种量(体积比5.0%、10.0%、15.0%)对柴油降解率和细菌生物量的影响结果。在30 ℃，150 r·min−1条件下培养5 d，定时取样并测定其中的柴油降解率以及生物量的变化，每组实验重复3次，取其平均值。
4)微生物多样性测试。将培养24 h的菌群混合液按10%的接种量接种到无机盐培养基中，柴油浓度为7.0 mL·L−1，pH=7.0，在30 ℃，150 r·min−1条件下培养，14 d后，将混合菌进行收集，离心弃上清液，收集菌体，测试微生物多样性，该工作由上海美吉医药科技有限公司完成。
5)微生物降解柴油产物的检测。将筛选获得的高效单菌种分别接种到种子培养基中，培养24 h后，离心收集菌体，稀释使其OD600=1.50，并按照最佳的体积比混合后接种于无机盐培养基中，以不加细菌为对照组，柴油浓度为7.0 mL·L−1，在30 ℃、150 r·min−1的恒温振荡培养箱中培养14 d。然后将培养基取出加入1∶1(体积比)硫酸5.0 mL酸化水样，继续加入0.2 g·L−1的氯化钠破乳[15]，然后加入石油醚20.0 mL(60~90 ℃)超声10 min。将上述溶液8 000 r·min−1离心10 min，将上清液转移至另一干净的三角瓶中，下层溶液倒入原三角瓶并用石油醚重新提取1次。合并2次提取液，过膜，利用GC-MS测定培养基内降解产物组成及含量。
6)微生物降解十五烷产物的检测。将本研究所构建的混合菌群接种于添加了十五烷(7.0 mL·L−1)的无机盐培养基中，在30 ℃、150 r·min−1的振荡箱里培养14 d，分别取降解3、6、14 d的培养液，按照上述方法处理并检测。
2. 结果与讨论
2.1 柴油降解菌的富集驯化结果
从柴油污染土壤中筛选获得4株具有较强柴油降解能力的菌株，其菌落形态和柴油降解能力结果见表1。
表 1 菌株的菌落形状及柴油降解能力Table 1. Colony shape and diesel degradability of strains菌株号 菌落形态 菌体形态 菌落颜色 降解率/% 1# 菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙皱褶 杆状 白色 27.0 2# 菌落透明、光滑、有光泽 球形 白色 29.0 3# 菌落微黄、表面光滑、边缘整齐 杆状 微黄色 32.0 4# 菌落淡红色、湿润、不规则 杆状 淡红色 35.0 | Show Table
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2.2 高效降解菌的初步鉴定
微生物初步鉴定结果如表2所示。通过16S rRNA测序结果可知，1#、2#、3#、4#菌株分别与Bacillus sp. VOC18、Enterococcus faecalis、Lysinibacillus、Rhodococcus equi有97%、98%、99%、99%的相似性。本研究分别对1#、2#、3#、4#菌株命名为Bacillus sp. VOC18-L1，Enterococcus faecalis-L2，Lysinibacillus-L3，Rhodococcus equi-L4(简称L1，L2，L3和L4)。
表 2 4种柴油降解菌株的生理生化实验结果Table 2. Physiological and biochemical characteristics of four diesel degrading bacteria实验类型 菌株号 1# 2# 3# 4# 淀粉水解实验 − − − − 明胶实验 + − + + 尿素实验 − + − − 甲基红实验 + − + + V-P实验 + − + − 吲哚实验 − − − − 柠檬酸盐实验 − − − − 硫化氢实验 − − − + 触酶实验 − + − + 葡萄糖发酵实验 + − + + 乳糖发酵实验 − − − − 木糖发酵实验 − − − − 麦芽糖发酵实验 + − + + 蔗糖发酵实验 + − − − 注：“+”表示显阳性，“−”表示显阴性。 | Show TableDownLoad:
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2.3 菌株的生长曲线分析结果
每种菌的生长曲线如图1所示。由图1可知，4种细菌在24 h均进入指数生长阶段，在该阶段，微生物生长速度快，活性较强，因此，后续实验均采用培养24 h的菌液为接种液。
图 1 柴油降解菌L1、L2、L3和L4的生长曲线Figure 1. Growth curves of diesel oil degrading bacteria L1, L2, L3 and L42.4 菌群构建的结果分析
