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苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析

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李良, 金永久, 金艳红, 杨梅花, 张智. 苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析[J]. 环境化学, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
引用本文: 李良, 金永久, 金艳红, 杨梅花, 张智. 苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析[J]. 环境化学, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
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LI Liang, JIN Yongjiu, JIN Yanhong, YANG Meihua, ZHANG Zhi. Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
Citation: LI Liang, JIN Yongjiu, JIN Yanhong, YANG Meihua, ZHANG Zhi. Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
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苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析

  • 1.

    南昌市绿色新型材料与工业废水处理重点实验室，豫章师范学院，南昌，330013

  • 2.

    传染病预防控制国家重点实验室研究基地江西省动物源与媒介生物性传染病重点实验室，南昌市疾病预防控制中心，南昌，330038

    • 通讯作者: E-mail：565535121@qq.com; 
  • 基金项目:
    江西省教育厅科学技术研究项目重点项目（GJJ203102）, 豫章师范学院科研创新团队建设计划和南昌市科技支撑计划重点项目（洪科字[2019] 258号-18）资助.

Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series

  • 1.

    Key Laboratory of Nanchang City for Green New Materials and Industrial Wastewater Treatment, Yuzhang Normal University, Nanchang, 330103, China

  • 2.

    The Collaboration Unit for Field Epidemiology of State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, Jiangxi Provincal Key Laboratory of Animal-Origin and Vector-Borne Disease, Nanchang Center for Disease Control and Prevention, Nanchang, 330038, China

    • Corresponding author: LI Liang, 565535121@qq.com ; 
  • Fund Project: the Science and Technology Research Project of the Education Department of Jiangxi Province (GJJ203102), Research and Innovation Team Construction Plan of Yuzhang Normal University and Science and Technology Support Plan Project of Nanchang ( Hong Kezi [2019] No. 258-18).

摘要

  • 摘要: “三苯”具有强的人体血液毒性和致癌作用，是一类重要的环境污染物. 以往常通过代谢组学软件筛查出工作场所中苯及苯系物暴露人群的内源性代谢物与相应的代谢路径，而未考虑机体的立体化学作用对代谢的影响. 基于自制的手性固定相，优化色谱分离与尿样的前处理条件后，借助开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件结合多元统计分析，分析出有显著差异的代谢物和代谢通路的变化. 暴露组检测到5种内源性的代谢物即泛酸、酮戊二酸、D-苯丙氨酸、2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸与2种外源性的代谢物即D-苯巯基尿酸与D-苄巯基尿酸. 6组代谢通路受到显著影响，包括D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环和嘌呤代谢. 结果表明，苯及苯系物暴露人群尿液代谢产物中2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸及D-苯丙氨酸会引起明显的升高，苯巯基尿酸与苄巯基尿酸也可能发生由L-型向D-型的手性转化，这为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定了基础，也为全面评估苯及苯系物暴露人群的健康风险提供了科学依据.
    Abstract: "Triphenyl" has strong human blood toxicity and carcinogenic effects, which is an important environmental pollutants. As usual, metabolomics software was used to screen the endogenous metabolites and corresponding metabolic pathways of benzene and benzene series exposed people in the workplace, without considering the influence of stereochemistry on metabolism. Based on the home-made chiral stationary phase, after optimizing the chromatographic separation and pretreatment conditions of urine samples, the open platform MetaboAnalyst 5.0 software being combined with multivariate statistical analysis was used to analyze the changes of significantly different metabolites and metabolic pathways. Five endogenous metabolites (pantothenate, oxoglutarate, D-phenylalanine, 2-hydroxy-gluarate, pyroglutamic acid) and two exogenous metabolites (D-phenylmercapturic acid and D-benzylmercapturic acid) were detected in the exposed group. Six groups of metabolic pathways were significantly affected, including D-glutamine and D-glutamate metabolism, Glutathione metabolism, Butanoate metabolism, Alanine, aspartate and glutamate metabolism, Citrate cycle (TCA cycle) and Purine metabolism. Results show that 2-hydroxy-glutaric acid, glutamate and D-phenylalanine can cause obvious rise in human urine metabolites exposed to benzene and benzene series, the configurational transformation may also occur from L-type of D-type for phenylmercapturic acid and benzylmercapturic acid, which laid a foundation for further research on the potential mechanism of blood toxicity caused by benzene and benzene series, and also provides a scientific basis for comprehensive assessment of the health risk of benzene and benzene series exposed population.

  • 多溴联苯醚（PBDEs）是一种广泛使用的溴代阻燃剂. 据统计，截至2020年，全球PBDEs的总产量已达约200万吨[1].PBDEs的大量生产和使用，使其不可避免地被释放至天然环境中[2-4]. 水体是PBDEs污染的主要环境介质之一，全球多数地区的水体，甚至南北极海洋，均有PBDEs检出[5-6]. 作为全球主要的PBDEs生产国 [1]，我国也面临着严峻的水体PBDEs污染形势. 目前，我国华东、华北、华南地区的多数湖泊、河流、海洋均受到了不同程度的PBDEs污染，检出浓度为0.007—43.000 ng·L-1[2]. 水中的PBDEs不但可进入水生生物体内，产生神经发育毒性和内分泌干扰效应，还具备较高的生物放大系数（0.06）和生物蓄积潜力，可通过鱼、贝类等水生食物进入人体，增加神经发育障碍、生殖功能受损和遗传变异的风险[7-9]. 因此，PBDEs的监管对保障水环境安全具有重要意义. 发展水体PBDEs的高灵敏检测方法十分必要.

    PBDEs在水体中的赋存浓度通常为痕量或超痕量水平，因此在对其进行检测时需要对样品进行富集等前处理. 固相微萃取（SPME）是一种新型、绿色的样品前处理技术[10]. 与液-液萃取、固相萃取等传统方法相比，SPME技术无需大量有机溶剂，灵敏度更高，且集采样、富集、浓缩、解吸于一体，极大地简化了前处理过程[11]，已在多种有机污染物的分析检测中显示了优异的应用性能[12].SPME的技术关键是其涂层. 现有的商用涂层多以石英纤维为基底、机械性能较差，涂层材料热稳定性较低，对PBDEs这类高沸点污染物的分析性能不佳. 因此，亟需开发新型、稳定、可高效富集PBDEs的SPME涂层[13].

    共价有机骨架（COF）是一类由C、N、O、H、B等有机元素共价整合而成，具有周期性骨架和有序纳米孔结构的结晶多孔聚合物[14]. 自2005年首次被报道以来，COF已在气体存储、催化、传感、吸附等领域广泛应用[15]. 这类材料比表面积大、孔径范围宽、官能团丰富、热稳定性和化学稳定性好，是理想的SPME涂层材料[12].

    本研究采用水热法合成了酮胺型COF材料（TpBD），用硅酮胶黏附法在刻蚀的钢丝表面制得SPME涂层，并对其进行了结构表征. 研究了TpBD涂层对PBDEs的萃取性能，探讨了萃取温度、萃取时间、搅拌速度、解吸温度、解吸时间等条件对萃取过程影响. 优化了萃取条件，建立了基于TpBD涂层的PBDEs分析方法，并在实际水体样品中验证了检测方法的适用性.

    1.   实验部分（Experimental section）

    1.1   化学试剂

    2,4,4′-三溴联苯醚（BDE-28，97.9%）、2,2′,4,4′-四溴联苯醚（BDE-47，100.0%）、2,2′,4,4′,5-五溴联苯醚（BDE-99，99.1%）、2,2′,4,4′,6-五溴联苯醚（BDE-100，100.0%）、2,2’,3,4,4’,5’-六溴联苯醚（BDE-138，97.9%）、2,2’,4,4’,5,5’-六溴联苯醚（BDE-153，98.6%）均购自美国AccuStandard公司，其理化性质如表1所示[16]. 6种PBDEs的混合标准溶液配制于异丙醇（99.8%，美国Tedia）中，于4 ℃避光保存. 联苯胺（98.0%）和1,3,5-三甲苯（98.0%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司. 三醛基间苯三酚（97.0%）和1,4-二氧六环（99.5%）购自上海麦克林生化科技有限公司. 乙酸（99.5%）购自南京化学试剂有限公司. 中性硅酮胶购自陶氏有机硅有限公司. 甲苯（99.5%）购自上海凌峰化学试剂有限公司.

