蚯蚓粪净化硫化氢恶臭气体

田维平; 陈学民; 周鹏; 伏小勇; 李晨旭

doi:10.12030/j.cjee.201806036

蚯蚓粪净化硫化氢恶臭气体

1.
兰州交通大学环境与市政工程学院，兰州 730070
2.
兰州交通大学电子与信息工程学院，兰州 730070
基金项目:
国家自然科学基金资助项目（51168029）

甘肃省自然科学基金资助项目（1610RJYA035，1610RJZA058）

兰州交通大学青年基金资助项目（2016009）

Removal of hydrogen sulfide contaminated air by using vermicompost mediated bioreactor

1.
School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China
2.
School of Electronic and Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China
Fund Project:

摘要: 为探究蚯蚓粪净化硫化氢恶臭气体的可行性及其微生物群落结构的构成，以蚯蚓粪为生物反应器的载体，考察了蚯蚓粪去除硫化氢的性能；采用Miseq高通量测序技术分析蚯蚓粪中微生物种群结构变化。结果表明,当进气浓度小于350 mg·m-3，气体流量为0.25~0.35 m3·h-1时，H2S去除率可达100%。随着进气流量的增大，H2S去除率下降。微生物种群结果揭示蚯蚓粪生物反应器的不同空间层次上呈现出明显的空间分布多样性差异。蚯蚓粪生物反应器的主要降解硫化氢的优势菌为：变形菌门（44%~85%），γ-变形菌纲（18%~76%）；产黄杆菌属（6.1%~62.5%）、盐生硫杆菌属（2.8%~5.2%）、硫杆菌属（0.7%~6.9%）等优势菌属。通过分析可知，蚯蚓粪能高效处理硫化氢恶臭气体，蚯蚓粪中丰富且多样的微生物群落对其处理效果有着重要的作用。
- 硫化氢 /
- 蚯蚓粪 /
- 高通量测序 /
- 微生物种群
Abstract: The aims of this study were to assess the removal feasibility of hydrogen sulfide (H2S) contaminated air by using the vermicompost and to investigate its microbial community feature. The vermicompost obtained from dewatered sludge was chosen as a media of bioreactor and the changes of microbial community were analyzed by Miseq high-throughput sequencing technique. The results showed that the hydrogen sulfide contaminated air was completely removed at the inlet concentrations less than 350 mg·m-3 and gas flow rates of 0.25~0.35 m3·h-1. However, the removal efficiency decreased with further increase of the gas flow. Moreover, an remarkable difference was observed for the bacterial diversity on different spatial site of vermicompost mediated bioreactor. After the experiment, the hydrogen sulfide decomposer in the vermicompost was dominated by the Proteobacteria accounting for 44% to 85%, including the γ-Proteobacteria of 18% to 76%. Specifically, the Rhodanobacter (6.1% to 62.5%), Halothiobacillus (2.8% to 5.2%) and Thiobacillus (0.7% to 6.9%) were detected as the major desulfurization strains in the final vermicompost. This study suggests that the vermicompost mediated bioreactor has an excellent performance on purifying the hydrogen sulfide contaminated air, which is strongly dependent on the diverse microbial community in vermicompost.
- hydrogen sulfide /
- vermicompost /
- high-throughput sequencing /
- bacterial community

硫化氢（H₂S）是一种急性神经性毒性气体，具有典型臭鸡蛋气味，是恶臭污染物之一。H₂S广泛存在于火山爆发、沼气以及各种工业生产过程中如石油化工厂、污水处理厂、垃圾填埋厂及造纸厂等环境中，不仅危害人体健康和生命安全，而且会引起动力设备和金属管道腐蚀及催化剂中毒^[1-2]。沼气燃烧后，H₂S会转化为含硫的氧化物（SO_x）释放到空气中，造成大气污染^[3]。因此，严格控制硫化氢恶臭气体的排放以及研究其处理技术显得尤为重要。