菌群构建的结果如表3所示。由表3可知，编号11的菌群组合在5 d内对柴油的降解率最高，可达到39.6%，这可能是由于不同菌种之间的协同作用，使得混合培养的菌群对于柴油污染物的降解效果要优于单菌，因此，选用该混合菌群作为最佳降解菌群进行后续的研究。
表 3 菌种组合对柴油降解效率的实验结果Table 3. Experimental results of degradation efficiency of diesel oil by species strain combination编号 组合 降解率/% 1 L1+L2 20.9 2 L1+L3 26.2 3 L1+L4 26.1 4 L2+L3 25.8 5 L2+L4 30.9 6 L3+L4 29.3 7 L1+L2+L3 23.5 8 L1+L2+L4 31.5 9 L1+L3+L4 25.0 10 L2+L3+L4 21.1 11 L1+L2+L3+L4 39.6 12 空白 10.9 | Show TableDownLoad:
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2.5 柴油降解菌群的混合配比及降解柴油的条件优化
1)采用正交实验法确定柴油降解菌群的最佳菌种混合比例。菌群中各菌种的相对含量对柴油等有机物的降解效率有显著的影响。因此，本研究通过正交实验研究了不同混合比例的菌种对柴油降解效率的影响关系，结果如表4所示。由表4可知，降解效果最好的菌种比例为L1∶L2∶L3∶L4=3∶1∶3∶4，在5 d时，降解柴油效率为52.5%，本研究将此比例的微生物组合命名为OCDL-3134。由于该菌群中的每种细菌都具有特定的作用，因此，柴油降解效率明显得到提高[16-17]。然而，将培养了14 d的微生物进行多样性分析结果如图2所示，由图2可以看出，OCDL-3134经过14 d的培养后，菌种之间的比例变为2∶6∶5∶1，这说明在降解过程中，4种菌根据环境的变化发挥着协同作用，并自行调整他们之间的相对丰度，以实现充分利用柴油污染物的目的。此时L2和L3菌种变为优势菌种，说明在培养后期，L2和L3菌种发挥了重要作用，这与其自身的功能是相一致的。同时也表明确定各种微生物的初始接种比例的菌群构建方案具有一定的合理性。有研究[18]表明，一旦长链烷烃耗尽，就会缺乏碳源和能量用于其生长，而由长链烷烃降解形成的短链烃类化合物则被其他菌种继续代谢利用而进一步降解。
表 4 4种柴油降解菌的接种比例和对应的柴油降解效率表Table 4. Inoculation ratio of four diesel oil degrading bacteria and their diesel oil biodegradation efficiency接种比例(L1∶L2∶L3∶L4) 降解率/% 接种比例(L1∶L2∶L3∶L4) 降解率/% 3∶3∶1∶2 16.5 2∶4∶3∶2 14.8 1∶1∶1∶1 39.3 4∶1∶4∶2 18.5 2∶1∶2∶3 15.3 2∶2∶1∶4 15.7 4∶4∶1∶3 21.4 4∶3∶2∶4 19.1 3∶4∶2∶1 15.6 1∶2∶2∶2 25.5 2∶3∶4∶1 13.7 3∶1∶3∶4 52.5 1∶4∶4∶4 22.3 3∶2∶4∶3 13.2 1∶3∶3∶3 13.1 4∶2∶3∶1 11.7 | Show TableDownLoad:
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图 2 OCDL-3134降解柴油14 d后的菌群结构示意图Figure 2. Analysis of microbial community structure of OCDL-3134 for diesel oil degradation after 14 d2)初始pH对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。环境pH可引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，改变营养物质的可给性和有害物质的毒性。本研究探讨了初始pH对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。由图3(a)可知，当环境pH过高或过低时，会对微生物产生抑制，这可能是由于此条件严重影响了细菌利用柴油的能量和物质代谢进程，从而影响菌体生长，因此会显著降低柴油的生物降解效率。当pH为7.0时，OCDL-3134对柴油降解的效率达到最佳，此时生物量也达到最高，如图3(b)所示。因此，OCDL-3134对柴油的降解效率和生物量的最佳初始pH均为7.0。
