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环境DNA[1](environmental DNA, eDNA)通常指从环境样品(如水样、泥样等)直接获取的DNA。环境样品中一般包含一定区域内存在的生物组织、排泄物以及分泌黏液等,通常被认为是环境DNA的主要来源[2]。从环境样品中提取DNA之后,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增目标DNA片段,进一步检测分析环境DNA所携带的信息,以达到获取某一区域环境生物信息的目的[3-4]。在过去的十几年,环境DNA技术已经被逐步应用于生态环境监测(如判断某些物种的存在与否)的研究中。RONDON等[5]从土壤样品中提取环境DNA研究土壤微生物的多样性,并首次提出了环境DNA这一术语。严格来讲,环境DNA技术是于2008年开始被研究者应用于监测大型生物的[6]。从2010年开始,随着实时荧光定量PCR技术(qPCR)和DNA条形码技术的引入,环境DNA技术的应用从定性分析物种存在与否逐步扩展到定量分析物种丰度[1-2, 7-9]。
近年来,有研究[7]表明,存在于某一区域的生物可以通过环境样品(如水样、泥样等)并采用环境DNA技术检测到,这一新兴检测技术有可能显著提升生态监测效率。与传统生态监测方法相比,环境DNA技术有如下优点:该技术不需要捕获、捕杀目标生物,因此,是更为环境行为友好的监测手段;该技术通过PCR技术扩增目标DNA片段,对DNA的检出限低于1 pg,与传统方法相比,对低丰度生物有更灵敏的检出限;该技术对于物种的鉴别是基于基因序列而非传统方法的人眼判断,与传统方法相比,对于物种鉴别的准确性更强。由于采样方式与判别标准不同于传统生态监测技术,环境DNA技术有望大幅提升生态监测的可行性与准确性。然而作为新兴生态监测手段,环境DNA技术仍然存在一些缺陷,如样品处理与检测手段有待进一步优化,环境DNA在环境中的迁移变化行为尚不明确等。着力解决这些问题可促进该技术的推广与应用,这些问题也是相关研究领域的重点研究课题。而对环境DNA降解动力学及环境影响因素的研究,可提高环境DNA数据对于周边环境的指示意义,如在不同的地域环境下,可根据周边环境特征,通过获取环境DNA数据,更准确地推断周边环境生物的丰度。
作为新兴技术,目前环境DNA的研究还局限于对环境水样的分析检测。有研究报道,温度[10-11]、pH[12]等环境变量是水体环境DNA变化的影响因素。底栖生物是重要的环境质量指示生物,多数底栖生物生活在表层沉积物中,因此,表层沉积物中的环境DNA同样值得关注。目前,对于表层沉积物中的环境DNA关注较少[9],环境DNA在表层沉积物中变化的主要影响因素仍然未知,需要进一步研究探索。本研究通过小试实验引入并培养底栖生物,以底栖生物为目标生物,通过采集表层沉积物提取环境DNA的方法,探究了模拟自然环境下水体表层沉积物中环境DNA含量变化与周边环境变量的关系,揭示了表层沉积物中的环境DNA对于周边环境变化的指示意义,为环境DNA变化的动力学研究提供参考。
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本研究以日本大螯蜚(Grandidierella japonica)作为目标生物,引入不同的生物丰度,共进行了4组小试规模的实验研究,每组实验包括3个平行样本和1个空白样本,结果见表1。实验设置与部分实验数据参考本课题组已有的研究[9]。本研究所使用的日本大螯蜚来自实验室水族箱养殖。
每个小试装置为1个250 mL烧杯(DURAN,德国),内装有70 g石英砂(HARIO WS-10BR,日本)作为沉积物和180 mL人工海水(配方见US EPA人工合成海水配方[13])。石英砂和海水在使用之前均已在灭菌锅中进行高温灭菌。实验启动时,4组小试装置中的平行样分别引入10、20、30和50只日本大螯蜚并依次命名为A组、B组、C组和D组,所有小试装置放入25 ℃恒温箱中运行并通过空气泵持续曝气。在小试装置中养殖日本大螯蜚4 d后全部取出,之后启动实验。在实验启动后的第0、6、12、18、24、72、144、264、384小时进行取样,每次取样从每个实验组烧杯中取出1.5 g表面石英砂和0.3 mL水样。石英砂用于环境DNA提取与qPCR分析,水样用于细菌数分析。在实验启动后的第0、72、144、264、384小时,各检测1次烧杯内水中的pH、DO(溶解氧)、盐度、电导率等指标。4个空白样只含有高温灭菌过后的石英砂和人造海水,在实验开始和结束后进行取样分析检测。
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在实验过程中采集的石英砂沉积物样品采用CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)方法提取环境DNA,具体操作流程参见文献中的方法[8-9],最终将每个环境DNA样品分别溶于200 μL TE缓冲液。采用DNeasy Blood & Tissue Kit套件(QIAGEN, 德国)提取日本大螯蜚的动物组织DNA,采用Qubit 3.0 Fluorometer仪器(Thermo Fisher Scientific, 美国)测定从动物组织提取的DNA浓度。
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在进行qPCR标准物制备时,本研究共使用3对PCR引物,通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库Primer-BLAST工具设计[8, 14],引物序列及PCR退火温度见表2。qPCR标准物为使用引物413F和413R通过传统PCR反应扩增纯化后的产物,标准物片段长度为413 bp。纯化后的标准物浓度通过Qubit 3.0 Fluorometer仪器测定,进而通过式(1)计算得出标准物中的DNA片段拷贝数[15],之后分成小份,于−20 ℃保存备用。
式中:c为标准物中DNA拷贝数,copies·µL−1;a为纯化后的标准物浓度,g·µL−1;b为DNA片段长度,bp;NA为阿伏伽德罗常数。
在进行qPCR检测沉积物样品中环境DNA片段含量时,每个提取出的环境DNA样品与平行样均进行2次平行qPCR检测,每个96孔反应板上包括2组拷贝数为1、10、100、1 000、1 000的qPCR标准物和3个空白对照样品。每个qPCR反应体系为20 μL,包括10 μL LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE, 瑞士),正反引物126F与126R各0.3 μmol L−1,5 μL经超纯水10倍稀释的环境DNA提取液。qPCR反应在LightCycler® 480 Instrument II仪器上进行,首先在95 ℃下变性3 min;之后进入扩增程序并循环50次:95 ℃下解旋30 s,在60 ℃下退火30 s,在72 ℃下延伸1 min;循环结束后,进入熔解曲线程序,根据熔解曲线筛选出有效的qPCR反应并计算原环境DNA样品的拷贝数。
