四环素（TC）常被用作饲料添加剂应用于畜牧业及水产养殖业^[1-2]，因在动物体内吸收率较低，常以原药和代谢产物的形式随粪尿排出体外，造成水体及土壤环境污染^[3]. 目前，常规的处理工艺无法有效去除废水中抗生素，因此导致TC能够在不同的水源甚至饮用水中被检测到^[4-5]. TC在地表水中的浓度可达μg∙L⁻¹级别^[6]，尽管浓度较低，但同样能增强细菌耐药性，从而对生态环境和人类健康造成潜在威胁^[7-8].

地表水中的可溶性有机物可通过光化学反应产生H₂O₂^[9]，而水体中H₂O₂与有机污染物的氧化还原反应有密切关系，能够影响化学物质的降解转化和生态效应^[10]. 水中的Cu²⁺、Fe²⁺等过渡金属离子可催化H₂O₂分解为∙OH（E⁰=2.80 V）^[11]，而自然水体的沉淀物中广泛存在过渡金属氧化物，能够缓慢的释放出金属离子催化H₂O₂产生活性物质形成类Fenton反应降解水中有机物^[12]. 水合氧化铁（HFO）广泛分布于沉积物和土壤中^[13]，具有很强的亲水性、较高的表面羟基密度和电子传输^[14] 等特性. 现有关于HFO对水中污染物的去除研究多集中于吸附作用方面^[15-16]，鲜有关于水合氧化铁在水环境中催化H₂O₂降解抗生素污染物方面的报道.

本研究以HFO为材料，模拟其催化H₂O₂降解TC反应过程，优化反应条件并探索HFO/H₂O₂体系的潜在氧化机制，同时采用超高效液相色谱串联质谱（LC-TOF-MS/MS）的分析结果，鉴定TC代谢转化产物并提出了TC可能的降解途径. 研究结果可为探讨自然水体中HFO催化降解TC提供理论参考，也可为含TC废水处理提供技术支撑.

1.   材料与方法（Materials and methods）

1.1   试剂与材料

盐酸四环素纯度＞98%，购自于上海源叶生物科技有限公司；六水合氯化铁（FeCl₃∙6H₂O），分析纯，购自于天津市科密欧化学试剂有限公司；过氧化氢（H₂O₂），质量分数30%，购自于上海沃凯生物技术有限公司；乙腈和甲醇，色谱级，购自于美国Merck公司；氢氧化钠、盐酸、苯醌、硫代硫酸钠、叔丁醇等均为分析纯，购自于西陇化工股份有限公司；实验用水均为超纯水.

1.2   实验方法

1.2.1   催化剂的制备

水合氧化铁（HFO）的制备方法参考文献 ^[17] 并做修改，在磁力搅拌下，将10.0 g的FeCl₃∙6H₂O溶解在100 mL超纯水中，然后用1 mol∙L⁻¹的NaOH溶液将FeCl₃∙6H₂O溶液的pH值调至7.0. 形成的悬浮液连续搅拌1 h，并在室温下陈化24 h，然后通过离心（4500 r·min⁻¹，5 min）法收集沉淀的水合氧化铁颗粒，然后用超纯水洗涤3次，去除残留离子. 最后，将水合氧化铁冷冻干燥，在玛瑙研钵中研磨，并通过200目筛，收集并存储在棕色玻璃瓶中备用.

1.2.2   催化剂的表征

ESCALAB 250Xi 型X-射线衍射仪测试样品的X射线衍射（XRD）谱图； Tristar II 3020M全自动比表面积和孔隙分析仪测定样品的比表面积和孔径； JES-FA200电子顺磁共振波谱仪（EPR）测试反应体系中产生的自由基种类； Nicolette iS50傅立叶红外-拉曼光谱仪测试样品红外光谱（FTIR）； Cary Eclipse荧光分光光度计测试样品的三维荧光光谱（3D EMM）.

1.2.3   TC催化降解及影响因素实验

配制50 mL初始pH6.5的四环素溶液（40 mg∙L⁻¹），分别加入HFO、H₂O₂和HFO/H₂O₂（其中HFO为20 mg，H₂O₂为5 mmol∙L⁻¹），在25 ℃的水浴温度下以150 r∙min⁻¹速率震荡，反应一定时间后取样，样品用0.2 mol∙L⁻¹的硫代硫酸钠溶液（甲醇:水 体积比为 1:1）稀释1倍，终止反应，样品经10000 r∙min⁻¹离心10 min后取上清液过0.22 μm水相滤膜过滤后用UPLC测定.