净化H₂S恶臭气体的方法主要有物理法、化学法和生物法，前2种方法是基于物理作用和化学氧化与沉淀吸附技术的研究，如活性炭吸附、焚烧、催化分解、化学洗涤和热氧化等^[4]；而生物法是利用微生物氧化分解H₂S恶臭物质这一原理发展的技术。生物法具有成本低、运行管理方便、处理效率高、深度脱硫作用强、无二次污染等优点而成为净化H₂S废气领域的研究热点^[5]。生物法中微生物活性、多样性及其与环境协同作用决定了其去除能力和运行性能^[6-7]。填料是微生物的载体，其性能的优劣直接影响微生物的生长环境，因此，选择合适的填料对于提高生物处理技术的处理效率具有重要意义。

蚯蚓粪是蚯蚓消解有机废弃物的产物，具有高孔隙度和表面积，其富含有机碳素和矿质营养素^[8]，含有大量微生物群落和有机化学成分，能够通过自身代谢作用将恶臭物质生物降解，是一种高效除臭剂^[9-10]。近年来，国内对蚯蚓粪的农业应用研究较多，而以蚯蚓粪为填料吸附降解硫化氢恶臭气体机理及蚯蚓粪中微生物分析鲜有报道。本研究以污泥基蚯蚓粪为填料，考察生物反应器系统去除H₂S恶臭气体的性能及净化效果，同时利用Miseq高通量测序技术^[11]对系统内不同空间层次的蚯蚓粪进行细菌种群结构和生物多样性分析，实现“以废治废”，以期为蚯蚓粪净化硫化氢恶臭气体研究提供理论依据。

1 方法与材料

1.1 实验材料

本实验以蚯蚓处理城镇生活污水污泥排泄物——蚯蚓粪作为填料，蚯蚓粪经孔径为2.36～4.75 mm的筛网筛分后，自然分装在生物反应器中。蚯蚓粪的理化性质如表1所示。实验气源由成都科源气体有限公司提供，气体由H₂S和N₂混合配置，浓度为8 000 mg·m⁻³，纯度99.99%。

表1 蚯蚓粪理化性质
Table 1 Physicochemical properties of the vermicompost

表1 蚯蚓粪理化性质
**Table 1** Physicochemical properties of the vermicompost
含水率/%	pH	堆积密度/（g·L⁻¹）	比表面积/（m²·g⁻¹）	孔径/nm	有机质/%	总氮/（g·kg⁻¹）	C/N	总磷/（mg·kg⁻¹）	总钾/（mg·kg⁻¹）	总硫/（g·kg⁻¹）
58.65±0.01	7.15±0	717.59±8.02	7.65±0.26	16.40±0.42	24.04±0.01	23.59±0.37	10.35±0.03	5.95±0.42	2.12±0.3	71.66±0.1

1.2 实验设计和运行条件

本实验生物反应器为卧式，由预处理系统、生物反应器和尾气吸收装置3部分构成。蚯蚓粪生物反应器主体结构由有机玻璃制成，外形为长方体（400 mm×210 mm×130 mm）；内部放置4个由聚四氟乙烯网布材料制成的蚯蚓粪填料盒（80 mm×200 mm×120 mm），蚯蚓粪填料总有效体积为7.37 L。沿反应器长度方向设置5个气体采样口。从钢瓶出来的一定浓度H₂S气体经稳压和转子流量计计量，进入气体缓冲瓶，与经过装有活性炭空气过滤器并预湿的空气混合，获得实验需要的模拟废气。模拟废气从反应器左侧进入，被反应器中附着在填料上的微生物净化，用氢氧化钠吸收尾气。实验装置见图1。

图1 实验装置图
Fig. 1 Schematic diagram of experimental apparatus

本系统连续24 h通入H₂S和空气的混合气体，实验环境温度范围为18～28 ℃，填料湿度保持在60%左右，进气浓度为20~500 mg·m⁻³，进气流量为0.25 ~0.55 m³·h⁻¹，考察在此条件下蚯蚓粪生物反应器的去除效果。

1.3 样品采集与分析

1.3.1 气体取样及分析

气体采样口H₂S浓度采用美国英思科公司M40 Pro H₂S检测仪检测。

1.3.2 填料取样及分析

蚯蚓粪生物反应器的俯视图见图2，气体流动方式呈水平“S”型。在生物反应器运行不同阶段，采集不同层填料，取2份样品，一份用来分析其相关理化性质；另一份保存在−80 ℃超低温冰箱中，供DNA提取和高通量测序分析。