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水样的盐度、电导率和温度通过Mother Tool CD-4307 SD便携式手持检测仪测定,溶解氧通过Fuso DO-5509溶氧仪测定,pH通过LAQUA Twin pH计测定,水样中活细菌总数通过BD Accuri™ C6流式细胞仪检测。
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为探究环境变量对环境DNA含量变化的影响,本研究采用广义线性模型(general linear model,GLM)进行回归分析。假设环境DNA降解规律服从指数降解模型,以qPCR检测出的表层沉积物环境DNA片段含量在t时刻的降解速率(由指数降解模型求得[9])作为因变量,以环境变量中的生物丰度、总活菌量、pH、盐度、溶解氧作为自变量,缺失数据由前后2个时间点均值代替。由于水质电导率与盐度为相关非独立关系变量,因此,回归分析中未将电导率纳入自变量中。本研究所涉及的数据分析均在R语言(版本3.6.0)[16]及其集成开发环境R Studio[17]上进行。
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本研究在实验中设置的空白样经qPCR检测,反应均为阴性,因此,认为本研究中不同实验组之间未受到DNA污染。实验期间,由qPCR检测出的环境DNA片段变化如图1所示,服从指数降解特征,对于实验期间环境DNA指数降解动力学研究可参见已有报道[9],4组实验中环境DNA的指数降解系数分别为0.044、0.021、0.029和0.005 5 h−1。4组实验组表层沉积物中的环境DNA含量在日本大螯蜚移除之后(0 h)迅速下降,在实验进行72 h后,基本降低至5 000 copies·g−1以下,并保持在这一较低含量水平。除此以外,在生物丰度较低的实验组(A,B)表层沉积物中,环境DNA片段含量低于生物丰度较高的实验组(C,D)。
本研究中4组实验组表层沉积物中的环境DNA含量在日本大螯蜚移除之后迅速下降,在实验进行72 h后,降低至较低水平。已有研究[18-20]表明,水体中环境DNA在目标生物移除后在1~14 d之后,降低至无法检出的水平,其变化速度与本研究基本处于同一水平。然而对于深层底泥中的环境DNA,有相关研究[21-25]显示可持续2 000、4 000、6 000、12 600 a后仍被检出。本研究与以往研究的主要区别为,本研究中环境DNA载体介质为表层沉积物而非深层底泥,这说明表层沉积物中的环境DNA与水体中的环境DNA可能具有相似的变化特征。可能的原因是表层沉积物与水体直接接触,其所携带的环境DNA所处的自然环境与水环境相似,因此,二者含有的环境DNA具有类似的变化特征。
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实验期间,各实验组水样中总活菌量变化如图2所示。各实验组水样中的活菌含量在日本大螯蜚移除之后(0 h)迅速下降,在实验进行72 h后基本降低至较低含量水平。除此以外,在生物丰度较低的实验组(A,B,C)水样中,总活菌含量低于生物丰度较高的实验组(D),这可能由于生物丰度较高的实验组内含有较多的有机质,导致活菌含量较高[9]。
实验期间,各实验组水样中pH、盐度、溶解氧、电导率变化如图3所示。各实验组水样中的pH在日本大螯蜚移除之后(0 h)缓慢上升,在实验进行264 h后pH保持在8左右;除此以外,在生物丰度较低的实验组(A)水样中,pH低于生物丰度较高的实验组(B,C,D)。各实验组水样中的盐度在日本大螯蜚移除之后(0 h)缓慢上升,在实验进行264 h后,盐度保持在2.6%~2.7%左右;除此以外,生物丰度较低的实验组(A)水样中盐度低于生物丰度较高的实验组(B,C,D)。各实验组水样中的电导率在日本大螯蜚移除之后(0 h)缓慢上升,在实验进行264 h后,电导率保持在4.5 S·m−1左右;除此以外,在生物丰度较低的实验组(A)水样中,电导率低于生物丰度较高的实验组(B,C,D)。各实验组在实验期间一直处于曝气状态,因此,水样中的溶解氧在整个实验期间保持相对稳定,未表现出明显变化趋势。
在4组实验所检测的水质参数中,除溶解氧以外均表现出较明显的变化趋势。总活菌量表现出随时间下降的趋势,可能的原因是生物从反应器中移除后,反应器内部的有机物质随时间逐步被降解,导致微生物数量逐渐降低。pH、盐度、电导率随时间推移呈现初步上升趋势,可能的原因是反应器中的部分水分随着时间的推移蒸发,导致反应器内溶解性物质浓度上升。研究发现表层沉积物中环境DNA含量与实验组生物丰度呈正相关关系。有研究[18, 26-32]报道,物种丰度与环境DNA含量呈现一定程度的线性或指数正相关关系,可决系数为0.03~0.93。尽管环境DNA与生物丰度之间精确的数量关系目前尚未明确,但目前的研究发现至少证明了环境DNA存在定量估计生物丰度的可能性。
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本研究中表层沉积物中环境DNA片段降解速率与环境变量(包括生物丰度、总活菌量、pH、盐度、溶解氧)回归关系如表3所示。水质参数中盐度与环境DNA片段降解速率呈显著负相关关系(回归系数=−3 673,P=0.005),pH与环境DNA片段降解速率呈显著正相关关系(回归系数=830.2,P=0.04)。生物丰度、总活菌量、溶解氧等水质参数与环境DNA片段降解速率呈正相关关系但不显著,回归系数分别为3.34、0.000 006、300。
通过广义线性回归分析发现,环境DNA降解速率与水质盐度呈显著负相关关系,在盐度较高的环境下降解速率降低;与pH呈显著正相关关系,在pH较高的情况下降解速率上升。并与总活菌量、溶解氧等水质参数呈不显著正相关关系。由于实验模拟水质为常见海水水质,因此,环境变量的研究结果对于河口海湾底泥的环境DNA监测具有一定的参考价值。
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环境DNA技术是近几年新兴的生态环境监测手段,目前的相关研究主要集中于水样与鱼类监测,而对于沉积物与底栖生物的研究相对缺乏。底栖生物经常被认为是环境质量指标生物,但其具有难以辨认捕捉的缺点,通过提取分析表层沉积物样品中的环境DNA,可以克服底栖生物难以辨认捕捉的缺点,从而提升监测效率。本研究发现表层沉积物中的环境DNA与水体中的环境DNA具有相似的变化特征,因此,同样可以用来表征某一区域较短时间内的环境质量变化。WEI等[33]对日本东京湾表层沉积物中的环境DNA进行了为期1年的持续取样研究,也发现表层底泥环境DNA的变化对于1个月以内的自然环境有较强的指示意义。
