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复合微生物菌剂是指由两种或两种以上具有不同功能并具有共生、互生关系的微生物以适当的比例进行组合并进行混合培养所配制的微生物共生体[1 − 3]，已广泛应用于农业、生活、环保等领域，具有保护资源环境、调节生态平衡等功能，在国内外受到广泛重视及认可. 与固态微生物菌剂相比，液体复合微生物菌剂具有制备方法简单、易保存、运输方便、启动时间短等优点，可达到快速启动反应器和提高处理效率的目的，在实践中极具开发潜力和应用前景[4]. 然而，液态复合菌剂在保存过程中受外界条件的影响较大，菌株细胞存在老化失活等现象[4 − 5]，造成使用效果较差，启动速度较慢等问题. 因此，如何维持液态微生物菌剂中有效微生物的活菌数，保存方法十分关键. 曾红等[6]研发了一种棉花黄萎病防治菌剂，结果表明，添加防腐剂可以延长液体制剂贮藏期，添加乳化剂有利于液体微生物菌剂的均匀分散，添加紫外防护剂则可降低紫外线产生的杀伤作用. 陈令浩等[7]向发酵液中加入3%—5%的纳米氧化锌制备复合微生物菌剂，也取得了较好的保存效果. 车建美等[8]将0.2‰的琼脂和2%—5%的NaCl添加到具有保鲜功能的微生物短短芽胞杆菌发酵液中，制成微生物保鲜菌胶悬剂，其活菌含量高，质地均匀，无上下分层，稳定性能良好. 邓勋等[9]制备了一种绿木霉T43抑菌活性成分水剂剂型，包括40%—60%发酵液、0.5%—1.5%聚三氧硅烷、0.5%—1.5%乳化剂OP-10、0.1%—0.3%抗氧剂BHT、0.2%—0.5%抗紫外剂UV531和0.3‰苯甲酸钠，获得的菌剂具有较长的保藏时间. 然而，截至目前，尚无多因素交互作用效果的研究报道.
本研究拟在课题组已有研究工作的基础上，借鉴食品保鲜与保藏等领域的理论和技术手段，针对影响菌剂保存效果的关键因素，研究菌剂保存效果对关键因素的响应规律，进一步的通过响应面优化实验研究关键因素的交互作用效果，获得高效、稳定液态微生物菌剂的保存方法，为其规模化生产及实际应用提供重要参考.
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受试菌株均为实验室自行保藏的芽孢杆菌ZX5、ZX6、GX2、GX5和GX9，均筛选自玉米秸秆与剩余污泥的混合堆肥物. 菌株ZX5为地衣芽孢杆菌，可降解糖类和蛋白质. 菌株ZX6为枯草芽孢杆菌，可降解糖类、脂肪和蛋白质. 菌株GX2为热嗜淀粉芽孢杆菌，菌株GX5为嗜热短芽芽孢杆菌，菌株GX9为thermolactis芽孢杆菌，3株菌均可降解木质纤维素，且均为高温菌株.
种子培养基：蛋白胨10 g·L−1、牛肉浸膏3 g·L−1、氯化钠5 g·L−1、pH为7.2±0.2. 计数培养基：蛋白胨10 g·L−1、牛肉浸膏3 g·L−1、氯化钠5 g·L−1、琼脂15 g·L−1、pH为7.0—7.2.
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将4 ℃冰箱内保藏的上述菌株接入已灭菌的液体肉汤培养基中，放置摇床上160 r·min−1活化12 h后，在固体肉汤培养基上三区平板划线，置于培养箱中培养24 h后，挑选三区单菌落转接两次后，可作为发酵菌株使用.
挑取已活化的发酵菌株单菌落，接种于装有100 mL已灭菌的肉汤培养基250 mL三角瓶中，置于摇床振荡培养，在温度为35 ℃和45 ℃，转速为160 r·min−1摇床中培养12 h后，获得相应菌株的菌液.
