所用化学试剂均为分析纯；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209，北京天根生化科技有限公司)；零背景pTOPO-TA克隆载体试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；TransStart® Tip Green qPCR SuperMix(AQ142-11，北京全式金生物技术公司)。富集硝化菌群的水样取自珠江穗石码头。

紫外-可见光分光光度计(UV-2800A，上海尤尼柯仪器有限公司)；立式压力蒸汽灭菌锅(GI80DP，美国致微仪器有限公司)；振荡培养箱(ZQLY-180G，上海知楚仪器有限公司)；pH测量仪(HQ40d，美国Hach公司)；超微量紫外可见光分光光度计(Nano Drop 1000，美国Thermo Fisher公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，美国Thermo Fisher公司)。

NOB液体培养基：0.5 g·L⁻¹ KCl，0.485 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O，1 g·L⁻¹ NaCl，0.3 g·L⁻¹ KH₂PO₄，0.1 g·L⁻¹ CaCl₂·2H₂O。以上成分高压蒸汽灭菌冷却后，加入过0.22 μm滤膜除菌的NaHCO₃、NaNO₂、微量元素母液，使其在培养基中的含量最终分别为2.5 mmol·L⁻¹、10 mmol·L⁻¹、体积分数1‰。在NOB液体培养基中加入质量分数为1.6%的琼脂。硝化菌群富集培养基：NOB液体培养基中NaNO₂替换为等浓度NH₄Cl。微量元素母液^[6]：10 mL 浓HCl，2.1 g·L⁻¹ FeSO₄·7H₂O，0.062 g·L⁻¹ H₃BO₃，0.017 g·L⁻¹ CuCl₂·2H₂O，0.100 g·L⁻¹ MnC1₂·4H₂O，0.036 g·L⁻¹ Na₂MoO₄·2H₂O，0.070 g·L⁻¹ ZnCl₂，0.190 g·L⁻¹ CoCl₂·6H₂O，0.024 g·L⁻¹ NiCl₂·6H₂O。

1)硝化菌群的富集和NOB的分离纯化。将10 mL珠江穗石码头水样接入装有90 mL富集培养基的锥形瓶中，在30 ℃、150 r·min⁻¹条件下振荡培养，每隔2 d取样检测$ {\rm{NH}}_4^{+} $-N、$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N、$ {\rm{NO}}_3^{-} $-N的含量，初始$ {\rm{NH}}_4^{+} $-N被AOB氧化为$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N，接着$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N被NOB氧化为$ {\rm{NO}}_3^{-} $-N，完成硝化过程。当硝化率达90%以上时，以10%体积比接种到新鲜富集培养基继续培养，以此获得稳定硝化菌群富集物，提取富集物DNA送至金唯智生物公司高通量测序。将富集液稀释涂布于NOB固体培养基平板上，在30 ℃恒温培养箱倒置培养28 d以上，挑取NOB单菌落至液体培养基进一步纯化，通过光学显微镜、扫描电镜观察NOB形态。

2) NOB的鉴定。以NOB菌液作为模板，用细菌16S rDNA通用引物^[7]27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR。PCR反应体系(25 μL)：2 μL NOB菌液，27F和1492R(10 μmol·L⁻¹)各0.5 μL，12.5 μL 2×Master Mix，9.5 μL ddH₂O。PCR反应条件：94 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。使用胶回收试剂盒回收纯化16S rDNA，采用零背景pTOPO-TA克隆载体试剂盒进行T-A克隆，经菌落PCR检测出阳性转化子并送至金唯智生物科技有限公司测序。将16S rDNA完整序列通过BLAST与Genebank数据库比对后，选择相似度较高的序列，用MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统进化树并分析同源性。

3)重金属、抗生素对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响。将NOB种子液以10%体积比接种至液体培养基中(初始$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N为80 mg·L⁻¹)，添加不同重金属、抗生素设置单一变量，在30 ℃、150 r·min⁻¹的条件下振荡培养，每12 h取样检测$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N含量。通过参考文献^[3-5,8]及预实验设定重金属实验组质量浓度梯度为Cu²⁺(0、1、5、10、20 mg·L⁻¹)、Zn²⁺(0、1、2、3、5 mg·L⁻¹)、Cd²⁺(0、1、5、10、20 mg·L⁻¹)、Mn²⁺(0、5、20、50、70 mg·L⁻¹)、Cr⁶⁺(0、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L⁻¹)；抗生素实验组质量浓度梯度为卡那霉素(0、1、5、10 mg·L⁻¹)、氨苄青霉素(0、1、2、3 mg·L⁻¹)、链霉素(0、1、3、5 mg·L⁻¹)、盐酸四环素(0、10、20、50 mg·L⁻¹)。

