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苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析

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李良, 金永久, 金艳红, 杨梅花, 张智. 苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析[J]. 环境化学, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
引用本文: 李良, 金永久, 金艳红, 杨梅花, 张智. 苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析[J]. 环境化学, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
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LI Liang, JIN Yongjiu, JIN Yanhong, YANG Meihua, ZHANG Zhi. Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
Citation: LI Liang, JIN Yongjiu, JIN Yanhong, YANG Meihua, ZHANG Zhi. Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
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苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析

  • 1.

    南昌市绿色新型材料与工业废水处理重点实验室，豫章师范学院，南昌，330013

  • 2.

    传染病预防控制国家重点实验室研究基地江西省动物源与媒介生物性传染病重点实验室，南昌市疾病预防控制中心，南昌，330038

    • 通讯作者: E-mail：565535121@qq.com; 
  • 基金项目:
    江西省教育厅科学技术研究项目重点项目（GJJ203102）, 豫章师范学院科研创新团队建设计划和南昌市科技支撑计划重点项目（洪科字[2019] 258号-18）资助.

Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series

  • 1.

    Key Laboratory of Nanchang City for Green New Materials and Industrial Wastewater Treatment, Yuzhang Normal University, Nanchang, 330103, China

  • 2.

    The Collaboration Unit for Field Epidemiology of State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, Jiangxi Provincal Key Laboratory of Animal-Origin and Vector-Borne Disease, Nanchang Center for Disease Control and Prevention, Nanchang, 330038, China

    • Corresponding author: LI Liang, 565535121@qq.com ; 
  • Fund Project: the Science and Technology Research Project of the Education Department of Jiangxi Province (GJJ203102), Research and Innovation Team Construction Plan of Yuzhang Normal University and Science and Technology Support Plan Project of Nanchang ( Hong Kezi [2019] No. 258-18).

摘要

  • 摘要: “三苯”具有强的人体血液毒性和致癌作用，是一类重要的环境污染物. 以往常通过代谢组学软件筛查出工作场所中苯及苯系物暴露人群的内源性代谢物与相应的代谢路径，而未考虑机体的立体化学作用对代谢的影响. 基于自制的手性固定相，优化色谱分离与尿样的前处理条件后，借助开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件结合多元统计分析，分析出有显著差异的代谢物和代谢通路的变化. 暴露组检测到5种内源性的代谢物即泛酸、酮戊二酸、D-苯丙氨酸、2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸与2种外源性的代谢物即D-苯巯基尿酸与D-苄巯基尿酸. 6组代谢通路受到显著影响，包括D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环和嘌呤代谢. 结果表明，苯及苯系物暴露人群尿液代谢产物中2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸及D-苯丙氨酸会引起明显的升高，苯巯基尿酸与苄巯基尿酸也可能发生由L-型向D-型的手性转化，这为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定了基础，也为全面评估苯及苯系物暴露人群的健康风险提供了科学依据.
    Abstract: "Triphenyl" has strong human blood toxicity and carcinogenic effects, which is an important environmental pollutants. As usual, metabolomics software was used to screen the endogenous metabolites and corresponding metabolic pathways of benzene and benzene series exposed people in the workplace, without considering the influence of stereochemistry on metabolism. Based on the home-made chiral stationary phase, after optimizing the chromatographic separation and pretreatment conditions of urine samples, the open platform MetaboAnalyst 5.0 software being combined with multivariate statistical analysis was used to analyze the changes of significantly different metabolites and metabolic pathways. Five endogenous metabolites (pantothenate, oxoglutarate, D-phenylalanine, 2-hydroxy-gluarate, pyroglutamic acid) and two exogenous metabolites (D-phenylmercapturic acid and D-benzylmercapturic acid) were detected in the exposed group. Six groups of metabolic pathways were significantly affected, including D-glutamine and D-glutamate metabolism, Glutathione metabolism, Butanoate metabolism, Alanine, aspartate and glutamate metabolism, Citrate cycle (TCA cycle) and Purine metabolism. Results show that 2-hydroxy-glutaric acid, glutamate and D-phenylalanine can cause obvious rise in human urine metabolites exposed to benzene and benzene series, the configurational transformation may also occur from L-type of D-type for phenylmercapturic acid and benzylmercapturic acid, which laid a foundation for further research on the potential mechanism of blood toxicity caused by benzene and benzene series, and also provides a scientific basis for comprehensive assessment of the health risk of benzene and benzene series exposed population.

  • 近年来，由于我国城市化和工业化速度不断加快，伴随而来的空气污染问题日益严重[1]。PM2.5是悬浮在大气中空气动力学直径小于等于2.5 μm的颗粒物，对能见度[2]、人体健康[3]、空气质量[4]和全球气候变化[5]等方面均产生重要的影响，因而受到学者的广泛关注。为了缓解国内严重的空气污染问题，国务院在2013年出台了严格的《大气污染防治行动计划》（简称“国十条”）（http://www.gov.cn/zwgk/2013-09/12/content_2486773.htm），其明确规定，到2017年全国地级及以上城市PM2.5浓度比2012年下降10%以上，从结果来看，重点区域的PM2.5浓度明显降低，京津冀、长三角、珠三角等重点区域细颗粒物（PM2.5）平均浓度分别比2013年下降39.6%、34.3%、27.7%（http://www.mee.gov.cn/gkml/sthjbgw/stbgth/201806/t20180601_442262.htm）。尽管环保部公布终期考核结果表示空气质量改善目标完满完成，但是我国大气污染形势仍然十分严峻，污染事件频发[6-8]。因此，针对典型污染城市进一步开展PM2.5的化学组成特征研究具有重要意义。