目前,有关环境DNA的研究主要来自国外报道,来自国内的研究报道还较少。我国幅员辽阔,生态环境多样,随着社会经济的发展,我国环境监测的指标要求将逐步从理化性指标扩展到生物性指标,在这一趋势下,环境DNA技术有望对提高环境监测效率和效果起到较大的推进提升作用。
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1)通过小试实验模拟海水底泥环境发现,水体表层沉积物中的环境DNA在源生物体移除后72 h内,能降低至较低含量水平,其变化特征与水体中的环境DNA较为相似。
2)通过广义线性回归分析发现,环境DNA降解速率与水质盐度存在显著负相关关系,与pH存在显著正相关关系。这表明,表层沉积物中的环境DNA对于周边环境变化具有一定的指示意义。
致谢:感谢日本东京大学工学院都市工学系中岛典之教授、飞野智宏讲师提供的技术支持与指导!
环境DNA在监测表层沉积物中的运用及其与环境变量的关系
Application of environmental DNA in monitorining surface sediment and its relationship to environment variables
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摘要: 环境DNA技术是近几年出现的新兴环境生态监测技术,为研究环境变量对表层沉积物中环境DNA变化的影响,通过小试实验模拟海水环境并以日本大螯蜚作为目标生物,引入4组不同的生物丰度,运用环境DNA技术研究了表层沉积物中环境DNA含量变化与周边环境变量的关系。在小试装置中养殖日本大螯蜚4 d后全部取出,之后启动实验。在实验启动后的第0、6、12、18、24、72、144、264、384小时进行取样,提取出的环境DNA片段含量通过实时荧光进行定量PCR检测。结果表明,表层沉积物中的环境DNA在源生物移除后72 h内降低至较低含量水平,与水体中的环境DNA有较为相似的变化特征。通过广义线性回归分析,发现环境DNA降解速率与水质盐度呈显著负相关(P=0.000 5),与pH呈显著正相关(P=0.04),说明表层沉积物中的环境DNA对于周边环境变化具有一定指示意义。上述结果为进一步推动环境DNA技术的应用及其对环境变量影响作用的深入研究提供参考。Abstract: Environmental DNA (eDNA) is an emerging tool for environmental and ecological monitoring in recent years. To clarify the effects of environment variables on the variation of eDNA in surface sediment, through the lab-scale experiments which could simulate marine environment and choose benthic organism Grandidierella japonica as target species with 4 groups of different bioabundance, the relationship between the variation of eDNA in surface sediment and ambient environment variables was investigated by using environmental DNA technology. After Grandidierella japonica were cultured for 4 days, and they were taken out from the experimental devices, then the following experiments start-up. The surface sediment samples and water samples were collected at 0, 6, 12, 18, 24, 72, 144, 264, 384 h from the start-up of the eperiments, the eDNA was extracted from these surface sediment samples and target eDNA copy numbers were determined by quantitative PCR with species-specific primers. The results showed that after removal of Grandidierella japonica, environmental DNA in surface sediment decreased to low level within 72 hours, which was similar to the decreasing characteristics of environmental DNA in water. The general linear modelling regression showed that the eDNA decay rate was significantly and negatively (P=0.000 5) related to the water salinity and significantly and positively (P=0.04) related to the pH value, indicating that environment DNA in surface sediment could reflect the changes of surrounding environment at a certain degree. This study provide a reference for promoting the application of eDNA and profoundly studying its effects on environment variables.
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我国工业高速发展及城镇化进程,使得重金属造成的水污染日趋严重,成为了全球关注的环境问题之一[1]. 重金属不可被生物降解,易在生物体内累积并通过食物链放大,严重威胁人类健康及生态系统. 镉(Cd)、锌(Zn)、镍(Ni)是工业废水中最常见的重金属污染物[2]. Ni、Zn是生命体需要的微量元素,但高浓度Ni2+、Zn2+能引起呕吐、哮喘及中枢神经系统紊乱等中毒症状[3 − 4];Cd2+即使在较低浓度下也表现出较高生物毒性[5],长期接触Cd2+会导致慢性肺部疾病、骨骼畸形和肾功能衰减等问题[6]. 因此,高效去除水体中的以镉(Cd)、锌(Zn)、镍(Ni)为代表的重金属离子成为了亟待解决的问题,并在近年来受到了相关研究领域的广泛关注.
