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有机肥的施用能够提高农田土壤的肥力，维持土壤养分平衡并优化土壤微生物群落组成，进而提高农作物的产量和品质[1 − 4]. 在环境治理领域，向污染土壤中施用有机肥可以促进各种污染物的降解. 齐建超等[5]采用有机肥和菌剂联合修复石油污染土壤，可使土壤中总石油烃、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的降解率达到73%、74.7%、55.5%. 常慧萍[6]发现，施入有机肥的土壤中石油烃降解率高达到76.7%. 伍港繁等[7]的研究表明，有机肥能够强化象草对土壤中镉的富集效果. Song 等[8]发现，有机肥能促进低溶解度、高稳定性的砷酸钙矿物的形成，从而对砷污染土壤起到修复作用.
石油是由烷烃和芳香烃组成的复杂混合物. 许多研究证实了有机肥施入可对土壤中的石油烃污染物起到有效去除作用[9 − 11]. 然而，对于有机肥施入土壤后石油烃不同组分的去除特性及作用机制的研究文献报道相对较少，不同研究者所得结果也并不一致. 如 Gupta[11]认为有机肥中蕴含的丰富微生物和油污土壤中的功能降解菌存在协同互促作用. 毛丽华等[12]则认为向油污土壤中施入有机肥可增加微生物与石油烃接触的吸附点位，从而对石油烃产生较高的降解效率，Wu 等[13]则认为有机肥的施入改变了土壤土著微生物菌群结构，为石油污染的生物降解提供了有利条件.
为探究有机肥施用对土壤中石油烃不同组分的去除特性和生物降解机制，本文从有机肥中提取微生物，通过比较向石油污染土壤中施入完整有机肥和接种从有机肥中提取的微生物进行修复处理对石油烃的去除效果及土壤微生态变化，探究有机肥对污染土壤中石油烃的去除效果和作用机制，研究可为有机肥修复石油污染土壤的作用机制提供理论基础.
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试供黄绵土采自陕西省延安市志丹县某油田附近，土壤基本理化性质见表1. 黄绵土样经风干、除杂、过筛（2 mm），混匀后进行后续的修复实验研究.
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实验所用的腐熟有机肥取自西北农林科技大学，以干质量比1:2的猪粪、稻壳再加入5.0%的木炭渣经堆制腐解而成，经风干、过筛（40目）后保存待用. 有机肥的基本性质见表2.
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准确称取
5.0000 g 有机肥置于150 mL 锥形瓶中，加入50 mL 灭菌的 PBS 缓冲液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.584 g，KH2PO4 0.27 g，定容至1L，pH 调节至7.0—7.4），恒温水浴振荡培养2 h，吸取1 mL 培养液加入到150 mL 灭菌的 L9培养基（Na2HPO4·12H2O 17.698 g，KH2PO4 3 g，NH4Cl 1 g，NaCl 0.5 g，1 mol·L−1 MgSO4 1 mL， MnCl2·2H2O 23 mg，MnCl4·H2O 30 mg，H3BO3 31 mg，CoCl2·6H2O 36 mg，CuCl2·2H2O 10 mg，NiCl2·6H2O 20 mg，Na2Mo4·2H2O 30 mg，ZnCl2 50 mg，定容至1 L）中，30℃、150 r·min−1恒温振荡培养24 h 后，将培养物置于50 mL 离心管中，3000 r·min−1离心5 min 后，弃除上清液获得从有机肥中提取的微生物，加入20 mL 灭菌的 L9培养基清洗后离心，重复上述操作3次后，将获得的菌体置于20 mL 灭菌的 L9培养基中， 获得有机肥中微生物的菌悬液. -
分别称取9份1.0 kg 石油污染土壤放入花盆中进行模拟生物修复实验. 修复试验方案如表3所示，设置 TF、TW、CK 三个处理组，每个处理3个平行. TF 为向石油污染土壤中添加有机肥，TW 为向石油污染土壤中接种从有机肥中提取的微生物（提取方法见“1.3.1”），CK 为自然条件下放置的污染土壤，定期向土壤中加入灭菌纯水以保持土壤含水率为15%，每2 d 翻动一次通氧，分别于修复的0、7、15、21、30、60 d 取样，对土壤中的石油烃含量、理化性质、微生物数量进行测定.
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土壤含水率、pH、有效磷、铵态氮、硝态氮的测定方法见“土壤分析技术规范”[14]. 含水率采用烘干称重法测定，pH 采用电极法测定，有效磷采用钼酸铵分光光度法测定，铵态氮采用靛酚蓝比色法测定，硝态氮采用紫外分光光度法测定.
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土壤中的 TPH 采用超声波提取-重量法[15]测定；利用柱层析法净化和分离 TPH 中的脂肪烃及芳香烃组分并采用重量法进行测定[16].
C10—C40正烷烃、3种多环芳烃的测定：将脂肪烃和芳香烃组分分别用正己烷和二氯甲烷（色谱级）溶剂溶解后，采用气相色谱-氢火焰离子检测器（GC-FID，Clarus PE680，美国安捷伦科技公司）进行测定.
正烷烃（C10—C40）测定参数：色谱柱：HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气（N2）：1.5 mL·min−1；分流进样；进样口温度300 ℃，检测器温度325 ℃；升温程序：50 ℃保持2 min，以30 ℃·min−1升至300℃，后以50 ℃·min−1升至325℃，保持8 min；空气流量450 mL·min−1，氢气流量45 mL·min−1.