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将芽孢杆菌ZX5、ZX6、GX2、GX5和GX9的菌液，以活菌数比1:7:617:295:443的比例混合，向复合菌液中添加不同的添加剂，以活菌数为评价指标，进行最佳增稠剂种类（质量分数0.2%的阿拉伯树胶、海藻酸钠和琼脂溶液）、最佳增稠剂浓度（0、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%）、最佳乳化剂种类（体积分数为0.5%的吐温-20和吐温-80，质量分数0.5%的月桂酸单甘油酯）、最佳乳化剂浓度（0、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%）、最佳抗氧化剂种类（质量分数为0.05%的茶多酚、抗坏血酸和二丁基羟基甲苯BHT）、最佳抗氧化剂浓度（0、0.02%、0.04%、0.06%和0.08%）的单因素优化研究. 以不加添加剂的空白菌液作对比，测定0、7、14、21、28 d的活菌数，通过活菌保存率获得液态菌剂制备的最佳条件范围，用于后续响应面优化研究. 制备过程中，所有药剂、离心管等均经121 ℃、30 min高压灭菌. 每组试验3次重复，结果取平均值.
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根据上述研究结果，获得增稠剂（A）、乳化剂（B）、抗氧化剂（C）较适水平，设计3因素3水平响应面优化实验，见表1. 根据分析结果，最终获得液体复合微生物菌剂的最佳制备条件.
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活菌数采用平板计数法测定[10]. 纤维素酶活参照《GB
20287 -2006》中3,5-二硝基水杨酸法测定[4]. 脱氢酶（DHA）酶活采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑法测定[11]. 总有机碳（TOC）采用重铬酸钾氧化法（NY 525-2012）测定. 多糖采用苯酚硫酸法测定[12]. -
采用Design-Expert软件进行响应面实验设计及结果分析. Microsoft Excel 2017用于数据的统计分析.
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增稠剂是一种常用食品添加剂，具有分散、稳定溶液的作用，可以增加体系的黏稠度，减慢蛋白质分子的运动，降低蛋白颗粒因重力作用而沉降，延长体系稳定时间[13]. 此外，增稠剂能在蛋白质粒子表面形成亲水性薄膜及保护胶体，防止凝集沉淀. 本研究选取阿拉伯树胶、海藻酸钠和琼脂作为研究对象，研究增稠剂种类及浓度对液态微生物菌剂制备保藏效果的影响，结果如图1所示.
由图1a可知，在第28天时，阿拉伯树胶的活菌数显著高于空白45.4%. 与琼脂和海藻酸钠相比，保藏28 d后，添加阿拉伯树胶的菌剂中活菌数较高，为29.3%. 阿拉伯树胶是一种中性或弱酸性的支链复杂多糖，其中包含的阿拉伯半乳聚糖通常用作稳定乳化剂，阿拉伯半乳聚糖蛋白以“荆花模型”为代表，既提供疏水性多肽链又提供亲水性碳水化合物嵌段，赋予其良好的乳化特性[14 − 15]. 在此基础上，对阿拉伯树胶的添加浓度进行筛选（图1b），可见，在第3天之前，阿拉伯树胶在0.4%浓度处的菌剂活菌数显著高于其他浓度. 此外，在第14天和28天时（第7、21天除外），0.4%与0.2%的阿拉伯树胶活菌数之间的差异不显著. 之后随着浓度的增加，活菌数呈降低趋势. 优先考虑阿拉伯树胶在短期内活菌数高的性能，选取0.4%阿拉伯树胶继续实验研究.
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乳化剂可以有效阻止液滴的聚结和絮凝，从而维持体系长期稳定. 本研究选取吐温-20、吐温-80和月桂酸单甘油酯作为研究对象，研究乳化剂的种类及浓度对液态微生物菌剂活菌数的影响，结果如图2所示.
由图2a可知，添加吐温-80菌剂活菌数降低较快，最终活菌保存率为14.9%. 吐温-20和月桂酸单甘油酯的降低趋势相近，月桂酸单甘油酯的活菌保存率为23.2%，而吐温-20为21.1%. 月桂酸单甘油酯因其具有抑菌广谱性，还存在水溶性差、浓度过高会形成胶束等问题[16]，故选择吐温-20进行后续实验. John等[17]也指出，乳化剂在配方的稳定性、微生物的均匀分散和活力中起着重要作用. 乳化剂浓度的研究结果表明（图2b），在第7、14、21、28天时，0.1%吐温-20的活菌数显著高于其他浓度的活菌数. 考虑活菌的存活率，选取0.1%吐温-20继续实验研究.