    表 1  PBDEs的理化性质
    Table 1.  Physico-chemical properties of PBDEs.
    同类物Congeners分子式Molecular formulalg KOW a蒸气压/（Pa, 25 ℃）Vapor pressure水溶解度/（mg·L−1, 25 ℃）Aqueous solubility分子直径/nm bMolecular diameter
    BDE-28C12H7Br3O5.942.19×10−30.0700.989
    BDE-47C12H6Br4O6.552.50×10−40.0020.998
    BDE-100C12H5Br5O6.862.86×10−50.0401.078
    BDE-99C12H5Br5O7.136.82×10−50.0090.995
    BDE-153C12H4Br6O7.625.80×10−60.0011.078
    BDE-138C12H4Br6O7.911.58×10−60.0010.995
    　　注：a正辛醇-水分配系数；b由GaussView 5.0计算. 　　a n-octanol-water partition coefficient; b calculated by GaussView 5.0.
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    1.2   TpBD涂层的制备

    1.2.1   涂层基底的预处理

    本研究选用不锈钢丝作为自制SPME纤维的涂层基底. 不锈钢丝的预处理过程如下：将直径为0.15 mm、长度为10 cm的不锈钢丝依次浸泡在氢氟酸、甲醇、纯水中超声20 min、晾干，以提高基底表面粗糙度.

    1.2.2   TpBD粉末的制备

    TpBD的制备方法参考文献[17]. 分别称取63.0 mg三醛基间苯三酚和82.8 mg联苯胺，溶于均三甲苯/1,4-二氧六环的混合溶液（1:1，V:V），边搅拌边滴加1.50 mL乙酸溶液（9.00 mol·L−1）. 超声5 min后，将上述混合液转移至高压釜的聚四氟乙烯内衬中，于120 ℃水热反应72 h.反应完成后，过滤、收集暗红色固体，并以丙酮为溶剂对材料进行12 h索氏提取，除去材料孔道中残留的反应物. 最后，将材料于60 ℃真空干燥12 h，即得TpBD粉末.

    1.2.3   TpBD涂层的制备

    将预处理后的不锈钢丝插入甲苯稀释的硅酮胶溶液、迅速抽出钢丝，重复数次，在钢丝表面形成均匀硅酮胶层. 用滤纸吸去硅酮胶层表面多余溶液后，将钢丝置于TpBD粉末中旋转，再于120 ℃烘箱中干燥20 min，获得涂覆均匀的TpBD涂层. 最后，将涂层长度截至1 cm.

    1.3   TpBD涂层的表征

    采用D8 ADVANCE型X射线衍射仪（XRD，德国Bruker）测定涂层材料的XRD图谱. 利用QUANTA FEG 250场发射环境扫描电子显微镜（SEM，美国FEI）观察涂层的微观形貌. 采用ASAP 2020型比表面积和孔径测定仪（美国Micromeritics）测定涂层材料的孔径分布和孔体积. 通过Pyris1 DSC热分析仪（TGA，美国Perkinelmer）对材料进行热重分析. 利用Nicolet 6700型傅立叶红外光谱仪（FTIR，美国Thermo）测定材料的FTIR光谱.

    1.4   PBDEs的SPME分析过程

    在40.00 mL具有聚四氟乙烯垫片的玻璃样品瓶（美国Supelco）中加入30.00 mL的PBDEs溶液，将SPME涂层插入溶液中进行萃取. 萃取温度和搅拌速度由加热磁力搅拌器（美国Scilogex）控制. 萃取完成后，将涂层置于气相色谱（GC，6890N，美国Agilent）进样口进行热解吸，并利用电子捕获检测器（ECD）测定PBDEs浓度. GC-ECD具体检测条件如下：分离色谱柱为TG-5MS毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm，美国Thermo）；载气为1.60 mL·min−1高纯氮（≥99.999%，南京天泽气体有限公司）；柱温初始温度为80 ℃，保持1 min，再以20 ℃·min−1升至280 ℃，保持5 min，最后以2 ℃·min−1升至300 ℃，保持2 min；检测器温度为310 ℃[18].

    2.   结果与讨论（Result and Discussion）

    2.1   TpBD涂层的表征结果

    图1为TpBD涂层材料的表征结果. 在XRD图谱中（图1a），2θ=3.42°（100）处的强尖峰体现了TpBD的高结晶度；2θ=26.35°（001）处的宽峰来源于TpBD中芳香结构的π-π堆积[19-20]. FTIR图谱（图1b）中也出现了TpBD的特征峰，包括芳香C=C在1573 cm−1和1450 cm−1处的振动峰，以及C—N在1284 cm−1处的振动峰，说明形成了β-酮胺连接的骨架结构[21]. 氮气吸附-脱附等温线测定结果（图1c）显示，所合成材料的BET比表面积达695.56 m2·g−1，孔体积为0.50 cm3·g−1，主要孔径分布在0.54—2.34 nm 之间，与文献报道的TpBD孔结构一致[17]. 以上结果证实TpBD的正确合成.TGA图谱表明（图1d），TpBD材料在30—360 ℃范围内无明显失重（低于10%），说明TpBD具有良好的热稳定性，适用于PBDEs等高沸点污染物的分析.

    图 1  TpBD材料的（a）XRD图、（b）FTIR图、（c）氮气吸附-脱附等温线和孔径分布图和（d）TGA图
    Figure 1.  （a） XRD pattern, （b） FTIR spectrum, （c） nitrogen adsorption-desorption isotherms and pore size distribution, and （d） TGA results of TpBD.
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    图2为TpBD粉末及涂层的SEM图.TpBD呈球状颗粒（图2a和b），直径在10 μm以内，与文献报道的形貌一致[17].图2c和d显示，在TpBD涂层中，TpBD粉末均匀分布于不锈钢丝基底表面，涂层厚度约为50 μm.

    图 2  （a）、（b）TpBD粉末和（c）、（d）TpBD涂层的SEM图
    Figure 2.  SEM images of （a）, （b） TpBD powder and （c）, （d） TpBD coating
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    2.2   TpBD涂层萃取条件的优化

    利用正交实验（L16（45）），对TpBD涂层萃取PBDEs的条件进行优化[22]. 其中PBDEs加标浓度为50.00 ng·L−1，所考察萃取条件因素包括萃取温度（30、45、60、75 ℃）、萃取时间（30、45、60、75 min）、搅拌速度（0、400、800、1200 r·min−1）、解吸温度（270、280、290、300 ℃）和解吸时间（1.0、2.5、4.0、5.5 min），以每个因素每个水平下萃取PBDEs的峰面积总和作为正交实验结果的响应值（图3）[23].

    图 3  （a）萃取温度、（b）搅拌速度、（c）萃取时间、（d）解吸时间和（e）解吸温度对PBDEs萃取效率的影响
    Figure 3.  Effects of （a） extraction temperature, （b） stirring rate, （c） extraction time, （d） desorption time, and （e） desorption temperature on the mean value of total peak area obtained in the range analysis of orthogonal array.
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    表2为正交实验的极差分析和方差分析结果. 可以看出，萃取温度和搅拌速度对TpBD涂层的萃取效率具有显著影响（P<0.05）. 萃取温度的升高可以提高PBDEs的扩散速率，进而提高萃取效率. 如图3a所示，当萃取温度由30 ℃升至75 ℃时，TpBD涂层的萃取效率持续提高（图3a），故取75 ℃为最优萃取温度.图3b为搅拌速度对萃取效率的影响. 随着搅拌速度的提高，PBDEs的扩散加快[24]，涂层的萃取效率也提高，因此选择1200 r·min−1为最优搅拌速度.图3c—e为其它因素对萃取过程的影响. 综合考虑萃取效率和分析速度，取最优萃取时间为45 min，解吸时间为1.0 min，解吸温度为290 ℃.

