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多溴联苯醚（poly brominated diphenyl ethers, PBDEs）是一种广泛应用的添加型溴系阻燃剂，可经产品的生产、使用和处置回收等途径释放到环境中[1]，世界范围的水体、土壤、沉积物、大气、动植物甚至人体中均可检出[2 − 4]. PBDEs脂溶性较强，容易在脂肪组织蓄积，并通过食物链放大，具有神经毒性[5]、肝毒性[6]、免疫毒性[7]、遗传毒性和内分泌干扰效应等[8]，也是潜在的致癌物[9]. 2009年，斯德哥尔摩公约将含有4—7个溴原子的4种PBDEs列入持久性有机污染物名单. BDE-47是商用PBDEs的主要成分，海洋环境中，BDE-47是生物利用度最高的低溴代PBDEs之一，约占PBDEs总量的70%，在水体和沉积物中浓度高（ND—pg·L−1/ND-ng·g−1），生物毒性比其它高溴代PBDEs强，很容易在贝类和鱼体等海洋生物中累积[10 − 11]. 贻贝对多数污染物有高蓄积性和耐受性，常作为海洋污染的指示生物，以鉴别污染物的时空分布特征和毒性作用[12]. 研究表明，BDE-47可在多种海洋贝类中蓄积转化并引发毒性效应[11,13]. 由BDE-47引发的生态和健康风险受到广泛关注[14 − 15].
2-羟丙基-β-环糊精（2-hydroxypropy-β-cyclodextrin, HPCD）是一种β-环糊精（β-CD）衍生物，具有疏水性空腔和亲水外围表面，被广泛应用于食品保鲜、药物传递和环境污染治理等领域[16]. HPCD可以通过包合、吸附等方式，将污染物包裹在空腔内部，可以促进有机污染物在环境介质中的传递，促进生物降解；减少污染物与生物的直接作用或将生物体中结合态污染物解吸出来，降低蓄积和毒性作用[17]. 近年来，环糊精及其衍生物也被添加到阻燃剂中，以增强其性能同时减少阻燃剂组分向环境中释放，在污染物的减毒和消除方面发挥重要作用，BDE-47作为多种PBDEs代谢物，在实际环境中极有可能与HPCD共存[18 − 22].
基于以上研究背景，本实验以BDE-47污染风险严峻的紫贻贝为研究对象，比较HPCD加入后BDE-47在贻贝各组织中的蓄积和分布变化，并计算BDE-47在贻贝各组织中蓄积和消除的动力学参数，测定氧化胁迫指标和组织损伤情况，结合分子对接模拟，以揭示HPCD对BDE-47生物蓄积、消除和毒性的影响.
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一台Agilent 7890B气相色谱仪，配备μECD检测器和DB-5MS色谱柱（15 m×0.25 mm×0.10 μm）. 一台HS-
3345 旋转切片机，购自金华市华速科技有限公司. BDE-47标准品（纯度>98%，Wellington Laboratories）购自北京联众行贸易有限公司，BDE-47粉末（>95%）购自上海源叶生物科技有限公司. 2-羟丙基-β-环糊精（HPCD，>98%）购自北京沃凯生物科技有限公司. Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（6 mL，600 mg）购自美国Agilent Technologies公司. 乙腈、水和二甲基亚砜（DMSO）等均为HPLC级别，购自美国Merck公司. 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所. Bouin’s固定液购自北京兰博康斯科技有限公司. 其他试剂未作说明均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司. -
二龄紫贻贝采集自山东青岛胶州湾养殖场，体重（12.7±1.6）g，壳长（5.4 ± 0.62）cm. 实验开始前，在洁净过滤海水中驯养10 d以适应实验室条件. 实验用水温度（15.2 ± 1.9）℃，pH 7.98 ± 0.15，盐度37.9% ± 2.1%（M:M），光照/黑暗周期为14 h/10 h. 期间不间断曝气，每天定时投喂1次螺旋藻粉（0.06%体重比），暂养期间贻贝死亡率<1%.
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暴露实验：称取BDE-47溶于DMSO中，配制100 μg·mL−1的BDE-47储备液，实验时用海水稀释至所需刻度. 暂养结束后选取健康且大小均一的紫贻贝，随机分到12只养殖箱中（90 cm×60 cm×30 cm，装有50 L溶液），每个养殖箱中60只. 12只养殖箱分为4组：海水对照组、溶剂对照组、BDE-47处理组（10 ng·mL−1）和BDE-47+HPCD处理组（10 ng·mL−1 BDE-47+60 ng·mL−1 HPCD，物质的量比约为1:2），每组设置3个重复. 实验在半静态条件下开展，每24 h更换等浓度暴露溶液，其它条件与暂养时一致.
消除实验：暴露实验后，将紫贻贝转移到洁净海水中净化10 d至无BDE-47检出，其中BDE-47+ HPCD处理组继续添加60 ng·mL−1的HPCD直至实验结束.
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在暴露实验开始的第0、1、3、5、7、14、21、28 d随机取12—15只（每个养殖箱4—5只）贻贝，解剖分离消化盲囊、鳃、性腺、外套膜和闭壳肌等部位，合并同一养殖箱的组织样本，冻干后研磨成粉末用于BDE-47含量测定. BDE-47含量测定参考耿倩倩和Komolafe的方法[11,23]，并根据实际情况优化，具体方法如下：准确称取（0.20 ± 0.01）g冻干粉，加入10 mL乙腈-水（80:20，V:V），1.0 g氯化钠并涡旋30 s，水浴条件下超声辅助萃取10 min，之后
4000 r·min−1离心5 min，移取5 mL上清液过Captiva EMR-Lipid小柱净化，收集萃取液，40 ℃氮气吹干，加入1 mL正己烷溶解，过0.22 μm滤膜后待测.仪器分析：气相色谱（GC）程序升温条件：100 ℃保持1 min，20 ℃·min−1升温至320 ℃保持5 min. 进样量：1 μL，进样方式：不分流. 外标法定量BDE-47含量以干重计（μg·g−1）.
质量控制：同时做方法空白、空白加标和基质加标，以控制整个分析过程的准确度和精密度.