    深入了解PM2.5的化学成分及来源组成，是探索大气污染形成机理的有效途径[6, 9]。目前获得PM2.5化学组分和来源解析的研究大多数是基于离线采样[10-11]。但离线采样获取滤膜的分析周期长，分辨率较低，无法对短期、频发的污染事件进行快速响应[12]。为了弥补这一缺陷，可以实时监测气溶胶化学组分信息的高时间分辨率仪器近年来被广泛应用到PM2.5研究中。如美国Aerodyne公司生产的气溶胶质谱仪（AMS，Aerosol Mass Spectrometer）/颗粒物化学组分在线监测仪（ACSM，Aerosol Chemical Speciation Monitor）和我国广州禾信分析有限公司生产的单颗粒气溶胶质谱仪（SPAMS，Single Particle Aerosol Mass Spectrometer）等。AMS/ACSM可以提供亚微米级颗粒物非难熔性化学组成的质量浓度[13]，关注颗粒物的整体信息；而SPAMS可以获取单颗粒的质谱数据以及混合状态，可以提供元素碳，金属等信息[14]，对于深入探讨颗粒物的生成机制和氧化机制提供数据，从而实现对PM2.5污染事件成因的快速响应[15-16]。国内已有多地使用SPAMS开展的化学组成和来源解析的研究。如Zhang等[9]研究四川盆地夏季不同单颗粒的化学组成，结果表明生物质燃烧和工业排放对成都市PM2.5污染有重要贡献；Wang等[6]研究南京雾霾事件中含碳气溶胶的混合状态，发现在雾霾天碳气溶胶与二次组分的混合程度增强。马乾坤等[7]研究了北京秋季灰霾天气下颗粒物的化学组成和混和状态，结果表明二次气溶胶的生成对于灰霾形成具有重要贡献；张贺伟等[8]研究了郑州市灰霾天气颗粒物的混合态特征，发现灰霾期间颗粒物与二次组分的混合程度增强，颗粒物老化严重。

    2018年国务院的“打赢蓝天保卫战三年行动计划”中，汾渭平原被指定为污染控制重点区域。西安作为汾渭平原的中心城市，地理位置上北有黄土高原，南有秦岭，污染物扩散条件差。伴随着经济快速发展，城市化进程不断加快，导致该地区一直饱受大气PM2.5污染，冬季存在严重的灰霾现象[17]。研究表明，西安冬季PM2.5日平均浓度分布在130—351 μg·m−3[18]，远高于大气环境质量标准（75 μg·m−3）（GB3095-82）。在西安地区，研究颗粒物多用于离线滤膜分析方法[18-19]，离线分析法揭示了西安市颗粒物的主要成分包括碳气溶胶，水溶性离子和矿物粉尘[20]。污染来源一般有燃煤排放，机动车排放及生物质排放[21]。但是，利用在线仪器探讨西安冬季颗粒物污染特征研究相对较少。

    本文利用SPAMS对西安冬季气溶胶开展连续实时观测，测定单颗粒气溶胶的化学组分和粒径分布，结合单颗粒类型，揭示颗粒物主要来源贡献，进一步探讨和认识西安冬季PM2.5污染事件的成因，为西安大气污染防治工作提供科学依据。

    1.   实验方法（Experimental methods）

    1.1   样品采集信息

    本研究采样地点设置在陕西省西安市中国科学院地球环境研究所建立的野外观测站点（北纬N34°13′，东经E108°52′）。该采样点位于西安市的西南方向，附近主要是居民区和商业区，周围无明显的工业污染源排放[11, 21-22] 。观测时间为2018年12月6—12日。采样期间无明显沙尘影响。因此，可以更好的研究人为源对空气污染形成的影响。

    1.2   单颗粒气溶胶质谱仪（SPAMS）

    1.2.1   仪器原理

    SPAMS仪器的操作原理和性能参数已由多位研究者进行过详细阐述[6, 15, 23-24]。其原理简述如下，大气中颗粒物经过PM2.5切割头以后，由不锈钢管导入到仪器的0.1 mm进样微孔片，通过空气动力学透镜加速、准直后进入由两个连续的二极管Nd∶YAG激光束（532 nm）组成的测径区，根据两个测径激光之间信号的时间间隔得到该颗粒的飞行速度，从而计算出该颗粒的空气动力学粒径；同时触发266 nm（Nd∶YAG）强紫外脉冲激光将该颗粒电离成正负离子碎片，经双极飞行时间质量分析器检测后，最后由数据采集系统获得该颗粒物的不同组分的质荷比（m/z，范围是−250 —250）。在仪器观测期间，为了保证数据质量，采样前使用了不同粒径段（0.23、0.32、0.51、0.73、0.96、1.4、2.0 μm）的聚苯乙烯乳胶小球（PSL）对空气动力学粒径的采集进行校准，校准系数R2>0.99。

    1.2.2   质谱数据处理

    本研究基于MATLAB的软件工具包YAADA version 2.1分析SPAMS采集到的单颗粒气溶胶质谱数据。采用自适应共振神经网络算法（ART-2a），根据颗粒质谱图中m/z离子碎片强度和分布特征，将颗粒物分为7类，包括：有机碳颗粒（OC）、有机碳与元素碳混合颗粒（OCEC）、富钾颗粒（K-rich）、元素碳颗粒（EC）、扬尘颗粒（Dust）、重金属颗粒（Metal）、生物质颗粒（BB）。ART-2a主要运算参数学习效率、迭代次数和相似度分别设置为0.05、20和0.8。

    1.3   辅助数据

    观测期间， PM2.5质量浓度、PM10质量浓度、空气质量指数（AQI）、温度、湿度、臭氧（O3）、二氧化氮（NO2）、二氧化硫（SO2）和一氧化碳（CO）的浓度数据来自中国质量在线分析平台真气网（https://www.aqistudy.cn）；风速由MAWS201型自动气象观测站（Vaisala，芬兰）测定；钾（K）元素的数据采用AMMS-100型在线重金属仪（聚光科技，中国）观测得到。以上数据采用的时间分辨率都是1 h。

    2.   结果与讨论（Results and discussion）

    2.1   大气污染特征

    观测期间SPAMS共采集1609344个颗粒，其中264351个含有有效质谱信息。SPAMS的平均打击率为20.6% ± 9.1%，与其它研究类似[25-26]，较小的变异系数（44.2%）说明整个采样过程SPAMS相对稳定。图1为观测期间AQI六要素及气象要素的时间序列变化。从图1可以看到，PM2.5、PM10质量浓度和AQI的变化趋势基本一致。在12月10日至11日，PM2.5、PM10和AQI均在此期间具有较明显的上升趋势，AQI超过100，表明该时段为污染天。在此期间，NO2、SO2和CO也存在浓度的上升趋势。