    表 2  正交实验的极差分析和方差分析结果
    Table 2.  Results of range analysis and analysis of variance （ANOVA） for the orthogonal experiments.
    条件Conditions方差分析 Analysis of variance （ANOVA）
    极距（×105）Polar distance方差和（×1011）Sum of variance组间自由度Degree of freedom between groups组内自由度Degree of freedom within the groupFP
    萃取温度/℃4.7225.6563444.0110.013*
    萃取时间/min2.4796.8123440.8420.478
    搅拌速度/（r·min−1）8.4622.54134426.9110.000*
    解吸温度/℃2.1106.9283440.5820.630
    解吸时间/min2.0966.9603440.5130.676
    　　注：* P<0.05.
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    2.3   TpBD涂层的萃取性能

    首先考察了TpBD涂层对PBDEs的萃取效率. 如图4所示，TpBD涂层可高效萃取水中的PBDEs，其对所测试6种PBDEs的富集倍数高达1970—3820（表3）. 在相同萃取条件下，TpBD涂层的萃取效率是商用100 μm PDMS（聚二甲基硅氧烷）涂层的1.2—2.0倍，85 μm PA（聚丙烯酸酯）涂层的1.8—10.7倍，65 μm PDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）涂层的3.2—11.9倍，50/30 μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷）涂层的6.0—39.5倍.TpBD涂层的高萃取效率一方面源于其较高的比表面积和较强的表面疏水性，可通过疏水作用吸附PBDEs[25]. 与此相一致，实验发现除BDE-28之外，其余5种PBDEs在TpBD涂层上的富集倍数（表3）随其疏水性（表1）的增强而增大. 另一方面，TpBD富含芳香结构（见XRD和FTIR表征结果），因此能与PBDEs的苯环发生π-π相互作用，进而增强对PBDEs的富集. Li等[21]和Gao等[26]的研究也指出，π-π相互作用是TpBD吸附双酚A、四溴双酚A等芳香性污染物的重要机制. 此外，TpBD具有发达的孔道结构，其中孔径在1.00—1.36 nm之间的孔含量尤为丰富（图1c）. 这些孔道的尺寸与PBDEs分子的大小（1.00 nm左右，表1）接近，因而可通过孔填充效应引起的吸附势能叠加，进一步促进TpBD涂层对PBDEs的富集[27-28].

    图 4  TpBD涂层和商业涂层对PBDEs的萃取效率
    Figure 4.  Comparison of extraction efficiency of PBDEs between TpBD coated fiber and commercial fibers.
    PBDEs浓度为10.00 ng·L−1，萃取温度75 ℃，搅拌速度1200 r·min−1，萃取时间45 min，解吸时间1 min，解吸温度290 ℃
    PBDEs concentrations of 10.00 ng·L−1, extraction temperature of 75 ℃, stirring rate of 1200 r·min−1, extraction time of 45 min, desorption time of 1 min, desorption temperature of 290 ℃.
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    表 3  基于TpBD涂层的SPME-GC/ECD方法对PBDEs的分析性能
    Table 3.  Analytical performance of the SPME-GC/ECD method based on TpBD coated fiber
    同类物Congeners线性范围/（ng·L−1）Linear range相关系数Regressioncoefficient检出限（S/N=3）/（ng·L−1） LOD定量限（S/N=10）/（ng·L−1） LOQ日内萃取重复性（n=5）/% Intra-day repeatability日间萃取重复性（n=3）/% Inter-day repeatability制备重复性（n=3）/% Fiber-to-fiber reproducibility富集倍数Enhancement factor
    BDE-281.00—50.000.9990.160.5214.78.78.02990
    BDE-471.00—50.000.9980.200.6614.111.37.62750
    BDE-1001.00—50.000.9920.301.0013.412.07.21970
    BDE-991.00—50.000.9960.240.808.29.19.72560
    BDE-1531.00—50.000.9950.401.3410.312.96.32790
    BDE-1382.00—50.000.9940.451.5013.913.513.13820
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    除萃取效率外，稳定性也是SPME涂层的重要性能参数.TpBD在360 ℃时的热失重仅为10%（图1d），表明其具有优秀的热稳定性. 为进一步探究TpBD涂层的化学稳定性，将其依次浸入0.10 mol·L−1盐酸溶液（pH 1）、0.01 mol·L−1氢氧化钠溶液（pH 12）、极性溶剂甲醇和非极性溶剂正己烷中，分别浸渍12 h[29]，对比浸渍处理前后涂层对PBDEs的萃取效果. 如图5所示，各项浸渍处理对TpBD涂层的萃取性能均没有显著影响，处理前后涂层萃取效率的相对标准偏差（RSD）为1.0%—14.6%.

    图 5  酸、碱和溶剂处理对TpBD涂层萃取效率的影响
    Figure 5.  Effect of acid/base or solvent treatments on extraction efficiency of PBDEs by TpBD coated fiber
    PBDEs浓度为10.00 ng·L−1，萃取温度75 ℃，搅拌速度1200 r·min−1，萃取时间45 min，解吸时间1 min，解吸温度290 ℃
    PBDEs concentrations of 10.00 ng·L−1, extraction temperature of 75 ℃, stirring rate of 1200 r·min−1, extraction time of 45 min, desorption time of 1 min, desorption temperature of 290 ℃.
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    图5表明，TpBD涂层在较宽的pH范围内（1—12）具有良好的稳定性，且对极性和非极性有机溶剂均具有较高的耐受性. 此外，重复使用实验显示，TpBD涂层在使用100次之后萃取效率没有明显降低，说明其具有较长的使用寿命.

    2.4   基于TpBD涂层的SPME/GC-ECD方法对PBDEs的分析性能

    利用TpBD涂层，在优化的萃取条件下建立了所测试6种PBDEs的分析方法. 该方法测定PBDEs标准样品的色谱图如图6所示，方法的线性范围、检出限、精密度、重现性等分析参数列于表3. 结果表明，BDE-28、BDE-47、BDE-100、BDE-99和BDE-153在1.00—50.00 ng·L−1，BDE-138在2.00—50.00 ng·L−1范围内具有良好的线性（R2 > 0.992）. 方法对PBDEs的检出限为0.16—0.45 ng·L−1，优于文献报道的其它自制SPME涂层，如石墨烯溶胶-凝胶涂层（0.2—5.3 ng·L−1）[30]、蚀刻的不锈钢丝（0.2—0.6 ng·L−1）[22]和基于四氧化三铁纳米粒子涂层的竹炭纤维（0.25—0.62 ng·L−1）[31]. 此外，该方法还具有良好的重复性，同批次涂层日内多次萃取的RSD为8.2%—14.7%（n=5），日间多次萃取的RSD为8.7%—13.5%（n=3）；3批次涂层萃取的RSD为7.2%—13.1%.

    图 6  基于TpBD涂层的SPME-GC/ECD方法检测PBDEs的色谱图
    Figure 6.  Chromatogram obtained by the SPME-GC/ECD method based on TpBD coated fiber
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    为了验证所建立方法的实际应用性，采用该方法分析了某废旧电器拆解污染场地地下水中的PBDEs浓度. 如表4所示，在实际污染水样中检测出了4种PBDEs（BDE-100、BDE-99、BDE-153和BDE-138），浓度范围为0.25—4.26 ng·L−1；其它2种PBDEs的浓度低于本方法检出限. 我们进一步开展了实际水样的加标回收实验（水样3#，加标浓度5.00 ng·L−1），测得回收率为81.1%—106.5%，RSD低于12.5%（n=3）. 这些结果表明，基于TpBD涂层的SPME/GC-ECD方法可用于检测实际环境水样中的PBDEs.