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基于预实验测定结果，选取暴露28 d的6—10只贻贝，冰上快速解剖分离消化盲囊和性腺，以1:9（V:V）体积比加入遇冷生理盐水匀浆，4 ℃下
5000 r·min−1离心10 min，取上清液待测；GST活性测定采用比色法，以GSH浓度降低的方式反映；还原型GSH含量测定原理是GSH可与二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成一种黄色化合物，可在405 nm下进行比色定量测定；SOD活性测定以反应体系中SOD抑制率对应的酶量表示，CAT活性测定采用钼酸铵法，MDA含量测定使用TBA，具体测定方法参照检测试剂盒说明书操作. 参考文献[24]中方法，将所得指标进行均一化处理，绘制响应星状图，计算综合生物标志物响应（IBR）指数. 贻贝脂肪含量测定采用酸水解法（GB/T5009.6 —2016 食品安全国家标准食品中脂肪的测定）. -
选取暴露28 d的3—5只贻贝，解剖分离消化盲囊和性腺，置于Bouin’s固定液中固定48 h，用于制备组织病理切片. 经梯度乙醇溶液脱水，二甲苯、甲苯和石蜡透明处理，浸蜡和包埋后，将蜡块修整为1 cm3左右，在旋转切片机中切成厚度介于3—5 μm的切片，之后经过烤片、贴片和苏木精-伊红染色（H&E染色）处理后，置于光学显微镜下观察.
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分子对接用于模拟BDE-47与HPCD可能的相互作用模式. BDE-47和HPCD的3D结构用Chem Bio Office 构建，将BDE-47定义为配体，HPCD 作为受体，在MMFF94x力场下将配体和受体分子能量最小化. 对接时，配体分子构象设为柔性可旋转，迭代次数为
1000 次，梯度测试值为 0.01，根据对接能量（S值）选择最优得分构象. -
采用Origin 2021软件中的一阶非线性蓄积-消除模型，对每个处理组贻贝组织在各取样时间点的BDE-47平均含量进行蓄积和消除动力学拟合[11]. 首先按照公式（1）计算消除动力学参数（Ke, d−1）：
式中，Ct是消除实验在时间t时贻贝组织中BDE-47含量（ng·g−1），Ct=0是消除实验开始时对应组织中BDE-47的含量（ng·g−1）.
按照公式（2）的非线性回归，计算蓄积速率常数（Ka, mL·g−1·d−1）：
式中，Ct是蓄积实验在时间t时贻贝组织中BDE-47含量（ng·g−1），C是暴露溶液中BDE-47的浓度（ng·mL−1）.
按照公式（3）计算消除半衰期（t1/2, d）：
动力学来源生物富集因子（BCFk, mL·g−1）按照公式（4）计算：
式中，Ka和Ke值分别为计算所得蓄积和消除速率常数.
依据公式（5）计算观测所得生物富集系数（BCFo, mL·g−1）：
式中，Cm为蓄积实验结束时贻贝组织中BDE-47平均含量（ng·g−1），Cw为暴露溶液中BDE-47实测浓度（ng·mL−1）.
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本研究中实验数据的统计使用SPSS 20.0软件，Duncan’s法进行多重比较，显著水平P = 0.05，以均值± SD值表示，使用Origin 2021软件绘图.
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蓄积和代谢消除阶段，对照组和各处理组紫贻贝的生长状态良好，死亡率均<1%. 紫贻贝消化盲囊、性腺、鳃、闭壳肌、外套膜和整贝（软组织）中BDE-47含量-时间变化如图1所示，拟合所得蓄积和消除动力学参数列于表1.
（1）BDE-47蓄积和分布.
暴露开始后1 d，紫贻贝各部位均可检测到BDE-47，随暴露时间延长，BDE-47含量均逐渐增大，至第28天时达到最大值；BDE-47处理组与BDE-47+HPCD处理组蓄积趋势一致：在暴露阶段BDE-47含量持续增加，至第28天仍未观察到平台期，说明紫贻贝对BDE-47的蓄积能力较强；各取样时间点的紫贻贝组织中BDE-47含量顺序大致为：消化盲囊>性腺>鳃>闭壳肌和外套膜，消化盲囊是BDE-47蓄积的靶组织.
在蓄积开始阶段（1—5 d），HPCD对紫贻贝中BDE-47的蓄积量无显著影响，各处理组的BDE-47含量接近；随暴露时间延长，BDE-47+HPCD处理组的贻贝组织中BDE-47含量总体上低于BDE-47处理组，这一现象在消化盲囊和性腺中更为明显，HPCD降低了BDE-47在紫贻贝各组织中的蓄积浓度.
（2）BDE-47消除特征
在消除阶段的前期，BDE-47含量降低较为明显，后期消除速率有不同程度的减缓. 经过10 d的消除，各处理组紫贻贝组织中仍有一定比例的BDE-47残留，BDE-47处理组残留量约为蓄积终点含量的20.4%—50.7%，BDE-47+HPCD处理组为9.0%—20.9%；BDE-47残留量顺序：BDE-47处理组，性腺>鳃>消化盲囊>闭壳肌>外套膜；BDE-47+HPCD处理组，性腺>消化盲囊>外套膜>鳃>闭壳肌. 紫贻贝对BDE-47的消除能力较差，BDE-47在紫贻贝中存在较高的残留风险. 在消除阶段几乎所有时间点的含量均是BDE-47处理组>BDE-47+HPCD处理组，HPCD促进了紫贻贝对BDE-47的消除. 主要表现为HPCD加入后，BDE-47的消除速率Ke值增大，蓄积速率Ka值和富集系数（BCFk和BCF0）降低，并且具有更短的消除半衰期（表1）. 紫贻贝整贝（软组织）中BDE-47的蓄积和消除的趋势与各组织类似.
BDE-47在紫贻贝中存在组织特异性蓄积和消除. BDE-47脂溶性较强，消化盲囊和性腺脂肪含量高于其它组织（消化盲囊13.4%，性腺13.7%，其它组织均<8%，以干重计），消化盲囊也是贝类代谢的重要部位，BDE-47经鳃等组织吸收后倾向于在这两种组织中蓄积，其它有机污染物在贻贝中蓄积和分布的组织差异也被证实[11,26]. BDE-47在贻贝性腺中的高浓度蓄积或可引发贝类繁殖异常. 鳃是BDE-47吸收和消除的重要部位，这与鳃丝有较大的接触表面积和丰富的血管有关. 研究表明，γ-CD可通过与全氟烷基辛酸（PFOA）形成包合物，逆转PFOA与血清蛋白（HSA）的结合，从而降低蓄积[27]；而加入β-CD或者氨基键合的β-CD也有助于将全氟（2-甲基-3-氧杂己酸，GenX）从HAS-GenX复合体中提取出来，从而缓解污染[28]. 与上述环糊精相似，HPCD也具有疏水性内腔和亲水外壁，容易和疏水性的污染物通过非共价相互作用形成包合物，改变赋存形态，降低生物有效性从而降低蓄积；HPCD也可能逆转贻贝中BDE-47的结合，促进其代谢消除[18 − 19]. 模拟生物膜吸收研究表明，HPCD可降低多种有机污染物的表观渗透率从而降低污染物的吸收量[29]，因此本研究中HPCD存在下降低BDE-47蓄积和促进消除作用可能是以上多因素影响的结果.