    图 1  西安2018年12月6日至12日温度、湿度和风速（a）、气体（CO、NO2、SO2和O3）浓度（b）、PM2.5、PM10质量浓度、AQI和颗粒物数浓度（c）的时间序列变化
    Figure 1.  Time series of temperature, relative humidity and wind speed （a）, gas concentrations （CO, NO2, SO2 and O3） （b）, PM2.5 and PM10 mass concentration, AQI and particle counts （c） in Xi’an from December 6 to 12, 2018
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    图2显示了采样期间SPAMS测量的颗粒物数浓度和PM2.5质量浓度（小时分辨率）的相关性。从回归结果看，颗粒物数浓度和PM2.5质量浓度的相关性较好，线性拟合R2达到0.68，表明颗粒物数浓度在一定程度上可以反映大气污染的变化特征。

    图 2  颗粒物数浓度和质量浓度的相关性
    Figure 2.  Relationship between PM2.5 mass concentration and particles counts
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    2.2   颗粒物的质谱特征

    图3为获得的7种类型颗粒物的质谱信息。有机碳颗粒的正谱图中含有一些常见的有机碳的质谱峰，如：27C2H+3、37C3H+、39C3H+3、41C3H+5、43C2H5O+、50C4H+2、61C5H+、64C5H+4、75C6H+3以及芳香烃类51C4H+3、63C5H+3、77C6H+5和91C7H+7[27]。有机碳的来源复杂，既有包括燃煤、机动车、生物质燃烧等[28]在内的一次排放源，也含有二次形成的有机气溶胶[29]。元素碳颗粒是不完全燃烧过程中产生的一种含碳物质，其正负谱图上有明显的元素碳质谱峰（如m/z = ±12、±24、±36、±12n，n=4,5,6…）。当质谱图中同时出现有机碳和元素碳的特征峰时，将其命名为有机碳与元素碳混合颗粒[7, 9, 30]。研究表明，有机碳与元素碳混合颗粒既可以来自于一次排放，例如工业排放，垃圾焚烧、车辆尾气等[6, 27, 31]，也可由半挥发性有机物冷凝在元素碳上而形成的有机碳与元素碳混合颗粒[24]。富钾颗粒的正谱图上含有显著的39K+的质谱峰，负谱图上含有较高的硝酸盐（m/z=−46、−62）质谱峰[9]。研究表明，富钾颗粒与二次颗粒物的形成有关[23-24]。生物质颗粒负谱图含有45CHO−2、59C2H3O−2、71C3H3O−2和73C3H5O−2质谱峰。研究表明m/z −45、−59、−71和−73可作为左旋葡聚糖的指示物[32]；与此同时，生物质颗粒与在线金属仪测量的K元素呈较好的相关性（R2 =0.47，图4a）， 进一步说明该分类的可靠性。重金属颗粒是指正谱图中含有较强的55Mn+、56Fe+、Pb+（m/z = 206、207、208）质谱峰，其主要来源可能是工业排放[33]。其中，Pb主要是来自化石燃料、工业和垃圾焚烧排放[34-35]；Fe主要来自于冶金工业源[36]；Mn的排放来自于钢铁工业[37]。扬尘颗粒正谱图中含有40Ca+和56CaO+，负质谱图中含有76SiO−3、79PO−3的质谱信号[38]，主要来自道路扬尘和建筑扬尘。值得注意的是，在不同颗粒物组分质谱特征中均出现了不同强度的硝酸盐（m/z = −46、−62）和硫酸盐（m/z = −97）的质谱峰信号，说明绝大部分颗粒都经历了不同程度的老化。

    图 3  7类颗粒物的正负平均质谱图
    Figure 3.  Average mass spectra of seven groups of particles
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    图 4  K元素和生物质颗粒数数浓度（a）、NO2和元素碳颗粒数数浓度（b）与风速和扬尘颗粒数数浓度（c）的相关性
    Figure 4.  Relationship between K and particles counts of BB（a）, between NO2 and particles counts of KEC（b）and between wind speed and particles counts of Dust（c）
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    表1汇总了本次采样期间不同类型颗粒物数浓度及相对占比。其中，含碳颗粒物（包括元素碳颗粒、有机碳颗粒和有机碳与元素碳混合颗粒）总计176922个，占颗粒总数的66.9%。本研究中碳气溶胶的占比稍高于Chen等[39]2013年利用SPAMS在西安冬季观测的结果（57%）。元素碳与NO2的相关性（图4b）说明元素碳与机动车排放有一定的关系[40]。观测到的生物质颗粒总计42176个，占总颗粒数的16.0%，说明生物质燃烧是西安市颗粒物的重要来源。在西安地区，生物质（如木材和农作物秸秆）是周边农村家庭的基本燃料[41]，仍占有较大比例。这一占比结果与Chen等[39]研究（19%）类似。富钾颗粒的数量总计35410个，占总颗粒数的13.4%。扬尘颗粒的个数是7809个，占总颗粒数的2.9%，与风速并无明显关系（R2=0.01，图4c），可能是由于观测期间风速较小。重金属颗粒的数量为2033个，仅占总颗粒数的1%。扬尘颗粒和重金属颗粒的占比与马等[7]研究结果一致。

    表 1  采样期间西安颗粒物不同类型的数量及占比
    Table 1.  Number counts and number fraction of each type of particles in Xi’an during the campaign
    颗粒物类型Particulate groups总颗粒个数Count总占比/%Proportion阶段Ⅰ占比/% PhaseⅠ Proportion阶段Ⅱ占比/%PhaseⅡ Proportion特征离子Major ion fragments
    富钾颗粒 35410 13.4 10.1 17.5 39K+，46NO−2，62NO−3，97HSO−4
    有机碳颗粒 38024 14.4 12.2 13.2 27C2H+3，37C3H+，41C3H+5，43C2H5O+，50C2H+4，51C4H+3，61C5H+，63C5H+3，64C5H+4，75C6H+3
    元素碳颗粒 67960 25.7 22.8 30.5 ±12C，±24 C2，±36C+3，…，±12nC+n，n=4,5,6…
    有机碳-元素碳混合颗粒 70939 26.8 34.7 20.7 27C2H+3，37C3H+，41C3H+5，43C2H5O+，50C2H+4，51C4H+3，61C5H+，63C5H+3，64C5H+4，75C6H+3，±12C，±24 C2，±36C+3，…，±12nC+n，n=4，5，6…
    生物质颗粒 42176 16.0 16.4 13.7 45CHO−2， 59C2H3O−2， 71C3H3O−2，73C3H5O−2
    重金属颗粒物 2033 0.8 1.3 0.8 55Mn +，56Fe+，Pb+（m/z = 206、207、208）
    扬尘颗粒物 7809 2.9 2.5 3.6 40Ca+，56CaO+， 76SiO−3， 79PO−3
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    2.3   颗粒物粒径分布特征

