四氯乙烯(C₂Cl₄)和甲醇(CH₃OH)为色谱纯，酵母浸膏和维生素B₁₂为生物试剂，乙醇(CH₃CH₂OH)、三水合磷酸氢二钾(K₂HPO₄∙3H₂O)、七水合硫酸亚铁(FeSO₄∙7H₂O)、一水合磷酸二氢钠(NaH₂PO₄∙H₂O)、氯化铵(NH₄Cl)、七水合硫酸镁(MgSO₄∙7H₂O)、七水合硫酸锰(MnSO₄∙7H₂O)、七水合硫酸锌(ZnSO₄∙7H₂O)、乳酸钠(dl-C₃H₅O₃Na)、葡萄糖(C₆H₁₂O₆)、六水合氯化钴(CoCl₂∙6H₂O)、一水合次氮基三乙酸三钠(N(CH₂CO₂Na)₃∙H₂O)均为分析纯。

实验过程中使用的仪器设备：恒温振荡箱(MQL-621R，上海旻泉仪器有限公司)、厌氧培养箱(YQX-Ⅱ型，上海新苗医疗器械制造有限公司)、立式压力蒸汽灭菌锅(YM30型，上海三申医疗器械有限公司)、紫外可见分光光度计(TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司)、氮吹仪器(ANPEL DC12，上海安谱实验科技股份有限公司)、气相色谱仪(Agilent7820A，安捷伦科技有限公司)、Illumina Mi Seq平台(微基生物科技(上海)有限公司)。驯化实验采用厌氧瓶密封操作，实验装置见图1，可定期使用注射器采样。

PCE降解菌群的驯化筛选。以南京某污水处理厂的厌氧活性污泥为菌种来源，采用图1的实验装置对厌氧活性污泥进行驯化培养，整个实验操作过程在厌氧培养箱中完成。实验配制无机盐培养基来模拟地下水^[22]，其组成成分为：K₂HPO₄∙3H₂O 1.05 g∙L⁻¹、NaH₂PO₄∙H₂O 0.25 g∙L⁻¹、NH₄Cl 0.49 g∙L⁻¹、N(CH₂CO₂Na)₃∙H₂O 0.03 g∙L⁻¹、dl-C₃H₅O₃Na 0.112 g∙L⁻¹、MgSO₄∙7H₂O 0.05 g∙L⁻¹、FeSO₄∙7H₂O 3 mg∙L⁻¹、MnSO₄∙7H₂O 0.74 mg∙L⁻¹、ZnSO₄∙7H₂O 0.74 mg∙L⁻¹、CoCl₂∙6H₂O 0.25 mg∙L⁻¹、维生素B₁₂ 0.05 mg∙L^−1[23]。PCE降解菌群的驯化采用梯度驯化法^[24]，按PCE浓度由低到高进行，先将200 mL活性污泥接种到700 mL除氧灭菌后的无机盐培养基中(除非特殊说明，pH均在6.80~7.25)，随后采用聚四氟乙烯瓶塞和铝卷曲盖密封血清瓶，并采用无菌注射器加入PCE溶液。PCE溶液浓度初次设定为0.5 mg∙L⁻¹，然后放置于30 ℃、转速为30 r∙min⁻¹的恒温振荡培养箱中进行培养驯化7 d，之后更新培养基并将浓度依次递增为1、2、3、4、5 mg∙L^−1[22]，每个阶段均培养7 d。

PCE降解特性研究。将100 mL无机盐培养基置于血清瓶中，所有培养基在使用前均利用氮气吹扫30 min，然后用高压灭菌锅在121 ℃下灭菌30 min，最后放入厌氧培养箱中冷却备用。将经过梯度驯化后获得的菌液按5%投加量接入含有100 mL无机盐培养基的血清瓶中，随后采用特氟隆表面橡胶隔膜(美国安捷伦公司)和铝卷曲盖密封血清瓶，PCE初始投加量设定为1 mg∙L⁻¹，随后置于30 ℃、30 r∙min⁻¹条件下恒温振荡器中培养。实验过程中每隔24 h采样1次，测定培养基中残留PCE的浓度以及吸光度，分析驯化所得菌群的PCE降解特性及菌群生长曲线。

环境因素对微生物群落降解PCE的影响。在保持与降解特性实验相应条件不变的前提下，分别研究不同温度(10、20、30 ℃)、不同pH(6、7、8)、不同PCE初始浓度(0.5、1、1.5、2、2.5 mg∙L⁻¹)等条件对菌群降解PCE的影响。在相同的实验条件下，不接种菌液作对照，每组实验重复做3个平行样，取平均值。每隔24 h采样1次，测定培养基中残留PCE的浓度，采样结束后使用硅胶填缝密封盖上留下的针孔以防止PCE挥发。