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研究表明，BDE-47暴露可在许多无脊椎动物中引发过氧化应激反应，并诱导机体的抗氧化防御功能，保护生物体免受氧化损伤[25,29 − 30]. 本研究中，蓄积28 d的消化盲囊和性腺中抗氧化酶活性（GST、SOD和CAT）脂质过氧化生物标记物（MDA）和非酶抗氧化剂（GSH）均受到BDE-47和BDE-47+HPCD暴露的影响，相关结果列于图2. 与对照组相比，BDE-47和BDE-47+HPCD显著（P<0.05）抑制消化盲囊和性腺GST活性，并且BDE-47处理组抑制作用较大（图2A）；GSH含量变化趋势与GST一致（图2B）. BDE-47和BDE-47+HPCD暴露处理的SOD（图2C）和CAT（图2D）酶活性，MDA（图2E）含量均显著（P<0.05）高于对照组，并且前者MDA含量的诱导升高作用高于后者.
GST是一种关键的Ⅱ相解毒酶，GSH是一种重要的非酶抗氧化剂. GST催化GSH与许多亲电化学物质结合并生成水溶性物质，在外源化学物质的抗氧化防御中发挥重要作用. GST活性的降低表明生物体无法适应BDE-47暴露处理引起的过氧化胁迫，这与之前关于PBDEs等污染物对贻贝暴露胁迫的研究一致[31]. 与BDE-47处理组相比，BDE-47+HPCD暴露处理组GST活性和GSH含量降低幅度较小，说明后者氧化胁迫的程度更低. SOD是一种重要的抗氧化酶，因为它能将超氧自由基（O2−）分解为H2O2，以消除活性氧（ROS），保护机体免受氧化损伤. CAT是消除H2O2的酶，与SOD一起协同作用保护生物体维持稳态平衡，具有抗炎作用[32]. SOD和CAT活性的显著升高说明BDE-47诱导O2−生成造成氧化胁迫；MDA是生物体内膜脂过氧化的产物，MDA含量升高意味着O2−并没有被彻底清除，造成ROS的积累[24,33]. BDE-47+HPCD处理组MDA含量显著低于BDE-47处理组，表明HPCD减轻了BDE-47诱导的氧化胁迫作用. SOD、CAT、MDA测定结果与GST、GSH测定结果一致.
图2F，2G所示为综合生物标志物星图，各指标中以SOD的响应值最高，GST、GSH和MDA的响应值相近，CAT响应值最低. IBR值可以综合多种生物标志物对污染胁迫的反应，用于评估污染物毒性效应. IBR值越高，毒性反应越大[34]. 消化盲囊BDE-47和BDE-47+HPCD处理组的IBR值（图2F、G中相邻生物标志物的辐射线围成的星状图面积之和）分别为3.40和1.47，性腺中分别为1.26和0.82. 说明BDE-47处理组的各生物标志物指标对暴露胁迫的反应更高. 氧化应激各项指标和IBR值结果说明HPCD大幅度降低了BDE-47诱导的氧化胁迫和毒性作用.
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（1）消化盲囊
对照组（图3A）消化盲囊中可见形态正常的消化管（dt），内含管腔（l）和分泌物（sp），外侧包围着单层或连续的消化细胞和嗜碱性细胞，内壁间质组织呈现“星形”结构，周围连接组织（ct）正常，未发现明显的萎缩或者坏死等结构损伤；BDE-47处理组（图3B）消化盲囊中观察到明显的消化管萎缩（at），组织脱落（ex），血细胞浸润（hi）和连接组织纤维化（fi）等损伤，内壁间质组织“星形”结构不明显. BDE-47+HPCD处理组（图3C）消化盲囊表现为消化管萎缩（at），组织脱落（ex）连接组织纤维化（fi），内壁间质组织“星形”结构同样不明显，组织损伤与BDE-47处理组无明显差别.
（2）性腺
对照组（图3D）雄性紫贻贝性腺处于生精中期，可见发育正常的精巢组织，大量初级次级精母细胞（*）呈辐射状排列，滤泡边界清晰可见；BDE-47处理组（图3E）精母细胞辐射状排列不规则，且精母细胞数量明显少于对照组，滤泡边界模糊；BDE-47+HPCD处理组（图3F）精巢组织的滤泡边缘模糊增厚，精母细胞数量和排列和对照组相比变化不大，精巢损伤低于BDE-47处理组.
对照组（图3G）可见发育完全的紫贻贝卵巢，表现为结构正常的梨形、圆形或卵圆形的卵细胞（1），大小均一，卵细胞内含细胞核（2）与核仁（3），细胞核比例适中，与核质界限分明，核仁清晰可见，着色较深；卵细胞外有滤泡壁（4）包围，滤泡间隙较小. BDE-47处理组（H）卵细胞数量明显减少，细胞核增大，核仁分散不清晰，且滤泡壁模糊增厚（5），相邻滤泡间隙变大（6）. BDE-47+HPCD处理组（图3I）卵细胞数量变化不显著，但也表现为滤泡壁模糊增厚（7）和滤泡间隙增大（8）的现象，损伤程度低于BDE-47暴露组.
研究表明，PBDEs可诱导双壳贝类的炎症反应并导致消化管等的损伤[15, 35]. 本研究中消化管萎缩表现为管腔增大或小管厚度增加，这是由炎症反应造成的，消化管内腔组织脱落是由消化细胞坏死引起的，血细胞浸润是由于管腔细胞破损，血细胞进入管腔引发. HPCD对BDE-47蓄积的消化盲囊组织损伤影响较小，这可能是由于两个处理组的消化盲囊中均蓄积了较高浓度的BDE-47导致的. 基于脊椎动物的毒性实验表明，BDE-47具有生殖发育毒性和遗传毒性[36]. 本研究中各处理组紫贻贝性腺均有不同程度的损伤，比如生殖细胞数量降低等，说明BDE-47可能影响其生殖功能，由BDE-47引发的海洋无脊椎动物尤其是双壳贝类的生殖功能异常也应当引起足够重视. 组织病理研究结果表明HPCD一定程度上减轻了对紫贻贝消化盲囊和性腺的组织损伤.