PAHs 测定参数：色谱柱：HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气 N2，1.5 mL·min−1；不分流进样；进样口温度280℃，检测器温度320℃；升温程序：80℃保持4 min，以8 ℃·min−1升至170℃，再以相同速率升至250℃，保持10 min，后以10 ℃·min−1升至300℃，保持10 min；空气流量450 mL·min−1，氢气流量45 mL·min−1.
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采用流式细胞术测定土壤中活性菌数量. 向1.00 g 土壤加入9 mL 灭活的 PBS 缓冲液，(20±2) ℃、150 r·min−1恒温振荡培养0.5 h 后，将培养物过5 μm 的滤膜，形成菌悬液. 向1 mL 菌悬液中加入2.5 mg·L−1NaClO[17]，避光处理10 min 后得到灭活细菌，以 NaClO 灭活的细菌作为阴性对照，未使用 NaClO 灭活的细菌作为阳性对照，将灭活后的细菌和未灭活的细菌分别利用 SG/PI 双染色剂进行染色后，根据文献[18]确定流式细胞仪的基本参数，利用流式细胞仪（Accuri C6，美国 BD 公司）进行测定. 根据阳性和阴性对照出现的位置区域不同确定活菌的位置，确定活菌的数量[19].
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将修复至60 d 的土壤样品送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序分析. 主要的分析步骤如下：将土壤样品进行预处理后，利用 OMEGA 试剂盒（Life. USA）提取土壤中总 DNA，再利用琼脂糖凝胶电泳技术检测 DNA 的完整性；利用 Qubit 定量测定 DNA 浓度；利用341F/805R 引物（341F 引物：5’－CCCTACACGACGCTCT－TCCGATCTG－3’；805R 引物：5’－GACTGGAGTTC－CTTGGCACCCGAATTCCA－3’）进行 PCR 扩增，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测文库大小、再利用 Qubit 荧光定量仪测定浓度后，采用 Illumina 平台对群落 DNA 片段进行双端测序.
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利用 Microsoft Excel 2019进行数据处理；采用 SPSS 26.0软件进行单因素（one-way ANOVA）方差分析和不同处理间的差异性显著性检验；利用 FlowJo V10对微生物数量进行统计分析. 采用 origin 2021进行图表绘制.
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不同修复处理土壤中总石油烃、脂肪烃、芳香烃的含量变化如图1（a-c）所示，修复60 d，向石油污染土壤中施入有机肥（TF）、接种从有机肥中提取的微生物（TW）、自然降解（CK）3个处理中总石油烃（total petroleum hydrocarbon，TPH）含量分别由
21140 、22140 、22140 mg·kg−1降低至14367 、20553 、21220 mg·kg−1，TPH 去除率分别为32.13%、4.16%、7.17%；脂肪烃组分含量由15040 、15720 、15720 mg·kg−1分别降低至8920 、14320 、13960 mg·kg−1，去除率分别为34.44%、9.16%、11.20%；芳香烃组分含量由3540 、3860 、3840 mg·kg−1分别降低至2980 、3560 、3460 mg·kg−1，去除率分别为15.82%、7.77%、9.99%. 与 CK 相比，向污染土壤中施入完整有机肥对 TPH 和组分烃的去除起到明显促进作用，接种从有机肥中提取的微生物对 TPH 和组分烃的去除起到弱抑制作用.对不同修复处理土壤中的石油烃、脂肪烃和芳香烃含量变化进行了动力学模拟（图1d-f）. 结果表明土壤中石油烃的降解符合一级动力学反应. TF、CK 和 TW 处理的 TPH 生物降解动力学常数分别为
0.0068 、0.0011 和0.0006 （图1d），降解半衰期分别为102 d、630 d和1155 d；脂肪烃组分的降解动力学常数分别为0.0086 、0.0017 和0.0014 ，降解半衰期分别为81 d、408 d 和495 d（图1e）；芳香烃组分的降解动力学常数分别为0.0029 、0.0018 和0.0013 ，降解半衰期分别为239 d、385 d 和533 d（图1f）.图2a-c为3种修复方式对 TPH 中 C10—C40 正烷烃的去除效果. 修复60 d, CK 土壤中的中链烷烃 F2（C10—C26）、中长链烷烃 F3（C27—C34）和长链烷烃 F4（C35—C40）的去除量分别为4.91、106.00、28.02 mg；TF 土壤中F2、F3、F4烷烃的去除量分别为5.83、407.89、32.75 mg；TW 土壤中的 F2、F3、F4的去除量分别为5.07、105.02、22.37 mg. 与 CK 相比，向污染土壤中施入有机肥进行修复处理显著提高了对中长链烷烃组分 F2（C27—C34）的去除效率，接种从有机肥中提取的微生物对长链烷烃组分 F3（C35—C40）的去除效果起到抑制作用.
图2d-f 为3种修复方式对石油污染土壤中的芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝等3种多环芳烃的去除效果. 修复60 d，CK处理中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的去除量分别为0.27、0.50、1.84 mg；TF 中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的去除量分别为0.30、0.90、2.47 mg；TW 土壤中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的去除量分别为0.22、0.46、1.74 mg. 不同修复处理对油污黄绵土中的多环芳烃去除效果均相对较差.