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抗氧化剂被认为是一类能通过各种途径有效清除内源和外源性自由基或抑制氧化扩散及提高机体内抗氧化酶活性和数量，并对自由基所致病变有防治作用的物质[18]. 本研究选取茶多酚、抗坏血酸、BHT作为研究对象，对抗氧化剂的种类及浓度进行筛选，结果如图3所示.
由图3a可知，在抗氧化剂种类优化中，保存28 d后，添加抗坏血酸的菌剂活菌数最高，菌株存活率达36.3%；茶多酚其次，存活率为21.5%；BHT最低，存活率为16.8%. 由此可知，抗坏血酸的抗氧化效果最佳. 抗坏血酸是通过在L-抗坏血酸中氧化葡萄糖而得到的，导致4个氢原子还原形成两个水分子[19]. 抗坏血酸作为一种极好的氧化剂，可以被氧化，形成相对稳定且无反应性的氧化形式（单氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸）. 当它以适当的比例使用时，可以增加主要抗氧化剂的活性[20]. 在此基础上，进行抗坏血酸的浓度优化，结果如图3b所示. 可见，随着抗坏血酸浓度的增加，活菌保存率提高，在第14、21、28天时，0.06%的抗坏血酸活菌保存率显著高于0.04%（第7天除外），28天时保存率达45.5%，浓度继续增加，活菌保存率降低. 考虑整个保存期间活菌存活率性能，选取0.06%的抗坏血酸继续实验研究.
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响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，通过对具有代表性的局部各点进行研究，回归拟合全局范围内因素与结果间的函数关系，并且取得各因素最优水平值[21]. 本研究中，在单因素实验的基础上，选取增稠剂（A）、乳化剂（B）、抗氧化剂（C）3个关键影响因素，分别选取3个水平，进行三因素三水平响应面优化研究，以活菌存活率为评价指标，研究关键影响因素对液态菌剂制备的综合效应，获得液态菌剂制备的最佳方法. 因素水平设计如表1所示，实验方案设计及结果如表2所示，方差分析如表3所示.
由表3可知，以活菌存活率为响应值时，模型P<0.01，表明二次方程模型极显著. 失拟项P=
0.0906 >0.05不显著，说明回归方程拟合度较高，数学模型稳定，可用该数学模型对液态微生物菌剂活菌存活率进行预测. 由P值可知，二次项AB和C2对菌剂活菌存活率影响极显著（ P<0.01），一次项C、二次项AC、A2和B2影响显著（ P<0.05），A、B和BC影响不显著（P>0.05）. 根据F值，判断各因素对活菌存活率的影响大小依次为抗坏血酸、吐温-20和阿拉伯树胶，说明抗坏血酸对活菌存活率的影响最显著.对响应面实验结果进行多元线性回归和二项式拟合，得到关于Y的回归方程，如式（1）所示. 式中，A表示阿拉伯树胶的浓度，B表示吐温-20的浓度，C表示抗坏血酸的浓度.
根据Design-Export 软件，分析得出残差的正态概率分布图（图4a）、残差与预测值分布图（图4b）和预测值与实际值分布图（图4c）. 由图4a可知，残差的正态概率分布应在一条直线上，说明模型适应性好. 图4b残差与预测值分布无规律. 由图4c可知，残差与预测值分布图尽可能在一条直线上. 由图4可以看出，利用响应面法拟合液态微生物菌剂关键因素优化的模型适应性较好.
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响应面法根据二次方程模型分别做出试验因素间交互作用的三维立体响应曲面和等高线图，考察在某个因素固定于中心值不变的情况下，其他两个因素的交互作用对液态微生物菌剂活菌存活率的影响，响应面及等高线图见图5、6和7所示. 响应面图的曲面坡度越大，则因素的改变对于响应值的影响越显著，表明两因素交互作用对响应值的影响越大. 反之，响应面图曲面越平缓，则因素对于响应值的影响不显著，两因素交互作用对响应值的影响较小. 等高线直观地反映出两个因素之间交互作用的显著程度，其中椭圆越扁平或椭圆的轴线与坐标轴之间角度越大，则表明两因素交互作用越显著，反之，则不显著.