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分子对接可直观展示主客体化合物之间的相互作用方式，优选后的包合物构型列于图4. 分子对接模拟结果表明，BDE-47分子部分进入HPCD空腔，分子在空腔内部折叠，位于空腔居中位置. 其中BDE-47的部分苯环，醚键和溴原子靠近HPCD小口端，部分基团暴露在空腔外部. 分子对接模拟计算BDE-47和HPCD的结合能为−4.16 cal·mol−1，说明BDE-47和HPCD可以形成较为稳定的包合物. 基于分子对接的结果，推测HPCD对BDE-47蓄积、分布的影响和毒性降低的作用可能是由于HPCD对游离态BDE-47（暴露溶液中）的屏蔽作用，或对结合态BDE-47（贻贝组织中）的解吸附作用，降低BDE-47的蓄积并加速消除，继而减缓其毒性作用[19].
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（1）BDE-47在紫贻贝中的蓄积具有组织特异性；HPCD显著降低BDE-47在紫贻贝各组织中的蓄积浓度，加快BDE-47的清除：加入HPCD后，BDE-47蓄积速率常数（Ka）、消除半衰期（t1/2）和生物富集因子（BCFk，BCFo）减小，消除动力学参数（Ke）增大.
（2）HPCD减轻了BDE-47对紫贻贝消化盲囊和性腺的氧化胁迫和组织损伤；HPCD降低BDE-47在紫贻贝中的残留风险的同时也减轻了BDE-47对紫贻贝的毒性.
（3）BDE-47蓄积、分布和消除动态，以及氧化损伤的结果表明贻贝消化盲囊和性腺组织损伤减轻与HPCD降低BDE-47的蓄积量并减轻氧化胁迫有关.
（4）分子对接结果表明HPCD可能通过对BDE-47的屏蔽或者解吸附作用降低BDE-47在贻贝中的蓄积，继而减缓其毒性作用. 研究结果为HPCD在减少海洋生物污染物蓄积和促进消除方面的应用提供参考.
2-羟丙基-β-环糊精降低BDE-47在紫贻贝中的蓄积并减缓其毒性作用
2-Hydroxypropy-β-cyclodextrin reduced the accumulation and toxicity of BDE-47 in Mytilus galloprovincialis
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摘要: 四溴联苯醚（BDE-47）因其高蓄积性和多毒性特点，引发严重的生态和健康风险，是国际上重点关注和管控的新污染物. 研究通过比较BDE-47单独暴露和BDE-47+2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）联合暴露处理的紫贻贝消化盲囊、性腺和鳃等组织中BDE-47蓄积和消除动态差异，测定氧化应激指标和组织损伤，结合分子对接模拟，探讨HPCD对BDE-47蓄积、分布和毒性效应的影响. 结果表明，BDE-47在紫贻贝中的蓄积具有组织特异性；HPCD可显著降低BDE-47在紫贻贝各组织中的蓄积浓度，同时加快BDE-47的消除. HPCD降低了BDE-47在贻贝中的残留风险. GST、SOD、CAT活性和GSH、MDA含量变化分析表明，HPCD减轻了BDE-47对紫贻贝消化盲囊和性腺的氧化胁迫. BDE-47+HPCD处理组的综合生物标志物响应值（IBR）低于BDE-47处理组，组织病理损伤也较轻. 分子对接显示HPCD减轻BDE-47对紫贻贝的毒性，可能是基于HPCD对BDE-47的屏蔽作用. 研究结果为HPCD在减少海洋生物污染物积累和消除方面的应用提供数据支持.
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关键词:
- 四溴联苯醚(BDE-47) /
- 羟丙基-β-环糊精(HPCD) /
- 紫贻贝 /
- 蓄积 /
- 毒性.
Abstract: Tetrabromodiphenyl ether (BDE-47) is a typical emerging pollutants of international concern and control due to its high accumulative and multi-toxic characteristics, which poses serious ecological and health risks. To investigate the effects of 2-hydroxypropy-β-cyclodextrin (HPCD) on the accumulation, distribution and toxicity of BDE-47, the dynamic differences in the accumulation and elimination of BDE-47 in digestive gland, gonad, gill and other tissues of blue mussel Mytilus galloprovincialis exposed to BDE-47 and BDE-47+HPCD, as well as the oxidative stress indicators and tissue damages, were studied. Molecular docking simulation was used to simulate intermolecular interactions. Results showed that the accumulation of BDE-47 in M.galloprovincialis was tissue-specific; HPCD significantly reduced the accumulation, and accelerated the clearance of BDE-47 in mussel tissues. HPCD reduced the risk of BDE-47 residues in mussels. Changes in GST, SOD, and CAT activity, GSH and MDA content indicated that HPCD alleviated the oxidative stress of BDE-47 on digestive gland and gonad. The integrated biomarker response (IBR) index was lower in the BDE-47+HPCD treatment groups than that of BDE-47, and histopathological damage was also less severe. HPCD reduced the toxicity of BDE-47 to M.galloprovincialis, which may be due to the shielding effect of HPCD on BDE-47, based on molecular docking results. Results of this study could provide data to support the application of HPCD in reducing the accumulation and elimination of pollutants from marine organisms. -