从水中去除重金属离子的方法包括吸附、化学沉淀/混凝、离子交换、膜技术和电化学方法等[7]. 随着纳米技术的发展,纳米材料在水处理中逐渐发挥重要作用. 其中,纳米零价铁(nanoscale zero-valent iron, nZVI)凭借比表面积大、还原活性高、适用面广、环境友好等特性被广泛用于水环境中的重金属去除[8]. nZVI的粒径在(20—100) nm范围,呈链状,合成后瞬间在表面生成铁(氢)氧化物,这使nZVI形成了独特“核-壳”结构[9]. nZVI在参与重金属去除过程中,外氧化壳层首先通过静电引力和表面络合作用吸附重金属离子,随后单质铁核可以充当电子供体还原被吸附的重金属离子,因此nZVI对重金属的去除可能涉及吸附和还原机制[10]. 但nZVI在实践应用中也呈现出一定的局限性,如易自发团聚,表面活性位点减少;极易被空气和水氧化,大大削弱其还原能力,导致活性降低. 为了解决上述问题,大量研究对nZVI的改性进行了探索[11 − 13],旨在进一步提升nZVI的稳定性、电子传递效率和去除的选择性.
研究发现,nZVI对磷酸盐具有很强的亲和力,能通过吸附、沉淀等作用高效去除水中PO43-[14 − 15]. 研究进一步表明,吸附在nZVI表面的PO43-能生成钝化层,磷酸基团的侧链质子抑制nZVI与氧和水的反应,从而对nZVI起到一定保护作用[16]. 因此,表面磷酸化能提高nZVI在水中的稳定性. 此外,磷酸盐能取代nZVI表面的羟基,与重金属形成三元配合物,进而增强其对重金属的配位能力[17]. 基于上述特性,表面磷酸化的nZVI(phosphorylated nanoscale zero-valent iron, P-nZVI)用于污染物去除已被广泛研究,如Zhang等[16]发现四聚磷酸盐改性nZVI对阿特拉津的降解过程中,四聚磷酸盐的存在抑制了质子还原,增强了分子氧活化,使阿特拉津的降解率提高955倍. Li等[18]的研究表明,磷酸化改性后,P-nZVI对Cr(Ⅵ)还原的电子选择性从6.1%提高到31.3%,去除效率提高了4倍,这是由于磷酸化修饰增强了对铬的吸附能力,进而促进其还原. 综上所述,nZVI的表面磷酸盐改性能提高对重金属离子的配位能力,同时表面磷酸盐抑制了nZVI被水和氧气氧化,在增强nZVI对重金属离子吸附能力的基础上有效提高了nZVI对吸附在表面的重金属的还原能力,其改性策略成本低,操作简单,效果显著. 但目前,P-nZVI对不同种类重金属的去除性能、机理的相关比较研究仍较少,因此,比较P-nZVI对常见重金属的去除能力和作用机制具有较大的研究价值.
本研究以KH2PO4为磷化剂,通过液相还原法制备磷化改性的nZVI,并且选择了Cd2+、Zn2+、Ni2+3种典型的重金属离子作为目标污染物. 由于Fe0对Cd2+、Zn2+、Ni2+具有不同的还原能力;Cd2+、Zn2+、Ni2+受pH影响的沉淀-溶解特性存在差异;同时,其与表面磷酸根的亲和力也不尽相同,因此磷酸化改性后的nZVI对于上述3种金属离子的去除特性可能存在差异. 本文在讨论P-nZVI去除水溶液中Cd2+、Zn2+、Ni2+效果的基础上,进一步研究了pH、干扰离子等影响因素的影响,并结合XRD、XPS、SEM、TEM等表征,讨论P-nZVI去除Cd2+、Zn2+、Ni2+的微观机理差异. 本研究旨在比较P-nZVI对不同重金属的去除能力、重金属去除过程中的影响因素和微观界面特征,为进一步深入探索P-nZVI在微界面上与重金属离子的作用机理提供一定的参考.
1. 实验部分(Experimental section)
1.1 纳米零价铁及改性纳米零价铁的制备
研究所用的nZVI、P-nZVI均采用NaBH4液相还原Fe3+法合成[19]. 根据先前的实验,P/Fe物质的量比在0.6左右P-nZVI去除效果较好,因此制备磷酸化修饰的nZVI时,需要将NaH2PO4以一定比例和NaBH4混合,确保P/Fe为0.6,并通过蠕动泵将混合溶液缓缓滴入三颈瓶中,其他步骤与nZVI的制备相同. 反应完成后,采用离心的方式收集nZVI并用去离子水和无水乙醇各洗涤3次,储存于无水乙醇中备用.
1.2 批量去除实验
实验分别探究了P-nZVI吸附Cd2+、Zn2+、Ni2+的动力学特征、pH及干扰离子等因素对重金属去除的影响. 所有实验中P-nZVI的投加量均为0.5 g∙L−1,重金属离子的初始浓度为100 mg∙L−1. 在动力学实验中,首先配制一定量Cd2+、Zn2+、Ni2+溶液至三颈瓶中,调节反应初始pH为6±0.1,通氮20 min脱去溶液中O2,再加入适量P-nZVI,分别反应0(空白)、5、10、15、30、40、50、60、75、90、120 min取出少量溶液,过0.22 μm滤膜后测定离子浓度. 反应过程中,采用磁力搅拌器以250 r·min−1进行机械搅拌,使P-nZVI与目标离子充分接触. pH实验中,为防止Cd2+、Zn2+、Ni2+大量沉淀控制pH范围在2—8之间,使用HCl和NaOH调节反应pH分别为2±0.1、3±0.1、4±0.1、5±0.1、6±0.1、7±0.1、8±0.1,其他步骤同上. 为探究溶液中干扰离子对吸附的影响,在其他操作不变的情况下,控制反应pH为6±0.1,量取适量含有共存离子的溶液[HA、Na2SO4、NaHCO3、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2]加入三颈瓶中,使共存离子浓度分别为0、10、50 mg∙L−1. 上述所有实验,控制实验温度为25 ℃.