石油是由脂肪烃和芳香烃为主要成分的复杂混合物. 由于芳香烃含有稳定的苯环结构而难于被微生物降解. 本文中向污染土壤中加入有机肥对脂肪烃组分的降解率最高，所得结果与文献报道一致[20 − 22]. 在利用 GC-FID 研究三种修复方式对石油污染土壤中多环芳烃的去除效果时，发现施入有机肥以及接种从有机肥中提取的微生物进行修复处理，对芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝等3种多环芳烃的去除最为有效，因此，本文选取3种多环芳烃进行分析. 根据文献报道，石油污染土壤中的正烷烃（C6—C40）根据碳数不同可分为短链烃 F1（C6—C9，易挥发）、中链烃 F2（C10—C26，半挥发性）、中长链烃 F3（C27—C34，难挥发性）和长链烷烃 F4（C35—C40）组分. 短链烷烃 F1的易挥发性使其在石油污染土壤中含量较少，中长链组分烃 F3在油污土壤中的含量最多[23 − 24]. 本文中向石油污染土壤中施入有机肥修复60 d，与 CK 相比对中长链烷烃组分 F3去除效率提高了3倍，说明有机肥的施入可显著提高土壤微生物对中长链正烷烃的降解. 向油污土壤中接种从有机肥中提取的微生物总石油烃中的多种组分烃的去除起到弱抑制作用，可能是由于有机肥中的微生物与土壤中的土著石油烃降解菌形成了竞争或者拮抗关系所致.
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图3为修复过程中的土壤理化性质变化情况. 修复60 d，CK 处理中土壤铵氮、硝氮、有效磷含量分别由2.54、7.31、8.56 mg·kg−1降低至1.07、3.67、3.39 mg·kg−1；添加有机肥处理的土壤（TF）中铵氮、硝氮、有效磷含量分别由98.60、28.16、60.16 mg·kg−1降低至82.47、22.07、33.23 mg·kg−1；接种从有机肥中提取的微生物（TW），土壤铵氮、硝氮、有效磷含量分别由2.48、7.23、7.64 mg·kg−1降低至1.12、3.23、6.55 mg·kg−1.
一些文献研究认为，pH 过高会抑制土壤微生物的活性，进而影响土壤养分的吸收和利用[25 − 26]. 施入有机肥修复使得土壤 pH 显著降低，这就为石油烃类降解菌提供了有利的生存环境，进而促进了对污染物的降解[27 − 28]. 3种不同修复处理土壤中的有效磷、铵态氮和硝态氮浓度呈明显降低的变化趋势，说明微生物在降解石油烃过程中需利用有效磷、铵态氮和硝态氮以进行生长代谢.
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利用流式细胞术测定土壤中高活性细胞数量[29]. 经 NaClO 灭活处理后的 CK、TW、TF 土壤中细胞赋存情况分别如图4中的 a、b、c 所示，左上方细胞所占比例达到99.4%、99.5%、99.1%，因此划定左上方为死细胞区域，则右下方为高活性细胞区域. 图4中的 d、e、f 分别是未经 NaClO 灭活的 CK、TW、TF 土壤中高活性细胞（右下方区域）和死细胞（左上方区域）赋存情况：右下方的高活性细菌占比为8.7%、4.5%、69.1%. 说明经过60 d 的修复处理，施入有机肥（TF）进行修复处理的土壤中的高活性菌比例明显高于自然降解和接种从有机肥中提取的微生物修复的处理.
图5a 为利用流式细胞术测得的土壤总微生物数量，在 CK 处理中，总微生物数量在5.07×108—6.58×108 CFU·g−1土之间，总体上趋于稳定；施入有机肥进行修复（TF）使得土壤总微生物数量显著增加. 修复7 d，土壤中的总微生物数量由1.12×109 CFU·g−1土增加至3.73×109 CFU·g−1土，7 d 后呈降低趋势，修复60 d 时土壤中微生物总量为3.07×109 CFU·g−1土；接种从有机肥中提取的微生物进行修复处理的土壤（TW）中的总微生物在初始时最多（6.60×108 CFU·g−1土），15 d 后减少至4.02×108 CFU·g−1土， 21 d 时减少至1.98×108 CFU·g−1土，21 d 后逐渐趋于平缓.
图5b 为利用流式细胞术测得的各土壤中高活性菌数量，与总菌数变化相似，在 CK 处理中，微生物活性菌数量在0—15 d 内呈增加趋势，在第15 d 时数量达到最大（2.48×108 CFU·g−1土），随后高活性菌数量降低，在第21 d 降低至1.46×107 CFU·g−1土后逐渐趋于平缓. 施入有机肥进行修复（TF）7 d 后，土壤中的高活性菌数量由最初的8.94×108 CFU·g−1土增加至3.45×109 CFU·g−1土，随后逐渐降低，修复60 d 时土壤中高活性菌数量为1.92×109 CFU·g−1土. 接种从有机肥中提取的微生物进行修复处理的土壤（TW）中的高活性菌在修复开始时最多（2.93×108 CFU·g−1土），修复15 d 后减少至1.51×108 CFU·g−1土， 21 d 时减少至8.39×106 CFU·g−1土，21 d 后逐渐趋于平缓.