探讨H₂O₂浓度的影响，将实验中H₂O₂浓度分别设置为0、0.5、1、2、5、10 mmol∙L⁻¹；探讨初始pH影响时用0.1 mol∙L⁻¹的NaOH或HCl调节溶液pH值分别为2、3、5、6.5、9、10；比较共存离子的影响时在HFO/H₂O₂反应体系中分别添加25 mmol∙L⁻¹和50 mmol∙L⁻¹的不同离子（Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、${\rm{NO}}_3^{-}$、${\rm{HCO}}_3^{-}$、${\rm{SO}}_4^{2-}$）.

1.2.4   自由基淬灭实验

为研究催化反应体系中的活性氧种类，分别使用叔丁醇（TBA）和苯醌（BQ）作为羟基自由基（∙OH）和超氧自由基（∙O₂^-）的抑制剂，采用电子自旋共振谱（EPR）验证体系中∙OH和∙O₂^-，∙OH和∙O₂^-自由基的捕获剂是100 mmol∙L⁻¹ DMPO.

1.2.5   四环素的测定

使用Waters UPLC-VWD型超高效液相色谱检测溶液中TC. 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C₁₈反相柱（100 mm × 2.1 mm i.d.，1.7 μm），检测波长为254 nm，进样量为10 μL，柱温40 ℃，流动相A为1‰甲酸，流动相B为乙腈. 梯度设置：95.0% A（0 min）、5.0% A（2.5 min）、95.0% A（3.51 min）、95.0% A（5 min），流速为0.30 mL∙min⁻¹.

1.3   数据处理与分析

式中，C₀和C_t分别代表四环素的起始质量浓度和t时刻的质量浓度，单位mg∙L⁻¹.

所有数据均以3次重复的平均值±标准偏差表示，并使用Origin 8.5绘制数据. 使用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析.

2.   结果与讨论 （Results and discussion）

2.1   HFO的表征

HFO的XRD图谱如图1所示. 图1中未出现较强的衍射特征峰，这表明水合氧化铁不具有晶体结构. 水合氧化铁在36.4º处出现1个宽峰，出峰位置与水铁矿相似 （JCPDS No. 29-0712）^[18] ，表明合成的水合氧化铁为无定形铁氧化物.

图 1  水合氧化铁的XRD图谱 图2 水合氧化铁的N₂吸附-解吸等温线

Figure 1.  XRD pattern of HFO Fig. 2 N₂ adsorption-desorption isotherms of HFO

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HFO的氮气吸附解吸曲线如图2所示. HFO的N₂吸附-脱附曲线属于V型等温线并具有H4型滞后回环，表明合成的样品中主要存在的是介孔结构^[19]. 水合氧化铁的比表面积，孔体积和孔径分别为226.796 m²∙g⁻¹、0.167 cm³∙g⁻¹和3.495 nm. 由上述数据可知，水合氧化铁的孔隙结构较为发达，拥有较高的比表面积，可提供更多的Fe活性位点，有利于催化H₂O₂降解污染物.

图 2  水合氧化铁的N₂吸附-解吸等温线

Figure 2.  N₂ adsorption-desorption isotherms of HFO

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2.2   不同反应体系下TC的降解速率

不同反应体系（H₂O₂、HFO和H₂O₂/HFO）下TC的降解动态如图3（a）所示. 当H₂O₂单独存在时，0—6 h内TC浓度几乎不变，这表明仅仅使用H₂O₂难以直接降解TC. 单独加入HFO时，四环素去除率为54%. 这可能是因为催化剂和TC发生了吸附反应. 在H₂O₂/HFO体系下，TC的去除率可达97%，这表明HFO可有效地催化H₂O₂氧化降解TC. 在实验中采用拟一级动力学拟合HFO/H₂O₂体系的降解数据，如图3（b）所示，与该模型相对吻合（R²>0.9），相对应的表观速率常数为9.4×10⁻³ min⁻¹，这表明HFO可以有效催化激活H₂O₂生成自由基，促进TC的降解.

图 3  不同反应体系下（a） TC降解动态，（b） 一阶动力学方程

Figure 3.  Degradation dynamic of TC by different reaction systems

（实验条件：催化剂投加量 为 0.4 g∙L⁻¹；pH = 6.5；[TC]= 40 mg∙L⁻¹；[H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

（Dosage 0.4 g∙L⁻¹; pH = 6.5; [TC] = 40 mg∙L⁻¹; [H₂O₂] = 5 mmol∙L⁻¹）

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2.3   H₂O₂浓度对TC降解的影响

H₂O₂浓度会直接影响自由基的生成，进而影响TC的降解效率^[20]. 不同H₂O₂浓度对TC降解的影响见图4.