图2 蚯蚓粪生物反应器俯视图
Fig. 2 Vertical view of the bioreactor mediated with vermicompost

1.4 样品理化指标分析

蚯蚓粪比表面积采用比表面积及孔径分析仪V-Sorb 2800P检测，pH采用杭州雷磁pHS-3C酸度计进行测定，填料的含水率和有机质采用灼烧减量法测定，TN采用微波消解凯氏定氮法测定。总硫TS采用碱熔-离子色谱法测定。总磷TP采用碱熔-钼锑抗比色法，总钾TK采用NaOH熔融-火焰光度法，样品的所有理化性质指标都进行3次重复测定，结果见表1（取3次测定结果平均值）。

1.5 DNA提取及高通量测序

1.5.1 DNA提取

取生物反应器运行前后的填料——蚯蚓粪（初始记为CK；第106天时反应器中的第1~4层的样品，记为T1~T4），所取平行样品混合后作为一个DNA样本，采用Power Soil®DNA Isolation Kit（MoBio公司，美国）试剂盒提取DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性、纯度和浓度。

1.5.2 PCR扩增和高通量测序

对细菌16S rDNA 的V3～V4 高变区片段进行PCR扩增，带有Bar code信息的引物序列为341F（5'- CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR反应体系（30 μL）：15 µL PhusionMasterMix（2×），3 μL 341F/806R（6 μmol），10μLgDNA模板（1 ng·μL⁻¹），2 μL ddH₂O。PCR反应程序：98 ℃预变性1 min；30个循环包括（98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；72 ℃延伸5 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并回收，用GeneJET胶回收试剂盒（Thermo Scientific，美国）进行纯化。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒（Thermofisher，美国）进行文库的构建，经过Qubit定量和文库检测合格后，委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序。

1.6 生物信息分析

采用Cutadapt软件对原始数据进行质控、过滤、去嵌合体，得到有效数据。然后按照97%的一致性，利用Uparse(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)软件对有效数据进行OTUs聚类。基于OTUs 数量和测试深度变化的关系，根据不同生物信息学算法及MUSCLE软件分析样品的 α-多样性及β-多样性等。

采用IBM SPASS22.0软件对实验数据进行相关性分析；使用Qiime软件计算物种数、Chao1、Shannon、覆盖率等指数；利用Sigmaplot16.2软件作图。

2 结果与讨论

2.1 蚯蚓粪生物反应器对硫化氢的去除效果

本实验考察了H₂S进气浓度为20~500 mg·m⁻³，通过调节进气流量改变气体停留时间，进气流量分别为0.25、0.35、0.45、0.55 m³·h⁻¹（对应的气体停留时间为106、76、59、48 s）条件下，蚯蚓粪生物反应器运行3个多月，考察蚯蚓粪对H₂S的总体去除性能结果见图3所示。当Q为0.25 m³·h⁻¹时，以H₂S为唯一的微生物生长外加能源的蚯蚓粪生物反应器系统在6d启动完成，H₂S去除效率快速上升,在第6 d去除效果达到98.0%，说明蚯蚓粪上已附着大量H₂S降解菌，驯化期短。进气浓度小于350 mg·m⁻³，蚯蚓粪生物滤池对H₂S的去除率接近100%。在气体流量为0.35 m³·h⁻¹时,系统对H₂S的去除率亦高达97.9%。在进气流量较低时，一方面，H₂S在气液传质中效果优良；另一方面，装置内的H₂S降解菌有充足的时间来吸附降解H₂S。当进气流量进一步增大，去除率下降显著，4个阶段末的去除率分别为91.2%、86.8%、72.6%和60.1%，这是因为进气流量提高，H₂S在装置内的停留时间减少，与H₂S降解菌的接触时间随之减少，H₂S未被降解完全即被排出系统之外，导致硫化氢去除率下降。所以确定最佳进气流量为0.25~0.35 m³·h⁻¹。张华新等^[12]研究发现，H₂S进气浓度为60 mg·m⁻³，进气流量0.4 m³·h⁻¹时的去除率为80%。

图3 蚯蚓粪生物反应器对硫化氢的去除效果
Fig. 3 Removal performance for hydrogen sulphide in the bioreactor mediated with vermicompost