图5中自然放置的污染土壤中（CK）微生物的增长曲线和培养皿中微生物生长曲线相似[30]. 向污染土壤中接种从有机肥提取的微生物（TW），在接种的第1天 高活性微生物数量增加明显（图1-b 中与 CK 相比），随后由于土壤土著微生物和有机肥中的微生物发生拮抗或竞争而使土壤中高活性菌数量降低[31 − 32]. 在施入完整有机肥的土壤中（TF），有机肥中丰富的养分使得高活性菌的数量增加显著. 有机肥添加后的第7 天 微生物群落及活性菌总数增加明显，但是随后出现降低趋势. 主要是由于有机肥施入的初期，其蕴含的丰富氮磷养分促进了土壤中微生物的增殖，进而促进了石油烃的降解. 有机肥添加7 d 后，可能由于石油烃降解产生的中间产物的毒性以及细胞的增殖凋亡规律，使得总微生物和高活性微生物数量明显降低[33 − 34].
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由表4可知，经过60 d 的自然修复，自然放置的土壤中 Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别为788、6.06、0.932；施入有机肥修复处理的土壤（TF）的 Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数最大，分别为
1174 、7.72、0.981；接种从有机肥中提取的微生物（TW），土壤 Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别为856、6.35、0.945. 与 CK 相比，向污染土壤中施入完整有机肥显著提高了土壤微生物多样性指数，接种从有机肥中提取的微生物使得土壤多样性指数略有增加.在施入有机肥进行修复的土壤中，Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数明显高于同时期的其他处理土壤. 可能是由于有机肥的施入既可以增加土壤的通气性，其丰富的养分又能促进土壤中微生物的增殖[35 − 36]. 接种从有机肥中提取微生物的修复1 d 后（TW_1d），微生物的多样性指数低于自然放置的土壤，结合图5中对高活性菌的测定结果表明向石油污染土壤中施入从有机肥中提取的微生物后，土壤中的高活性菌数量在7—15 d 时减少（与 CK 相比较），结果说明有机肥中的微生物和土著微生物存在弱拮抗作用.
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土壤中微生物的不同分类水平相对丰度如图6所示. 根据图6a，在所有土壤样本中放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）均为最优势菌门. 自然放置的污染土壤中放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）相对丰度分别为48.51%、31.87%和8.78%；修复60 d，CK 处理和 TW 处理土壤中的巴氏杆菌门（Patescibacteria）相对丰度分别从2.05%和1.34%上升至15.2%和6.23%. TF 处理土壤中的拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度从6.53%上升至11.38%.
根据图6b-6e，在 CK 土壤中，隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—棒杆菌亚目（Corynebacterineae）—分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）的分枝杆菌属（Mycobacterium）是土壤中的最优势菌属（11.60%）. 修复60 d 后，CK 土壤中隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—棒杆菌亚目（Corynebacterineae）—诺卡氏菌科（Nocardiaceae）的诺卡氏菌属（Nocardioide）、隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—链孢囊菌亚目（Streptosporangineae）—链孢囊菌科（Streptosporangineae）的嗜热单胞菌属（Thermomonas）、隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—假诺卡氏亚目（Pseudonocardineae）—假诺卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）科的糖单胞菌科属（Saccharimonadaceae）相对丰度分别增加至27.79%、6.19%和13.74%. 而在TW 处理中这3种菌属的丰度分别为26.29%、6.88%、4.93%. TF 处理土壤中优势菌属包括隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—棒杆菌亚目（Corynebacterineae）—迪茨氏菌科（Dietziaceae）的迪茨氏菌属（Dietzia）、隶属于诺卡氏菌科（Nocardiaceae）的红球菌属（Rhodococcus）和隶属于变形菌门（Gammaproteobacteria）—γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）—黄单胞菌目（Xanthomonadales）—溶杆菌科（Lysobacteraceae）的溶杆菌属（Lysobacter），其相对丰度分别为 13.34%、6.13%、7.57%.
放线菌门和变形菌门是文献报道的可降解石油烃的优势菌门[37 − 38]. 迪茨氏菌属（Dietzia）[39 − 40]、红球菌属（Rhodococcus）[41]、溶杆菌属（Lysobacter）[42]、诺卡氏菌属（Nocardioide）[43]是文献报道的常见石油烃降解菌. 本文中向污染土壤中施入有机肥（TF处理）修复60 d，这些石油烃降解菌属在其门、纲、目、科分类学中的丰度明显增加. 说明有机肥的施入促进了土壤中石油烃降解菌的生长.
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向石油污染土壤中施入有机肥对脂肪烃组分的去除有明显促进作用，尤其对 C27—C34正烷烃组分的去除效率比自然降解提高了3倍. 有机肥对于芳香烃组分的去除效果较差. 有机肥中的微生物与石油污染土壤中的土著微生物存在弱拮抗作用，有机肥中蕴含的丰富氮磷养分促进了土壤中高活性菌的增殖和土著石油烃降解菌的生长，维持了土壤菌群结构多样性的稳定，并降低了土壤 pH 值. 有机肥施用情况下土壤中石油烃降解菌的生长、高活性菌数量的增加以及菌群结构的稳定使得土壤中石油烃的去除效果明显增加.