从图5的等高线图可见，阿拉伯树胶和吐温-20交互作用显著. 从三维立体图可见，活菌存活率在合适的阿拉伯树胶和吐温−20的浓度下具有最大值. 该极大值出现在阿拉伯树胶浓度0.35%—0.45%和吐温-20浓度为0.09%—0.11%. 从图6的等高线图可以看出，在吐温-20不变条件下，阿拉伯树胶和抗坏血酸对活菌存活率的交互影响显著，三维立体图可看出，活菌存活率存在极大值点，该极大值点出现在阿拉伯树胶0.35%—0.45%和抗坏血酸0.035%—0.045%. 从图7的等高线图可以看出，在阿拉伯树胶不变条件下，吐温-20和抗坏血酸对活菌存活率的交互影响显著，三维立体图中可见，活菌存活率存在极大值点，该极大值点出现吐温-20浓度0.09%—0.11%和抗坏血酸0.035%—0.045%.
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响应曲面和等高线图反映了响应面图在考察因素范围内存在极值，通过Design-Expert软件进行验证优化，得到液态微生物菌剂制备活菌存活率最高时的工艺条件为：0.401%的阿拉伯树胶、0.090%的吐温-20和0.042%的抗坏血酸，预测活菌存活率达62.592%. 通过保存期间相关指标的测定，评价菌剂的安全及稳定性，结果如表4所示.
由表4可知，不同添加剂对菌剂内相关指标的影响不同. 3种因素对纤维素酶活的影响依次是抗坏血酸、阿拉伯树胶和吐温-20. 不加任何添加剂的空白对照的纤维素酶活持续降低，加入吐温-20的纤维素酶活也降低，而其余纤维素酶活变化较小. DHA酶活在前15 天时增大，到30 d后急剧减少，说明前15 天由于体系内营养成分较多，细胞生命活动增大；而在30 d后营养成分消耗殆尽，细胞生命活动减弱. 这与有机碳及多糖成分变化类似，在前15 天有机碳及多糖成分呈现增大的趋势，而到30 d时成分降低. 同时，含有阿拉伯树胶的有机成分较高. 含有抗坏血酸的DHA酶活性较低，说明抗坏血酸可抑制微生物活性. 活菌数在保存过程中呈降低趋势，在第30天时，添加3种添加剂的活菌保存率为63.9%，与响应面优化实验预测活菌存活率达62.592%相近，说明响应面分析法提供的模型较真实地拟合了实际情况，证明应用响应面法对液态菌剂制备方法进行优化，不仅科学合理，而且快速有效.
所得液态复合微生物菌剂应符合我国《农用微生物菌剂》（GB
20287 —2006）的技术指标要求，表5显示了液态菌剂在保存30 d后的相关菌剂技术指标. 与我国《农用微生物菌剂》（GB20287 —2006）对照可以看出，保存30 d后，液态菌剂的活菌数仍有1.86×109 CFU·mL−1，活菌数能达到上述标准的要求，霉菌杂菌数为1.4×105 CFU·mL−1，杂菌率为0.022%，均低于标准限值，pH为7.98，在适用范围内. -
（1）添加阿拉伯树胶、吐温-20和抗坏血酸均有利于液态复合微生物菌剂的保藏，其中，较佳的增稠剂为0.4%阿拉伯树胶，活菌保存率为29.3%，较佳的乳化剂为0.1%吐温-20，活菌保存率21.1%，较佳的抗氧化剂为0.06%抗坏血酸，活菌存活率为45.5%.
（2）通过三因素三水平的响应面优化研究，得到液态复合微生物菌剂中微生物存活率的多元二次回归方程为Y=62.34−1.31A−1.42B+2.14C−4.75AB+3.78AC−1.20BC−3.38A2−3.86B2−11.68C2，液态复合微生物菌剂制备的最佳条件为0.401%的阿拉伯树胶、0.090%的吐温-20和0.042%的抗坏血酸，此条件下保藏30 d后，微生物的存活率为63.9%. 方差分析结果显示，各因素对微生物存活率的影响大小依次为抗坏血酸、吐温-20和阿拉伯树胶.
（3）对不同保存周期的菌剂进行效果验证和稳定性评价，结果表明，抗坏血酸对纤维素酶活和DHA酶活影响较大，液态菌剂在保存过程中营养成分逐渐消耗，细胞生命活动减弱. 保存30 d后，活菌数为1.86×109 CFU·mL−1，霉菌杂菌数为1.4×105 CFU·mL−1，杂菌率为0.022%，可达到我国《农用微生物菌剂》（GB
20287 —2006）的技术指标要求. 本研究为后续开发新型的液态复合微生物菌剂的保存技术提供了理论依据. 在以后的研究中，有必要对其他因素（pH、温度等）和其他类型的增稠剂、乳化剂以及抗氧化剂进行深入的探索.