图 4  不同浓度H₂O₂对（a） TC降解动态，（b） 一阶动力学方程的影响

Figure 4.  Effect of different concentrations of H₂O₂ on TC degradation （Dosage 0.4 g∙L⁻¹；pH = 6.5； [TC]= 40 mg∙L⁻¹）

（实验条件：催化剂投加量 为 0.4 g∙L⁻¹；pH = 6.5；[TC]= 40 mg∙L⁻¹；）

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H₂O₂的浓度从0 mmol∙L⁻¹增加到10 mmol∙L⁻¹时，TC的去除率从54%增加到98%. 采用拟一级动力学模型拟合HFO催化不同浓度H₂O₂降解四环素的过程，结果见图4（b）. 当H₂O₂的浓度从0.5 mmol∙L⁻¹增加到10 mmol∙L⁻¹时，其相对应的表观速率常数从4.04×10⁻³ min⁻¹增加到10.9×10⁻³ min⁻¹，这表明随着H₂O₂浓度增加促进了TC的降解速率. 这主要是由于随着H₂O₂浓度的增加，HFO能够催化H₂O₂产生更多的自由基降解TC.

2.4   溶液初始pH值对TC降解的影响

溶液初始pH值对TC降解速率的影响如图5所示，在酸性条件下，TC具有更高的降解速率和去除率. 这可以归因于，在酸性条件下，HFO催化剂表面更容易溶解出Fe（Ⅱ）和Fe（Ⅲ）催化H₂O₂生成自由基降解TC. 由图5（a）可知，初始pH值在2—10之间时催化剂对TC都具有良好的降解效果，降解效率都在90%之上. 可见HFO催化H₂O₂对TC的降解有着较好的pH适应性.

图 5  初始pH对（a） TC降解动态，（b） 一阶动力学常数的影响

Figure 5.  Effect of initial pH on TC degradation

（实验条件：催化剂投加量 = 0.4 g∙L⁻¹； [TC] = 40 mg∙L⁻¹；[H₂O₂] = 5 mmol∙L⁻¹）

（Dosage 0.4 g∙L⁻¹; [TC] = 40 mg∙L⁻¹; [H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

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2.5   共存离子对TC降解的影响

由于在实际水体中含有大量的阴离子和阳离子，因此在实验中研究了共存Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、${\rm{NO}}_3^{-}$、${\rm{HCO}}_3^{-}$、${\rm{SO}}_4^{2-}$等离子对HFO催化H₂O₂降解TC的影响. 各共存离子对HFO催化H₂O₂降解四环素的影响结果如图6所示.

图 6  无机盐离子（a） Na⁺，（b） Ca²⁺，（c） Mg²⁺，（d） NO₃^-，（e） HCO₃^-，（f） SO₄^2-对HFO催化H₂O₂降解四环素的影响

Figure 6.  Effect of inorganic salt ions on HFO catalytic degradation of tetracycline by H₂O₂.

（实验条件：催化剂投加量 为 0.4 g∙L⁻¹；pH = 6.5；[TC]= 40 mg∙L⁻¹；[H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

（Dosage 0.4 g∙L⁻¹; pH = 6.5; [TC] = 40 mg∙L⁻¹;[H₂O₂] = 5 mmol∙L⁻¹）

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Na⁺、Ca²⁺、${\rm{NO}}_3^{-}$和${\rm{SO}}_4^{2-}$浓度在25 mmol∙L⁻¹和50 mmol∙L⁻¹时，对HFO催化H₂O₂降解TC基本没有影响. 由图6（c）和（e）可以观察到，Mg²⁺和${\rm{HCO}}_3^{-}$会降低HFO催化H₂O₂降解TC的降解率，这可能是由于Mg²⁺与TC竞争吸附位点从而影响TC的去除^[21]，而${\rm{HCO}}_3^{-}$与HFO/H₂O₂体系中的自由基发生反应以生产氧化还原电位较低的${\rm{HCO}}_3^{-}$∙和${\rm{CO}}_3^{-}$∙，从而抑制TC的降解.

