氨氮浓度对猪粪厌氧消化及产甲烷菌群结构的影响

孟晓山; 张玉秀; 隋倩雯; 王子月; 郁达伟; 王亚炜; 魏源送

doi:10.12030/j.cjee.201802064

氨氮浓度对猪粪厌氧消化及产甲烷菌群结构的影响

1.
中国科学院生态环境研究中心环境模拟与污染控制国家重点联合实验室，北京100085
2.
中国矿业大学北京化学与环境工程学院，北京100083
3.
中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室，北京100085
4.
中国科学院大学，北京100049
基金项目:
国家重点研发计划项目（2016YFD0501405）

国家水体污染控制与治理科技重大专项（2015ZX07203-007）

国家自然科学基金资助项目（21677161）

中国矿业大学（北京）中央高校基本科研业务费专项基金资助项目（2010YH05）

Effects of ammonia concentration on anaerobic digestion of swine manure and community structure of methanogens

1.
State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
2.
School of Chemical & Environmental Engineering, China University of Mining & Technology Beijing, Beijing 100083, China
3.
Department of Water Pollution Control Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
4.
University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Fund Project:

摘要: 氨氮抑制是影响高含固厌氧消化推广应用的主要因素之一。通过批式实验，采用外源氨氮投加方式，考察了厌氧消化过程中不同氨氮浓度对鲜猪粪产甲烷效果和产甲烷菌群结构的影响。结果表明：氨氮添加量为2 000 mg·L-1（TAN≈3 596.7 mg·L-1）时，日产甲烷速率及累积产甲烷量均明显下降；添加量大于4 000 mg·L-1（TAN≈5 618.7 mg·L-1）时，氨氮抑制加剧，出现VFAs累积、产甲烷高峰期后移、丙酸降解失败。不同氨氮投加量下猪粪中挥发性固体（VS）产甲烷率分别为（369.0 ± 17.3）、（318.5 ± 7.6）、（234.7 ± 2.5）、（165.4 ± 19.4）mL·g-1，产甲烷效率较对照组分别下降14%、36%和55%。超过4 000 mg·L-1的外源氨氮投加促使产甲烷菌群结构发生显著变化，乙酸利用型产甲烷优势菌Methanosaeta 逐渐被Methanosarcina代替，而氢利用型产甲烷菌属中Methanospirillum的优势性逐渐被Methanoculleus和Methanomassiliicoccus取代，说明后者均有较强的氨氮耐受性。主成分分析和冗余分析表明，高浓度氨氮会促使产甲烷途径由乙酸利用型为主向氢利用型为主转变。
- 猪粪 /
- 厌氧消化 /
- 氨氮抑制 /
- 产甲烷菌 /
- 丙酸
Abstract: Ammonia inhibition is regarded as a main factor that influences the popularization and application of high solid anaerobic digestion. In this study, batch experiments were carried out with exogenous ammonia addition to investigate the effect of ammonia concentration on methane production and methanogenic community during the anaerobic digestion of swine manure. Results showed that the daily and cumulative methane production both decreased obviously when the addition amount was 2 000 mg·L-1 with corresponding TAN about 3 596.7 mg·L-1. Furthermore, extend of ammonia inhibition was further aggravated with the accumulation of VFAs, lag phase of methane production peak and failure of propionic aid degradation when the addition amount of ammonia exceeded 4 000 mg·L-1 with corresponding TAN about 5 618.7 mg·L-1. With the increase of ammonia addition, the methane production of volatile solid in swine manure was (369.0 ± 17.3), (318.5 ± 7.6), (234.7 ± 2.5) and (165.4 ± 19.4) mL·g-1, respectively, resulting in 14%, 38% and 55% reduction of methane production potential compared with control group. The methanogenic community changed significantly when the addition amount exceeded 4 000 mg·L-1. For example, Methanosaeta was outcompeted by Methanosarcina among aceticlastic methanogens, and Methanospirillum was eliminated by Methanoculleus and Methanomassiliicoccus among hydrogenotrophic methanogens, indicating that the latter ones are more tolerant to ammonia. According to the result of PCA and RDA, high concentration of ammonia nitrogen would promote the evolution of methanogenesis from the aceticlastic pathway to hydrogenotrophic pathway gradually.
- swine manure /
- anaerobic digestion /
- ammonia inhibition /
- methanogens /
- propionic acid