图 3 初始pH对OCDL-3134的柴油降解效率和细菌生物量影响Figure 3. Effect of initial pH on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134 and bacteria biomass3)柴油浓度对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。柴油浓度是微生物代谢过程的一个重要因素，对微生物降解性能有一定影响[19]。柴油浓度较低时，碳源不足，细菌生长缓慢，对柴油降解效果不佳。随着柴油浓度的增加，碳源可以满足微生物生长，微生物的降解效果也随之增大。但随着柴油浓度继续增加，柴油降解菌的活性受到抑制，同时培养基表面形成一层油膜，使得溶液内的溶解氧浓度降低，抑制微生物的生长繁殖，从而影响对柴油的降解。如图4(a)所示，随着柴油浓度的增大，微生物的柴油降解率呈先上升后下降的趋势，在柴油浓度为7.0 mL·L−1时，降解效果最好，达到50.0%以上。同时，图4(b)为初始柴油浓度对生物量的影响结果，随着柴油初始浓度的增加，生物量呈先增后降的趋势，结果表明OCDL-3134在初始柴油浓度为7.0 mL·L−1时生物量最佳。
图 4 初始柴油浓度对OCDL-3134降解柴油效率及细菌生物量的影响Figure 4. Effect of initial diesel oil concentration on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134 and bacteria biomass4)接种量对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。如图5所示，接种量在体积比为10.0%时，微生物对柴油的降解率较高。此后，再增加接种量反而导致新增细胞减少，进而使菌株整体活性下降，降解柴油的后劲不足。15.0%的接种量虽然生物量最多，但由于微生物大量繁殖，造成菌株集中，短时间内消耗了培养基中大量营养成分，不利于新菌株的持续生长，从而影响了菌株对柴油的降解率，因此，根据实验结果最佳接种量为10.0%。
图 5 接种量对OCDL-3134降解柴油效率及细菌生物量的影响Figure 5. Effect of inoculation on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134and bacteria biomass2.6 菌群OCDL-3134降解柴油及十五烷过程中的产物分析
1)菌群OCDL-3134降解柴油过程中的产物分析。各单菌种和OCDL-3134对柴油降解的产物结果如图6所示。图6(a)是原始柴油的组分，由此可知，原始柴油的组分非常复杂，主要包括C13~C24的烷烃。图6(b)是L1培养14 d后的产物，通过与图6(a)对比可发现，L1对短链烷烃降解效果好，推测可能是由于该菌在生长代谢过程中产生了相应的表面活性剂[13]，促进了微生物与柴油的接触，从而对短链烷烃具有较好的降解效果；图6(c)是L2培养14 d后的产物，通过与图6(a)对比可发现，整体烃类的含量降低。该菌株具有利用该有机物代谢产酸的能力[20]，可以将柴油降解的一些产物分解成小分子的酸，因此，在柴油降解过程中发挥着重要作用；图6(d)是L3培养14 d后的产物。与图6(a)对比可发现，短链以及长链烷烃的含量菌有所减少。该菌能够在好氧条件下代谢简单的碳水化合物，因此，在小分子烃类物质的降解过程具有重要作用，同时在柴油降解的后期可能会具有重要贡献，这一点与图3的结果是一致的；图6(e)是L4培养14 d后产物，与图6(a)对比可发现，整体的烃类含量降低，而环苜蓿烯的含量也有明显的下降。有研究[20]表明，该菌株的主要特性是能够有效降解芳香烃，因此，对于柴油中芳香烃的降解具有重要作用。
图 6 L1、L2、L3、L4和OCDL-3134降解柴油的产物气相色谱图Figure 6. Gas chromatographic charts of products from diesel oil degradation by L1, L2, L3, L4 and OCDL-3134综上所述，L1、L2、L3、L4对柴油污染物中的有机烃类物质具有一定的降解效果，并且不同的菌种对不同链长的烃类物质降解效果也有显著差异。然而，L1、L2、L3、L4却不能将柴油完全降解。而L1、L2、L3、L4混合形成的菌群OCDL-3134对柴油降解效果显著，如图6(f)所示，相同时间内，柴油几乎被完全降解，转化成无毒无害的酸类小分子、二氧化碳和水。这表明混合菌对柴油的降解效率显著优于单菌株。