不同共代谢基质对微生物群落降解PCE的影响。为了探索各种共代谢基质对降解菌群性能的影响，将培养所得菌液按5%接种量加入100 mL的无机盐培养液，PCE初始投加量设定为1 mg∙L⁻¹，再分别加入甲醇、乙醇、葡萄糖、酵母浸膏、乳酸钠^[25]。其中，葡萄糖以及酵母浸膏浓度为1 g∙L⁻¹、甲醇浓度为0.6 g∙L⁻¹、乙醇浓度为20 mg∙L⁻¹、乳酸钠浓度为0.77 g∙L^-1[26]。在30 ℃、30 r∙min⁻¹条件下振荡培养，每24 h采样检测，并利用实验结果建立动力学模型。

实验中PCE浓度采用顶空气相色谱仪^[27](Agilent 7820A，美国Agilent公司)及DB-624色谱柱测量。

实验中菌群浓度采用分光光度法^[25]测定，取适量实验样品放入1 cm的比色皿中，利用紫外分光光度计测量其在600 nm处的吸光度(A₆₀₀)。

实验中PCE降解菌群群落结构分析采用16S rDNA^[28]来分析，按照柱式细菌基因组抽提试剂盒的使用操作说明，对混合培养体的菌液中的DNA进行提取^[29]，将纯化后的样品利用Illumina Mi Seq平台进行高通量测序。

驯化期后PCE降解曲线及菌群生长曲线见图2。由图2(a)可知，PCE能得到高效降解并且去除率已明显高于90%。由图2(b)可知：降解初期(0~2 d)，菌群在PCE存在条件下能以较快速度生长；随着采样时间的推移，中期(2~4 d)达到静止期，OD值缓慢下降；后期(4~5 d)，由于PCE含量不足，菌群活性被抑制，OD值下降较快。筛选得到的菌群能够高效降解PCE，可以进行菌种鉴定以及环境因素影响实验。

种水平下的样本群落结构组成分布见图3，菌种鉴定结果表明PCE的降解菌群群落结构复杂多样。该菌群中共有16个高于0.50%的种，分别为Clostridium sp. FCB45、Methylotrophic bacterium RS-X3、Rhodocyclales bacterium TP139、Bacterium B3C1-6、Clostridium sp. 6-44、Desulfovibrio sp. Mlhm、Sinorhodobacter ferrireducens、Veillonellaceae bacterium 6-15、Bacteroidetes bacterium 4F6B、Geobacter lovleyi、Treponema sp. HM、Paracoccus kocurii、Thermomarinilinea lacunifontana、Riemerella sp. Lo3、Chlorobi bacterium feline oral taxon 101及Rhizobium selenitireducens。其中，梭状芽孢杆菌(Clostridium sp. FCB45)含量最高，占总量的44.49%，成为优势菌种。这一结果证实了DAVID^[12]在微生态研究中推测Clostridium属这种活性较高的梭状菌可以成为降解PCE的潜在微生物的结论。然而，因为这是由普通污水厂的厌氧污泥驯化而来的，故与LOFFLER等^[30]在被PCE长期污染的沉积物中所观察到的Desulfuromonas和Dehalococcoides是PCE的优势降解菌有所不同。Methylotrophic bacterium RS-X3含量为17.34%，作为甲基营养菌不仅可以在氯化甲烷上生长^[31]，并且其被证实含有脱氯酶基因^[32]，因此，可推测在本研究中Methylotrophic bacterium RS-X3可以促进PCE的生物降解。而占总量7.39%的Rhodocyclales bacterium TP139作为能够利用多种有机化合物生长的多功能细菌的代表^[33]，首次在PCE降解菌群中被发现并检测到。

有研究表明，脱硫弧菌属(Desulfovibrio sp. Mlhm)可以参与几种氯代污染物的脱氯和硫酸盐还原，包括1, 2-二氯乙烷^[34]、1-三氯乙烷^[35]和氯仿^[36]，Treponema属(Treponema sp. HM)能够通过添加醋酸盐将五氯苯酚脱氯成氢气、二氧化碳和甲酸盐^[37]，Bacteroides属(Bacteroidetes bacterium 4F6B)可降解甲基叔丁基醚^[38]，Sinorhodobacter ferrireducens能利用肌醇、L-丙氨酸、4-羟基苯甲酸和L-脯氨酸作为碳源^[39]，Thermomarinilinea属(Thermomarinilinea lacunifontana)能在多种有机物存在时生长(包括明胶、甲壳素、谷氨酸等)^[40]。这些菌株也在该菌群中被检测到，其含量分别为2.61%、0.85%、0.97%、1.99%和0.80%，其中Desulfovibrio、Treponema属为潜在PCE降解菌。