    获取颗粒物的粒径分布特征对于进一步理解其产生的环境效应至关重要，例如大气能见度的降低与颗粒物的粒径分布密切相关[42]。图5显示了SPAMS采集到的颗粒物数浓度及不同颗粒物随粒径变化的分布。从图5a中可以看到，颗粒物数量主要分布在0.2—0.5 μm之间，占总测径颗粒数的88.6%。颗粒物数量峰值出现在380 nm处，占总颗粒数的12.2%。图5b进一步显示了随粒径的变化不同颗粒物种类数量浓度的相对占比。有机碳与元素碳混合颗粒、元素碳颗粒、有机碳颗粒在整个测径范围内占比都较大，分别占到总颗粒数的34.2% ± 14.4%、16.8% ± 8.7%和10.7% ± 8.0%。

    图 5  采样期间西安不同类型颗粒物的数浓度（a）和相对占比随粒径变化的分布情况（b）
    Figure 5.  Size distribution of particle number concentration （a） and number fraction of each group of particles （b） during the whole observation period
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    对于元素碳颗粒来说，在整个粒径段均有明显的贡献，主要分布在200 — 450 nm之间，平均占比为22.5%。有机碳主要集中在较小粒径段，分布在300 — 400 nm之间，与刘琴和刘慧琳等[43- 44]在成都和南宁研究的有机碳粒径分布较为一致。有机碳与元素碳混合颗粒的粒径主要在200—340 nm和800—1200 nm范围内较为丰富，贡献分别高达34.4%和40.2%。富钾颗粒主要在200—600 nm之间占比较大，平均为13.6%，该粒径分布与Bi等[24]在广州的研究一致。生物质颗粒在250—700 nm之间占比快速增长，峰值分布在560 —700 nm，大于元素碳、有机碳及富钾颗粒的粒径峰值。扬尘颗粒和重金属颗粒都分布在较大粒径段[43]，例如李思思等[45]在张家口市研究的沙尘期间Dust颗粒主要分布在800 nm处，本研究扬尘颗粒主要集中在600—1300 nm处，平均占比为4.6%。重金属颗粒主要集中大于600 nm处，平均占比是1.7%。

    2.4   污染期间颗粒物的变化特征

    根据PM2.5浓度变化趋势可将采样期间的一个典型污染事件分为2个阶段，包括清洁期（阶段Ⅰ）：12月6日13:00至9日18:00；污染期（阶段Ⅱ）：12月9日19:00至11日8:00。划分标准参考环境空气质量标准（GB3095—82）。两个不同污染时期不同种类颗粒物的质谱图无明显差异性。图6显示不同颗粒物在不同污染水平下不同种类的数浓度及占比的变化趋势。

    阶段Ⅰ期间，PM2.5平均质量浓度为32 μg·m−3，变化范围是15—73 μg·m−3。不同种类的颗粒物中占比较大的是含碳颗粒，包括：有机碳和元素碳混合颗粒（34.7%）、元素碳颗粒（22.8%）和有机碳颗粒（12.2%）。其它种类颗粒物依次为生物质颗粒（16.4%）、富钾颗粒（10.1%）、扬尘颗粒（2.5%）和重金属颗粒（1.3%）。含碳颗粒和生物质颗粒占比较大，说明人为燃烧源排放对于西安市PM2.5的贡献占据重要地位。生物质燃烧和燃煤排放是西安大气碳气溶胶的主要来源[11]。观测期间正处于西安市采暖阶段，所以燃煤和生物质燃烧排放对PM2.5的贡献不容忽视。

    阶段Ⅱ期间，PM2.5的平均质量浓度为114 μg·m−3，范围是79—149 μg·m−3，不同种类颗粒物占比最大的是元素碳颗粒（30.5%），其次是有机碳和元素碳混合颗粒（20.7%）、富钾颗粒（17.5%）、生物质颗粒（13.7%）和有机碳颗粒（13.2%）；扬尘颗粒（3.6%）和重金属颗粒（0.8%）的占比较小。与阶段I相比，元素碳和富钾颗粒占比在阶段II明显升高。元素碳颗粒主要来自于生物质燃烧、燃煤排放以及机动车的一次排放[27]，因此元素碳颗粒的快速升高可能说明了此次污染与这些一次燃烧源排放有关。富钾颗粒来自于颗粒物的二次生成，说明二次化学反应对本次污染的形成也起到了重要作用。有机碳和元素碳混合颗粒和生物质颗粒的占比在阶段II均低于阶段I，说明本次污染不是由有机碳与元素碳混合颗粒和生物质颗粒主导的。有机碳颗粒、扬尘颗粒和重金属颗粒阶段I和阶段II的占比变化不大。

    此外，在12月10日12点时，富钾颗粒物的占比达到最大（25.1%）；在16点时，元素碳的占比达到最大（42.2%）。在12:00—16:00期间，同样也是颗粒物数浓度快速上升时段，再次证明了本次污染的形成受到了燃烧源和颗粒物二次生成带来的影响。从阶段Ⅰ与阶段Ⅱ的气象条件来看（图1），阶段Ⅱ相对湿度（66%）明显高于阶段Ⅰ（43%）；阶段Ⅱ的风速（0.4 m·s−1）低于阶段Ⅰ（0.7 m·s−1）；阶段Ⅱ（−1.4℃）和阶段Ⅰ（−1.2℃）的温度相当。表明阶段Ⅱ 低风速不利于污染物的扩散，较高湿度有利于促进二次污染物的形成，从而加重污染。