4)重金属、抗生素胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响。通过绝对定量qPCR检测NOB种子液和硝化菌群富集物中NOB的绝对数量(以nxrA基因拷贝数计)：nxrA引物^[9]F1370F1(5′-CAGACCGACGTGTGCGAAAG-3′)和F2843F2(5′-TCCACAAGGAACGGAAGGTC-3′)。使用nxrA的胶回收产物作为标准品。采用改良CTAB法提取DNA^[10]。绝对定量qPCR体系与程序参考TransStart® Tip Green qPCR SuperMix试剂盒(全式金，北京)说明书。

选择一组合适的重金属离子、抗生素质量浓度(显著影响NOB氧化活性但不完全抑制活性，NOB完全耗完底物时间为无添加组的1.5倍以上)，比较NOB初始接种量相等情况下NOB和硝化菌群富集物对重金属、抗生素单一因素胁迫的亚硝酸盐氧化响应。其中重金属组：5 mg·L⁻¹ Cu²⁺、1 mg·L⁻¹ Zn²⁺、10 mg·L⁻¹ Cd²⁺、20 mg·L⁻¹ Mn²⁺、0.8 mg·L⁻¹ Cr⁶⁺；抗生素组：0.5 mg·L⁻¹ 卡那霉素、0.5 mg·L⁻¹氨苄青霉素、1 mg·L⁻¹ 链霉素、30 mg·L⁻¹ 盐酸四环素。NOB和硝化菌群富集物种子液接种量依据qPCR结果设定(见表1)，使NOB和硝化菌群实验组中初始NOB数量相等；摇床条件设为30 ℃、150 r·min⁻¹，每12 h取样检测$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N含量。

$ {\rm{NH}}_4^{+} $-N采用靛酚蓝法测定^[11]；$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N采用N-(1-萘基)-乙二铵光度法测定^[11]；$ {\rm{NO}}_3^{-} $-N采用离子色谱法测定^[12]；pH通过pH计(HQ40d，美国Hach公司)测量；NOB nxrA质量浓度通过超微量紫外可见光分光光度计(Nano Drop 1000，美国)测定，标准品拷贝数按照式(1)计算；NOB nxrA基因绝对拷贝数量使用实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，美国)和7500 Software v2.3检测分析。

式中：c为NOB nxrA质量浓度，ng·μL⁻¹；L为nxrA片段长度，320 bp。

在属水平统计珠江水环境样、富集物群落组成情况如图1所示。在富集培养过程中，AOB、NOB以及Pseudomonas逐渐成为优势菌群。在15代硝化菌群富集培养中，Pseudomonas由环境样0.88%增长到第15代的72.18%，成为富集物的主要优势菌种之一；Nitrosomonas丰度由0.11%升高至10.04%；Nitrobacter的丰度由0.014%上升到2.10%；环境样中Nitrospira、Candidatus Nitrotoga、Nitrospina等属的NOB在第15代富集物中检测不到。有研究表明，Nitrobacter的亚硝酸盐半饱和常数(K_m,NO2-)为40~1 380 μmol·L⁻¹，Nitrospira的亚硝酸盐半饱和常数为9~27 μmol·L⁻¹，Nitrospira具有更高$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N亲和力，生长速率低，适合在低浓度$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N下缓慢生长^[13-14]；Nitrososphaera与Nitrosomonas同样具有这种关系。这解释了10 mmol·L⁻¹ $ {\rm{NH}}_4^{+} $-N和$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N的选择压力下Nitrosomonas和Nitrobacter分别成为优势AOB、NOB且丰度升高的现象。

NOB的菌落形态和细胞形态如图2所示。培养30 d，长出来NOB菌落呈针尖大小，色泽淡黄，平实不透明，边缘及表面光滑，直径0.2~0.3 mm，直径随培养时间的延长而增大(图2(a)和图2(b))；培养45 d，直径约0.5 mm。结晶紫染色结果显示：NOB为分散排列、无芽孢、两端钝圆的短杆状细菌，细胞大小为0.5~1.0 μm(图2(c))。扫描电镜成像显示：NOB呈杆状，细胞表面完整、光滑(图2(d))。