近年来，随着畜禽养殖业的不断发展，我国每年约有 38 亿t畜禽粪污产生，其中40%未能有效处理和利用^[1]，这给周边环境带来严重危害。厌氧消化技术是降解有机废弃物的有效手段，适于畜禽粪污的减量化、无害化、资源化处理，能够同时生产清洁能源沼气和有机肥原料沼渣、沼液^[2]，已成为优先选择的粪污处理方法^[3-4]。相比传统厌氧消化（含固率为1%～5%）^[5]，高含固厌氧消化（含固率 ≥8%）^[6]具有设施体积小、水耗及能耗较低等优势，逐渐得到重视与应用。然而，猪粪中含有丰富的粗蛋白，约占干重的17%^[7]，这部分有机氮随着厌氧消化的进行最终被转化为氨氮，会大幅提高系统的氨氮浓度，对厌氧消化产生不利的影响，降低其效率，甚至会导致系统崩溃。

当前，厌氧消化过程中氨氮对微生物抑制的机理研究有很多，虽然有些机理仍存在争议，但是游离NH₃分子比NH₄⁺离子更容易对微生物产生抑制作用且抑制程度更大的观点^[8-9]已被广泛证实，是产甲烷过程受氨氮抑制的主要原因^[10-12]，而FAN的浓度由总氨氮（TAN）浓度、pH和温度共同决定^[13-14]，TAN仍是衡量氨氮抑制的重要指标。一般认为：TAN浓度为50～200 mg·L⁻¹时利于厌氧消化；200～1 000 mg·L⁻¹时没有明显拮抗作用；在1 500～3 000 mg·L⁻¹会受到抑制，尤其在高pH厌氧体系；超过3 000 mg·L⁻¹，厌氧消化过程在任何pH条件下微生物均会受到不同程度的抑制^[15-16]。氨氮抑制除了跟TAN浓度密切相关，还受底物的理化性质、接种物对氨氮的耐受性以及厌氧消化操作条件（温度、pH及有机负荷）的影响^[17]，研究得到的抑制阈值存在较大差异，这些对制定有效的氨氮抑制应对措施构成了较大阻碍。所以，厌氧消化氨抑制研究的重点不仅在于获得TAN及对应FAN的抑制阈值浓度，还在于同时研究TAN及FAN浓度变化背后相关的产甲烷菌群结构和代谢途径的变化，从而真正揭示氨氮抑制的机制，并据此制定相应的氨氮抑制控制措施。

本研究采用批式全自动厌氧消化装置，以猪粪为消化底物，通过氯化铵投加梯度提升总氨氮（TAN）浓度，同步考察不同TAN对厌氧消化效率（包括产甲烷速率、累积产甲烷量）和厌氧消化过程主要理化指标（包括挥发性脂肪酸、pH、FAN及SCOD）的影响；并采用新一代高通量测序技术（Illumina Hiseq）解析厌氧消化过程中产甲烷功能菌群的动态变化，分析不同氨氮浓度下主要环境因子与产甲烷菌群演替之间的关系，以期为应对氨氮抑制、保障厌氧消化系统稳定运行提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验用猪粪及接种厌氧污泥均取自北京郊区某集约化养猪场，其中接种污泥为升流式固体反应器（USR）的溢流出料，经过18目筛网剔除杂质后再沉降浓缩至所需浓度。取回的样品均立即存入4 ℃冷库保存、待用。实验原料的理化特性如表1所示。

表1 厌氧消化物料的理化性质
Table 1 Physical and chemical characteristics of substrate and inoculums

表1 厌氧消化物料的理化性质
**Table 1** Physical and chemical characteristics of substrate and inoculums
原料	TS/%	VS/%	pH	C/N	总氨氮/(mg·kg⁻¹)	TVFAs/(mg·kg⁻¹)
猪粪	25.97 ± 0.11	20.25 ± 0.07	6.95 ¹⁾	10.2	3 763	19 907
接种泥	5.17 ± 0.01	3.18 ± 0.02	7.76	6.5	2 481	825