    图 6  阶段Ⅰ和阶段Ⅱ 大气颗粒物主要化学组分百分占比（a）、各类颗粒物的数浓度和PM2.5质量浓度（b）及其所占比例（c）的时间序列变化
    Figure 6.  Time series of the percentage of seven groups during phase Ⅰ and phase Ⅱ （a）, number concentration of each group and PM2.5 mass concentration （b） and number fraction of each particle group （c） during the campaign.
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    2.5   颗粒物的混合特征

    硫酸盐、硝酸盐和铵盐是二次气溶胶的重要标志[46]。通常是由于气态污染物（SO2、NOx和NH3）转化而来[47]。研究各类颗粒物与硫酸盐和硝酸盐的混合状态，有利于了解颗粒物在不同阶段的老化特征。图7显示了不同种类颗粒物与硫酸盐、硝酸盐以及铵盐在一起的混合比例。

    图 7  阶段Ⅰ和阶段Ⅱ不同种类颗粒物与二次无机组分的混合状态。
    Figure 7.  Mixing states of different groups of particles with secondary ions during phase Ⅰ and phase Ⅱ.
    图中每个色块表示的是含有该离子的化学组分颗粒数个数与该组分的颗粒数个数的比值，颜色不同代表比值不同。
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    如图7所示，在阶段Ⅰ和阶段Ⅱ，7类颗粒物与硫酸盐和硝酸盐的混合程度均高于铵盐。硝酸盐和7种不同种类颗粒物混合的均较好；而硫酸盐与富钾颗粒、有机碳颗粒、有机碳与元素碳混合颗粒以及生物质颗粒混合的较好。在阶段Ⅱ中，除有机碳与元素碳混合颗粒外，硝酸盐和硫酸盐与其它类型颗粒的混合比例均高于阶段Ⅰ，混合比例大于0.8；尽管不同类型颗粒物与铵盐的混合比例均低于0.1，但是在阶段II中的混合程度都高于阶段Ⅰ。

    整体来看，颗粒物与二次无机离子的混合状态在污染期间有所增加。在阶段Ⅱ期间，相对较高的湿度，有利于二次组分在颗粒物表面的形成，从而使颗粒物的老化程度加深。结合硫酸盐、硝酸盐颗粒物数浓度随相对湿度变化（图8）可以看到，在相对湿度70%以下时，硝酸盐和硫酸盐个数随湿度的增加而增，这表明相对湿度在一定范围内可以促进硫酸盐和硝酸盐的生成。当相对湿度超过70%时，硝酸盐和硫酸盐个数随湿度的增加反而呈下降趋势。这可能是由于受转化消耗导致较低的前体物浓度带来的影响。这可以从NO2和SO2在高湿度下也呈下降趋势来证明。

    图 8  硝酸盐颗粒、硫酸盐颗、NO2和SO2随相对湿度的变化
    Figure 8.  Variations of nitrate, sulfate, NO2, and SO2 with relative humidity during the campaign
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    3.   结论（Conclusions）

    本文于2018年12月6—12日利用SPAMS对西安市颗粒物进行观测，根据ART-2a分类方法和人工分类方法对颗粒物进行分类，经分析得到如下结果：

    （1）观测期间颗粒物主要分为七类，分别是有机碳和元素碳混合颗粒、元素碳颗粒和生物质颗粒、有机碳颗粒、富钾颗粒、扬尘颗粒和重金属颗粒。污染期间元素碳和富钾颗粒占比明显升高，说明此次污染事件形成与一次燃烧排放和二次颗粒物生成有关；气象条件分析，污染期间高湿度，低风速促进了此次污染事件形成。

    （2）颗粒物主要分布在200—800 nm之间。不同种类的颗粒物在不同粒径下的占比具有明显的差异。元素碳颗粒主要分布在200—450 nm；有机碳主要集中在300—400 nm；有机碳与元素碳混合颗粒在200—340 nm和800—1200 nm处较为丰富；生物质颗粒主要分布在250—600 nm；富钾颗粒主要分布在200— 600 nm；扬尘颗粒和重金属颗粒主要分布在600—1300 nm之间。

    （3）不同污染阶段颗粒物的化学组分特征差异显著，与清洁期相比，污染期元素碳颗粒和富钾颗粒占比上升最为明显，表明人为燃烧源以及二次颗粒物的生成是造成污染事件发生的主因。与此同时，污染期风速低，湿度较高，有利于污染物的积累和二次生成。

    （4）不同类型颗粒物与硫酸盐和硝酸盐的混合程度高于铵盐。除有机碳与元素碳混合颗粒外，污染时期硝酸盐和硫酸盐与其它类型颗粒的混合比例均高于清洁期，表明颗粒物的老化程度加深。

  • 图 1  EACDP手性固定相的红外光谱图

    Figure 1.  The infrared spectrum of chiral stationary phase EACDP

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    图 2  HLB与SAX固相萃取小柱中 PMA（A）、BMA（B）、MHBMA（C）和DHBMA（D）的4种生物标志物回收率（n=3）

    Figure 2.  The recoveries of PMA（A），BMA（B），MHBMA（C） and DHBMA （D）enantiomers by HLB and SAX cartridges （n=3）

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    图 3  暴露组与对照组的尿液TIC色谱图

    Figure 3.  Urine TIC chromatograms of exposure and control groups

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    图 4  对照组（a,c）与暴露组（b,d）的尿液中MHBMA与DHBMA 的SIM色谱图

    Figure 4.  SIM chromatograms of MHBMA and DHBMA in urine of control group（a,c） and exposure group（b,d）