施用有机肥对黄绵土中石油烃污染物的去除特性及作用机制
Removal characteristics and degradation mechanism of petroleum hydrocarbons in the loess soil by applying organic fertilizers
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摘要: 向石油污染土壤中施入有机肥可以增加土壤的保水、保温、透气能力，促进土壤微生物的生长和活性，达到石油烃去除的目的. 目前对于有机肥施入后不同组分烃的去除特性以及有机肥生物降解石油烃的作用机制尚不清楚. 本文设置了向石油污染土壤中施入有机肥（TF）和接种从有机肥中提取的微生物（TW）两个处理. 利用重量法和 GC-FID 分别对土壤中的总石油烃（total petroleum hydrocarbon，TPH）和不同组分烃进行测定，采用分子生物学技术分析了土壤微生物变化. 结果表明，修复60 d，TF 处理对土壤中的 TPH、脂肪烃组分、芳香烃组分的去除率分别为32.13%、34.44%、15.82%，土壤中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的消减量分别为0.30、0.90、2.47 mg·kg−1土；TW 处理对 TPH、脂肪烃和芳香烃的去除率分别为4.16%、9.16%和7.77%，土壤中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的消减量分别为0.27、0.50、1.84 mg·kg−1土. 流式细胞术和高通量测序测定结果表明，TF 土壤中高活性菌数量由3.16×107增加至1.92×109 CFU·kg−1土，Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别由788、6.06、0.932增加至
1174 、7.72、0.981. TW 土壤中的高活性菌数量降低至9.87×106 CFU·kg−1土，Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别降低至855.8、6.35、0.945. 研究表明向石油污染土壤中施入完整有机肥对总石油烃和脂肪烃组分的去除具有明显促进作用，但对土壤中芳香烃组分的去除效果较差. 接种从有机肥中提取的微生物对总石油烃和组分烃的降解有微弱抑制作用. 结果说明有机肥中的微生物与污染土壤中的土著微生物存在弱拮抗作用，有机肥中富含的丰富养分显著提高了土壤土著微生物多样性和高活性菌数量，进而对总石油烃和脂肪烃组分起到有效降解作用.Abstract: The application of organic fertilizer to remediation of the oil-contaminated soils can effectively degrade petroleum hydrocarbons due to increase the soil's moisture, thermal insulation, and air permeability, thereby promoting the growth of soil microorganisms. However, the removal characteristics and biodegradation mechanism of petroleum hydrocarbons using organic fertilizer are still unclear. In this study, two treatments including applying organic fertilizer (TF) and inoculating of microorganisms which obtained from organic fertilizer (TW) were set up in order to illustrate the issues. The total petroleum hydrocarbon (TPH) and hydrocarbon fractions were determined using the gravimetric method and GC-FID, respectively; soil microorganisms were analyzed using molecular biology techniques. Results showed that after 60 days of remediation, the removal rates of the TPH, aliphatic, and aromatic fractions were 32.13%, 34.44%, and 15.82%, respectively; and the reduction amounts of pyrene, benzo [a] pyrene, and benzo [g,h,i] perylene respectively were 0.30, 0.90, and 2.47 mg·kg−1 in the TF treatment. In the TW treatment, the removal rates of the TPH, aliphatic, and aromatic fractions were 4.16%, 9.16%, and 7.77%, respectively; as well as the reduction amounts of pyrene, benzo [a] pyrene, and benzo [g,h,i] perylene respectively were 0.27, 0.50, 1.84 mg·kg−1. The flow cytometry and high-throughput sequencing showed that the number of highly active bacteria increased from 3.16×107 to 1.92×109 CFU·kg−1 soil, and the Chao1, Shannon, and Simpson index increased respectively from 788, 6.06, and 0.932 to1174 , 7.72, and 0.981 in the TF soil. In the TW soil, the quantities of highly active bacteria decreased to 9.87×106 CFU·kg−1soil; and the Chao 1, Shannon, and Simpson index decreased to 