注：1）将鲜猪粪与去离子水质量比1:9混匀后，测定其上清液pH。

1.2 实验装置及方法

本研究使用瑞典碧普公司（Bioprocess Control，Sweden AB）研制的第2代全自动甲烷潜力测试系统（AMPTS II）进行实验，该系统由厌氧消化单元、CO₂吸收单元、气体计量单元3个部分构成。厌氧消化单元包括15 个配备了全自动内置搅拌系统的650 mL血清瓶（有效容积一般为400 mL）和控温水浴槽；CO₂吸收单元包括15 个100 mL血清瓶，内部装有80 mL的3 mol·L⁻¹的NaOH溶液吸收沼气中的CO₂；气体计量单元配备了全自动微量气体体积计量系统及流量数据即时采集、分析功能。

血清瓶中依次放入50.9 g猪粪、287.2 g水和61.9 g厌氧接种污泥，充分混匀后分别加入0、3.06、6.12和8.41 g氯化铵，对应的总氨氮（TAN）浓度较对照组分别提升0、2 000、4 000、5 500 mg·L⁻¹，依次命名为A组（对照组）、B组、C组和D组。再次搅匀后密封、氮气吹脱5 min置换出血清瓶中残余空气，保证严格厌氧环境。反应器搅拌速度为80 r·min⁻¹，水浴槽温度控制在（37 ± 1）℃。每组实验均设置3个平行，实验以厌氧消化反应器的日产甲烷量小于5 mL为终点。

1.3 测试项目及方法

每周或每2周采集1次厌氧消化过程中的实时样品，样品的pH由梅特勒FE20型pH计测定；pH测定后，留取1 mL样品用于测定其他指标，其余消化液注射回反应器，部分留样用于DNA提取，其余样品稀释10倍，再经8 000 r·min⁻¹离心10 min 后取其上清液过0. 45 μm水系聚醚砜滤膜，滤液用来测试其它理化指标，其中溶解性化学需氧量（SCOD）采用DR2800分光光度计（HACH，USA）测定；挥发性脂肪酸（VFAs）浓度通过岛津GC-2010气相色谱（Shimadzu，Japan）测定，色谱配备FID检测器及DB-FFAP毛细管柱（30 m×0.32 mm×1.00 μm），色谱进样口温度为220 ºC，检测器温度为250 ºC；TS、VS及氨氮等其他指标依据标准方法^[18]测定。

游离氨（FAN）浓度^[1]可参照式（1）计算获得：

$C_{FAN} = C_{TAN} (1 + \frac{10^{- pH}}{10^{- (0.090 18 + \frac{2 729.92}{T})}})$

（1）

式中：C_FAN为FAN 的质量浓度，mg·L⁻¹；C_TAN为总氨氮（TAN）的质量浓度，mg·L⁻¹；T为厌氧消化反应温度，K；pH为样品刚取出时的实测pH。

1.4 污泥中DNA的提取及测序分析

使用FastDNA® SPIN Kit for Soil试剂盒（MP Biomedical，USA）提取样品中的基因组DNA，提取的DNA 在Nanodrop 分光光度计（Nanodrop，USA) 上测定DNA 的浓度和质量，并使用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA 的完整性，经检验合格后交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行后续DNA扩增及上机测序。古细菌群落结构分析使用引物M-340F（5′-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3′）和GU1ST-1000R（5′-GGCCATGCACYWCYTCTC-3′)进行第1轮扩增；PCR结束后，其产物再次经引物349F（5′-GYGCASCAGKCGMGAAW-3′）和 806R（5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′）进行第2轮扩增；引入Illumina桥式PCR兼容引物进行第3轮扩增，PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶拍照检测质量合格后纯化回收，采用Illumina Miseq 平台( Illumina，USA) 测序分析，测序数据除杂、过滤后的纯净序列采用Ribosomal Database Project ( RDP) 分类，设定cutoff 值为50%进行物种分类。主成分分析（PCA）及冗余性分析（RDA）采用Canoco 5.0 ( Microcomputer，USA) 基于各样品中相对丰度大于1%的产甲烷菌属绘制。

1.5 产甲烷潜势动力学模型

Modified Gompertz模型拟合在厌氧消化研究过程中应用非常广泛，相关参数可以作为抑制效果及厌氧消化效率的评价依据，模型的方程式^[19]如下：

$P_{{CH}_{4}} (t) = P \cdot \exp [- \exp (\frac{R_{m} \cdot e}{P} (λ - t) + 1)]$

（2）

式中：P_CH₄(t) 为反应器运行至第t天的累积产甲烷量，mL·g⁻¹；R_m 为最大比产甲烷速率，mL·d⁻¹；P 为累积产甲烷潜势，mL·g⁻¹；λ 为产甲烷迟滞期，d；e = 2.718 3。