人工湿地技术是一项通过模拟或强化生态系统的结构和功能，利用植物 、微生物及动物等的共同作用进行水污染治理和生态修复的水质净化工程技术，已被广泛应用于地表水的保护以及多种污废水，如生活污水、农业废水、工业废水、酸性矿山排水、城市和公路径流的脱氮处理[1-3]。其中，垂直流人工湿地，由于具有较好的有机物和氨氮去除能力[4-7]，并具有占地面积小的优势，在实际工程中常用于处理含氮量较高的污水[8-9]。目前国家对于农村生活污水的排放标准主要考察COD、氨氮和总氮等指标，没有对硝态氮作出明确要求，所以在使用传统非饱和垂直流人工湿地时也是主要考虑强化其对氨氮的硝化能力，忽略了对其反硝化能力的提升，从而导致其反硝能力普遍较弱[10-13]。
微生物的硝化和反硝化作用是人工湿地脱氮的主要途径，但二者对氧的需求不同[14]。一般来说，参与硝化过程的功能微生物对氧的需求较高，大多数为好氧或兼性好氧微生物，而参与反硝化过程的功能微生物多数为兼性厌氧微生物。因此，当水中溶解氧(dissolved oxygen，DO)<1~2 mg·L−1时硝化作用会减小, DO>0.2 mg·L−1 反硝化作用受到抑制[15-16]。大多数传统垂直流人工湿地系统在运行过程中是处于水不饱和状态，大气复氧能力强，有利于硝化作用进行但不利于反硝化作用进行。因此，为了弥补传统垂直流人工湿地反硝化能力差的问题，本研究对传统垂直流人工湿地系统进行了结构改造，将系统构建成分内、外两层的多氧态垂直流人工湿地，采用内层底部连续进水，在内层形成水上行的饱和状态和厌氧环境，促进生活污水中的高浓度有机化合物进行厌氧降解，使污水中有机氮通过氨化反应转化为氨氮[17]。同时，在外层形成水下行的部分饱和状态，使系统(尤其是系统外层)中DO的分布呈持续的动态变化状态(多氧态)，为硝化和反硝化过程的进行提供适宜的DO环境，在系统外层上部的非饱和区利用硝化反应将氨氮转化为硝态氮，在系统外层下部的饱和区利用反硝化反应将硝态氮转化为氮气，从而实现在同一湿地系统中将污水中的有机氮经氨化降解、再硝化、反硝化彻底去除的目的。此外，本研究对该湿地系统在不同水饱和比、不同水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)条件下的污染物去除效率、基质中微生物群落结构的演变规律以及氮循环功能基因的分布特征进行了分析和比较，可为多氧态垂直流人工湿地系统的推广和应用提供参考。
1. 材料和方法
1.1 实验装置
本实验采用自行设计的多氧态垂直流人工湿地系统，实验装置设置在桂林理工大学污水处理站内。系统由配水箱、蠕动泵和垂直流人工湿地3部分组成如图1所示。垂直流人工湿地部分由内外两层的PVC圆柱体建成，内层直径为16 cm，外层直径为30 cm；内层高度为0.7 m，填充高度为0.6 m；外层高度0.8 m，填充高度为0.7 m，内外层填充体积比为1:3。进水通过蠕动泵和布水装置均匀的从内层底部自下而上的流过内层床体，出水由与外层底部的出水口相连的软管排出。根据虹吸原理，通过调节出水软管高度来控制外层床体的饱和区水位，以外层饱和区水位高度与总高度比值来表示系统外层水饱和比。
图 1 多氧态垂直流人工湿地系统及采样位点示意图Figure 1. Schematic diagram of the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones and sampling sites湿地系统的内、外层分别采用粒径8~10 mm的石英砂颗粒和粒径5~8 mm的焦炭颗粒进行填充。内外层主体填料的上下两端各填充厚度为5 cm的鹅卵石，作为进水区和集水区，以截留悬浮物防止堵塞。内外层的填料层上种植的植物为美人蕉。填料中在内层距底部20 cm(a点)和40 cm(b点)处，以及外层距底部25 cm(c点)和55 cm(d点)处分别埋有直径8 mm的4根采样管，便于水样采集。
1.2 实验设计
实验进水取自桂林理工大学污水站的生活污水，污水中COD、NH4+-N、NO3−-N的平均质量浓度分别为(105.60±17.36)、(51.54±14.35)、(0.78±0.45) mg·L−1。实验正式开始前，系统先在HRT为48 h的条件下连续进水1个月进行预培养，使系统运行达到稳定。
为确保系统外层水位不会影响最佳HRT的确定，正式实验以系统外层水饱和比(既外层水位高度与外层填料高度的比值)为0的条件作为对照，比较HRT 分别为6、12、24、48 h时对污染物(COD和NH4+-N)的净化效果，来确定系统污染物去除的最佳HRT。再在最佳HRT条件下，比较系统外层水饱和比分别为1、3∶4、1∶2、1∶3、0时，对污染物的去除效果，确定最优的系统外层水饱和比；同时，分析该水饱和比条件下湿地系统内部的饱和区和非饱和区DO、ORP分布特征，确定系统的多氧态形成情况。最后，在最佳外层水饱和比和最佳HRT条件下，控制进水C/N为7:1，测定系统对高负荷生活污水的污染物净化效率，分析比较系统填料微生物群落结构、以及反硝化功能基因的丰度变化情况，分析其促进污染物去除的机理。
1.3 样品采集与分析
1)水样采集与分析。水样采集位点如图1所示为内层20 cm(a点)、内层40 cm(b点)、内部顶层(i70 cm)、外层25 cm(c点)和外层55 cm(d点)，分别标记为内层20、内层40、内层70、外层25、外层55。内、外层填料中不同高度的水样使用洗耳球通过预埋的采样管吸取，i70 cm的水样采用50 mL注射器直接抽取，出水水样直接从排水管口直接收集。每个点水样采集至少150 mL。针对特定条件运行周期，每2 d采集1次，水样采集后立即带回实验室进行分析。分析的指标包括：化学需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3−-N)。测试方法分别为：重铬酸钾法(GB11914-89)，纳氏试剂分光光度法(GB7479-87)和紫外分光光度法(HJ-T346-2007)。水样采集的同时，以便携式YSI多参数水质分析仪在采样现场测定各采样点的DO、氧化还原电位(oxidation-reduction potential，ORP)。
2)微生物样品采集与分析。实验末期，控制系统外层水饱和比为1:2，进水C/N为7:1，连续运行两周。期间除了水样采集，在实验结束后，再在如图1所示的a点、b点、c点和d点4个水样采集点中，各取3个基质样品，将其均匀混合后取10 g作为该采样点的基质微生物样品，其中对b点和d点处样品进行氮循环功能基因定量PCR分析。样品采集后，立即送样至北京奥维森生物科技有限公司进行DNA提取，微生物多样性检测和氮循环功能基因定量PCR分析。其中，DNA 提取方法参照 DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)试剂盒说明书。微生物多样性检测选取细菌16S rDNA V3~V4区，利用 Illumina Miseq PE300高通量测序平台测序。氮循环功能基因定量PCR分析选择氨氧化作用的三种菌(AOA，AOB与厌氧氨氧化 (Anammox) 菌和反硝化菌)的功能基因进行研究。定性和定量PCR时，AOA与AOB的扩增都采用功能基因氨单加氧酶amoA的引物，Anammox菌的扩增采用Anammox 16s-RNA；硝化检测功能基因nxrA、nxrB；反硝化菌检测功能基因narG、nirS和nirK。所有引物的合成和数据分析处理均由北京奥维森生物科技有限公司完成。