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    图 5  对照组和暴露组的尿样热图分析

    Figure 5.  Heat map analysis of urine samples in the control and exposure groups

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    图 6  主成分分析图

    Figure 6.  Principal component analysis （PCA） diagram

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    图 7  随机森林识别图

    Figure 7.  Random Forest Identification diagram

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    图 8  苯与甲苯的代谢路径图

    Figure 8.  Metabolic pathways of benzene and toluene

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    表 1  不同组的相应参数表（n=30）

    Table 1.  Corresponding parameter table for different groups （n=30）

    对照组Control group暴露组Exposure group
    行政人员油漆工 *
    年龄Age31.93±8.9331.60±7.61
    性别Gender男1921
    女119
    吸烟Smoke是02
    否3028
    饮酒Drink wine是106
    否2024
    遗传病史Whether there is a history of genetic disease是00
    否3030
    暴露强度/（mg m−3）Exposure intensity苯——
    甲苯—4.94±0.0094
    邻-二甲苯—0.99±0.013
    间-二甲苯—1.44±0.036
    对-二甲苯——
    工作年限/aLength of service8.43±7.057.80±6.90
    　　*与对照组比较，P<0.05.吸烟：指吸烟超过1 d，烟龄超过1 a.饮酒：指饮酒超过1年至少1周1次. — 代表没有检出.　　*Compared with the control group, P<0.05. Smoking: refers to smoking for more than 1 day and smoking for more than 1 year. Drinking: refers to drinking for more than 1 year at least once a week. — means no detection.
    对照组Control group暴露组Exposure group
    行政人员油漆工 *
    年龄Age31.93±8.9331.60±7.61
    性别Gender男1921
    女119
    吸烟Smoke是02
    否3028
    饮酒Drink wine是106
    否2024
    遗传病史Whether there is a history of genetic disease是00
    否3030
    暴露强度/（mg m−3）Exposure intensity苯——
    甲苯—4.94±0.0094
    邻-二甲苯—0.99±0.013
    间-二甲苯—1.44±0.036
    对-二甲苯——
    工作年限/aLength of service8.43±7.057.80±6.90
    　　*与对照组比较，P<0.05.吸烟：指吸烟超过1 d，烟龄超过1 a.饮酒：指饮酒超过1年至少1周1次. — 代表没有检出.　　*Compared with the control group, P<0.05. Smoking: refers to smoking for more than 1 day and smoking for more than 1 year. Drinking: refers to drinking for more than 1 year at least once a week. — means no detection.
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    表 2  PMA, BMA, d2-PMA, MHBMA-1+-2 与 DHBMA的多反应监测优化条件

    Table 2.  MRM optimization conditions for PMA, BMA, d2-PMA, MHBMA-1+-2 and DHBMA

    化合物Compounds母离子Precusor （m/z）子离子Product（m/z）驻留时间/msDwell time解簇电压/eVDP碰撞能量/eVCE
    （1） 苯巯基尿酸 (PMA)*238.03108.9430−16.91−16.99
    （2） 苄巯基尿酸 (BMA)*252.07122.9930−32.15−24.22
    （3） 同位素标记的苯巯基尿酸内标 (d2-PMA)*241.10109.9330−16.84−17.14
    （4） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)*232.03102.9430−19.90−14.14
    （5） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)232.03128.1030−33.14−14.16
    （6） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸） (DHBMA)*250.05120.9530−11.97−18.96
    （7） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸 ）(DHBMA)250.05127.8030−14.00−16.26
    （8） 泛酸 Pantothenate218.01146.1330−25.00−21.00
    （9） 酮戊二酸 Oxoglutarate145.10101.1230−35.31−13.00
    （10） D-苯丙氨酸 D-phenylalanine166.1103.2030−16.93−30.46
    （11） 2-羟基-戊二酸 2-hydroxygluarate147.12128.7430−45.52−17.12
    （12） 焦谷氨酸 Pyroglutamic acid128.0882.1330−23.16−19.15
    　　*代表定量离子. *Represent quantitative ion.
    化合物Compounds母离子Precusor （m/z）子离子Product（m/z）驻留时间/msDwell time解簇电压/eVDP碰撞能量/eVCE
    （1） 苯巯基尿酸 (PMA)*238.03108.9430−16.91−16.99
    （2） 苄巯基尿酸 (BMA)*252.07122.9930−32.15−24.22
    （3） 同位素标记的苯巯基尿酸内标 (d2-PMA)*241.10109.9330−16.84−17.14
    （4） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)*232.03102.9430−19.90−14.14
    （5） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)232.03128.1030−33.14−14.16
    （6） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸） (DHBMA)*250.05120.9530−11.97−18.96
    （7） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸 ）(DHBMA)250.05127.8030−14.00−16.26
    （8） 泛酸 Pantothenate218.01146.1330−25.00−21.00
    （9） 酮戊二酸 Oxoglutarate145.10101.1230−35.31−13.00
    （10） D-苯丙氨酸 D-phenylalanine166.1103.2030−16.93−30.46
    （11） 2-羟基-戊二酸 2-hydroxygluarate147.12128.7430−45.52−17.12
    （12） 焦谷氨酸 Pyroglutamic acid128.0882.1330−23.16−19.15
    　　*代表定量离子. *Represent quantitative ion.
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    表 3  尿液鉴定出的差异性代谢物

    Table 3.  Differential metabolites identified in urine

    序号NO.趋势（暴露组/对照组）Tendency（exposure/control）代谢物Metabolities相关路径Related pathway
    1↑D-苯巯基尿酸D-PMA谷胱甘肽代谢
    2↑D-苄巯基尿酸D-BMA谷胱甘肽代谢
    3—泛酸Pantothenate丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢
    4↓酮戊二酸OxoglutarateD-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢
    5↑D-苯丙氨酸D-phenylalanine丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,柠檬酸循环
    6↑2-羟基-戊二酸2-hydroxy-gluarate柠檬酸循环
    7↑焦谷氨酸Pyroglutamic acidD-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢，谷胱甘肽代谢
    　　注：↑代表上调，↓代表下调，—代表不变. 　　Note：↑represent upward adjustment, ↓represent downward adjustment, and — represent unchanged.
    序号NO.趋势（暴露组/对照组）Tendency（exposure/control）代谢物Metabolities相关路径Related pathway
    1↑D-苯巯基尿酸D-PMA谷胱甘肽代谢
    2↑D-苄巯基尿酸D-BMA谷胱甘肽代谢
    3—泛酸Pantothenate丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢
    4↓酮戊二酸OxoglutarateD-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢
    5↑D-苯丙氨酸D-phenylalanine丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,柠檬酸循环
    6↑2-羟基-戊二酸2-hydroxy-gluarate柠檬酸循环
    7↑焦谷氨酸Pyroglutamic acidD-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢，谷胱甘肽代谢
    　　注：↑代表上调，↓代表下调，—代表不变. 　　Note：↑represent upward adjustment, ↓represent downward adjustment, and — represent unchanged.
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    表 4  代谢路径P值表