2 结果与讨论

2.1 氨氮浓度对产甲烷的影响

不同氨氮浓度下的累积产甲烷量及日产甲烷量如图1所示。从图1（a）中可知，随着氨氮浓度的升高，累积产甲烷总量逐渐下降。2 000 mg·L⁻¹的氨氮投加量将产甲烷量由对照组的（3 667.6 ± 171.7）mL削减至（3 165.6 ± 75.6）mL，下降了13.7%，表明2 000 mg·L⁻¹的氨氮投加量已导致厌氧消化系统的总氨氮（TAN）浓度超过了氨氮抑制的阈值，对产甲烷构成轻度的氨氮抑制作用，与高文萱等^[3]的研究结果相似。氨氮投加量达到4 000 mg·L⁻¹时，累积产甲烷量下降更为严重，甚至出现了明显的产甲烷滞后期，表明氨氮抑制程度进一步增大。而5 500 mg·L⁻¹最高氨氮投加量下的累积产甲烷量则降至对照组的44.8%，表明该投加量已导致系统的总氨氮浓度超过了半抑制浓度（IC₅₀，造成甲烷产量减少50%的TAN浓度），产甲烷效率下降超过一半。实验结束时，对照组和实验组的VS产甲烷率分别为（369.0 ± 17.3）、（318.5 ± 7.6）、（234.7 ± 2.5）、（165.4 ± 19.4）mL·g⁻¹。实验组与对照相比，猪粪的VS产甲烷率分别下降了14%、36%和55%。图1（b）为日产甲烷量曲线，一定程度上可以体现产甲烷菌的产甲烷活性。没有投加外源氨氮时，对照组中的氨氮浓度仅为（1 481.9 ± 67.7）mg·L ⁻¹，远低于文献报道的3 000 mg·L⁻¹总氨氮抑制阈值^[10-11,20]，氨氮不会对产甲烷菌构成抑制，产甲烷菌活性较高，在第5天达到最大日产甲烷量234.9 mL·d⁻¹。随着产甲烷菌将反应器内底物不断消耗，日产甲烷量会逐渐下降。随着外源氨氮的投加，日产甲烷量随着氨氮浓度增加明显减少，峰值分别为153.3 mL·d⁻¹（第1天）、79.9 mL·d⁻¹（第20天）和54.6（第59天）mL·d⁻¹，产甲烷量的峰值大幅下降，达到峰值的时间也明显后移，说明氨氮抑制在产甲烷速率和产甲烷周期上均对厌氧消化产生明显的不利影响。除此之外，对照组有明显的3个产气高峰期，实验组则减少为2个或1个，且不是很突出。据报道^[3,21]，不同的产甲烷峰值对应不同底物的降解，通常有2个高峰期，第1个产气高峰对应溶解性有机质的快速酸化与降解，第2个产甲烷高峰主要来自粗蛋白、粗脂肪和粗纤维等大分子难溶性物质的水解、酸化和降解。本实验对照组中出现的3个高峰期，根据产甲烷特征、过程VFAs和SCOD等理化参数分析，前2个高峰期应该如文献所述，而第3个峰值则可能是厌氧消化后期丙酸的降解（图2）。而在实验组随着外源氨氮的加入，产气峰值减少为2个或1个，可能是由于产甲烷活性的不断降低，待溶解性有机物和不溶解有机物都被细菌水解酸化成为VFAs后，产甲烷菌才逐渐适应系统的氨氮浓度，开始缓慢利用VFAs产甲烷。

图1 不同氨氮浓度下累积产甲烷量及日产甲烷量
Fig. 1 Cumulative and daily methane production curves under different ammonia concentrations

图2 不同氨氮浓度下VFAs质量浓度随消化时间的变化
Fig. 2 Evolution of VFAs mass concentration with digestion time under different ammonia concentrations