1.3 分析方法
采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-720 ES,安捷伦公司,美国)测定溶液中Cd2+、Zn2+、Ni2+浓度. 采用Zeta电位测定仪(Zetasizer Nano ZS90)测定P-nZVI的零电荷点,ASPS 2460气体分析仪测定材料孔径分布及比表面积. 为比较反应前后材料的微观形貌变化,采用场发射电子扫描显微镜(Nova naniSEM-450, FEI公司,美国)及球差校正扫描透射电子显微镜(TatanTMG2 60-300, FEI公司,美国)进行表征,并使用EDS能谱对材料的元素分布情况进行定性及半定量分析. 采用X射线衍射仪(D8 Advance,布鲁克公司,德国)及X射线光电子能谱仪(ESCALAB 250XI, 赛默飞, 美国)探测材料体相物质的晶体结构及表相化学组成、元素种类及价态,并使用MDI Jade 6软件对XRD结果进行比对分析、Advantage 5.948软件对XPS谱进行分峰拟合. 采用Origin 2021软件对所得数据进行绘图.
2. 结果与讨论 (Results and discussion)
2.1 P-nZVI结构及界面性质
2.1.1 结构特征
HAADF-STEM图直观反映出P-nZVI的壳-核结构特征及表层2 nm左右的无定形壳(图1a). Fe、O、P及Fe+O重叠的EDS元素分布图显示,Fe、O元素分别分布在颗粒内核与外壳,P元素均匀分布在颗粒表面(图1a). 磷酸基团的修饰虽不影响零价铁的“壳-核”结构,却使nZVI的球形轮廓稍有变形并出现不规则边缘;同时,P-nZVI的HAADF-STEM图揭示P-nZVI内部出现了明显的径向裂纹结构,该裂纹从外壳层延伸至铁芯内部. 这与Zhang等的研究结果一致[20],Zhang等指出在磷酸基团存在下,铁壳表面生成的磷酸铁物种阻碍颗粒的继续长大,并且铁芯生长和外壳层施加的阻力发生了对抗,导致P-nZVI最终生长成边缘缺陷、内部皲裂的不规则球状颗粒. BET测试也证实了这一现象,计算结果显示P-nZVI的比表面积为(159.27±1.01) m2∙g−1,远大于nZVI的比表面积(26.54±2.13) m2∙g−1;同时,P-nZVI的总孔容及孔径均值分别为(0.6093±0.0025) cm³·g−1、(21.22±0.19) nm,相较于nZVI均有所增加(图2、表1). 因此,裂纹结构显著增加了材料的比表面积,这有利于提供更多活性位点、促进吸附. 该结构还有利于污染物快速穿过氧化外壳层,提高Fe0的电子利用率[21].
图 1 (a)P-nZVIHAADF-STEM图像和Fe、O、P、Fe+O的EDS 元素分布图;(b)P-nZVI的Fe 2p、O1s XPS谱图;(c)不同pH下P-nZVI、nZVI的Zeta电位图;(d)P-nZVI上磷酸基团的结合示意图Figure 1. (a)HAADF-STEM image of fresh P-nZVI as well as the corresponding elemental mapping of Fe, O, P and the overlapped mapping of Fe, O;(b)XPS survey spectra of P 2p, Fe 2p and O 1s of P-nZVI;(c)zeta potential of P-nZVI and nZVI at different pH;(d)schematic diagram of phosphate groups binding mode表 1 nZVI及P-nZVI的比表面积、孔容、孔径对比Table 1. Comparison of specific surface area, pore volume and pore size of nZVI and P-nZVI比表面积/(m2·g−1)Surface area 孔容/(cm3·g−1)Pore volume 孔径/nmPore size nZVI 26.54±2.13 0.0759±0.0030 27.67±0.06 P-nZVI 159.27±1.01 0.6093±0.0025 21.22±0.19 2.1.2 表面化学性质
为进一步确定P-nZVI表面元素成分及化学性质,对P-nZVI进行了XPS分析(图1b)及不同pH下的Zeta电位测试(图1c). P 2p XPS谱图在132.54 eV、133.49 eV的特征峰分别归属于P 2p1/2、P 2p3/2[20],该结果证实了纳米铁表面的成功磷酸化. Fe 2p XPS谱图观察到P-nZVI在710.69 eV、713.76 eV附近分别出现Fe(Ⅱ)—O与Fe(Ⅲ)—O的特征峰[22],表明新鲜制备的P-nZVI表面出现一定程度的氧化,氧化层的形成主要来自于溶液中水及少量氧的腐蚀作用[23],这一现象与nZVI类似. 有趣的是,P-nZVI与nZVI的O 1s XPS谱存在明显区别. P-nZVI在结合能为529.83 eV、530.98 eV、532.48 eV附近的特征峰分别归属于O2-、OH-以及物理或化学吸附水[24]. 其中,P-nZVI的OH-光电子特征峰占比高达到75.67%,O2-的占比偏低,仅为12.59%(表2);nZVI的O2-与OH-光电子峰面积占比接近,分别为43.98%和53.08%,化学计量比接近1:1,表明nZVI表面铁氧化物以FeOOH为主(表2)[25]. 该对比表明,P-nZVI表面存在较高比例的 OH-,这主要来自于磷酸基团的贡献,表明nZVI表面被大量磷酸根包被. 磷酸盐可能主要以3种方式结合在nZVI表面(图1d):(1)nZVI的氧化铁外壳对磷酸基团发生静电吸附,该结合方式会受到pH的显著影响[26]. (2)PO43-与颗粒表面羟基脱水络合(方程式1),以单齿单核形式结合在nZVI表面[18,27]. (3)随着nZVI外壳的腐蚀,释放的Fe2+能与PO43-发生沉淀作用(方程式2),以表面沉积[26]的方式附着在颗粒上. Zeta电位测试的结果与预期一致,由于结合在nZVI表面的磷酸基团能提供一定负电荷,导致P-nZVI的IEP相较于nZVI大幅下降. Zhang等[20]通过DFT计算证实,磷酸基团周围负电量增加,因此P-nZVI表面能通过累积负电荷的方式增大对重金属阳离子的静电引力[28].