855.8, 6.35, and 0.945, respectively. Results indicated that application of organic fertilizer to the oil-contaminated soil could promote biodegradation of TPH and aliphatic hydrocarbon, but the removal effect of the aromatic components is poor. Inoculation of the microorganisms which extracted from the organic fertilizer present weak inhibitory effects on the degradation of the TPH and hydrocarbon components. This study suggested that the weak antagonistic effects presented on microorganisms which obtained from the organic fertilizers and the indigenous bacteria of oil-polluted soil. The affluent nutrients of the organic fertilizers significantly improved the diversities of the microorganisms and the quantities of highly active bacteria in the soil, thereby effectively promoting degradation the TPH and alkane components. -
四溴双酚S(tetrabromobisphenol S，TBBPS)作为添加型或反应型溴代阻燃剂被广泛应用于电子设备、塑料和纺织品中，在其生产、使用、回收的过程中，又不可避免的进入池塘、湖泊、河流等水体中，最后汇入海洋[1]。近年来，四溴双酚S以及其衍生物在水体及其水生动物中被检测出来。有研究者[2]发现，微量四溴双酚S有致癌作用、肝毒性、破坏内分泌系统，所以选用合适且有效的方法对其降解处理，使得健康风险降到最低显得尤为重要。
近年来，高级氧化技术被广泛的应用于难降解有机废水的处理中，包括 Fenton 氧化法[3]、光催化氧化法[4]、臭氧氧化法[5]、电化学降解法[6]和放电等离子体方法[7-8]等，其中，等离子体技术作为一种绿色有效的去除有机污染物的技术，引起了研究人员的广泛关注。该技术通过提供高能电子、离子、活性自由基、激发态原子和分子[9]参与化学反应；同时，光、热、电场和局部空化等物理效应也有利于有机污染物的降解。
介质阻挡放电因其放电面积大，效果均匀稳定，被广泛应用于等离子体水处理研究中[10]，但是，其存在的主要问题是活性物质的传质效率不高导致处理效果不佳[11]。通过近年研究发现，利用鼓泡法在气泡内产生活性物质自由扩散进入水相，可有效地增加气液传质界面，促进活性物质的吸收和利用[12-14]。另一种提高气液传质效率的办法是增加气液间的比表面积，采用降膜式反应器，既能增强活性物质的吸收，又能增强有机污染物的去除[15-16]。
在本研究中采用了泡膜式介质阻挡放电等离子体反应器，相比较于降膜式反应器，其具有多级传质和多级放电的双重特性，从活性物质产生效率和活性物质利用效率来看是理想的。根据这些优势，我们推测其对四溴双酚S的降解是有效的。本文考察了放电电压、空气流量、液体流量、活性物质抑制剂对TBBPS降解效果的影响，且对四溴双酚S降解机理进行了初步的分析，以期对难降解的有机废水提供一种有效且实用的处理方法。
1. 材料与方法
1.1 实验装置
本研究中，实验装置如图1所示，反应器、检测系统、电源为实验主要组成部分，反应器中高压电极为置于石英玻璃管(外径为3 mm，内径为2 mm)中的不锈钢丝，不锈钢丝与石英管之间的间隙中填充饱和NaCl溶液，以避免石英管中可能出现的放电现象。另一根石英玻璃管(管直径2 cm，长22 cm)与高压电极同轴，其外表面包裹不锈钢丝作为接地电极。在调节合适的水气流量后，外加空气通过气体通道进入反应区对经底部进水口进入的待处理废水鼓泡，进而在高压电极石英玻璃管外壁与低压电极石英玻璃管内壁之间形成稳定上升的液膜，水气流量过大过小将影响水膜的稳定上升，放电发生在内部的气液界面和外部的石英玻璃管表面。降解反应发生在反应器中，根据实验情况从反应器中取样分析测量。
1.2 实验仪器和试剂
电源CTP-2000K(南京苏曼)；pH测定通过PHSJ-4F型pH计(雷磁-上海仪电)；采用DDSJ-308F型电导率仪(雷磁-上海仪电)测量溶液电导率变化；使用LZB-4型玻璃转子流量计控制进气量；使用UV1102Ⅱ紫外-可见分光光度计(上海天美)和LC 2050型高效液相色谱仪对溶液成分进行检测；生物毒性由Lux-T010型测定。四溴双酚S(TBBPS)采购于上海阿达玛斯有限公司，配制溶液用水为去离子水，TBBPS的质量浓度为50 mg·L−1。
1.3 实验步骤和实验方法
本实验中，模拟废水单次处理量为100 mL，处理浓度为50 mg·L−1，连通气体和溶液后，调节合适参数，待到反应器中液膜可均匀稳定上升时，启动电源，产生等离子体用以处理废水。在处理过程中，每隔3 min取样1次，取样体积为3 mL。本研究中所有结果均为 3 个平行样品的平均值。模拟废水中四溴双酚S的质量浓度由高效液相色谱法测定，四溴双酚S的去除率根据式(1)进行计算。
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) 式中：η是去除率，c0是TBBPS的初始质量浓度，mg·L−1；ct是降解时间为t时刻的TBBPS质量浓度，mg·L−1。
高效液相色谱检测条件：Agilent Extend-C 18型色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相配比为乙腈(600 mL)∶0.1 %磷酸二氢钾(400 mL)∶磷酸(1 mL)，检测波长λ为227 nm，流速为1 mL·min−1，进样量为20 μL；化学需氧量(COD)由高锰酸钾指数法滴定测定。
实验结果均采用origin 2018及Excel 2019软件进行数据处理和分析。对于同一初始质量浓度的TBBPS溶液在不同放电电压、空气流量、液体流量、活性物质抑制剂条件下去除率的差异采用单因素方差分析(One-Way ANVON)，P<0.05被认为差异显著。
2. 结果与讨论
2.1 放电等离子体的图像