液态复合微生物菌剂的保存技术研究
Study on the preservation technology of liquid composite microbial inoculants
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摘要: 与固态微生物菌剂相比，液体复合微生物菌剂具有制备方法简单、易保存、运输方便、启动时间短等优点，可达到快速启动反应器和提高使用效果的目的. 借鉴食品保鲜与保藏等领域的技术手段研发液态复合微生物菌剂的新型保存技术，可为其规模化生产及实际应用提供重要参考. 研究增稠剂、乳化剂和抗氧化剂对菌剂保存效果的影响规律，同时进行响应面优化研究. 液态复合微生物菌剂制备的最佳工艺为0.401%的阿拉伯树胶、0.090%的吐温-20和0.042%的抗坏血酸. 效果验证和稳定性评价结果表明，抗坏血酸对纤维素酶和脱氢酶的酶活影响较大，此条件下保藏30 d后，微生物的存活率为63.9%，活菌数为1.86×109 CFU·mL−1，霉菌杂菌数为1.4×105 CFU·mL−1，杂菌率为0.022%，可达到我国《农用微生物菌剂》（GB
20287 —2006）的技术指标要求. 本研究探索了食品保鲜与保藏等领域的技术手段对液态复合微生物菌剂保存效果的影响，为提高液态菌剂的保存提供了一种新方法.Abstract: Compared with solid microbial inoculants, liquid composite microbial inoculants have the advantages of simple preparation method, easy storage, convenient transportation and short start-up time, which can quickly start the reactor and improve practical efficiency. The novel liquid composite microbial inoculants are prepared with the aid of the technical means in the fields of food preservation in this study. It would provide important references for its large-scale production and practical application. The influence of thickeners, emulsifiers and antioxidants on the preservation efficiency of microbial inoculants is investigated and the response surface optimization is conducted. The optimal conditions for preparing liquid composite microbial inoculants are 0.401% arabic gum, 0.090% Tween-20 and 0.042% ascorbic acid. The results of effectiveness verification and stability evaluation indicate that ascorbic acid has a significant impact on the enzyme activities of cellulase and dehydrogenase. After 30 days of storage under these conditions, the microorganism survival rate is 63.9%. The number of viable bacteria is 1.86 × 109 CFU·mL−1, a mould count is 1.4 × 105 CFU·mL−1 and a mixed bacterial rate is 0.022%, It meets the technical indicator requirements of China’s “Microbial inoculants in agriculture” (GB 20287-2006). This study explores the influence of technical means in the fields of food storage on preserving liquid composite microbial inoculants, and provides a novel method for the preparation of liquid microbial inoculants.-
Key words:
- microbial inoculants /
- thickening agent /
- emulsifier /
- antioxidant.