表 2 nZVI及P-nZVI的O1s XPS谱中O2-、OH-及H2O相对丰度(% at.)Table 2. Relative abundance of O2-, OH- and H2O in the O1s XPS spectra of nZVI and P-nZVIP-nZVI nZVI O2- 23.11 43.98 OH- 62.88 53.08 H2O 14.01 2.94 总计 100 stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2) 2.2 重金属去除实验
2.2.1 反应动力学
通过批量去除实验,对nZVI、P-nZVI去除Cd2+、Ni2+、Zn2+的动力学过程进行了对比研究. 结果表明,磷酸化修饰成功实现了对3种重金属离子的高效去除(图3a、b). 未经修饰的nZVI对Cd2+和Zn2+的去除率仅为45.4%、53.8%,并且去除率在达到平衡后的一定时间内出现波动,这是由于P-nZVI对金属离子的吸附不牢固,易出现解吸现象. 而P-nZVI对Cd2+、Zn2+的去除率相比nZVI有大幅提升,分别达到79.6%、90.6%. 这是由于P-nZVI表面形成了nZVI-PO43--金属阳离子三络合物,磷酸基团能快速富集并稳定结合重金属离子,不易造二次释放.
图 3 (a, b)反应动力学曲线;(c, d)伪一级、伪二级动力学拟合曲线;(e)pH的影响;(f, g, h)干扰离子的影响Figure 3. (a, b)Kinetic adsorption experiments of nZVI and P-nZVI;(c, d)fitted curves of pseudo-first-order kinetic model and pseudo-second-order kinetic model;(e)influence of different pH conditions;(f, g, h)influence of interfering ions对比Ni2+的去除动力学,发现P-nZVI能加快Ni2+的去除,在15 min左右即去除了80%的Ni2+,并将去除率提高10%左右. 结合标准氧化还原电位可知,Ni2+/Ni的标准电位(E0 = − 0.23 V)高于Fe2+/Fe(E0 = − 0.44 V),因此Ni2+不仅可以被吸附固定,还能通过还原作用去除[29]. Fe0的电子转移被认为是整个反应过程的限速步[19],而P-nZVI的缺陷结构有利于Ni2+快速突破氧化外壳的反应屏障、“攻击”富含电子的铁核,促进还原过程并提升去除效率.
为了进一步认识P-nZVI去除Cd2+、Zn2+、Ni2+的反应过程,对3种重金属离子的反应动力学进行了评估,分别采用伪一级、伪二级动力学模型进行模拟,两种模型表达式如下:
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (3) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (4) 式中,
(mg∙g−1)为t时刻材料对重金属离子的吸附量,qt (min−1)为伪一级动力学模型的吸附速率常数,k1 (g·mg−1·min−1)为伪二级动力学模型的吸附速率常数. 图3c、d表明,P-nZVI对Cd2+、Zn2+、Ni2+的去除过程均更符合伪二级动力学模型,R2分别为0.9988、0.9992、0.9997.k2 相较于活性炭、沸石等常见商用重金属去除材料,P-nZVI对上述3种重金属的去除能在短时间内达到相近的水平[30],但不同于这些材料的单一吸附作用,P-nZVI在与水及污染物相互作用中会不断产生高活性的新鲜表面,在一定程度上提升颗粒周边pH,从而能够通过吸附、沉淀、共沉淀等多种方式去除更多的重金属,同时该材料及其产物具有一定的磁性,便于分离回收,因此P-nZVI具有一定潜在应用价值.
2.2.2 pH的影响
环境因素对水体中重金属存在形式及迁移转化具有重要影响,其中,pH是影响重金属吸附行为的关键因素之一[31]. 由于Cd2+、Zn2+、Ni2+在碱性条件下均会大量沉淀,因此本实验控制溶液初始pH值在2—8范围内,探究pH对P-nZVI吸附3种重金属离子的影响,结果如图3e所示. 当pH值为2、3时,P-nZVI对重金属离子的吸附量较低;pH值提升至4时,吸附量增幅明显, 因为P-nZVI在偏酸性环境下会受到H+的腐蚀而大量溶解. 当pH值从4增加到8,P-nZVI对Cd2+、Zn2+、Ni2+的吸附量分别从(152.24±1.89) mg·g−1、(165.52±1.14) mg·g−1、(172.25±3.21) mg·g−1提升至(168.24±2.83) mg·g−1、(185.52±4.23) mg·g−1、(188.54±2.84) mg·g−1.
从表面化学的角度分析,由于P-nZVI的IEP为4.51(图1c),因此在低pH条件下,H+与重金属离子竞争P-nZVI表面的吸附位点,导致目标离子的吸附量较低. 随着pH升高,P-nZVI表面带明显负电,对金属阳离子的静电吸引大大增加,吸附量随之升高. 因此,在pH 7—8时重金属的去除效果最佳.
2.2.3 干扰离子的影响
为进一步探究P-nZVI在实际水体中对Cd2+、Zn2+、Ni2+的去除情况,本研究选择了自然水体中最为常见的几种阴阳离子SO42-、HCO3-、Ca2+和Mg2+,以及广泛存在于自然水体中的天然有机物质腐殖酸HA(黄腐酸含量>90%)进行探究. 结果与预期一致(图3f-h),阳离子Mg2+和Ca2+对Cd2+、Zn2+、Ni2+的去除抑制作用明显,且随着浓度的增加,抑制作用将增强. 因为Mg2+和Ca2+与目标离子带有相同的电荷且离子水合半径接近,在反应过程中能与目标离子竞争P-nZVI表面结合位点,导致去除效率下降[32]. 而阴离子SO42-、HCO3-存在时,P-nZVI对目标离子的吸附几乎不受影响.