菌株NOB1的16S rDNA序列在GenBank数据库通过BLAST检索对比，结果表明，NOB1与Nitrobacter winogradskyi Nb-255模式菌株相似度最高，达到99.58%。基于16S rDNA序列构建系统发育树，如图3所示，NOB1与Nitrobacter winogradskyi Nb-255同源性最高，且与各Nitrobacter处于同一聚类。

1)重金属对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响。不同浓度的Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响情况如图4所示。可以看出，在5种重金属组中，亚硝酸盐氧化活性随重金属浓度的变化规律基本一致，均随重金属离子浓度升高而其活性抑制作用增强。以Cu²⁺组为例，Cu²⁺添加量为0 mg·L⁻¹时亚硝酸盐氧化速率最快，在第3 天基本消耗完底物，脱$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N率达到97.58%；在Cu²⁺添加量为1、5、10 mg·L⁻¹组中，分别在第4.5、6.5、8 天基本消耗完初始添加的$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N，表明NOB亚硝酸盐氧化速率随Cu²⁺浓度升高而降低；Cu²⁺质量浓度为20 mg·L⁻¹时的亚硝酸盐氧化速率介于1 mg·L⁻¹与5 mg·L⁻¹组之间，其原因是Cu²⁺添加量较高(根据Ksp(Cu(OH)₂)=2.2×10⁻²⁰计算出20 mg·L⁻¹ Cu²⁺开始沉淀pH为5.92)，形成可见的Cu(OH)₂沉淀，毒害性随之减小，同样的现象亦存在于5 mg·L⁻¹的Zn²⁺实验组。从5种重金属离子对NOB亚硝酸盐氧化速率的影响来看，对NOB亚硝酸盐氧化活性抑制作用为Cr⁶⁺>Zn²⁺>Cu²⁺>Cd²⁺>Mn²⁺。重金属对微生物的损害主要体现为破坏细胞膜、抑制生物大分子合成^[15]。有学者研究^[16-18]表明，当添加Cu²⁺≥30 mg·L⁻¹、Cd²⁺≥10 mg·L⁻¹、Cr⁶⁺≥5 mg·L⁻¹时对硝化脱氮过程有显著影响，这些研究是以硝化活性污泥作为材料，活性污泥可能通过沉淀、吸附或吸收重金属而降低毒性，相比于单一菌株，活性污泥可能对重金属胁迫有更好的抗性^[19]，所以这些研究中的结果略高于本研究中的单一NOB菌株。

2)抗生素对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响。不同浓度卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素、盐酸四环素对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响如图5所示。可以看出，除盐酸四环素外，其他3种抗生素对NOB亚硝酸盐氧化活性起到显著的抑制作用。空白对照组在第2.5 天氧化完$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N；卡那霉素或氨苄青霉素≥1 mg·L⁻¹时，NOB在培养前期表现较弱的亚硝酸盐氧化活性，随着培养时间的延长，NOB受抗生素毒害作用加深，活性逐渐殆尽；NOB对盐酸四环素的耐受性较强，添加盐酸四环素≤10 mg·L⁻¹时NOB亚硝酸盐氧化活性几乎不受影响，盐酸四环素为20 mg·L⁻¹时NOB活性略有降低，在高达50 mg·L⁻¹时，盐酸四环素才对NOB表现出较明显的抑制效果，但脱$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N率仍能在第4 天达到90.02%。以质量浓度1 mg·L⁻¹抗生素的脱$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N率为依据判断4种抗生素对NOB亚硝酸盐氧化速率的影响，对NOB亚硝酸盐氧化活性抑制作用强弱顺序为氨苄青霉素>卡那霉素>链霉素>盐酸四环素。

1) NOB和硝化菌群绝对定量。NOB和硝化菌群富集物中nxrA绝对定量结果见表1，可以看出NOB纯培养种子液中NOB的绝对拷贝数要高于硝化菌群富集物的，前者数量约为后者的3倍。为使两者初始接种NOB量相等，NOB种子液和硝化菌群种子液的接种量分别为2.000%和6.056%。