随着氨氮浓度的不断增加，产甲烷过程受到了不同程度的氨氮抑制。通过Modified Gompertz方程拟合获得的相关参数如表2所示，可以发现Modified Gompertz模型可以很好地模拟不同氨氮抑制程度下猪粪厌氧消化产甲烷过程。拟合所得猪粪的产甲烷潜势P随氨氮浓度升高逐渐下降，较对照组依次下降14.6%、34.2%和53.0%，与实际VS产甲烷率下降幅度和趋势均保持一致。此外，产甲烷迟滞期λ随着抑制程度增强明显增大，迟滞期最长的D组比对照组延长了108倍，有效地量化了氨氮浓度对产甲烷过程的抑制程度。

表2 Modified Gompertz模型对累积甲烷产量的拟合结果
Table 2 Fitted results for cumulative methane yields by Modified Gompertz model

表2 Modified Gompertz模型对累积甲烷产量的拟合结果
**Table 2** Fitted results for cumulative methane yields by Modified Gompertz model
组别	实际产甲烷量/（mL·g⁻¹）	P/(mL·g⁻¹)	R_m/(mL·d⁻¹)	λ/d	R²
A	369.0 ± 17.3	368.0	19.7	0.31	0.998
B	318.5 ± 7.6	314.1	12.2	0.23	0.996
C	234.7 ± 2.5	242.1	6.5	8.71	0.996
D	165.4 ± 19.4	172.9	3.6	33.65	0.978

2.2 氨氮浓度对有机物降解、pH和FAN的影响

2.2.1 VFAs和SCOD

挥发性脂肪酸（VFAs）是厌氧消化过程中有机物水解、酸化的产物，同时也是产甲烷菌产甲烷过程使用的底物，反映水解酸化和产甲烷间的平衡，是评价厌氧消化系统运行状态重要参数^[12]。从图2可以看出，反应启动前发酵液中即有近2 500 mg·L⁻¹的VFAs，以乙酸、丙酸和正丁酸为主，占总VFAs（TVFAs）的92.7%。反应启动后，水解酸化菌将有机物迅速降解成为VFAs供给产甲烷菌利用。对照组的TVFAs浓度在第7天基本维持不变，说明产酸速率与耗酸速率达到了动态平衡，但是VFAs的组成发生了明显的变化，乙酸和丁酸被快速降解，促进了产甲烷的第1个高峰期，丙酸浓度反而显著增大。在B、C、D组，由于产甲烷古菌比产酸细菌更容易被氨氮抑制^[10-11]，产酸菌仍不断产酸，而产甲烷菌对VFAs的消耗速率较空白组开始减慢，前文所述的产酸与耗酸的动态平衡被打破，造成了VFAs的浓度逐渐升高，实验组VFAs在第7天分别达到3 242、4 978和5 598 mg·L⁻¹，TVFAs明显累积，成为除产气量下降外氨氮抑制的另一重要特征^[22]。随着厌氧消化的继续进行，对照组中的丙酸逐渐被互营型产乙酸菌逐渐分解为氢和乙酸，供产甲烷菌进一步产甲烷利用。与此同时，大分子的不溶性有机物也被逐渐转化为VFAs并迅速被进一步降解，这部分VFAs的降解与丙酸的降解分别构成了对照组第2和第3产气高峰期。在B组，当氨氮投加量为2 000 mg·L⁻¹时，在厌氧消化起始阶段发生VFAs累积，随着VFAs消耗速率超过生成速率，TVFAs开始减少，结构组成也发生与对照组A组相似的变化，是其第8～18天的产甲烷高峰期的主要贡献。C组与B组的规律相似，但由于抑制程度更高，VFAs降解更为缓慢，与产甲烷峰值低对应。与B、C组不同，D组的抑制程度最大，VFAs的累积期长达21 d，随后产甲烷菌才慢慢适应高浓度的氨氮，逐渐开始降解VFAs，是33.65 d产甲烷滞后期的重要原因。然而，实验结束时，C组和D组仍有2 500 mg·L⁻¹的VFAs未能被降解，其中丙酸占84%～86%。许之扬等^[23]在研究氨氮对餐厨垃圾厌氧消化影响时也发现了1 900 mg·L⁻¹的丙酸累积。在厌氧发酵过程中，丙酸易积累的本质原因在于热力学限制及互营养型菌群^[24]。从热力学角度分析，丙酸转化为乙酸、CO₂和H₂的反应所需吸收能较高，不能自发进行，如下式：