    表 4  基于TpBD涂层的SPME-GC/ECD方法对实际水样中PBDEs的分析结果
    Table 4.  Analytical results for the determination of PBDEs in real water samples
    同类物Congeners1#水样2#水样3#水样4#水样5#水样6#水样加标回收率（n=3）/%Recoveries
    BDE-28NDaNDNDNDNDND97.6 ± 8.1
    BDE-47NDNDNDNDNDND90.8 ± 9.8
    BDE-1000.930.32NDNDNDND106.5 ± 11.8
    BDE-992.450.710.380.25ND0.3196.3 ± 10.6
    BDE-1532.200.64NDNDNDND83.7 ± 12.2
    BDE-1384.261.050.54NDNDND81.1 ± 12.5
    　　注：a 未检出. a not detected.
     | Show Table
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    3.   结论（Conclusion）

    本研究通过水热法合成TpBD型COF，以不锈钢丝为基底，利用物理黏附法制得基于TpBD材料的SPME涂层，并将其应用于萃取和检测水体中的PBDEs. 研究结果显示，TpBD涂层具有优越的PBDEs萃取性能，其萃取效率是商用涂层的1.2—39.5倍. 这是因为TpBD具有较高的比表面积和表面疏水性，还可与PBDEs产生π-π作用和孔填充作用，能高效富集水体中的PBDEs. 此外，TpBD涂层还具有良好的热稳定性和化学稳定性，使用寿命较长. 基于该涂层的PBDEs检测方法线性范围较宽、检出限低、精密度和重现性好，在实际环境水样的分析中具有良好的应用潜能.

  • 图 1  EACDP手性固定相的红外光谱图

    Figure 1.  The infrared spectrum of chiral stationary phase EACDP

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    图 2  HLB与SAX固相萃取小柱中 PMA（A）、BMA（B）、MHBMA（C）和DHBMA（D）的4种生物标志物回收率（n=3）

    Figure 2.  The recoveries of PMA（A），BMA（B），MHBMA（C） and DHBMA （D）enantiomers by HLB and SAX cartridges （n=3）

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    图 3  暴露组与对照组的尿液TIC色谱图

    Figure 3.  Urine TIC chromatograms of exposure and control groups

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    图 4  对照组（a,c）与暴露组（b,d）的尿液中MHBMA与DHBMA 的SIM色谱图

    Figure 4.  SIM chromatograms of MHBMA and DHBMA in urine of control group（a,c） and exposure group（b,d）

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    图 5  对照组和暴露组的尿样热图分析

    Figure 5.  Heat map analysis of urine samples in the control and exposure groups

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    图 6  主成分分析图

    Figure 6.  Principal component analysis （PCA） diagram

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    图 7  随机森林识别图

    Figure 7.  Random Forest Identification diagram

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    图 8  苯与甲苯的代谢路径图

    Figure 8.  Metabolic pathways of benzene and toluene

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    表 1  不同组的相应参数表（n=30）

    Table 1.  Corresponding parameter table for different groups （n=30）

    对照组Control group暴露组Exposure group
    行政人员油漆工 *
    年龄Age31.93±8.9331.60±7.61
    性别Gender男1921
    女119
    吸烟Smoke是02
    否3028
    饮酒Drink wine是106
    否2024
    遗传病史Whether there is a history of genetic disease是00
    否3030
    暴露强度/（mg m−3）Exposure intensity苯——
    甲苯—4.94±0.0094
    邻-二甲苯—0.99±0.013
    间-二甲苯—1.44±0.036
    对-二甲苯——
    工作年限/aLength of service8.43±7.057.80±6.90
    　　*与对照组比较，P<0.05.吸烟：指吸烟超过1 d，烟龄超过1 a.饮酒：指饮酒超过1年至少1周1次. — 代表没有检出.　　*Compared with the control group, P<0.05. Smoking: refers to smoking for more than 1 day and smoking for more than 1 year. Drinking: refers to drinking for more than 1 year at least once a week. — means no detection.
    对照组Control group暴露组Exposure group
    行政人员油漆工 *
    年龄Age31.93±8.9331.60±7.61
    性别Gender男1921
    女119
    吸烟Smoke是02
    否3028
    饮酒Drink wine是106
    否2024
    遗传病史Whether there is a history of genetic disease是00
    否3030
    暴露强度/（mg m−3）Exposure intensity苯——
    甲苯—4.94±0.0094
    邻-二甲苯—0.99±0.013
    间-二甲苯—1.44±0.036
    对-二甲苯——
    工作年限/aLength of service8.43±7.057.80±6.90
    　　*与对照组比较，P<0.05.吸烟：指吸烟超过1 d，烟龄超过1 a.饮酒：指饮酒超过1年至少1周1次. — 代表没有检出.　　*Compared with the control group, P<0.05. Smoking: refers to smoking for more than 1 day and smoking for more than 1 year. Drinking: refers to drinking for more than 1 year at least once a week. — means no detection.
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    表 2  PMA, BMA, d2-PMA, MHBMA-1+-2 与 DHBMA的多反应监测优化条件

    Table 2.  MRM optimization conditions for PMA, BMA, d2-PMA, MHBMA-1+-2 and DHBMA

    化合物Compounds母离子Precusor （m/z）子离子Product（m/z）驻留时间/msDwell time解簇电压/eVDP碰撞能量/eVCE
    （1） 苯巯基尿酸 (PMA)*238.03108.9430−16.91−16.99
    （2） 苄巯基尿酸 (BMA)*252.07122.9930−32.15−24.22
    （3） 同位素标记的苯巯基尿酸内标 (d2-PMA)*241.10109.9330−16.84−17.14
    （4） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)*232.03102.9430−19.90−14.14
    （5） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)232.03128.1030−33.14−14.16
    （6） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸） (DHBMA)*250.05120.9530−11.97−18.96
    （7） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸 ）(DHBMA)250.05127.8030−14.00−16.26
    （8） 泛酸 Pantothenate218.01146.1330−25.00−21.00
    （9） 酮戊二酸 Oxoglutarate145.10101.1230−35.31−13.00
    （10） D-苯丙氨酸 D-phenylalanine166.1103.2030−16.93−30.46
    （11） 2-羟基-戊二酸 2-hydroxygluarate147.12128.7430−45.52−17.12
    （12） 焦谷氨酸 Pyroglutamic acid128.0882.1330−23.16−19.15
    　　*代表定量离子. *Represent quantitative ion.
    化合物Compounds母离子Precusor （m/z）子离子Product（m/z）驻留时间/msDwell time解簇电压/eVDP碰撞能量/eVCE
    （1） 苯巯基尿酸 (PMA)*238.03108.9430−16.91−16.99
    （2） 苄巯基尿酸 (BMA)*252.07122.9930−32.15−24.22
    （3） 同位素标记的苯巯基尿酸内标 (d2-PMA)*241.10109.9330−16.84−17.14
    （4） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)*232.03102.9430−19.90−14.14
    （5） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)232.03128.1030−33.14−14.16
    （6） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸） (DHBMA)*250.05120.9530−11.97−18.96
    （7） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸 ）(DHBMA)250.05127.8030−14.00−16.26
    （8） 泛酸 Pantothenate218.01146.1330−25.00−21.00
    （9） 酮戊二酸 Oxoglutarate145.10101.1230−35.31−13.00
    （10） D-苯丙氨酸 D-phenylalanine166.1103.2030−16.93−30.46
    （11） 2-羟基-戊二酸 2-hydroxygluarate147.12128.7430−45.52−17.12
    （12） 焦谷氨酸 Pyroglutamic acid128.0882.1330−23.16−19.15
    　　*代表定量离子. *Represent quantitative ion.
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    表 3  尿液鉴定出的差异性代谢物