2)菌群OCDL-3134降解十五烷过程中的产物分析。使用GC-MS检测了以柴油作为碳源的微生物降解的产物，实验结果表明，混合菌群对柴油的降解效果显著优于单菌种的效果。对此已有大量研究[21]证明了微生物对柴油等有机污染物的降解作用，但是生物降解长链烷烃的机理研究报道并不多见，而且对其降解途径也缺乏了解。由于柴油属于混合物，且主要的烷烃为十五烷和十六烷，因此，本研究选择十五烷作为研究对象，初步探讨微生物降解十五烷的机理，如图7所示。由图7(a)可知，第3天样品中的主要成分是十五烷，这表明在前3 d菌种要先适应新环境，降解效率低。而到第6天，OCDL-3134中的各菌种在协同作用下将十五烷降解为C13H28、C13H26O2等化合物，如图7(b)所示。据报道[15]，微生物对直链烷烃最常见的降解途径为烷烃末端氧化，微生物攻击直链烷烃的末端甲基，由加氧酶、脱氢酶、水化酶等混合功能氧化酶催化，生成伯醇，再进一步氧化为醛和脂肪酸，脂肪酸接着通过氧化进一步代谢，被彻底氧化成二氧化碳和水。如图7(c)所示，在第15天，十五烷以及产物被OCDL-3134彻底降解为水和二氧化碳等小分子物质。
图 7 OCDL-3134降解十五烷在不同时间的产物气相色谱图Figure 7. Gas chromatographic charts of degradation of pentadecane by OCDL-3134 at different time3) OCDL-3134降解柴油过程中细菌代谢功能的预测。图8是从KEGG数据库中获得的代谢丰度图，碳水化合物代谢的丰度最好，表明微生物一开始是对柴油的代谢，而氨基酸的代谢功能丰度是其次的，可能发挥的作用是对中间代谢产物脱氨基，从而进一步代谢成醛、酮、酸等小分子物质，因此，细菌首先利用柴油，并将柴油分解成中间代谢产物，然后经过代谢途径分解成酸类小分子物质。其他的代谢途径如能量代谢、辅因子和维生素的代谢、核酸代谢等也参与进来，最终一起合作完成降解柴油的任务。而且可以发现，4种菌种的异质降解和代谢丰度较好，这一代谢丰度说明微生物具有增强降解柴油的能力，这与TAO等[13]的研究结果相一致，但由于是混合菌，故不能判断是哪一种菌种产生的作用。代谢功能预测进一步证明了混合菌在柴油完全降解方面优于单种菌种。
图 8 OCDL-3134代谢柴油的功能预测Figure 8. Metabolic function prediction of OCDL-3134 metabolizing diesel3. 结论
1)通过排列组合的方式将筛选出的微生物菌种进行组合，得出高效柴油降解菌群OCDL-3134，通过正交实验得出它们之间接种量最优比例为3∶1∶3∶4，同时对混合菌柴油降解性能进行优化，实验测得微生物降解柴油的最优条件为pH=7.0，初始柴油的浓度为7.0 mL·L−1，初始接种量为10.0%，在此优化条件下，测得第14天柴油的最佳降解率为89.0%，这说明所筛选的混合菌种具有较高的应用价值。
2)通过GC-MS检测和微生物多样性功能预测分析证明了微生物对柴油以及十五烷的协同作用高于单菌株的降解效果，4种菌种之间存在协同作用，能够将长链烷烃降解为短链烷烃和小分子物质，并获得自身生长与代谢的能源和碳源。KEGG数据库中获得的代谢丰度图也进一步证明了混合菌在柴油完全降解方面优单种菌种。
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图 1 以藻酸盐为底物的恒化器厌氧运行状况
Figure 1. Performance of a mesophilic chemostat with alginate as substrate
图 2 ADC菌群利用模拟物质厌氧酸化的情况
Figure 2. Distribution of produced VFAs from typical organics by dosing ADC
图 3 不同pH条件下ADC菌群强化剩余污泥厌氧酸化
Figure 3. Enhanced VFAs production by dosing ADC bacteria under different pH conditions
图 4 不同pH条件下剩余污泥的SCOD值及水解和酸化的效率
Figure 4. Released SCOD and hydrolysis and acidification efficiency of WAS under different pH conditions
表 1 剩余污泥基本特性
Table 1. Basic characteristics of WAS
pH TSS/(g·L−1) VSS/(g·L−1) TCOD/(g·L−1) SCOD/(g·L−1) PS/(mg·L−1) PN/(mg·L−1) 7.2 ± 0.1 21.7 ± 2.2 10.2 ± 0.1 10.4 ± 1.6 0.10 ± 0.01 2.7 ± 0.1 237.3 ± 4.9
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