2.6   三维荧光光谱分析

采用荧光光谱技术检测分析了四环素在不同体系（TC、H₂O₂/TC、HFO/TC和H₂O₂/HFO/TC）反应后的三维荧光特征及其指纹特征. 在实验中收集了6个样品（M1-M6），M1：初始TC溶液的三维荧光光谱、M2：HFO/TC体系在黑暗中振荡6 h后，离心取上清液测定的三维荧光光谱、M3：H₂O₂/TC体系在黑暗中震荡4 h后，离心取上清液测定的三维荧光光谱、M4：H₂O₂/TC体系在黑暗中振荡6 h后，离心取上清液测定的三维荧光光谱、M5：HFO/H₂O₂/TC体系在黑暗中震荡4 h后，离心取上清液测定的三维荧光光谱、M6：HFO/H₂O₂/TC体系在黑暗中振荡6 h后，离心取上清液测定的三维荧光光谱. M1-M6的三维荧光如图7所示.

图 7  不同体系反应溶液（a） M1，（b） M2，（c） M3，（d） M4，（e） M5，（f） M6三维荧光光谱

Figure 7.  3D EEMs of （a） M1，（b） M2，（c） M3，（d） M4，（e） M5，（f） M6 reaction solution.

（实验条件：催化剂投加量 为 0.4 g∙L⁻¹；pH = 6.5；[TC]= 40 mg∙L⁻¹；[H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

（Dosage 0.4 g∙L⁻¹; pH = 6.5; [TC]= 40 mg∙L⁻¹; [H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

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Shi等 ^[22] 研究表明在三维荧光中，TC的存在会起到荧光淬灭作用. 如图7（a）、（b）、（c）和（d）所示，在TC、HFO/TC和H₂O₂/TC体系中均未检测到荧光信号，这表明在TC、HFO/TC和H₂O₂/TC体系中TC分子均没有被完全去除. 由图7（e）和（f）可知，在HFO/H₂O₂体系中，出现了一个对应于类腐殖酸区域的荧光峰（λ_EX/λ_EM=（305—330 nm）/（430—450 nm） ）^[23]，且峰强度随着反应的进行而减弱，表明TC及其降解产物在HFO/H₂O₂体系中不断被降解.

2.7   催化降解后HFO的FTIR分析

图8为HFO在催化反应前后的FTIR图谱. 由图8可知，HFO的红外光谱中出现了—OH（3405 cm⁻¹、1629 cm⁻¹）这表明了羟基的存在. 444 cm⁻¹处为Fe—O键伸缩振动峰，1023 cm⁻¹处为Fe—OH键伸缩振动峰^[24]. HFO在催化过程中，Fe—O的出峰位置从444 cm⁻¹迁移到463 cm⁻¹，Fe—OH的吸收峰消失，这表明Fe—O和Fe—OH官能团参与了催化作用. 在3405 cm⁻¹处的羟基伸缩振动峰移至3416 cm⁻¹，这表明在催化反应过程中羟基参与了反应.

图 8  HFO和HFO/TC/H₂O₂的FTIR图谱

Figure 8.  FTIR spectral of HFO, HFO/TC and HFO/TC/H₂O₂.

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2.8   催化反应前后HFO的XPS分析

图9为HFO催化反应前后的XPS分析结果. 由图9（a）和（c）可知，HFO的全扫描能谱中出现了C 1s、O 1s和Fe 2p的3个能区，而HFO催化后的全扫描能谱中出现了C 1s、O 1s、Fe 2p和N1s的4个能区，这表明HFO在催化过程中吸附了一定量的TC及其降解产物. 图9（b）和（d）为HFO催化前后O 1s的高分辨扫描能谱，其中530 eV、531 eV和532 eV处的3个主峰分别对应Fe—O、Fe—OH和C=O/OH的结合能^[25]. 其中催化后Fe—OH峰面积从32%增加值43%，Fe—O的峰面积从40%降低到37%，这表明HFO在催化过程中部分Fe—O官能团转变成Fe—OH官能团，铁主要分布在HFO的表面.

图 9  （a） HFO催化前的XPS图谱，（b） 催化前O1s峰谱，（c） HFO催化后的XPS图谱，（d） 催化后O1s峰谱

Figure 9.  XPS spectrum of HFO.

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2.9   循环次数对HFO降解TC效果的影响

催化剂的稳定性和可重复利用性对其在实际应用中至关重要. 通过连续反应3次循环实验评估HFO在黑暗处催化H₂O₂降解TC的效率，以验证HFO的可重复利用性，结果如图10所示. 经过3次循环实验后，在360 min内对TC的降解速率逐渐降低，表明HFO上的某些催化活性位点可能会随Fe的浸出而损失^[26]. HFO经历3次循环后，TC在360 min内的去除率分别为95%、80%和75%. 因此，在HFO/H₂O₂具有可重复应用的潜力.