    Table 3.  Differential metabolites identified in urine

    序号NO.趋势（暴露组/对照组）Tendency（exposure/control）代谢物Metabolities相关路径Related pathway
    1↑D-苯巯基尿酸D-PMA谷胱甘肽代谢
    2↑D-苄巯基尿酸D-BMA谷胱甘肽代谢
    3—泛酸Pantothenate丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢
    4↓酮戊二酸OxoglutarateD-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢
    5↑D-苯丙氨酸D-phenylalanine丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,柠檬酸循环
    6↑2-羟基-戊二酸2-hydroxy-gluarate柠檬酸循环
    7↑焦谷氨酸Pyroglutamic acidD-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢，谷胱甘肽代谢
    　　注：↑代表上调，↓代表下调，—代表不变. 　　Note：↑represent upward adjustment, ↓represent downward adjustment, and — represent unchanged.
    序号NO.趋势（暴露组/对照组）Tendency（exposure/control）代谢物Metabolities相关路径Related pathway
    1↑D-苯巯基尿酸D-PMA谷胱甘肽代谢
    2↑D-苄巯基尿酸D-BMA谷胱甘肽代谢
    3—泛酸Pantothenate丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢
    4↓酮戊二酸OxoglutarateD-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢
    5↑D-苯丙氨酸D-phenylalanine丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,柠檬酸循环
    6↑2-羟基-戊二酸2-hydroxy-gluarate柠檬酸循环
    7↑焦谷氨酸Pyroglutamic acidD-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢，谷胱甘肽代谢
    　　注：↑代表上调，↓代表下调，—代表不变. 　　Note：↑represent upward adjustment, ↓represent downward adjustment, and — represent unchanged.
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    表 4  代谢路径P值表

    Table 4.  Metabolic pathway P values

    路径名 Pathway NameP−lgP
    D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢 D-Glutamine and D-glutamate metabolism0.0026832.57130
    丁酸代谢 Butanoate metabolism0.0065932.1578
    柠檬酸循环 Citrate cycle （TCA cycle）0.0087062.06020
    谷胱甘肽代谢 Glutathione metabolism0.0120021.92075
    丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 Alanine, aspartate and glutamate metabolism0.0120061.92060
    嘌呤代谢 Purine metabolism0.0259531.58620
    路径名 Pathway NameP−lgP
    D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢 D-Glutamine and D-glutamate metabolism0.0026832.57130
    丁酸代谢 Butanoate metabolism0.0065932.1578
    柠檬酸循环 Citrate cycle （TCA cycle）0.0087062.06020
    谷胱甘肽代谢 Glutathione metabolism0.0120021.92075
    丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 Alanine, aspartate and glutamate metabolism0.0120061.92060
    嘌呤代谢 Purine metabolism0.0259531.58620
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-10-20
  • 录用日期:  2023-02-19
  • 刊出日期:  2023-10-27
李良, 金永久, 金艳红, 杨梅花, 张智. 苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析[J]. 环境化学, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
引用本文: 李良, 金永久, 金艳红, 杨梅花, 张智. 苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析[J]. 环境化学, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
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LI Liang, JIN Yongjiu, JIN Yanhong, YANG Meihua, ZHANG Zhi. Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
Citation: LI Liang, JIN Yongjiu, JIN Yanhong, YANG Meihua, ZHANG Zhi. Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
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苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析

    通讯作者: E-mail：565535121@qq.com; 
  • 1. 南昌市绿色新型材料与工业废水处理重点实验室，豫章师范学院，南昌，330013
  • 2. 传染病预防控制国家重点实验室研究基地江西省动物源与媒介生物性传染病重点实验室，南昌市疾病预防控制中心，南昌，330038
  • 收稿日期:  2022-10-20
  • 录用日期:  2023-02-19
  • 网络出版日期:  2023-10-23
基金项目:
江西省教育厅科学技术研究项目重点项目（GJJ203102）, 豫章师范学院科研创新团队建设计划和南昌市科技支撑计划重点项目（洪科字[2019] 258号-18）资助.

摘要: “三苯”具有强的人体血液毒性和致癌作用，是一类重要的环境污染物. 以往常通过代谢组学软件筛查出工作场所中苯及苯系物暴露人群的内源性代谢物与相应的代谢路径，而未考虑机体的立体化学作用对代谢的影响. 基于自制的手性固定相，优化色谱分离与尿样的前处理条件后，借助开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件结合多元统计分析，分析出有显著差异的代谢物和代谢通路的变化. 暴露组检测到5种内源性的代谢物即泛酸、酮戊二酸、D-苯丙氨酸、2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸与2种外源性的代谢物即D-苯巯基尿酸与D-苄巯基尿酸. 6组代谢通路受到显著影响，包括D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环和嘌呤代谢. 结果表明，苯及苯系物暴露人群尿液代谢产物中2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸及D-苯丙氨酸会引起明显的升高，苯巯基尿酸与苄巯基尿酸也可能发生由L-型向D-型的手性转化，这为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定了基础，也为全面评估苯及苯系物暴露人群的健康风险提供了科学依据.

English Abstract

    全文HTML

  • 苯、甲苯、二甲苯等芳烃是重要的工业原料和挥发性溶剂[1-2]，其具有强的血液毒性和致癌作用，均被列入美国EPA 的129 种优先污染物名单[3]. 美国职业苯暴露量为16 mg·m−3[4]，而在发展中国家，职业性苯暴露量比美国还要高1—2个数量级[4-6]. 为此，许多研究人员进行了苯及苯系物暴露人群的代谢组学[7] 研究，并通过代谢组学软件筛选出内源性生物标志物与相应的代谢路径，这对于疾病诊断与监测、生物标志物鉴定和毒性机制探索等都能起到非常重要的作用[8-16]. 如：Sun [17-18]与Campo等[19]近几年开展了对苯及苯系物暴露的代谢组学研究. 已报道的苯及苯系物暴露的代谢组学方法是基于代谢物的非手性总量定性与定量分析，但对代谢产物的手性分析领域并没有涉及到. 代谢产物的手性分析在医学领域有重要的应用，如Kimura等[20]报道了手性氨基酸代谢物用于慢性肾炎诊断的新型的生物标志物监测. L-型氨基酸的异构体即D-型氨基酸越来越多地被认为是新型的生物标志物. 这项研究测试了多种手性氨基酸是否与肾功能、并发症以及慢性肾炎（CKD）的诊断有关并确认了手性氨基酸可作为肾炎疾病中的潜在生物标志物. 而人类机体的组成部分及其代谢产物一般也都具有手性[21-22]. 多糖和核酸中的糖是右旋的D-构型；除某些细菌以外，蛋白质都是由左旋的L-氨基酸组成；在机体的代谢过程中的细胞表面的受体和生物酶，一般也都具有手性. 当它们与环境中污染物相互作用时，通常要经过复杂的手性生物代谢过程[23-24]. 因此，从立体化学的角度研究代谢物的手性和含量变化对于深入评价污染物的药物功能和毒理学具有重要意义[25]. 将代谢组学技术与手性毒理学分析结合在疾病的病理、药理及食品、环境安全等领域的应用文献报道较少[26-33]，在职业卫生领域的研究尚未见报道.

    本研究借助自制的手性固定相，通过代谢组学技术和统计学软件筛查出职业场所苯及苯系物暴露人群尿液中有差异性的靶向手性代谢产物及相应的代谢途径，这对于揭示其体内代谢机理，评价职业场所相关从业人员的职业危害，以及职业卫生管理部门加强行业监管、职业性防护干预等都具有重要的现实意义.