2. 结果与讨论
2.1 多氧态湿地系统的最佳HRT
通过改变可伸缩U型管的出水高度，控制系统外层水饱和比为0，比较不同HRT条件下系统对污染物COD和NH4+-N的净化效果，此阶段进水COD为140.62~219.53 mg·L−1，进水NH4+-N在32.36~65.65 mg·L−1。由图2可以看到，随着HRT从6 h增加到48 h，湿地系统的COD和NH4+-N的去除率逐渐从76.03%和88.28%(6 h)增加到95.76%和98.38%(24 h)，并在48 h时达到96.64%和99.04%。
图 2 不同HRT条件下多氧态湿地系统对COD和NH4+-N的去除效率Figure 2. Removal rates of COD and NH4+-N by the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones at different HRT在HRT为6 h和12 h时，系统对污染物的去除率较低，这可能在于停留时间较短，系统的水力冲刷大，污水在系统填料间的停留时间较短，不能充分被微生物转化、降解。而当HRT增大为24 h和48 h时，系统对污染物的去除率逐渐升高并达到最佳状态，对COD和NH4+-N的去除率可达到90%以上，可见，HRT的变化可显著影响人工湿地的污染物净化效果。分别核算HRT为24 h和48 h时的单位面积氨氮负荷去除量可得，24 h时为8.22 g·(m2·d)−1，48 h时为5.11 g·(m2·d)−1，则系统在24 h时对氨氮的去除效能最好，同时从经济性上考虑，过长的HRT可能会造成系统处理能力的浪费。因此系统HRT采用24 h时长，既可以保证污染物的最好净化效果，又能充分发挥系统的处理能力，因此后续的实验均在HRT为24 h条件下进行。
2.2 多氧态湿地系统的构建
1)多氧态湿地系统的最优水饱和比。在HRT为 24 h条件下，通过改变可伸缩U型管的出水高度，控制系统外层水饱和比分别为1、3:4、1:2、1:3、0，比较系统在不同水饱和比条件下对COD和NH4+-N的去除效果，结果如图3(a)和图3(b)所示。
图 3 不同水饱和比条件下多氧态湿地系统对COD和NH4+-N的去除效率Figure 3. Removal rates of COD and NH4+-N by vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones at different water saturation ratios方差分析结果表明，系统外层水饱和比对COD和NH4+-N的去除均有显著性影响(P<0.05)。水饱和比为0时COD的去除效率最高，约为96%；水饱和比为1∶2、1∶3和0时，NH4+-N的去除效率均在98%以上，故分别核算系统外层水饱和比为1、3∶4、1∶2、1∶3和0时的单位面积氨氮负荷去除量为6.78、18.76、21.30、16.71和8.22 g·(m2·d)−1，可得本系统在外层水饱和比为1∶2时对氨氮的去除效能最好。总的来看，系统外层水饱和比为1∶2时，系统对COD和NH4+-N可以达到相对较好的净化效果。
2)多氧态湿地系统的DO及ORP分布特征。DO是影响污水有机物去除效率的重要因素，ORP则可综合DO、有机物质及微生物活性等指标来反映系统中的氧化还原状态[18]。当外层水饱和比为1∶2时，湿地系统DO及ORP 分布特征如图4(a)所示。系统内层饱和区的DO普遍较低(0.2~0.7 mg·L−1)，基本处于厌氧状态，ORP呈由内层底部(20 cm)的−143.04 mV向顶部(70 cm) 提升至−124.1 mV，呈逐渐升高的趋势。系统外层分为水饱和区和非饱和区，但二者的DO和ORP均显著高于内层。其中，外层的DO由底部向顶部同样呈现由低向高的逐渐变化，且表现出好氧、缺氧和厌氧区的区分，其中c点处DO值为0.7~1.7 mg·L−1，处于缺氧状态；d点DO值在2.1~2.5 mg·L−1，处于好氧状态。同时，外层中的ORP随着深度的增加呈下降趋势，−49.10 mV(d点)降到−68.80 mV(c点)。以上结果表明，本研究采用的双层垂直流人工湿地设计，可通过控制系统外层水饱和比的高低，调节系统的饱和区和非饱和区的占比，促使系统尤其是系统外层的DO和ORP分布呈持续的动态变化状态，实现系统多氧态状态的构建。
图 4 多氧态湿地系统DO和ORP的分布特征及主要位置污染物质量浓度变化Figure 4. Distribution characteristics of DO and ORP in vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones and changes in pollutant mass concentrations at major locations垂直流人工湿地中有机物的去除主要是通过微生物的氧化，对NH4+-N的净化主要是通过微生物的硝化作用。由图3可见，当外层的水饱和比为0时，有机物的去除效率最高；系统外层水饱和比≤1:2时，NH4+-N的去除效率即可达到98%以上。由图4(b)可以看出，i70 cm处的NH4+-N质量浓度高于进水。这可能是因为系统内层发生的厌氧发酵使得污水中的有机氮在微生物作用下转化生成NH4+-N，同时部分有机物也被降解去除，使COD的去除率接近70%，之后随着外层非饱和区利用大气的复氧作用使得水中DO含量上升，为有机物的进一步氧化分解及NH4+-N的硝化去除创造了条件，表现为出水中NO3−-N质量浓度上升，而COD和NH4+-N质量浓度持续下降。
3)多氧态湿地系统中氨氮的转化。传统垂直流人工湿地中，部分饱和的垂直流人工湿地的反硝化效果明显高于不饱和垂直流人工湿地[19]。因此，在外层水饱和比分别为0和1:2的条件下，对比系统进、出水的NH4+-N和NO3−-N的浓度得到如图5所示结果。可以看出，系统外层水饱和比为0时，进水中的NH4+-N几乎全部转化成NO3−-N，且出水中NH4+-N和NO3−-N的含量与进水中的基本相当，说明此条件下，进水中NH4+-N质量浓度的降低主要是依靠硝化作用，但产生的NO3−-N 在系统中没有进一步的转化。这可能由于此条件下系统由外层底部直接出水，非饱和区占比大，所以NH4+-N的硝化作用彻底，绝大部分均转化成了NO3−-N 。但由于决定NO3−-N 去除的反硝化阶段缺失，因此系统总的脱氮效率较低。而当系统外层的水饱和比为1∶2时，外层形成了一定的饱和区，使其底部呈现缺氧状态，而顶部仍然是好氧状态，整个系统形成厌氧-好氧-缺氧的多氧态，进水中的NH4+-N可以通过硝化作用去除，其生成的NO3−-N 也能够在外层下部饱和区的缺氧环境中发生反硝化作用生成N2去除，所以该条件下出水的NO3−-N 含量更低，同时NH4+-N+NO3−-N的含量也显著下降，仅为系统外层水饱和比为0时的57%，可大大提高系统总的脱氮效率。因此，与传统非饱和垂直流湿地相比，多氧态湿地系统的不仅保留了其原本的硝化能力，还提升了一定的反硝化能力[19–20]。
图 5 不同外层水饱和比下湿地系统中氮的转化情况Figure 5. Nitrogen transformations in wetland systems at different outer water saturation ratios2.3 多氧态湿地系统对污染物的净化效率