CH₃CH₂COOH + 2H₂O → CH₃COOH + CO₂ +3H₂ △G⁰ = +76.1 kJ·mol⁻¹

（3）

丙酸产甲烷过程涉及多种不同类型微生物间的互营代谢，包括2菌群的丙酸氧化细菌与氢型产甲烷菌之间的互营代谢，或3菌群的丙酸氧化菌、氢利用型产甲烷菌及乙酸利用型产甲烷菌之间的协同代谢过程^[24]。本研究中，随着总氨氮浓度升至或超过（5 618.7 ± 276.9）mg·L⁻¹（见表3中的C组及D组），氨氮对微生物的抑制作用进一步增强，影响了丙酸氧化菌降解丙酸的活性，进而中断了丙酸降解过程中的互营代谢过程，导致丙酸不能被有效降解供后续的产甲烷过程利用^[25-26]，累积产甲烷量进一步降低。

表3 总氨氮浓度及污染物去除率对比
Table 3 Comparison of total ammonia concentration and contaminant reduction ratio

表3 总氨氮浓度及污染物去除率对比
**Table 3** Comparison of total ammonia concentration and contaminant reduction ratio
组别	总氨氮浓度/(mg·L⁻¹)	TS削减率/%	VS削减率/%	TCOD去除率/%
A	1 481.9 ± 67.7	64.68 ± 0.59	77.93 ± 0.01	63.36 ± 0.04
B	3 596.7 ± 139.5	60.71 ± 0.14	73.83 ± 0.46	62.89 ± 1.10
C	5 618.7 ± 276.9	55.35 ± 0.08	65.38 ± 0.26	46.77 ± 1.57
D	6 883.2 ± 272.7	51.20 ± 0.40	58.88 ± 0.53	43.98 ± 3.78

与VFAs类似，SCOD是水解酸化的重要指标，与微生物产甲烷过程密切相关。从图3可以明显看出，对照组在反应启动后，水解酸化菌将不溶性有机物（或COD）转化为溶解性COD的速度明显小于产甲烷过程对COD的消耗速率，并在28 d内达到恒定值，说明厌氧消化系统处于良好的运行状态。B组SCOD的变化趋势与对照组相似，但是由于产甲烷菌受到轻度的氨氮抑制，SCOD消耗速率略慢于对照组，尤其是在14 d之后，造成这一差异可能跟丙酸的互营降解效率密切相关。而在C组和D组，反应启动后，SCOD首先增长，VFAs的累积是主要原因之一。随着产甲烷菌对高浓度氨氮逐渐适应，对VFAs的消耗促进了SCOD的下降。实验结束时，这2组仍有（6.9 ± 0.08）和（7.88 ± 0.40）g·L⁻¹，参考WU等^[6]给出的VFAs理论COD的折算系数，发现残余的VFAs对终点样品中SCOD的贡献最大，分别为3.92 和3.70 g·L⁻¹，其余的SCOD可能是一些与水解酸化相关的胞外酶、腐殖酸及其他溶解性微生物产物（SMP）等物质^[27]。

图3 不同氨氮浓度下SCOD随消化时间的变化
Fig. 3 Variation of SCOD with digestion time under different ammonia concentrations

2.2.2 pH和FAN

反应体系的pH是厌氧消化系统运行过程中另一个最重要理化参数，能反映消化过程的稳定性以及影响体系中有害物质（如游离氨FAN）的毒性表达，进而影响微生物活性。如图4（a）所示，实验组的起始pH较空白组的低些，介于6.80～6.99之间，可能是由于氯化铵投加的缘故。pH虽略有下降，但仍适于微生物的生长与代谢，故未进行pH调节。随着厌氧消化的开始，产甲烷过程不断消耗酸性VFAs，A组、B组的pH逐渐升高。由于B组产甲烷速率较A组要慢，pH的上升速度也相对慢些。C组和D组则由于起始阶段VFAs明显累积，pH先下降再上升，最终由于丙酸的残留和B组相似，pH在7.2左右，低于空白组的7.8。就整个过程来看，pH的波动在合适的范围内，适于微生物的生命活动^[2]。游离氨NH₃的毒性要比NH₄⁺的要强，本研究对其浓度进行了计算，如图4（b）所示。由于TAN在整个过程中相对稳定，所以FAN受pH的影响较大，4组实验中虽然TAN不断增高，但由于实验组的pH较对照组的要低，FAN在厌氧消化过程中差别不大，变化趋势较为相似。值得注意的是，所有样品的FAN浓度均低于200 mg·L⁻¹的游离氨抑制阈值^[10-11]，可以推测FAN抑制在本研究中不是很突出。