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图 2 乳化剂对液态菌剂保藏效果的影响
Figure 2. Effects of emulsifiers on the preservation of liquid bactericides
图 3 抗氧化剂对液态菌剂保藏效果的影响
Figure 3. Effects of antioxidants on the preservation of liquid bactericides
图 5 阿拉伯树胶和吐温-20 对活菌存活率的交互影响
Figure 5. Interactive effects of gum arabic and Tween-20 on viability
图 6 阿拉伯树胶和抗坏血酸对活菌存活率的交互影响
Figure 6. Interactive effects of gum arabic and ascorbic acid on viability
图 7 吐温-20和抗坏血酸对活菌存活率的交互影响
Figure 7. Interactive effects of Tween-20 and ascorbic acid on viability
表 1 设计因素编码与水平
Table 1. Design factor coding and level
因素
FactorA增稠剂（阿拉伯树胶）
A Thickener （Gum arabic）B乳化剂（吐温-20）
B Emulsifier （Tween-20）C抗氧化剂（抗坏血酸）
C Antioxidant （Ascorbic acid）−1 0.2% 0.05% 0.02% 0 0.4% 0.1% 0.04% 1 0.6% 0.15% 0.06% 
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表 2 响应面优化设计及实验结果
Table 2. Response surface optimization design and experimental results
实验号
Experiment numberA B C 活菌存活率/%
Survival rate of viable bacteria1 0.4 0.10 0.04 60.0 2 0.6 0.10 0.06 50.9 3 0.4 0.05 0.06 51.8 4 0.4 0.15 0.06 46.4 5 0.2 0.10 0.02 51.2 6 0.4 0.10 0.04 66.0 7 0.6 0.15 0.04 48.5 8 0.6 0.05 0.04 60.7 9 0.4 0.10 0.04 61.1 10 0.4 0.05 0.02 44.8 11 0.2 0.15 0.04 59.0 12 0.4 0.10 0.04 65.4 13 0.4 0.15 0.02 44.2 14 0.4 0.10 0.04 59.2 15 0.6 0.10 0.02 39.4 16 0.2 0.05 0.04 52.2 17 0.4% 0.1% 0.04% 47.6
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表 3 回归方程的方差分析表
Table 3. Analysis of variance table for regression equation
类型
TypeSS DF MS F Pr>F 显著性
Significant模型Model 955.05 9 106.12 16.45 0.0006 ** A 13.78 1 13.78 2.14 0.1873 B 16.25 1 16.25 2.52 0.1566 C 36.55 1 36.55 5.66 0.0489 * AB 90.25 1 90.25 13.99 0.0073 ** AC 57 1 57 8.83 0.0207 * BC 5.76 1 5.76 0.89 0.3762 A2 48.17 1 48.17 7.47 0.0292 * B2 62.65 1 62.65 9.71 0.0169 * C2 574.66 1 574.66 89.06 < 0.0001 ** 残差 45.17 7 6.45 失拟项 5.54 3 1.85 0.19 0.0906 不显著Not significant 纯误差 39.63 4 9.91 注：SS—平方和，DF—自由度，MS—均方，Pr>F—无显著影响的概率，**非常显著，*显著.
Notes：SS—Sum of squares，DF—Degree of freedom，MS—Mean square，Pr>F—Probability of no significant impact，**very significant，*significant.
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表 4 不同添加剂对液态菌剂相关指标的影响
Table 4. Effects of different additives on relevant indicators of liquid bacteria
指标
Indicators时间/d
TimeCK A B C AB AC BC ABC 纤维素酶活/
（U·mL−1）
Cellulase activity0 1.682 1.023 0.955 2.614 1.692 2.455 2.091 2.068 15 0.455 1.228 0.750 2.159 0.727 1.727 2.023 1.523 30 0.091 1.406 0.568 2.796 0.409 2.887 2.319 1.773 DHA酶活/
（U·mL−1）
DHA activity0 124.47 122.06 63.20 59.77 80.06 41.20 64.06 47.78 15 159.06 241.63 252.91 200.92 200.91 161.76 197.20 177.92 30 36.92 24.92 18.47 17.06 34.91 26.92 23.20 37.77 TOC/
（g·L−1）0 1.051 1.732 0.556 0.869 1.511 1.407 0.484 1.421 15 2.809 1.809 1.374 1.703 1.676 3.201 1.718 2.506 30 1.861 1.749 1.470 1.817 1.064 1.657 0.705 0.839 多糖/
（g·L−1）
Polysaccharides0 0.241 0.603 0.174 0.142 0.340 0.385 0.281 0.485 15 0.184 0.980 0.199 0.192 1.461 1.246 0.211 1.073 30 0.172 0.786 0.139 0.143 0.990 0.772 0.227 1.063 活菌数/
（×108 CFU·mL−1）
Numbers of viable bacteria0 29.1 25.8 30.3 27.3 25.5 31.5 30.6 29.1 15 15.5 18.8 17.9 22.2 17.0 20.6 19.2 21.0 30 5.5 13.9 8.0 12.8 14.6 15.4 17.8 18.6
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表 5 相关技术指标
Table 5. Relative technical indicators
技术指标
Technical indicatorsGB 20287 —2006自制液态菌剂
Preparation of liquid microbial inoculant有效活菌数/（×108 CFU·mL−1） ≥2.0 18.6 霉菌杂菌数/（CFU·mL−1） ≤3×106 1.4×105 杂菌率/% ≤10% 0.022% pH值 5.0—8.5 7.98 保质期/m ≥3 1
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