控制湿地系统外层水饱和比为1:2，进水C/N为7:1(COD为350.23~381.46 mg·L−1、NH4+-N为50.23~60.57 mg·L−1)，测定系统对COD和NH4+-N的较高有机负荷污水的净化效率。如图6所示，多氧态湿地系统对污水中COD的去除率可达91.92%，而NH4+-N去除率也可达到90.53%。说明本系统具有良好的有机物降解能力，能够去除较高负荷的有机污染物，同时对于高氨氮污水也有较高的处理能力。
图 6 进水C/N为7:1时系统对COD和NH4+-N的去除效率Figure 6. Removal rates of COD and NH4+-N by the system at an inlet C/N of 7:12.4 氮循环功能基因在多氧态湿地系统的分布特征
以特定功能基因或特定的16S-RNA片段作为分子标记，采用定量 PCR(Real-time PCR)来测定特定基因片段的相对数量，可以对样品中特定功能微生物数量进行定量分析[21]。本研究选择的分子标记：氨单加氧酶amoA、亚硝酸盐氧化酶nxrA和nxrB、硝酸还原酶narG、亚硝酸还原酶nirS和nirK 是参与自然界氮循环过程的关键催化酶，其分别在氨的好氧氧化、亚硝酸盐氧化、亚硝酸盐还原、硝酸盐还原过程中起到重要作用；Anammox菌介导的厌氧氨氧化过程，可直接在缺氧条件下以NH4+为电子供体，亚硝酸盐为电子受体，产生N2。
由图7(a)可知，多氧态湿地系统amoA功能基因主要来源于AOA，且外层中amoA功能基因的数量显著高于内层，说明系统的好氧氨氧化作用主要发生外层，且主要由好氧氨氧化细菌驱动[22–23]。与之类似, 通过图7(b)可看出，催化亚硝酸盐氧化的重要功能基因nxr在外层中的含量比内层高，也说明系统外层中的硝化作用更强[24]。因此，由图7(a)和图7(b)可以表明外层营造的好氧环境为硝化细菌的生存和繁殖提供了适宜的环境。
图 7 氮循环功能基因在多氧态湿地系统内、外层的丰度Figure 7. Abundance of functional nitrogen cycling genes in the inner and outer layers of the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones此外，系统中还同时存在一定量的Anammox菌，其中内层石英砂的丰度为2.91×109 拷贝数·g−1，外层焦炭中的丰度为7.86×108 拷贝数·g−1，与AOA的数量基本持平，但主要分布在系统内层饱和区，这与Anammox菌对氧的需求适应。Anammox菌能够在厌氧/缺氧的条件下，直接以NH4+为电子供体，NO2−为电子受体，产生N2[25]。虽然这一过程的存在，可能使亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的因为底物竞争而生长受抑，使nxrA、nxrB基因的数量较低(图7(b))，但Anammox过程的存在，可以使NH4+直接转化为N2而去除，对提高系统总氮的去除效率是非常有利的。
narG编码的硝酸盐还原酶参与催化反硝化过程的第1步，促使硝酸盐向亚硝酸盐的转化，而nirK和nirS则是编码反硝化过程第2步中催化亚硝酸盐还原酶的关键功能基因[26–27]。由图7(c)和(d)可知，narG、nirK和nirS在系统内、外层中均有分布，但在系统内层中的含量均比外层中的少。这可能与外层中的NO3−-N含量远大于内层有关，也表明系统多氧态的形成，可以促使反硝化作用在外层进行，提升系统总的氮去除能力，这也与前期的研究结果(图5)相符合。
总的来看，本湿地系统构建形成的“多氧态”状态，可以在保持传统垂直流人工湿地系统水流特点和优势的同时，为对氧具有不同需求的氮循环功能微生物提供适宜的微生态环境，强化其生物转化作用(包括硝化、反硝化以及Anammox作用)，从而提高系统的氮去除效率。
2.5 多氧态湿地系统的微生物结构特征
1)门水平微生物群落结构。对多氧态湿地系统内外层共4个基质样品进行微生物多样性检测分析，并对所有OTU系列进行物种注释，共得到60多种不同的细菌门。如图8所示，微生物数量最多的前3个门依次为Proteobacteria(变形菌门) 、Chloroflexi(绿弯菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)，这3种菌门也被广泛报道存在于水处理反应器中[28-30]。
图 8 多氧态湿地系统4个基质样品中微生物群落丰度图(门水平)Figure 8. Abundance map of microbial communities in four substrate samples from the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones (at phylum level)从门水平看，Proteobacteria在4个样本中均为相对丰度最高的优势种，这与ANSOLA等[31]在人工湿地中的研究结果一致。Proteobacteria属于革兰氏阴性细菌，其物种和遗传多样性极为丰富，是COD去除和脱氮过程的重要贡献者。本研究结果表明，Proteobacteria在系统外层所占的比例(平均55.6%)比内层的(平均25.8%)高(图8)，说明湿地系统多氧态的构建可以促使Proteobacteria大量繁殖，从而可能提升系统的污染物去除能力增加。
此外， 4个样本中Chloroflexi和Bacteroidetes的相对丰度仅次于Proteobacteria，但二者在系统内层所占的比例(平均21.9%)比外层的(平均6.6%)大(图8)，这与Chloroflexi和Bacteroidetes均属于兼性厌氧微生物，对氧的需求较低有关。已有研究表明这两类细菌都是有机物的主要降解者，能够降解复杂的有机物[32]。因此，Chloroflexi和Bacteroidetes在内层的广泛存在，可充分发挥其对复杂有机物的降解能力，有利于系统对有机污染物的去除。同时，多氧态湿地系统中丰度较大的还有Caldiserica、Actinobacteria、Firmicutes、Acidobacteria等，他们在有机物的矿化和氮的固定等方面发挥着重要作用[33]。
2)属水平微生物群落结构。以属为单位对多氧态湿地系统的微生物群落结构进行分析得到图9。系统内层的优势菌属为Caldisericum、Longilinea、Smithella、Leptolinea、Syntrophorhabdus等厌氧菌，他们均与有机物的代谢有关，其中，Longilinea和Leptolinea对多糖具有良好的降解能力[34]，Caldisericum和Syntrophorhabdus是工业废水生物处理系统中常见菌种，有助于有机物的降解，并且Syntrophorhabdus是厌氧生态系统中的丰富细菌主要降解芳香族化合物[35]。他们在样品总丰度中的占比分别为37.74%(内层20)、34.70%(内层40)、1.09%(外层25)、0.14%(外层55)，且在内层的相对丰度远大于在外层的。可以推测，系统的有机物降解过程主要在系统内层发生。