共存物质为HA时,目标重金属的去除率受到显著影响. 当HA浓度从0 mg·L−1增加到50 mg·L−1时,其对目标离子的去除效率至少下降20%. 这与HA表面丰富的官能基团有关,该表面特性使其具有较强的配位结合能力[33],在短时间极易占据大量活性位点,导致目标离子的解吸释放.
2.3 机理研究
2.3.1 XRD
图4为P-nZVI、nZVI与Cd2+、Zn2+、Ni2+3种重金属离子反应2 h后的XRD图谱. 谱图显示,在2θ = 44.8°附近均出现了尖峰,经对比确认,为Fe0(110)晶面峰(PDF # 89-7194);在2θ = 35.5°附近出现的峰为Fe3O4(311)面的宽化衍射峰(PDF # 75-0033),说明P-nZVI、nZVI反应后均表现出一定程度的氧化. 其中,与Cd2+、Zn2+反应后,该氧化峰信号较弱,可能由于表面铁(氢)氧化物的结晶度较差或主要以无定形态存在[34];与Ni2+反应后,相对较强的氧化峰信号表明铁的氧化较明显,并且P-nZVI的氧化更加显著. 值得注意的是,P-nZVI与Cd2+反应后,在2θ = 13.2°处出现了尖峰,这来自于Fe3(PO4)2·8H2O(020)晶面的衍射(PDF # 83-2453),表明少量磷酸盐还可能进一步在nZVI表面生成具有一定结晶度的蓝矿石[26]. XRD图谱上并未反映出与Cd、Ni、Zn元素相关的晶面衍射峰,因此需要结合其他表征手段进一步分析.
2.3.2 SEM
nZVI、P-nZVI去除Cd2+、Zn2+、Ni2+后的形貌对比如图5所示. P-nZVI去除Cd2+后(图5b)外表变为不规则球形并出现絮状沉淀,而nZVI与Cd2+反应未出现明显絮状沉淀. 该对比表明P-nZVI的去除能力强于nZVI,P-nZVI表面的高浓度磷酸盐环境促使Cd2+形成了Cd3(PO4)2界面沉淀(pKsp = 32.6)[35]. 与Cd2+类似,Zn2+反应后纳米铁的球形形貌仍然保持并出现少量絮状沉淀(图5c、5d). 但与Ni2+反应后,P-nZVI表面的球形则完全消失,外表被大量片层状结构及针状结构覆盖(图5e、5f). 结合上述XRD谱图,这再次证实P-nZVI对Ni2+的去除能力最强,在反应过程材料表面氧化明显,生成了结晶度低/无定形铁(氢)氧化物,根据外观结构推测其主要成分可能为FeOOH[36].
2.3.3 TEM
对P-nZVI反应后的单颗粒进行了STEM及EDS分析,以进一步对比微观界面的变化. 如图6a、6b所示,P-nZVI与Cd2+、Zn2+反应后,“壳-核”结构仍然保持,外形及内部结构没有明显改变,颗粒的裂纹及外部的氧化薄层清晰可见. 但EDS能谱的定量结果表明,反应后颗粒O原子相对丰度小幅增加(表3),这是由于溶液中O2、H2O对Fe0的腐蚀作用[23]. 根据Cd、Zn及P的EDS元素分布图,Cd2+、Zn2+与P元素的分布高度相关,均匀分布在外壳层,由此推测磷酸基团在Cd2+、Zn2+的去除过程中起到主导作用.
HAADF-STEM图显示,与Ni2+反应2 h后,P-nZVI颗粒的“壳-核”结构遭到严重破化,裂纹结构消失,图像明暗衬度的差异反映出铁芯已被明显腐蚀. Ni、Fe元素分布图表明Ni元素不仅分布在外壳层还深入铁核内部,颗粒中心的铁元素大量减少(图6c). 同时,反应后P-nZVI单颗粒中Ni原子相对丰度高于Cd、Zn,并且O原子比例升高至54.5%、Fe原子占比明显降低(表3),这进一步证明P-nZVI颗粒的快速氧化及铁离子的大量溶出[37]. 因此,P-nZVI与Ni2+的反应较为剧烈,这与SEM表征结果一致.
表 3 P-nZVI及去除重金属后的EDS定量结果Table 3. Quantitative results of EDS before and after removal of heavy metalsP-nZVI 除Cd2+后After removal of Cd2+ 除Zn2+后After removal of Zn2+ 除Ni2+后After removal of Ni2+ Fe 85.68 63.55 76.01 28.22 O 13.83 34.37 21.90 54.50 P 0.49 1.45 1.13 0.62 目标污染物 — 0.64 0.95 16.55 总计 100 2.3.4 XPS
为进一步确定P-nZVI去除重金属的机理,采用XPS分析反应后的表面元素组成及价态变化. 如图7a所示,反应后的XPS谱图检测出了Cd、Zn、Ni元素的特征峰,证实重金属离子成功结合在P-nZVI表面.