图4 pH及游离氨浓度的变化
Fig. 4 Variation of pH and FAN concentration

厌氧消化的目的是对有机废弃物进行资源化、无害化及减量化处理。从上述过程参数分析可明显看出厌氧消化过程已受到外源氨氮投加的影响，且浓度越大，抑制越明显。表3列出了反应器在不同氨氮浓度下的整体厌氧消化效果，TS、VS及TCOD的去除率随氨氮浓度增加明显下降，需采取有效措施缓解氨氮抑制或将TAN控制在一定浓度（如3 596.7 mg·L⁻¹）以下，以提高厌氧消化效率。

2.3 产甲烷菌群结构变化及分析

基于Illumina Hiseq 第2代高通量测序技术，本研究4组实验厌氧消化过程中14个样品分别得到了81 387～107 318条序列，平均读长约417 bp，能满足后续的统计分析。如图5（a）所示，在整个厌氧消化过程中，产甲烷菌的优势菌群在不断变化且受到氨氮浓度的影响。反应起始样品中Methanosaeta, Methanosarcina和Methanosphaera为优势产甲烷菌属，其中Methanosphaera主要来自于底物猪粪^[28]，随着厌氧消化的进行，逐渐被其他菌群替代。厌氧消化运行至第7天时，A组和B组的产甲烷菌群结构发生了明显的变化，与第0天相比，Methanosaeta丰度由50.8%分别提升至64.9%和63.1%。Methanosaeta是一种严格的乙酸营养型产甲烷菌型^[29]，在厌氧消化初始阶段有丰富的乙酸作为碳源，说明此时产甲烷途径以乙酸利用型为主。当反应运行至21 d时，A组中由于乙酸消耗殆尽，丙酸成为主要碳源，在互营丙酸氧化菌的作用下分解为氢气和乙酸，氢气的大量生成刺激了氢营养型产甲烷菌Methanospirillum相对丰度的提升（4.6%～19.8%），成为另一优势产甲烷菌，与乙酸营养型Methanosaeta协同将丙酸降解产物转化为甲烷。B组菌群有相似的演替趋势，但由于产甲烷菌的活性受到氨氮浓度影响，菌群演替的速率较A组要慢些。随着氨氮浓度不断提高，C组和D组的产甲烷菌演替趋势较前2组截然不同，在到达第1个产气高峰期之前即Methanosarcina（51.5%）取代了Methanosaeta（22.0%）成为优势菌，说明其对氨氮的耐受力更强。Methanosarcina 同属于乙酸营养型、氢营养型和甲基营养型^[11]，并且Methanosarcina 常形成不规则的细胞团聚体，因此能抵抗高浓度的毒性离子物质^[10]。因此，在C组5 600 mg·L⁻¹的高氨氮浓度下，Methanosaeta被抑制后，Methanosarcina成为优势菌群利用丰富的乙酸产甲烷。戊酸等有机酸被产乙酸菌进一步降解为氢气和乙酸才能被产甲烷菌利用，氢气促使Methanoculleus（12.0%～16.2%）及Methanomassiliicoccus（5.3%～10.9%）相对丰度明显增加，超过Methanospirillum（0.8%～1.3%），成为新的氢营养型优势菌，说明前者比后者更耐受氨氮。NIU等^[30]在启动CSTR处理鸡粪过程中，反应器遭遇了明显的氨氮抑制，但Methanoculleus相对丰度由起始的2%增至30%，降低进料浓度缓解氨氮抑制后，又降至13%，同样说明Methanoculleus特别适于在高氨氮环境下生存。在D组，Methanoculleus相对丰度进一步增加至20.0%。TIAN等^[8]在对厌氧污泥进行氨氮驯化过程发现Methanoculleus丰度提高的同时会促进乙酸氧化菌（SAOB）相对丰度的增加。根据最新的同位素示踪研究结果，TAN浓度小于3 000 mg·L⁻¹时，产甲烷途径以乙酸利用型为主，而大于6 000 mg·L⁻¹时在SAOB的互营作用下以氢利用型产甲烷途径为主^[31]，可以推测C组和D组在厌氧消化后期的产甲烷途径已经逐渐由乙酸利用型为主向氢利用型为主转变。因此，产甲烷菌群的主成分分析结果表明（图5（b）），厌氧消化起始阶段A组和B组聚类明显，而C组和D组聚在一起；随着厌氧消化进行到后期，A组和B组仍能明显聚类，而C组和D组有一定相似性，但距离较远。产甲烷菌群演替路径的差异验证了上述产甲烷途径发生改变的推测。