    • 1.   材料与方法（Materials and methods）

      1.1.   仪器与试剂

    • QTRAP4500 LC-MS/MS系统（美国ABSCIEX），使用Analyst®1.6.3 工作站并采用3.0.2版本的MultiQuant定量分析软件，主要用于尿液代谢物定量分析；GC-2010 PLUS 气相色谱仪（日本SHIMADZU，配有FID检测器）主要用于工作场所中“三苯”的定量分析；Vario EL Ⅲ元素分析仪（德国Elementar）；5700傅立叶变换红外光谱仪（美国Nicolet）；AW-60柱填充机（美国Haskel公司）；TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-100E超声波清洗装置（昆山超声仪器有限公司）；MS-3微型涡旋振荡器（德国IKA公司）；HSC-12A氮吹仪（南京科杰分析仪器有限公司）；Milli-Q超纯水制备装置（美国Millipore公司）.

      球形硅胶（粒径5 μm，孔径12 nm，比表面积约为290 m2·g−1）由济南博纳生物技术有限公司提供；HLB和SAX固相萃取柱（美国Waters公司）；FFAP毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）由美国Agilent公司提供；6-对甲苯磺酰化-β-环糊精（纯度 ≥99.5%，山东滨州智源生物科技有限公司）；DL-苯巯基尿酸（简称PMA），DL-苄巯基尿酸（简称BMA）和同位素标记的PMA内标DL-d2-PMA，其纯度均大于99%，购自加拿大CDN公司；N-乙酰基-S-（3，4-二羟基丁基-L-半胱氨酸）（DHBMA），（R,S）-N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸（MHBMA-1）+（R,S）-N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸（MHBMA-2） 1:1，纯度均大于95%，由加拿大Toronto Reasearch Chemicals公司提供；甲醇和乙腈均为色谱纯级（美国Honeywell Burdick＆Jackson）；153种常见的内源性氨基酸、脂肪酸和外源手性标志物等MRM负离子模式参数由美国AB SCIEX公司提供；异氰酸丙基三乙氧基硅烷（纯度 ≥95%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；6-对甲苯磺酰基-β-环糊精（纯度≥98%，武汉欣欣佳丽生物科技有限公司）； 分析纯级别的乙二胺、丙酮、无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等试剂均购自中国上海国药集团；甲酸为质谱纯级别（美国 AnAQUA公司）；实验用水是由Milli-Q装置制备的超纯水（≥18.2 MΩ·cm）；60名非吸烟工人（男40名，女20名，年龄21—53岁, P>0.05）的尿液样本是由景德镇市职业病防治所现场采集的班后尿.

      • 1.2.   乙二胺单衍生化-β-环糊精固定相的制备

    • 手性固定相是参照实验室以前的报道[34-36]并进行了一些改进来制备的. 制备路线简要描述如下：将市售的6-对甲苯磺酰化-β-环糊精（A）用水多次重结晶，80 ℃下真空干燥10 h. 称取3.0 g（2.33 mmol） A于圆底烧瓶中, 慢慢加入30 mL乙二胺温升至80 ℃磁力搅拌反应8 h后减压蒸馏. 冷却至室温,加入丙酮-水溶液（10:1, V/V）, 析出的固体重结晶2—3次,得到产物B. 产物通过ESI质谱来鉴定，[M + H]+ 峰（m/z） 1177.82（理论值1177.88）,与理论值相符，产物为6-乙二胺单衍生化-β-环糊精，单步产率为62%.

      称取1.0 g产物B，慢慢加入30 mL无水DMF使其溶解，在磁力搅拌下于冰浴中加入0.20 mL异氰酸丙基三乙氧基硅烷反应1 h，然后在氮气保护下85 ℃下反应6 h，得到产物C. 直接加入2.0 g实验室以前合成的SBA-15 （Santa Barbara Amorphous 15）升温至110 ℃反应12 h，过滤，然后将固体粗产品分别用DMF、丙酮和甲醇洗涤，用丙酮萃取16 h. 在60 ℃下减压干燥10 h后，得到乙二胺单衍生化-β-环糊精手性固定相（简称EACDP）. EACDP的结构表征是通过元素分析仪和红外光谱仪获得的. 最后在恒定压力下将EACDP的匀浆填充不锈钢柱（4.6 mmI.D.×150 mm），并用溶剂依次冲洗此色谱柱.

      • 1.3.   人群研究

    • 以江西景德镇某汽车制造厂喷漆车间的工人及行政管理人员为研究对象，车间苯及苯系物暴露水平在 8 h轮班期间进行监测. 健康的没有职业苯暴露的受试者是办公室行政管理人员并与苯及苯系物暴露人群按照年龄、吸烟史和饮酒史（表1）进行了匹配.

      表1中所有信息均来自问卷调查，包括人口学特征、工作史、吸烟史和酒精史、医疗病史、理化因素暴露、尿液疾病的用药史和家族病史等. 根据调查问卷，排除标准如下：（1）尿液病史，如尿毒症、尿道感染、前列腺炎等；（2） 其他已知的尿液毒性因素（如氯霉素使用和电离辐射）； （3） 长期或目前用药或感染史. 本研究中涉及人类参与者的所有程序均符合世界医学协会“涉及人类受试者的医学研究伦理原则”中提到的伦理标准和人权准则. 该项目已经通过豫章师范学院审批，所有项目都给出了书面知情同意书，并在整个尿样采集等过程中都符合规范.

      • 1.4.   样品提取与净化

    • 使用带有盖子的PVC塑料瓶收集班后尿（每份尿样约50 mL）. 同时用6 mol·L−1盐酸酸化样品，尿液与酸的体积比为100:1（V/V），并于-20 ℃冷冻保存. 使用时将冷冻的人尿样品在室温下解冻并在使用前用水稀释10倍. 根据前人及本实验室报道的一些方法[35, 37-39]稍加改进进行样品的提取与净化.

      将250 μL同位素内标D,L-d2-PMA储备液（2.0 μg·mL−1）加入到50 mL稀释的尿样中，混匀15 min. 将SAX SPE小柱分别用5.0 mL甲醇，5.0 mL 水，5.0 mL 1%的无水乙酸活化，然后向SAX小柱加入1.0 mL尿样. 接着萃取柱分别加入3.0 mL甲醇，3.0 mL 5mmol·L−1磷酸缓冲液（pH=7.0）洗涤，空气蒸干5 min，然后分别用3.0 mL 乙腈，3.0 mL 5%氨化乙酸乙酯洗脱. 用氮气将洗脱液缓慢吹至近干，并用0.1%甲酸-甲醇（50:50，V/V）定容至1.0 mL. 过滤后，进10 μL样液并通过LC-MS/MS进行分析.

      • 1.5.   仪器分析

    • 将从工作场所收集“三苯”用的0.2 g活性炭放入溶剂解吸瓶中，然后加入1.0 mL二硫化碳解吸剂，最后将1.0 μL解吸液注入GC-2010 PLUS气相色谱仪. 气相色谱仪的氮气流速为40 mL·min−1，空气流速为400 mL·min−1，氢气流速为40 mL·min−1. 检测器为 FID 检测器，进样量为 1.0 μL，柱温为70 ℃. 进样口温度为150 ℃，检测器温度为 200 ℃，色谱柱为FFAP毛细管柱. 测量峰面积以计算苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯的相应浓度.

      尿样通过ABSCIEX的LC-MS/MS以多反应监测（MRM）模式来检测4种生物标志物和内标（I.S.）的MS信号完成定量分析工作，5种内源性代谢物完成定性鉴定工作，离子对信息如表2所示，色谱柱为自制的EACDP.