图 9 属水平上多氧态湿地系统4个基质样品中微生物群落丰度Figure 9. Abundance of microbial communities in four substrate samples from the vertical flow constructed wetland system with multi-aerobic and anerobic zones at genus level系统的外层优势菌属为Rhodanobacter、Nitrospira等。其中，Rhodanobacter属变形菌门γ-变形菌纲的黄色单胞菌科[36]。该菌在好氧的土壤表层发现并分离，具有反硝化能力[37-40]，它在多氧态湿地系统的外层中大量出现，可促进反硝化反应的进行。而外层的另一优势菌Nitrospira是亚硝酸盐氧化细菌的主要菌属，主要分布在外层上部的好氧区域，丰度达2.94%。作为硝化过程中的关键菌属，它可将水体中的亚硝酸盐氧化成硝酸盐[41]，其在系统外层的优势存在，也很好的解释了为何多氧态湿地系统的外层具有较强的硝化能力。
3)多氧态湿地系统促进氮去除的机理。综上所述，本实验所构建的多氧态垂直流人工湿地，可通过调节外层水饱和比，在保证系统有机物去除效率的同时，提高系统总的脱氮效率，这与其特殊的分层结构有关。首先，多氧态垂直流人工湿地分为内外两层，当外层不饱和比为0时，其内层与传统的多氧态垂直流人工湿地相似，出水中氮主要以NO3−-N为主，NH4+-N 和 NO3−-N的含量与进水相比，降低仅为5%左右。而当外层不饱和比大于0时，系统的外层被由下到上被分成了饱和区和非饱和区，这与内层在完全饱和状态下形成的单一缺氧甚至是厌氧的环境相比，外层由底部向顶部DO和ORP均逐渐上升，形成同时兼备厌氧-缺氧-好氧环境的结构特点， 这使得系统外层中参与反硝化和硝化过程的微生物如Rhodanobacter和Nitrospira等均得到优势生长(图9)，系统的外层硝化和反硝化功能也比内层得到强化(图7)，从而使系统的氮去除能力得到提升(图5)。
3. 结论
1)通过调节系统外层水饱和比，多氧态湿地系统的内层呈饱和状态，DO比较低，属于缺氧厌氧区；外层上部非饱和区为好氧区，底部饱和区为厌氧/缺氧区，能够形成由厌(缺)氧到好氧的氧化还原分区。
2)多氧态湿地系统对NH4+-N和COD均有较好的去除效果，而当外层水饱和比为1:2，HRT为24 h时，多氧态湿地系统对污染物的净化效果最好。
3)多氧态湿地系统氮循环功能微生物的数量在外层中的分布高于内层，对系统的硝化和反硝化功能均有促进作用，可提升系统总的氮去除效率。
4)多氧态湿地系统内、外层的微生物群落结构组成具有显著差异。在门水平上Proteobacteria、Chloroflexi和Bacteroidetes的相对丰度较大，其中Proteobacteria在系统外层的丰度较大，而Chloroflexi和Bacteroidetes在内层丰度较大。属水平上，系统外层与内层的优势菌属也不同，外层的优势菌属为Rhodanobacter，属于反硝化菌；内层的优势菌属为Caldisericum、Longilinea等厌氧菌，有助于有机物的降解。
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图 1 蓄积和消除过程中四溴联苯醚（BDE-47）在贻贝消化盲囊、性腺、鳃、闭壳肌、外套膜和整贝（软组织）中的含量变化
Figure 1. Changes of tetrabromodiphenyl ether （BDE-47） content in digestive gland, gonad, gill, mantle, adductor muscle and whole mussel （soft tissue） of blue mussel during accumulation and elimination（n=3, dry weight, mean ± SD）
图 2 紫贻贝消化盲囊和性腺中谷胱甘肽-S-转移酶活性（GST，A），还原型谷胱甘肽含量（GSH，B），超氧化物歧化酶（SOD，C）和过氧化氢酶活性（CAT，D），丙二醛含量变化（MDA，E），综合生物标志物星图（F-消化盲囊，G-性腺）
Figure 2. Glutathione S-transferase activity （GST, A）, glutathione content （GSH, B）, superoxide dismutase （SOD, C） and catalase activity （CAT, D）, malondialdehyde content change （MDA, E）, integrated biomarker star chart （F-digestive gland, G-gonad） in digestive gland and gonad of blue mussel（28 d, n=3, mean ± SD, P=0.05）
图 3 紫贻贝消化盲囊和性腺的组织病理切片照片（28 d，H&E染色）
Figure 3. Histopathological pictures of the digestive gland and gonad of blue mussel （28 d, H&E staining）
图 4 分子对接模拟的BDE-47与HPCD相互作用空间构型
Figure 4. Optimized structures of BDE-47 included into HPCD （a, b-side view; c, d-top view）
表 1 BDE-47处理组和BDE-47+HPCD处理组的紫贻贝组织中BDE-47的蓄积和消除动力学参数
Table 1. The accumulation and elimination kinetic parameters of BDE-47 in the tissues of blue mussels treated with BDE-47 and BDE-47+HPCD
组别Group 组织Tissue Ke/d−1 Ka/（mL·g−1·d−1） t1/2/d BCFk/（mL·g−1） BCFo/（mL·g−1） BDE-47 消化盲囊（digestive gland） 0.2447 720.6 2.83 2944.8 5725.5 性腺（gonad） 0.2595 580.1 2.67 2235.5 5032.2 鳃（gill） 0.5322 913.2 1.30 1715.9 3587.8 外套膜（mantle） 0.1932 257.9 3.59 1334.9 2898.5 闭壳肌（adductor muscle） 0.2363 284.0 2.93 1201.9 2365.2 整贝（whole mussel） 0.2152 428.9 3.22 1993.0 3983.4 BDE-47+HPCD 消化盲囊（digestive gland） 0.2875 579.4 2.41 2015.3 4214.8 性腺（gonad） 0.2521 384.0 2.75 1523.2 3693.9 鳃（gill） 0.6622 840.5 1.05 1269.3 2646.8 外套膜（mantle） 0.3718 423.3 1.86 1138.5 2329.7 闭壳肌（adductor muscle） 0.2171 203.4 3.19 936.9 2194.7 整贝（whole mussel） 0.4892 702.2 1.42 1435.4 3092.7 
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