图5 产甲烷菌群相对丰度的变化及PCA分析（属水平）
Fig. 5 Relative abundance of methanogens and principal component analysis (genus level)

通过冗余分析（RDA）所测样品的产甲烷菌群组成和厌氧消化过程中重要理化参数的关系，揭示环境因子与产甲烷间的多元关联作用，将产甲烷菌属相对丰度作为物种变量（9个），解释变量包括乙酸、丙酸、TVFAs、TAN及FAN浓度，结果如图6所示。Methanosarcina与环境中的有机酸（包含乙酸、丙酸及TVFAs）及氨氮具有正相关性，说明Methanosarcina有较好的耐受力，有机酸和TAN可能对其相对丰度的增加具有促进作用。而另一乙酸营养型产甲烷菌属Methanosaeta则与TAN呈现明显的负相关，说明了其对氨氮的耐受力较差，文献中已有较多类似的报道^[10,11,31]。与之相似的Methanospirillum也表现出与TAN的负相关性，并且与有机酸的负相关性，这可能是由于其与厌氧消化后期丙酸降解过程密切相关^[28]，在A组和B组厌氧消化后期，Methanospirillum相对丰度较高，而在C组和D组则由于更高的TAN导致系统中的丙酸未能明显降解，其相对丰度较低。Methanomassiliicoccus、Methanoculleus与FAN的相关性较强，而对有机酸相关性较弱，说明在厌氧消化后期随着VFAs的消耗、减少，pH得到提升，导致FAN浓度增大，而FAN能促进Methanomassiliicoccus及Methanoculleus等氢利用型产甲烷菌的增多^[31]，氢利用型产甲烷途径在厌氧消化后期对累积甲烷量的贡献逐渐增大。Methanobrevibacter对TAN及FAN均有明显的相关性，在实验组的相对丰度明显高于对照组。RDA 的结果与产甲烷菌属的组成分布结果较为一致，说明环境因子对菌群分布有着重要的影响，在实际应用中，需控制好关键的环境因素，才能有效应对氨氮抑制，以期获得高效的产甲烷菌群结构，提升底物的产甲烷潜势。

图6 环境因素与产甲烷菌群结构间的冗余性分析（属水平）
Fig. 6 Redundancy analysis between environmental factor and methanogenic community (genus level)

3 结论

1）氨氮浓度的提升会引发VFAs的累积及丙酸的残留，导致产甲烷速率及累积产甲烷量大幅下降，系统中TAN浓度从（1 481.9 ± 67.7）mg·L⁻¹升至（6 883.2 ± 272.7）mg·L⁻¹时，猪粪的VS产甲烷潜势由（369.0 ± 17.3）mL·g⁻¹下降至（165.4 ± 19.4）mL·g⁻¹，降幅达55%。

2）氨氮浓度低于3 500 mg·L⁻¹时，厌氧消化系统的产甲烷途径以乙酸利用型为主，氨氮浓度高于5 000 mg·L⁻¹时，产甲烷途径有逐渐向氢利用型转变的趋势。

3）低氨氮浓度（≤ 3 500 mg·L⁻¹）时，系统中乙酸主要被Methanosaeta利用产甲烷，氢气主要被Methanospirillum利用产甲烷；高氨氮浓度（≥ 5 000 mg·L⁻¹）时，系统中乙酸主要被Methanosarcina利用产甲烷，氢气主要被Methanoculleus和Methanomassiliicoccus利用产甲烷，说明Methanosarcina、Methanoculleus和Methanomassiliicoccus比Methanosaeta和Methanospirillum更耐受氨氮。

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