2.2 蚯蚓粪去除硫化氢过程中细菌群落结构及变化

2.2.1 空间多样性及处理前后细菌群落多样性分析

通过PCR和高通量测序后，5个样品获得的有效测序条带为64 271~80 214。5个样品中OTUs数分别为1 156、734、994、1 103和1 042，覆盖率均在99%以上，表明本次测序结果能够反映污泥基蚯蚓粪生物反应器中微生物群落结构组成的真实情况，可满足后续基因多样性及丰度等功能分析的要求。

表2 反映了污泥基蚯蚓粪生物反应器中不同空间层次蚯蚓粪中微生物的丰富度和多样性相关指数。Chao1指数表示一个群落或生境中物种数目的复杂度，指数越大，说明群落内物种丰度越多；Shannon指数反映细菌群落多样性指数，Shannon指数越大，表明群落的多样性越高^[13]。由表2可知，随着运行时间的增加，生物反应器处理硫化氢后的蚯蚓粪与CK的Chao1均减小，且生物反应器中微生物的丰度从左到右呈现上升趋势。对于Shannon指数来说，变化趋势类似，说明不同空间层次处理引起蚯蚓粪中细菌群落多样性的变化。这与进气方式有很大关系，本研究中的生物反应器为卧式，模拟废气从左侧进入，气体流动方式呈水平“S”型，H₂S浓度从左到右逐渐减小，最左侧层微生物首先接触较高浓度的H₂S气体，较高浓度的H₂S气体以及细菌氧化生成的硫酸对微生物有较大的毒害作用，增加了蚯蚓粪中细菌优势度，因此，样品T1的微生物丰富度和多样性最少，T4样品的多样性相对较高，可能是由于H₂S浓度的降低，对微生物的毒害作用也相对减少。这与陈桐生等^[14]的研究结果基本一致。

表2 处理H₂S和对照组蚯蚓粪中细菌群落多样性指数
Table 2 Diversity index of bacterial community in vermicompost and control for treating hydrogen sulphide

表2 处理H₂S和对照组蚯蚓粪中细菌群落多样性指数
**Table 2** Diversity index of bacterial community in vermicompost and control for treating hydrogen sulphide
样品	序列数	Shannon指数	Chao1指数	覆盖率/%
CK	70 368	7.51	1 161.78	99
T1	75 359	3.27	734.67	99
T2	80 214	6.62	984.71	99
T3	73 665	6.08	1 093.28	99
T4	64 271	7.24	1 052.46	99

2.2.2 不同空间层次处理硫化氢的蚯蚓粪样品的主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA），是一种应用方差分解，对多维数据进行降维，从而提取出数据中最主要的元素和结构的方法。对5个样品中OUT的组成进行PCA分析（图4），第1主成分和第2成分的贡献值分别为41.1%和23.3%。结果表明5个样品的细菌群落结构分布在不同的象限内，说明群落结构差异大，虽然样品T1和T2分布在同一个象限内，但两者之间距离较远。

图4 不同蚯蚓粪样品的OTU主成分分析
Fig. 4 Principal component analysis of OTU in different sampling vermicompost

2.2.3 不同空间层次蚯蚓粪中细菌类群分析

对质控后的序列进行物种分类，发现污泥基蚯蚓粪生物反应器处理硫化氢恶臭气体不同层次的填料样品中，共检测到41个门，82个纲，129个目，236个科，342个属。图5为样品中主要微生物在门水平上的变化。由图5可知该研究中蚯蚓粪中细菌种群主要有变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、Latescibacteria门、酸杆菌门（Acidobacteria）、Ignavibacteriae、疣微菌门（Verrucomicrobia）、绿菌门（Chlorobi）、浮霉菌门（Planctomycetes）、未分类的和微小菌群，并以变形菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门为优势菌门，相对丰度比例约为：82.1%~96.6%。变形菌门在硫氧化微生物中占主导地位，是降解硫化氢的主要降解者^[15]。在5个样品中其丰度最高，分别为31.6%、85.0%、46.1%、62.0%和44.0%，与CK相比，不同空间层次处理样品中变形菌门丰度显著增加，其中T1样品变形菌门丰度达到最大值。但是与CK相比，芽单胞菌门相对丰度降低。

图5 细菌群落结构门水平上的组成
Fig. 5 Composition of bacterial communities of the samples at the phylum level