为了测试本放电装置在液膜有无和不同外加电压下，其放电形貌的变化，本研究在液体流量为150 mL·min−1，空气流量为1.8 L·min−1，电导率为18.25 μS·cm−1的条件下，使用去离子水对液膜有无和不同电压的放电现象进行了拍照，并记录放电过程的电压电流变化。由图2可见，相比较于无液膜存在的情况，液膜存在时的放电现象更加明显。同时，在有液膜的情况下，当电压为5.7 kV时，只有内部微弱的流光放电，放电波形较为平缓；当电压增至12.8 kV时，内部流注放电和外部的沿面介质阻挡放电明显，对比其电流电压波形，波形稳定；当电压达到15.6 kV时，沿面介质阻挡放电逐渐减弱，流注放电增强，电流波形幅度变大。综合上述结果可知，由电压和气液两相流速对放电强度的影响可以得出，电压和气液两相流速的最佳组合是必要的，液膜的形成可以增强放电强度。
2.2 放电电压的影响
图3反映了在TBBPS初始质量浓度为50 mg·L−1，液体流量为150 mL·min−1，空气流量为1.8 L·min−1的条件下，放电电压对TBBPS去除率的影响。可以看出，TBBPS去除率随外加电压的增大而上升，但当电压在12.5 kV达到峰值后逐渐减小。其中，TBBPS去除率随放电电压的增加可以解释为输入能量的不断增加，导致活性物质的产生量提高，污染物的去除率显著升高 (P<0.05)。而放电区域的温度随着外加电压的增加而增加，会缩短H2O2和O3等活性物质的寿命[17-19]，使其与污染物的反应时间缩短。此外，在外加电压为12.5 kV的条件下，可以同时点燃内部流注放电和外部沿面介质阻挡放电。但在较高电压下，内部流注放电向火花放电转变，活性物质的产生效率降低，从而限制了污染物的去除效率。
2.3 空气流量的影响
图4反映了在TBBPS初始质量浓度为50 mg·L−1，液体流量为150 mL·min−1，外加电压为12.5 kV的条件下，空气流量对TBBPS去除率的影响。当气体流量分别为1.2 L·min−1和1.6 L·min−1时，TBBPS的去除率低。其原因是：此时未形成稳定水膜，只点燃了内部的流注放电。在此基础上，当空气流量增加到1.8 L·min−1时，TBBPS的去除率显著增加(P<0.05)，且在9 min时达到95 %以上。而当空气流量增加到2.4 L·min−1时，TBBPS的去除率却降低。这是因为，在低空气流速下，反应器内部发生微弱的流注放电，外表面的沿面介质阻挡放电未被点燃，也无活性物质产生，TBBPS的去除仅取决于内部的流注放电。当气体流量增加到1.8 L·min−1时，会形成水膜，从而提高污染物的去除效率，在此阶段，内部区域内水膜上升，外部放电被点燃并产生活性物质，从而提高TBBPS的去除率。而当气体流量进一步增加到2.4 L·min−1时，会破坏水膜的稳定性，影响放电的均匀性，从而导致污染物去除效率的降低。
2.4 液体流量的影响
图5反映了在TBBPS初始质量浓度为50 mg·L−1，外加电压为12.5 kV，空气流量为1.8 L·min−1的条件下，液体流量对TBBPS去除率的影响。可以看出，TBBPS去除率随液体流量增加而上升，且在150 mL·min−1时达到峰值，其去除率上升效果显著(P<0.05)，之后TBBPS去除率略有下降。与空气流量的影响情况类似，液体流量也会影响水膜。在流量较低时，进水不能维持明显的水膜。而增大水流量可形成水膜，进而增强H2O2、O3、·OH等活性物质的生成和利用过程。但当液体流量200 mL·min−1过大时，内部高压电极与外部石英管之间的间隙内不会形成水膜，而是形成气泡-水混合流动。这导致整体放电强度和活性物质的生成率下降。同时，本实验是循环处理系统，较高的液体流速也使得液体在反应器中单位时间循环次数增加，增加等离子体对污染物作用次数增加，从而提高污染物与活性物质的反应效率。
2.5 活性物质抑制剂对四溴双酚S降解效果的影响
为了研究污染物降解过程中不同活性物质起到的作用，本研究中分别选用了对苯醌、三乙烯二胺和异丙醇作为
⋅O−2 ⋅O−2 ⋅O−2 ⋅O−2 ⋅O−2 
图 6 超氧自由基抑制剂(对苯醌)对TBBPS去除率的影响Figure 6. Effect of⋅O−2 图7反映了不同浓度三乙烯二胺对TBBPS去除率的影响。由图7可以看出，当三乙烯二胺的浓度由1 mmol·L−1增至5 mmol·L−1，反应6 min后，其TBBPS的去除率由86%降至63%。由此可以看出，单线态1O2 是等离子体放电处理TBBPS过程中存在的活性物质之一，三乙烯二胺的添加导致去除率的显著降低(P<0.05)。此外，由图8可以看出，当异丙醇的浓度由1 mmol·L−1增至5 mmol·L−1时，反应6 min后，TBBPS的去除率由85%降至65%。表明·OH是放电处理TBBPS过程中存在的活性物质之一，异丙醇的添加导致去除率显著降低(P<0.05)。这是因为，在相同条件下，三乙烯二胺和异丙醇消耗了反应体系中的单线态1O2和·OH。综合以上结果可知，放电过程中产生的
⋅O−2 
图 7 单线态1O2抑制剂(三乙烯二胺)对TBBPS去除率的影响Figure 7. Effect of 1O2 inhibitor (DABCO) on TBBPS removal
图 8 羟基自由基抑制剂(异丙醇)对TBBPS去除率的影响Figure 8. Effect of ·OH inhibitor (isopropanol) on TBBPS removal2.6 溶液电导率和pH的变化
在降解过程中，随着降解时间的延长，TBBPS的物质组成和性质会发生变化。本实验考察了在初始电导率为37.0 μS·cm−1、初始pH为7.5、空气流量为1.8 L·min−1，外加电压为12.5 kV的条件下，TBBPS溶液中pH和电导率随降解时间的变化(图9)。由图9可看出，溶液的pH和电导率的变化趋势是不同的，pH随着降解时间的延长而下降，电导率则随着降解时间的延长而上升。这说明放电处理过程中，伴随着放电等离子体的产生和活性物质的生成，不断有带电粒子和酸性物质生成。其中，pH在3~9 min内迅速下降，在此反应时间内TBBPS的去除速率最高，随后二者变化缓慢，这可以解释为本实验通入空气中的氮在放电等离子体的作用下形成硝酸(pKa=−1.3)、亚硝酸(pKa=3.3)以及TBBPS降解后产生的酸性中间产物(BrO−、
BrO−3 
图 9 TBBPS溶液的pH和电导率随降解时间的变化Figure 9. Changes of solution conductivity and pH with the treatment time2.7 处理过程中COD的变化
图10反映了在TBBPS初始质量浓度为50 mg·L−1、液体流量为150 mL·min−1、空气流量为1.8 L·min−1的条件下，TBBPS溶液中COD的变化情况。由图10可以看出，TBBPS溶液的COD先上升后下降，在放电15 min后，COD先由31.06 mg·L−1上升到36.14 mg·L−1，后又下降到18.10 mg·L−1。由此可见，在放电处理过程中，初始阶段溶液中TBBPS由于放电活性物质的作用，生成了有机酸类物质和小分子物质，导致溶液的COD值上升，之后随着降解时间的不断延长，TBBPS降解生成的这些小分子物质被降解，COD值则呈下降趋势。