图 10  HFO的循环次数对TC降解的影响

Figure 10.  Effect of HFO cycles on TC degradation （ Dosage 0.4 g∙L⁻¹; pH=6.5; [TC]=40 mg∙L⁻¹;[H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

（实验条件：催化剂投加量为0.4 g∙L⁻¹；pH=6.5；[TC]=40 mg∙L⁻¹；[H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

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2.10   活性氧化物质的鉴定

通过自由基淬灭实验和电子自旋共振波谱仪测定反应体系中的主要自由基. 在淬灭实验中分别使用苯醌（BQ）和叔丁醇（TBA）对类Fenton反应过程中产生的∙O₂^-和∙OH进行淬灭^[27]. 如图11（a）所示，当反应溶液中分别添加5、10、20 mmol∙L⁻¹的苯醌时，在360 min内，TC的降解率从95%分别下降到82%、64%和46%. 但是当添加5、10、20 mmol∙L⁻¹的叔丁醇时，在360 min内，TC的降解率几乎没有下降，说明HFO/H₂O₂反应体系中产生的主要活性物质是∙O₂^-[28].

图 11  自由基淬灭剂（a） BQ，（b） TBA对TC降解的影响和（c） EPR光谱（实验条件：催化剂投加量 0.4 g∙L⁻¹；pH=6.5；[TC=40] mg∙L⁻¹；[H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

Figure 11.  Effect of Free Radical Quenching Agent on HFO Catalytic Degradation of TC by H₂O₂ （Dosage 0.4 g∙L⁻¹; pH=6.5; [TC] =40 mg∙L⁻¹; [H₂O₂]= 5 mmol∙L⁻¹）

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为了进一步确认反应机理，通过EPR检测反应体系中的活性物质，采用DMPO作为∙OH和∙${\rm{O}}_2^-$的捕获剂^[29]. 由图11（c）可知，单独的H₂O₂并未产生DMPO-∙${\rm{O}}_2^-$信号峰和DMPO-∙OH信号峰. 而在HFO/H₂O₂反应体系中，发现明显的DMPO-∙${\rm{O}}_2^-$信号峰. 以上结果表明，HFO/H₂O₂体系降解四环素的主要活性物种是∙${\rm{O}}_2^-$.

2.11   TC降解途径

利用LC-TOF-MS共检测到9种TC的中间降解产物，质荷比（m/z）分别为：A（m/z=453）、B（m/z=437）、C（m/z=406）、D（m/z=362）、E（m/z=413）、F（m/z=356）、G（m/z=310）、H（m/z=262）和I（m/z=235）. 根据分子量、理论分子量和文献报道，推测HFO/H₂O₂降解TC中间产物的结构和反应路径如图12所示.

图 12  HFO/H₂O₂体系降解TC的降解途径

Figure 12.  Degradation pathways of TC in HFO/H₂O₂ systems

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TC降解途径Ⅰ，TC上碳碳双键羟基化，生成产物A（m/z=453）^[30]，通过A脱羟基形成产物B（m/z=437），通过C—N键断裂和脱羟基形成产物C（m/z=406），通过去甲基化作用将产物 C 进一步转化为产物 D（m/z  =362）^[31]，通过开环、去甲基化和去羟基将产物D转化为产物H（m/z=262），然后产物H通过开环和加羟基化为产物I（m/z=235）^[32]，最后产物I被转化为小分子物质并进一步氧化为H₂O和CO₂. 降解途径Ⅱ，TC去甲基和羟基生成产物E（m/z=413）^[33]，通过E去甲基、脱羟基和NH₂形成产物F（m/z =356），F通过开环和C=C双键的氢加成变成产物G（m/z=310），G通过脱C18上的羧基（—C—OH）和羟基生产H（m/z=262），最后再进一步通过开环和加羟基化为产物I（m/z=235）^[32]，最后产物I被转化为小分子物质并进一步氧化为H₂O和CO₂.

3.   结论 （Conclusion）

HFO/H₂O₂体系在H₂O₂的浓度为5 mmol∙L⁻¹，催化剂为0.4 mg∙L⁻¹，pH=3，温度25 ℃的反应条件下可在180 min内去除水中90%的TC. 在pH为2—10的范围内和共存离子存在时，HFO都可有效的催化H₂O₂降解水体中的TC，HFO/H₂O₂体系降解TC的主要活性物质是∙O₂^-. TC降解过程中出现了9种中间产物，说明TC主要是通过羟基化、去甲基、去酰胺基和开环等途径被降解成小分子化合物. 本研究揭示了HFO对TC催化降解作用，说明自然界存在的HFO在TC降解和代谢过程中起到重要作用.