      色谱条件：25 ℃柱温，0.5 mL·min−1流速等度洗脱，流动相的构成为 5.25 mmol·L−1甲酸铵（pH=2.70）（A）与甲醇（B），V（A）/V（B）=10/90, 进样量为10 μL.

      质谱条件：电喷雾离子源，负离子模式，雾化气的压力均为50 psi，气帘气的压力为35 psi，离子源温度为500 ℃，碰撞气为中等压力，电离电压为−4.5 kV.

      • 1.6.   统计学方法分析

    • 本实验首先用液质分析得到MRM数据，然后用MultiQuant软件（3.0.2版本）积分得到153种靶向代谢物与4种外源性生物标志物的峰面积数据，接着导出存为CSV文件格式，将Sample ID和Sample type行删除，在第二行增加sample group行并在相应的组下面进行标识出control 与expose.

      通过开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件进行数据分析处理来找出差异性的化合物和差异通路，其网址为https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml，接着选择statistical Analysis[one factor]进入界面后可以进行t值分析，PCA分析，PLS-DA分析，Heatmap，Correlation Heatmaps等找出有显著差异的内源性代谢物和外源性标志物进行统计学分析.

      本文进行代谢路径分析是通过进入MetaboAnalyst 5.0 软件后选择The Pathway Analysis界面找出有显著差异的代谢路径.

    2.   结果与讨论 （Results and discussion）

      2.1.   乙二胺-β-环糊精固定相的结构表征

    • 具有脲键的环糊精三乙氧硅烷与SBA-15硅胶反应键合在硅胶上形成了衍生化环糊精固定相. 通过红外光谱、元素分析对新固定相进行了相应的结构表征.

      红外光谱如图1所示. 环糊精配体和残留的硅醇羟基的O—H吸收峰及胺基的N—H伸缩峰出现在约3474 cm−1处；有机配体在2926 cm−1和2852 cm−1处出现C—H伸缩振动峰；1656 cm−1为氨基甲酸酯的C=O伸缩振动峰；胺基的N—H面内弯曲峰位于1552 cm−1；环糊精配体和硅胶基质的C—O和Si—O—Si吸收峰是出现在1252、1191、1126、1052 cm−1处的重叠峰.

      元素分析结果如下：C 3.67%，H 6.35%，N 0.23%. 根据碳含量计算，乙二胺-β-环糊精固定相EACDP上配体的键合量为0.102 μmol·m−2，这表明有一层有机配体键合在硅胶上.

      • 2.2.   优化样品前处理

    • 在已发表的文献中检测三苯（BETX）和1.3-丁二烯（BD）暴露的尿液代谢产物，应用固相萃取（SPE）方法更为方便有效[35, 40]. 在本研究中，评价了两种类型的SPE小柱，即OASIS®HLB和SAX小柱（6 cc/200 mg，美国Waters 公司）. 目前，苯巯基尿酸（PMA）和苄巯基尿酸（BMA） [41-42]被认定为最可靠的苯系物职业危害经尿液排泄的生物标志物，是苯和甲苯在人体中具有较强特异性和较高敏感性的代谢产物. BD是一种大量生产的石化产品，也是一种致癌性空气污染物，其主要环境来源是生物质燃烧产生的废气以及汽车尾气，尤其是香烟烟雾. 丁二烯是人体致癌风险最高的环境污染物之一[43]，其致癌作用的靶器官是淋巴-造血系统. 然而，丁二烯并不是直接致癌物，它的致癌作用源于其代谢产物[44]，如：DHBMA与MHBMA等，而且研究发现MHBMA 被证明在监测近期的丁二烯暴露方面比 DHBMA 更敏感[45]. 为此通过分离和检测香烟中1,3-丁二烯成分所引起人体尿液代谢产物中DHBMA和MHBMA这两种手性生物标志物的含量变化及可能引起的手性转化来较为精准地预估非吸烟人群，这为后续的苯及苯系物暴露人群尿液的代谢组学筛查垫定了基础. 故尿液的前处理优化主要是针对PMA，BMA，MHBMA与DHBMA这四种代谢产物展开的.

      SPE小柱的净化过程是使用不同的活化液和洗脱剂，比较OASIS®HLB和SAX固相萃取小柱（6 cc/200 mg，美国）的萃取效果（回收率比较见图2）[40]. 使用5.0 mL甲醇，5.0 mL 水和5.0 mL 1%的无水乙酸依次活化固相萃取柱. 加入1.0 mL尿样上样后，用3.0 mL甲醇，3.0 mL 5 mmol·L−1 磷酸缓冲液（pH=7.0）洗涤. 为了确认乙腈是否能较为有效洗脱出PMA、BMA、MHBMA与DHBMA，先将这两种固相萃取小柱分别用3.0 mL乙腈洗脱，然后用氮气吹干，加入1.0 mL甲醇溶液过0.45 µm有机相滤膜后进LC-MS/MS分析. 结果发现HLB小柱能将这4种物质洗脱出来，但对DHBMA与MHBMA的回收率却较低；SAX小柱中的洗脱产物中只有MHBMA与DHBMA，PMA与BMA却基本没有检出. 分析原因可能是PMA与BMA的酸性较MHBMA与DHBMA酸性强，故在SAX小柱中有较好的保留，用乙腈不能将其洗脱出来；而HLB小柱却是依据其极性大小进行吸附，MHBMA与DHBMA较PMA与BMA的极性小，故可能在前面的净化过程中已经被甲醇洗脱出来，这可能是造成MHBMA与DHBMA回收率不高的原因. 继续用3.0 mL 5% 氨化甲醇洗脱SAX小柱，合并乙腈洗脱液然后用氮气吹干，加入3.0 mL甲醇溶液过0.45 µm有机相滤膜后进LC-MS/MS分析，结果发现4种物质都能检出.

      选择OASIS® SAX固相萃取小柱是由于其对这4种生物标志物较高的回收率、稳定性及较宽的pH适用范围. 在洗脱步骤中，发现PMA、BMA、MHBMA与DHBMA不能被3.0 mL乙腈完全洗脱，而后续加入3.0 mL 5% 氨化甲醇洗脱则能实现. 因此，选择乙腈与氨化甲醇可作为本实验中的最佳分步洗脱溶剂.

      • 2.3.   人群特征分析

    • 本研究共招募了60名参与者，包括30个暴露组人群和30个健康对照组人群. 暴露组与对照组平均年龄分别为（31.93±8.93）岁和（31.60±7.61）岁，男女比例为2:1（参见表1）. 暴露组和对照组的性别、年龄、吸烟和饮酒的分布没有观察到统计学差异（P > 0.05）.

      苯及苯系物暴露强度测定结果分别为（4.94±0.0094）mg·m−3（甲苯）、（0.99±0.013）mg·m−3（邻二甲苯）、（1.44±0.036）mg·m−3（间二甲苯），平均暴露持续时间为（7.80±6.90）a. 暴露组和对照组的特点总结在表1中.

      • 2.4.   暴露组的尿液代谢组学分析

    • 从m/z100到1000的负离子模式下的全扫描用于数据收集. LC-MS总离子流来自暴露组与对照组的尿液TIC色谱图，如图3所示. 观察到暴露组与对照组之间存在显著性差异的保留时间是在10—12 min和18—22 min，分别对应上述4种标志物中为DHBMA与MHBMA，谱图如图4所示）.

      基于已知的尿样代谢物生成热图（图5），每行代表特定的代谢物的离子强度，每列代表30个对照组与30个暴露组工作场所人群的个体代谢特征. 红色块代表区域代表健康对照组，对应的每条线代表每个对照组工人；图中的绿色块代表区域代表暴露组，对应的每条线代表每个暴露组工人. 代谢水平的折叠变化是色标：黄色，上调；蓝色，下调；绿色，无显著性变化（见表3所示）. 这揭示了暴露组和对照组之间的差异. 热图表明暴露组主要由于其代谢变化的内在差异与对照组能够分开聚集.