    Table 4.  Metabolic pathway P values

    路径名 Pathway NameP−lgP
    D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢 D-Glutamine and D-glutamate metabolism0.0026832.57130
    丁酸代谢 Butanoate metabolism0.0065932.1578
    柠檬酸循环 Citrate cycle （TCA cycle）0.0087062.06020
    谷胱甘肽代谢 Glutathione metabolism0.0120021.92075
    丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 Alanine, aspartate and glutamate metabolism0.0120061.92060
    嘌呤代谢 Purine metabolism0.0259531.58620
    路径名 Pathway NameP−lgP
    D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢 D-Glutamine and D-glutamate metabolism0.0026832.57130
    丁酸代谢 Butanoate metabolism0.0065932.1578
    柠檬酸循环 Citrate cycle （TCA cycle）0.0087062.06020
    谷胱甘肽代谢 Glutathione metabolism0.0120021.92075
    丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 Alanine, aspartate and glutamate metabolism0.0120061.92060
    嘌呤代谢 Purine metabolism0.0259531.58620
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-10-20
  • 录用日期:  2023-02-19
  • 刊出日期:  2023-10-27
李良, 金永久, 金艳红, 杨梅花, 张智. 苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析[J]. 环境化学, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
引用本文: 李良, 金永久, 金艳红, 杨梅花, 张智. 苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析[J]. 环境化学, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
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LI Liang, JIN Yongjiu, JIN Yanhong, YANG Meihua, ZHANG Zhi. Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
Citation: LI Liang, JIN Yongjiu, JIN Yanhong, YANG Meihua, ZHANG Zhi. Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(10): 3327-3340. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022102008
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苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析

    通讯作者: E-mail：565535121@qq.com; 
  • 1. 南昌市绿色新型材料与工业废水处理重点实验室，豫章师范学院，南昌，330013
  • 2. 传染病预防控制国家重点实验室研究基地江西省动物源与媒介生物性传染病重点实验室，南昌市疾病预防控制中心，南昌，330038
  • 收稿日期:  2022-10-20
  • 录用日期:  2023-02-19
  • 网络出版日期:  2023-10-23
基金项目:
江西省教育厅科学技术研究项目重点项目（GJJ203102）, 豫章师范学院科研创新团队建设计划和南昌市科技支撑计划重点项目（洪科字[2019] 258号-18）资助.

摘要: “三苯”具有强的人体血液毒性和致癌作用，是一类重要的环境污染物. 以往常通过代谢组学软件筛查出工作场所中苯及苯系物暴露人群的内源性代谢物与相应的代谢路径，而未考虑机体的立体化学作用对代谢的影响. 基于自制的手性固定相，优化色谱分离与尿样的前处理条件后，借助开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件结合多元统计分析，分析出有显著差异的代谢物和代谢通路的变化. 暴露组检测到5种内源性的代谢物即泛酸、酮戊二酸、D-苯丙氨酸、2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸与2种外源性的代谢物即D-苯巯基尿酸与D-苄巯基尿酸. 6组代谢通路受到显著影响，包括D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环和嘌呤代谢. 结果表明，苯及苯系物暴露人群尿液代谢产物中2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸及D-苯丙氨酸会引起明显的升高，苯巯基尿酸与苄巯基尿酸也可能发生由L-型向D-型的手性转化，这为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定了基础，也为全面评估苯及苯系物暴露人群的健康风险提供了科学依据.

English Abstract

    全文HTML

  • 苯、甲苯、二甲苯等芳烃是重要的工业原料和挥发性溶剂[1-2]，其具有强的血液毒性和致癌作用，均被列入美国EPA 的129 种优先污染物名单[3]. 美国职业苯暴露量为16 mg·m−3[4]，而在发展中国家，职业性苯暴露量比美国还要高1—2个数量级[4-6]. 为此，许多研究人员进行了苯及苯系物暴露人群的代谢组学[7] 研究，并通过代谢组学软件筛选出内源性生物标志物与相应的代谢路径，这对于疾病诊断与监测、生物标志物鉴定和毒性机制探索等都能起到非常重要的作用[8-16]. 如：Sun [17-18]与Campo等[19]近几年开展了对苯及苯系物暴露的代谢组学研究. 已报道的苯及苯系物暴露的代谢组学方法是基于代谢物的非手性总量定性与定量分析，但对代谢产物的手性分析领域并没有涉及到. 代谢产物的手性分析在医学领域有重要的应用，如Kimura等[20]报道了手性氨基酸代谢物用于慢性肾炎诊断的新型的生物标志物监测. L-型氨基酸的异构体即D-型氨基酸越来越多地被认为是新型的生物标志物. 这项研究测试了多种手性氨基酸是否与肾功能、并发症以及慢性肾炎（CKD）的诊断有关并确认了手性氨基酸可作为肾炎疾病中的潜在生物标志物. 而人类机体的组成部分及其代谢产物一般也都具有手性[21-22]. 多糖和核酸中的糖是右旋的D-构型；除某些细菌以外，蛋白质都是由左旋的L-氨基酸组成；在机体的代谢过程中的细胞表面的受体和生物酶，一般也都具有手性. 当它们与环境中污染物相互作用时，通常要经过复杂的手性生物代谢过程[23-24]. 因此，从立体化学的角度研究代谢物的手性和含量变化对于深入评价污染物的药物功能和毒理学具有重要意义[25]. 将代谢组学技术与手性毒理学分析结合在疾病的病理、药理及食品、环境安全等领域的应用文献报道较少[26-33]，在职业卫生领域的研究尚未见报道.

    本研究借助自制的手性固定相，通过代谢组学技术和统计学软件筛查出职业场所苯及苯系物暴露人群尿液中有差异性的靶向手性代谢产物及相应的代谢途径，这对于揭示其体内代谢机理，评价职业场所相关从业人员的职业危害，以及职业卫生管理部门加强行业监管、职业性防护干预等都具有重要的现实意义.