环境因素对PCE降解效果的影响见图4。由图4(a)可知温度对PCE降解率的影响不显著。数据显示3个温度梯度下去除率均高于80%，表明该菌群整体代谢活性较高，具有较宽的温度生态幅，适应不同温度的环境能力较强。在实验初期(0~3 d)，菌群在10 ℃以及 20 ℃下对PCE的降解速率相比30 ℃较慢；在后期(4 d后)，菌群在10 ℃和20 ℃时对PCE的降解率与其在30 ℃下的降解率相当。ZHANG等^[41]也得出TCE去除率随温度的升高(从20 ℃上升到30 ℃)而增加的类似结论。SHARMA等^[42]认为，低温下微生物需要更多的时间来矿化疏水性物质。因此，生物反应与化学反应都会减慢速率，而较高的温度会导致生物降解增加。一般地下水的平均温度约为15 ℃(我国西北地区冬季地下水水温仍处于10 ℃左右)^[43-45]，可以达到该菌群生长的适宜温度范围。

由图4(b)可知：菌群在降解PCE的过程中受非极端pH的影响不显著。在初始pH 6~8时，PCE的降解速率随着初始pH的变化呈现出一定的波动性，但在总体上体系中的微生物群落均能够实现PCE的有效降解。初始pH 7.0为PCE降解的最适值，因为弱酸以及弱碱性的条件不会对降解菌群活性产生抑制，所以在非极端pH的地下水环境中，此菌群也可以发挥作用。

由图4(c)可知：菌群在降解PCE的过程中受PCE初始浓度的影响不显著，但其降解速率存在一定波动性。在此PCE初始投加范围内，该菌群活性没有受到明显抑制，此浓度下的PCE毒性没有破坏菌群体内的酶、核酸以及DNA等的结构，所以菌群能正常进行新陈代谢，但当PCE初始浓度过低时，与酶结合的底物浓度偏低，会使微生物的活性降低，从而导致PCE降解速率下降^[46]。

不同共代谢基质对PCE降解效果的影响见图5，其中，酵母浸膏作为共代谢基质时降解效果最好。为了比较不同共代谢基质对微生物脱氯能力的影响，需要建立动力学模型进行比较。一般情况下，反应的动力学方程见式(1)，对应一级动力学模型^[47]见式(2)。

式中：c为PCE浓度，mg·L⁻¹；p为反应级数；k为反应速率常数，d⁻¹；t为反应时间，d；c₀为初始PCE浓度，mg·L⁻¹；t₀为初始反应时间，d。

PCE反应动力学模型见图6，根据一级反应动力学拟合方程得到的相关参数见表1。由图6和表1可知，共代谢基质强化的微生物降解过程全部符合一级反应动力学，R²均在0.928以上，除无共代谢对照组只有0.884外，整体拟合效果较好。根据表1进一步可得出，添加了酵母浸膏后实验的半衰期比不添加共代谢基质时减少了0.838 d，并且降解反应速率常数由0.327 d⁻¹降至0.098 d⁻¹，其他共代谢基质（除乙醇外）添加后降解反应速率常数均有提高。上述结果表明，这些共代谢基质的添加均提高了菌群的降解速率。添加不同共代谢基质后的PCE降解反应速率常数有以下关系：酵母浸膏>葡萄糖≈甲醇>乳酸钠>无共代谢基质>乙醇。以酵母浸膏为共代谢基质时，降解反应速率常数最大为0.327 d⁻¹，半衰期为1.571 d，大于其他共代谢基质，所以在此实验条件下，酵母浸膏为最佳的共代谢基质。这可能是因为酵母浸膏含有丰富的维生素、各种氨基酸及核酸降解物等，可以作为促进微生物生长的氮素营养源^[22]。乙醇作为共代谢基质时四氯乙烯的降解反应速率常数最小，还小于没有共代谢条件下的降解速率，这可能是因为乙醇对该菌群产生了活性抑制。乙醇因为其特殊的理化性质，会对简单节杆菌中的细胞色素酶等产生抑制作用，使降解菌的降解效率降低^[48]，乙醇还会改变乳酸杆菌细胞膜的通透性从而影响菌体的代谢活力^[49]。因此，可推断同为革兰氏阳性^[50]菌的Clostridium sp. FCB45(优势菌种)会出现相似的活性抑制，从而影响PCE降解速率。

1)利用梯度驯化法获得可将PCE高效降解的菌群，此菌群可以在PCE长期选择压力下生存繁殖。菌种鉴定结果显示：在种水平上，梭状芽孢杆菌Clostridium sp. FCB45含量最高，成为群落中的优势菌种。该群落多样性高，组成复杂，群落稳定性高，易于管理。

2)当温度为30 ℃、pH为中性、PCE初始浓度为1 mg∙L⁻¹和共代谢基质为酵母浸膏时，PCE降解效率最高可达96.75%。此群落可以在不同环境条件下(pH、温度等)表现出较高的降解率，该微生物群落有较宽的生态幅，在非极端环境条件下该群落均能发挥作用。

3)添加共代谢基质强化的微生物实验结果表明，反应模型均符合一级反应动力学，拟合度良好，降解反应速率常数由大到小顺序依次是：酵母浸膏>葡萄糖≈甲醇>乳酸钠>无共代谢基质>乙醇。该菌群在利用酵母浸膏作为共代谢基质时，降解速率常数最大可达0.327 d⁻¹。本研究中酵母浸膏最大程度地提高了四氯乙烯的降解速率。