      • 2.5.   PCA分析

    • 为了揭示暴露组的内源性与外源性的代谢变化，主成分分析（PCA）被选为无监督法. 如图6 所示，PCA 得分图显示来自不同样本的数据组倾向于聚集在一起，并且暴露组与健康对照组能够分开. 该分析表现出令人满意的性能，因为超60% 的变异性是通过使用5个组件来解释的.

      然后确定了哪些代谢物是造成上述差异的原因. 使用学生t检验法测量了暴露组和健康对照组之间具有相对较低的严格性（P < 0.05，倍数变化≥2）的显著差异的不同分子特征的数量. 结果表明，暴露组尿样与对照组尿样相比有50种代谢物发生显著变化. 通过随机森林识别（图7所示），这些特征在排列时按分类准确度的平均下降进行排序，最终识别出7种生物标志物（表3），有5种内源性的与2种外源性的. 即泛酸（pantothenate）、酮戊二酸（oxoglutarate）、D-苯丙氨酸（D-phenylalanine）、2-羟基-戊二酸（2-hydroxy-gluarate）、焦谷氨酸（pyroglutamic acid）、D-苯巯基尿酸（D-PMA）、D-苄巯基尿酸（D-BMA）. D-PMA在对照组中均为阴性，暴露组在0—98.60 µg·L−1间变化；D-BMA在对照组中均为阴性，暴露组在0—11.04 µg·L−1间变化. 其他代谢物可通过峰面积变化得出含量变化. 人体的氨基酸一般为L型的，并且苯与苯系物暴露后生成的巯基尿酸生物标志物如PMA与BMA，正常的人群也应为L型的，这几种D型代谢物的出现可能意味着某种疾病的发生，应引起高度的重视[35].

      • 2.6.   代谢通路分析

    • 可利用开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件进行数据分析和处理来找出差异的代谢通路，其网址为https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml. 统计学分析中选择Pathway Analysis进入界面后输入一列代谢物化合物列表名，得出化合物相应的KEGG代谢物通路（如表4所示），由于给定的化合物列表均为内源性化合物，而外源性化合物PMA与BMA的代谢通路只能通过文献报道[41-42]的方法进行分析. 内源性化合物有6组代谢通路有显著性差异（D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（D-glutamine and D-glutamate metabolism）、谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism）、丁酸代谢（butanoate metabolism）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）、柠檬酸循环（citrate cycle （TCA cycle））、嘌呤代谢（purine metabolism））.

      D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢会生成L-谷氨酰胺与D-谷氨酰胺,而代谢过程形成的酮戊二酸（2-oxoglutarate）参与到柠檬酸循环中. 谷氨酰胺（glutamine）是肌肉和血液中数量最多的氨基酸. 人体不能自己生产必需氨基酸，只能通过饮食摄取，而谷氨酰胺却是一种有条件必需氨基酸. 这意味着健康和无压力的身体条件能自己产生足够的谷氨酰胺，但在人患病或遭受创伤时，对谷氨酰胺的需求量会超过供应量，就使这种氨基酸变成必需. 故在人体在有苯或苯系物暴露环境中，可能会通过谷氨酸代谢生成酮戊二酸（2-oxoglutarate）. 同时代谢形成的酮戊二酸（2-oxoglutarate）也参与丁酸代谢（butanoate metabolism）过程中，从而生成2-羟基-戊二酸（2-hydroxy-gluarate）. 杨臻峥[46] 曾报道了人体代谢产物2-羟基戊二酸（2-HG）可诱发神经胶质瘤和白血病, 尿液中2-羟基-戊二酸代谢产物的升高也能在一定程度上表明由于苯及苯系物暴露导致的血液毒性.

      谷胱甘肽（GSH）是一种多功能三肽，它既是磷酸甘油醛脱氢酶的辅基，又是乙二醛酶和丙糖脱氢如酶，所以是细胞内重要的调节代谢物. 氢化酶的辅酶参与体内的三羧酸循环（TCA循环）和葡萄糖代谢，可以激活多种酶，巯基（SH）酶-辅酶等，从而促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢. GSH分子以活性巯基（—SH）为特征，这是最重要的官能团. 它可以参与体内多种重要的生化反应，保护体内的蛋白质和一些重要酶的巯基不被氧化和失活，保证能量代谢和细胞利用. 同时通过巯基与体内自由基结合，可直接将自由基还原为酸性物质如巯基尿酸，可以加速自由基的排泄，以抵抗对重要器官的损害. 参考相关文献[40-41, 47]，外源性标志物PMA与BMA的代谢路径如图8 所示. 谷胱甘肽多为L型的，但是代谢过程中由于苯及苯系物毒性较大，可能会破坏谷胱甘肽-SH的活性进而造成构型的转化（如D-PMA与D-BMA的生成），从而影响人体的身体健康，这可为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定基础.

      在谷胱甘肽循环中，焦谷氨酸也是一种重要的代谢物. 在某些多肽中谷氨酸的氨基与5-羧基脱水而成焦谷氨酸, 在一些活性肽类的N端的谷氨酸，其侧链羧基与N端的氨基脱水后形成的环化衍生物. 它也可通过5-氧代脯氨酸酶转化为谷氨酸. GSH循环是一种非酶促抗氧化防御，可防止在体内形成氧化剂并修复氧化损伤[48]. 文献报道在随访期间发现患有咽喉癌的吸烟者血清焦谷氨酸（GSH 代谢）水平升高[49]. 与上述文献报道的结果相一致，本研究在苯及苯系物暴露人群尿液中发现了焦谷氨酸水平的升高.

      丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）生成L-丙氨酸参与到D-氨基酸的代谢（D-amino acid metabolism）中可以形成诸如D-苯丙氨酸（D-phenylalanine），而丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）形成L-谷氨酸再通过一系列代谢路径形成R-pantothenate（泛酸）. Sun等[17]进行了苯暴露C3H/He小鼠骨髓细胞和血浆内源性代谢物变化的研究，在他们的研究中，发现可能是由于线粒体的功能障碍从而导致了骨髓细胞中苯丙氨酸水平的显著升高，这就需要苯丙氨酸、蛋白质、黑色素和酪氨酸的合成. 这两种氨基酸能够为糖异生和分解代谢为三羧酸循环（TCA）循环提供中间体. 本文的研究中也同样通过TCA循环出现了D-苯丙氨酸的升高，这可能是苯及苯系物暴露对细胞的毒性与TCA循环有关. 尿液中苯丙氨酸水平升高的相关的通路可能是苯及苯系物暴露导致血液毒性的重要机制.

      嘌呤代谢（purine metabolism）会生成环状磷酸腺苷cAMP（cyclic adenosine monophosphate）. 环磷酸腺苷（cAMP）是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”. 此外，对核酸、蛋白质、糖、脂肪代谢的合成及代谢调节等方面起着重要的作用.

    3.   结论（Conclusion）

    • 本研究基于自制的手性固定相EACDP来优化色谱分离与人尿的样品前处理条件，借助开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件结合多元统计分析，结果显示苯及苯系物暴露人群尿液中检测到5种内源性的代谢物与2种外源性的代谢物. 6组代谢通路受到显著影响，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环和嘌呤代谢. 2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸及D-苯丙氨酸会引起明显的升高，苯巯基尿酸与苄巯基尿酸也可能发生由L-型向D-型的手性转化，这为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定了基础，也为全面评估苯及苯系物暴露人群的健康风险提供了科学依据. 在后续研究中将进一步拓展代谢产物的研究范围，由靶向代谢物转向全面的非靶向代谢物，将具有显著性差异的代谢物进行动物学实验或建立代谢模型以进一步确认其危害性.

    参考文献 (49)

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