图 10 TBBPS随降解时间的COD变化Figure 10. Change in COD value of TBBPS solution with degradation time2.8 处理过程中生物毒性的变化
本实验测试了在TBBPS初始质量浓度为50 mg·L−1，液体流量为150 mL·min−1、空气流量为1.8 L·min−1的条件下，不同降解时间下该溶液的生物毒性变化，结果如图11所示。其发光细菌生物毒性抑制率随着降解时间的增加而降低，经过放电处理，抑制率由未处理时的83%降低到经处理24 min后的63%。由此可见，放电等离子体处理可以有效地降解TBBPS，而降解过程中的中间产物仍具有毒性，故需要进一步的降解处理。
图 11 TBBPS溶液生物毒性随降解时间的变化Figure 11. Changes of biotoxicity of TBBPS solution with degradation time2.9 紫外-可见光谱变化
图12反映了在TBBPS初始质量浓度为50 mg·L−1、液体流量为150 mL·min−1、空气流量为1.8 L·min−1的条件下，放电处理后溶液的光谱扫描，扫描用样均是处理后水样稀释10倍所得。通过对其进行全波长扫描，可以看到，在可见光区存在2个特征吸收峰，分别在227 nm和310 nm处，随着降解时间的增加，可以看到2个特征峰均逐渐降低。其中，227 nm处的特征峰在降解时间9 min后逐渐消失，这与第2.2节中报告的TBBPS去除率的变化结果是一致的；随着时间的延长，在310 nm处对应的吸收峰强度降低，且伴有明显的蓝移。这说明TBBPS在处理3 min后就开始发生主链的断裂，导致其分子结构受到破坏，生成了TBBPS的降解中间产物，推测该物质为双酚S[22-23]。
图 12 放电处理后水样光谱扫描Figure 12. Spectrum scanning of water sample after discharge treatment3. 结论
1)本研究中的泡膜式等离子体放电装置放电均匀稳定、传质快、可有效降解废水中的TBBPS。在外加电压为12.5 kV、液体流量为150 mL·min−1和空气流量为1.8 L·min−1的条件下，TBBPS去除率可在9 min后达到95%以上。
2)放电体系中产生的
⋅O−2 3)在降解过程中随着溶液pH不断下降，电导率呈上升趋势，这是因为在降解过程中TBBPS的中间产物和硝酸类物质的生成。同时，降解过程中COD呈先升高后降低的趋势，生物毒性有所下降。
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图 1 不同修复处理对土壤中TPH、脂肪烃组分、芳香烃组分的去除效果
Figure 1. The concentrations and removal efficiencies of the TPH and hydrocarbon fractions in different treatments
图 2 土壤中不同组分烃含量变化
Figure 2. The concentrations of different fractional petroleum hydrocarbons in cultivated loessial soil
图 3 不同修复处理土壤的理化性质变化
Figure 3. The changes of physical and chemical properties in different treatments
图 5 不同修复处理的土壤中高活性微生物数量变化
Figure 5. The number of soil microorganisms in different treatments
图 6 不同处理土壤中细菌的群落组成和相对丰度
Figure 6. Composition and relative abundance of bacterial community in different treatments
表 1 石油污染土壤的理化性质
Table 1. Physical properties of the petroleum-contaminated soil
指标Index pH 有效磷/（mg·kg−1）Phosphate 铵态氮/（mg·kg−1）Ammonia nitrogen 硝态氮/（mg·kg−1）Nitrate nitrogen 含水率/%Moisturecontent 细菌总数/（CFU·g−1土）Total bacteriacount 总石油烃/（mg·kg−1）Total petroleum hydrocarbon 含量Content 8.54 8.56 2.53 3.71 1.22 5.87×108 22140 
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表 2 有机肥的基本性质（mg·kg−1）
Table 2. Basic properties of organic fertilizer （mg·kg−1）
指标Index C N P K Na Ca S 含量Content 185600 20400 6500 36200 3810 21300 1575
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表 3 生物修复实验方案
Table 3. Experimental project for remediation of oil-polluted soil
样品Sample 修复方案Experimental plan TF 1.0 kg 试供土壤+150 g 有机肥 TW 1.0 kg 试供土壤+有机肥中提取的微生物（108 CFU·g−1土） CK 1.0 kg 试供土壤（自然降解）
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表 4 不同处理土壤中细菌的α多样性
Table 4. The α-diversity of soil bacterial community in different treatments
CK_1d CK_60d TW_1d TW_60d TF_1d TF_60d OTU 1309 787 1151 845 1455 1173 Chao1 1312 788 1154 856 1455 1174 Shannon 7.77 6.06 7.37 6.35 8.49 7.72 Simpson 0.986 0.932 0.982 0.945 0.991 0.981 Coverage 0.999 0.999 0.999 0.999 0.999 0.999
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