Cd 3d与Zn 2p的XPS谱图显示,nZVI去除Cd2+后Cd 3d5/2结合能为405.28 eV,归因于Cd(Ⅱ)在nZVI表面的吸附;Zn2+2p3/2结合能更高,特征峰值在1022.38 eV附近,均与文献报道一致[38]. 与P-nZVI反应后,Cd 3d5/2特征峰稍稍左移,通过分峰分别得到峰值为405.5 eV及406.18 eV的两个峰,根据Cd2+所处的化学环境不同,将 405.5 eV处的峰分配给吸附在nZVI活性位点上的Cd2+,406.18 eV处的峰分配给吸附于磷酸基团上的Cd2+. 由于Cd2+/Cd(E0 = − 0.40 V)的标准电位非常接近Fe2+/Fe(E0 = − 0.44 V),因此在nZVI上Cd2+被还原为Cd0在热力学上是不利的[34,39],并且在pH≤8时Cd2+几乎不发生沉淀[10]. 由上推测,P-nZVI主要以两种不同吸附方式去除Cd2+:(1)直接吸附于nZVI的表面活性位点[40](2)与磷酸基团结合,形成三元络合物[41]. 由于吸附在磷酸基团位点的Cd2+特征峰面积远大于直接吸附在nZVI表面的特征峰面积,这归因于磷酸根对Cd2+较高的亲和力(
= 32.6),证实磷酸基团对Cd2+的吸附起到了主导作用. Zn2+的XPS结果与Cd2+类似,可通过同样的方式分峰并分配给不同吸附位点上的Zn2+. 由于Zn2+/Zn的E0 = − 0.7624 V 显著低于Fe2+/Fe, Zn2+在nZVI表面以吸附为主,并且Zn2+对PO43-也具有较高亲和力(pKsp[Cd3(PO4)2] = 32.04),因此Zn2+可能的去除机制与Cd2+相近,即优先吸附在磷酸根位点,少量直接与nZVI表面的铁(氢)氧化物结合[25](图7). Cd2+、Zn2+与nZVI的反应方程式可表达如下:pKsp[Zn3(PO4)2] stringUtils.convertMath(!{formula.content}) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) Ni2+与P-nZVI反应后的XPS谱图显示,在851.89 eV、855.60 eV、861.25 eV附近出现了Ni0、Ni(Ⅱ)—O与Ni(Ⅱ)—OH的特征峰[42],其结合能相较于nZVI均略向左偏移. 同时,P-nZVI的Ni(Ⅱ)—O、Ni(Ⅱ)—OH特征峰信号明显强于Ni0,表明磷酸化修饰的纳米零价铁表面更倾向于吸附Ni2+,少量Ni2+被还原为Ni0. 而STEM及EDS元素分布图显示,P-nZVI的内部被严重腐蚀. 根据上述现象推测,P-nZVI首先通过三元络合作用将大量Ni2+吸附在表面,部分Ni2+能通过径向裂纹结构深入铁芯内部,发生较为剧烈的氧化还原反应. Zhang等[20]采用XPS刻蚀,详细比较了Ni2+在4 h内对nZVI及P-nZVI铁芯的腐蚀过程,结果证实P-nZVI的确大大提升了反应速率、促进腐蚀. 原因可作如下分析:浓度梯度被认为是污染物进入铁核速率的决定因素[43],虽然铁氧化物外壳及表面磷酸基团阻碍Ni2+与Fe0的直接接触,但由于P-nZVI表面负电荷量大,能比nZVI更迅速地通过静电引力作用将溶液中游离的Ni2+以物理、化学吸附结合在铁壳表面,较高的浓度梯度促进 Ni2+跨越P-nZVI氧化外壳层,向铁芯转移;其次,P-nZVI独特的径向裂纹及表面缺陷更有助于Ni2+向铁芯扩散,加快电子转移,提高Fe0的利用率(图7). 因此,P-nZVI的结构降低了Ni2+跨越铁氧化壳的阻碍,其反应方程式可表达如下:
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) 3. 结论(Conclusion)
本文以KH2PO4为磷化剂通过液相还原法制备出磷酸化修饰的纳米铁,并结合XRD、SEM、TEM、XPS等分析手段探究其对Cd2+、Zn2+、Ni2+的去除效果及微观作用机制. 结果表明,P-nZVI是一种表面缺陷、内部皲裂的不规则球状颗粒,其较大的比表面积及表面包被的磷酸基团为重金属的吸附提供了更多位点. 反应动力学表明,P-nZVI对Cd2+、Zn2+、Ni2+的去除效率均显著优于nZVI,2 h左右分别达到了79.6%、90.6%、92.6%. 其中,P-nZVI对Cd2+、Zn2+的去除以表面磷酸基团的吸附为主,形成了nZVI-PO43--金属阳离子三元络合物,使重金属离子结合牢固、不易解吸. 该吸附过程均可用准二级动力学描述. 而Ni2+的去除过程有所不同,其首先在P-nZVI的表面吸附作用下被富集,其次部分Ni2+通过径向裂纹深入铁芯并被快速还原,因此P-nZVI独特的裂纹结构能促进电子的转移. 综上,P-nZVI表面的磷酸化修饰及物理结构的缺陷,使其具有较好的重金属去除活性,本研究结果为开发简单实用的改性nZVI高效去除重金属的方法提供了一定可行性思路.
-
表 1 小试实验条件设置
Table 1. Setup of lab-scale experiment
实验组 被测生物数量/只 石英砂/g 人造海水/mL 平行样数量/个 A 10 70 180 3 B 20 70 180 3 C 30 70 180 3 D 50 70 180 3 空白样 0 70 180 4 表 2 引物序列及PCR退火温度
Table 2. Nucleotide sequence of primers and PCR annealing temperature
引物名称 核苷酸序列 (5′~3′) 产物长度/bp 扩增目标区 退火温度/℃ 126F GTTTTAGGTGCTTGGGCCAG 126 线粒体COI基因 60 126R AGCATGCGCTGTTACTGAGA 413F CTTCGTTTTAGGTGCTTGGGC 413 线粒体COI基因 55 413R AGGAGGCCCCTGCTAAATGA 表 3 环境DNA片段降解速率与环境变量广义线性回归结果
Table 3. Results of general linear regression between eDNA decay rate and environmental variables
自变量 回归系数 标准差 t值 P值 生物丰度 3.34 4.02 1.830 0.41 总活菌量 0.000 006 0.000 017 0.366 0.72 pH 830.2 387.2 2.144 0.04 盐度 −6 022 1 549 −3.888 0.000 5 溶解氧 300 601 0.500 0.62 -
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