2)重金属胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响。重金属胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响结果如图6所示。可以看出，在重金属离子胁迫作用下，硝化菌群富集物的亚硝酸盐氧化速率均高于NOB组。以5 mg·L⁻¹ Cu²⁺组为例，NOB对照和实验组分别于第3.5和5 天氧化完底物，硝化菌群对照和实验组的亚硝酸盐氧化速率更快，在第2 天的脱$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N率分别达到100%和90.08%。同时，值得注意的是，硝化菌群对照组和实验组的亚硝酸盐氧化速率几乎一致，而NOB对照组和实验组的亚硝酸盐氧化速率差异显著。这表明NOB组在5 mg·L⁻¹ Cu²⁺胁迫作用下活性受到显著影响，而硝化菌群组则几乎不受到5 mg·L⁻¹ Cu²⁺的抑制作用。同样的现象发生也在1 mg·L⁻¹ Zn²⁺和20 mg·L⁻¹ Mn²⁺实验组。由此可见，在初始NOB数量相等情况下，NOB纯培养物在铜、锌、镉、锰、铬等重金属胁迫下的抗逆性和稳定性略显不足，而硝化菌群富集物亚硝酸盐氧化活性和稳定性更高，抗重金属胁迫能力更强，实际应用潜力更大。硝化菌群富集物中除了NOB、AOB，还有丰富的微生物群落，其中Pseudomonas、Rhizobiaceae、Burkholderiaceae等占比较大，分别达到72.18%、2.04%、1.39%。有研究^[20-22]表明，这些微生物有较强分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)能力。EPS上的羧基、羟基、磷酰基等阴离子基团是吸附Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺等重金属离子的主要位点^[23-24]。此外，有的微生物还有离子通道、重金属外排、氧化还原等复杂的胞内解毒机制，如Cr⁶⁺可以竞争${\rm{SO}}_4^{2-} $转运蛋白结合位点，细菌相关蛋白表达水平升高从而解毒^[25]。这些研究结论与本研究中观察到的硝化菌群富集物稳定性更高、亚硝酸盐氧化速率更快等现象一致。

3)抗生素胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响。4种抗生素胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响结果如图7所示。对比NOB与硝化菌群富集物组可以看出，在不同抗生素胁迫下，后者的亚硝酸盐氧化速率均高于前者。以0.5 mg·L⁻¹卡那霉素组为例，在无添加卡那霉素的情况下，NOB和硝化菌群分别在第5、3.5 天消耗完底物。NOB对抗生素敏感，在0.5 mg·L⁻¹卡那霉素胁迫下，NOB和硝化菌群组的亚硝酸盐氧化活性均受到显著抑制作用，培养前期氧化速率较缓慢，随着培养时间的延长受毒害作用加深，亚硝酸盐氧化活性逐步降低，第6 天NOB和硝化菌群组的脱$ {\rm{NO}}_2^{-} $-N率分别为24.60%和77.18%，在抗生素的抑制作用下，硝化菌群的亚硝酸盐氧化能力仍高于NOB。在硝化系统中，微生物主要通过外排泵、核糖体保护机制、以及破坏活性位点等方式抵抗抗生素；ZHANG等^[26]的研究表明，Pseudomonas、Flavobacterium和Nocardiopsis的菌群数量与抗生素抗性基因呈正相关。本研究的高通量测序结果(图1)表明，Pseudomonas和Flavobacterium在富集物菌群中占比为73.55%。这可能是硝化菌群富集物在抗生素胁迫下亚硝酸盐氧化活性、稳定性以及抗逆性都比NOB单一菌株更高的原因之一，说明硝化菌群在应对抗生素污染的环境问题具有更大的潜力。

同时，值得注意的是，在30 mg·L⁻¹ 盐酸四环素条件下，不管是NOB还是硝化菌群富集物，实验组都比对照组先消耗完底物，即30 mg·L⁻¹ 盐酸四环素在实验中在一定程度上促进亚硝酸盐氧化而非抑制作用，表明适量浓度的四环素可能对NOB的富集有帮助。宋超^[27]在NOB的活性受到四环素抑制的结论基础上进一步研究发现，在硝化污泥中加入较高浓度的四环素，NOB的数量比四环素浓度较低的组更多，硝化性能更好。其可能原因是：四环素刺激EPS的分泌，与EPS的—OH、C—O—C、C=O和C—N等官能团作用，诱导硝化污泥形成结构紧密的聚合体，对部分优势菌种起到保护作用^[28-29]；四环素被EPS吸附并通过微生物缓慢降解而减弱毒性效应^[30]；且四环素本身易变质失效。

1)以珠江穗石码头水样富集硝化菌群并分离纯化一株NOB菌株，NOB的亚硝酸盐氧化活性随重金属离子(Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺)、抗生素(卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素、盐酸四环素)浓度升高而受到抑制效应增强。

2)在初始NOB相等情况下，与NOB纯培养物相比，硝化菌群富集物在重金属或抗生素胁迫下的亚硝酸盐氧化速率更快，稳定性更高，对重金属和抗生素的抗逆性更强，对于处理含氮废水有更好的应用潜力。