图6为样品中主要微生物在纲的分类水平上组成。γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、梭状芽胞杆菌纲（Clostridia）、放线菌纲（Actinobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、嗜热油菌纲（Thermoleophilia）、纤维黏网菌（Cytophagia）、酸微菌纲（Acidimicrobiia）、Ignavibacteria和黄杆菌纲（Flavobacteriia）等在细菌纲中相对丰度较大，相对丰度之和在5个样品中占蚯蚓粪细菌总量的80%以上。由图6可知，不同空间层次蚯蚓粪细菌优势纲存在显著差异，与CK相比，随着系统运行时间的增加，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和β-变形菌纲（Betaproteobacteria）相对丰度增加，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）是微生物中第一大类群，γ-变形菌纲是变形杆菌门内最大的一个纲，所包含的细菌在生理上有极大的多样性^[16]且在T1中γ-变形菌纲相对丰度为76.5%；芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）和δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）相对丰度变化降低，在4个层次中，T1中相对丰度分别为1.79%、0.81%。这种不同可能是因为蚯蚓粪含有丰富微生物菌群、多种植物激素和腐植酸类物质，能分解各种有机类消化酶和菌类，将其吸附的物质进行分解^[9,17]。蚯蚓粪生物反应器是一个特殊的微生态环境，其细菌的多样性与硫化氢的进气浓度、气体停留时间、负荷及蚯蚓粪基质的营养因素密切相关。

图6 细菌群落结构纲水平上的组成
Fig. 6 Composition of bacterial communities of the samples at the class level

通过对样品细菌群落结构属水平的分析，可知与α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）、梭状芽胞杆菌纲（Clostridia）和鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）同源的硫氧化细菌参与了硫化氢恶臭气体的氧化。与CK相比，发现不同空间层次的4个样品中丰度较高的菌属主要有产黄杆菌属（Rhodanobacter）、盐生硫杆菌属（Halothiobacillus）、硫杆菌属（Thiobacillus）、Mizugakiibacter、Romboutsia、芽孢杆菌属（Bacillus）、鞘脂杆菌属（Sphingopyxis）梭状芽胞杆菌属（Clostridium sensu strict 1）等。其中，产黄杆菌属（Rhodanobacter，6.1%~62.5%）、盐生硫杆菌属（Halothiobacillus，2.8%~5.2%）、硫杆菌属（Thiobacillus，0.7%~6.9%）为优势菌属。产黄杆菌属（Rhodanobacter）革兰氏阴性，好氧，属于黄色单孢菌科，黄单胞菌在好氧的条件下可以降解硫化氢^[18]。盐生硫杆菌属（Halothiobacillus）嗜常温、专性化能自养、严格好氧硫化细菌，可以从还原性硫化物的氧化过程中获取能量而存活，可将硫化物氧化为单质硫^[19-20]。Thiobacilllus是严格化能自养、好氧或兼性厌氧的硫氧化细菌^[15]，可以将硫化物氧化成单质硫、硫酸盐或硫代硫酸盐，是脱硫系统中主要的优势属^[21]。在本反应系统中随着进气H₂S浓度和去除率的变化，硫杆菌属（Thiobacillous）相对丰度增加，这与肖莉凡等^[22]发现硝酸盐生物氧化沼气硫化氢生物反应器中污泥微生物群落所得的结果一致。

3 结论

1）蚯蚓粪生物反应器在启动运行6 d后，硫化氢的去除率可接近100%，说明蚯蚓粪处理硫化氢恶臭气体效果良好。

2）当进气浓度小于500 mg·m⁻³，进气流量为0.25 ~0.55 m³·h⁻¹时，在4个阶段末蚯蚓粪对硫化氢的去除率分别为91.2%、86.8%、72.6%和60.1%，反映了硫化氢去除效果与蚯蚓粪中所存在的微生物群落关系密切，随着负荷增加，进气流量增加，去除性能发生变化。

3）高通量测序结果表明系统中不同空间层次的蚯蚓粪中细菌群落结构差异显著，变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为优势菌门，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）为优势菌纲，产黄杆菌属（Rhodanobacter）、盐生硫杆菌属（Halothiobacillus）、硫杆菌属（Thiobacillus）为优势菌属，对于蚯蚓粪去除硫化氢的性能至关重要。

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