    • 1.   材料与方法（Materials and methods）

      1.1.   仪器与试剂

    • QTRAP4500 LC-MS/MS系统（美国ABSCIEX），使用Analyst®1.6.3 工作站并采用3.0.2版本的MultiQuant定量分析软件，主要用于尿液代谢物定量分析；GC-2010 PLUS 气相色谱仪（日本SHIMADZU，配有FID检测器）主要用于工作场所中“三苯”的定量分析；Vario EL Ⅲ元素分析仪（德国Elementar）；5700傅立叶变换红外光谱仪（美国Nicolet）；AW-60柱填充机（美国Haskel公司）；TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-100E超声波清洗装置（昆山超声仪器有限公司）；MS-3微型涡旋振荡器（德国IKA公司）；HSC-12A氮吹仪（南京科杰分析仪器有限公司）；Milli-Q超纯水制备装置（美国Millipore公司）.

      球形硅胶（粒径5 μm，孔径12 nm，比表面积约为290 m2·g−1）由济南博纳生物技术有限公司提供；HLB和SAX固相萃取柱（美国Waters公司）；FFAP毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）由美国Agilent公司提供；6-对甲苯磺酰化-β-环糊精（纯度 ≥99.5%，山东滨州智源生物科技有限公司）；DL-苯巯基尿酸（简称PMA），DL-苄巯基尿酸（简称BMA）和同位素标记的PMA内标DL-d2-PMA，其纯度均大于99%，购自加拿大CDN公司；N-乙酰基-S-（3，4-二羟基丁基-L-半胱氨酸）（DHBMA），（R,S）-N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸（MHBMA-1）+（R,S）-N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸（MHBMA-2） 1:1，纯度均大于95%，由加拿大Toronto Reasearch Chemicals公司提供；甲醇和乙腈均为色谱纯级（美国Honeywell Burdick＆Jackson）；153种常见的内源性氨基酸、脂肪酸和外源手性标志物等MRM负离子模式参数由美国AB SCIEX公司提供；异氰酸丙基三乙氧基硅烷（纯度 ≥95%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；6-对甲苯磺酰基-β-环糊精（纯度≥98%，武汉欣欣佳丽生物科技有限公司）； 分析纯级别的乙二胺、丙酮、无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等试剂均购自中国上海国药集团；甲酸为质谱纯级别（美国 AnAQUA公司）；实验用水是由Milli-Q装置制备的超纯水（≥18.2 MΩ·cm）；60名非吸烟工人（男40名，女20名，年龄21—53岁, P>0.05）的尿液样本是由景德镇市职业病防治所现场采集的班后尿.

      • 1.2.   乙二胺单衍生化-β-环糊精固定相的制备

    • 手性固定相是参照实验室以前的报道[34-36]并进行了一些改进来制备的. 制备路线简要描述如下：将市售的6-对甲苯磺酰化-β-环糊精（A）用水多次重结晶，80 ℃下真空干燥10 h. 称取3.0 g（2.33 mmol） A于圆底烧瓶中, 慢慢加入30 mL乙二胺温升至80 ℃磁力搅拌反应8 h后减压蒸馏. 冷却至室温,加入丙酮-水溶液（10:1, V/V）, 析出的固体重结晶2—3次,得到产物B. 产物通过ESI质谱来鉴定，[M + H]+ 峰（m/z） 1177.82（理论值1177.88）,与理论值相符，产物为6-乙二胺单衍生化-β-环糊精，单步产率为62%.

      称取1.0 g产物B，慢慢加入30 mL无水DMF使其溶解，在磁力搅拌下于冰浴中加入0.20 mL异氰酸丙基三乙氧基硅烷反应1 h，然后在氮气保护下85 ℃下反应6 h，得到产物C. 直接加入2.0 g实验室以前合成的SBA-15 （Santa Barbara Amorphous 15）升温至110 ℃反应12 h，过滤，然后将固体粗产品分别用DMF、丙酮和甲醇洗涤，用丙酮萃取16 h. 在60 ℃下减压干燥10 h后，得到乙二胺单衍生化-β-环糊精手性固定相（简称EACDP）. EACDP的结构表征是通过元素分析仪和红外光谱仪获得的. 最后在恒定压力下将EACDP的匀浆填充不锈钢柱（4.6 mmI.D.×150 mm），并用溶剂依次冲洗此色谱柱.

      • 1.3.   人群研究

    • 以江西景德镇某汽车制造厂喷漆车间的工人及行政管理人员为研究对象，车间苯及苯系物暴露水平在 8 h轮班期间进行监测. 健康的没有职业苯暴露的受试者是办公室行政管理人员并与苯及苯系物暴露人群按照年龄、吸烟史和饮酒史（表1）进行了匹配.

      表1中所有信息均来自问卷调查，包括人口学特征、工作史、吸烟史和酒精史、医疗病史、理化因素暴露、尿液疾病的用药史和家族病史等. 根据调查问卷，排除标准如下：（1）尿液病史，如尿毒症、尿道感染、前列腺炎等；（2） 其他已知的尿液毒性因素（如氯霉素使用和电离辐射）； （3） 长期或目前用药或感染史. 本研究中涉及人类参与者的所有程序均符合世界医学协会“涉及人类受试者的医学研究伦理原则”中提到的伦理标准和人权准则. 该项目已经通过豫章师范学院审批，所有项目都给出了书面知情同意书，并在整个尿样采集等过程中都符合规范.

      • 1.4.   样品提取与净化

    • 使用带有盖子的PVC塑料瓶收集班后尿（每份尿样约50 mL）. 同时用6 mol·L−1盐酸酸化样品，尿液与酸的体积比为100:1（V/V），并于-20 ℃冷冻保存. 使用时将冷冻的人尿样品在室温下解冻并在使用前用水稀释10倍. 根据前人及本实验室报道的一些方法[35, 37-39]稍加改进进行样品的提取与净化.

      将250 μL同位素内标D,L-d2-PMA储备液（2.0 μg·mL−1）加入到50 mL稀释的尿样中，混匀15 min. 将SAX SPE小柱分别用5.0 mL甲醇，5.0 mL 水，5.0 mL 1%的无水乙酸活化，然后向SAX小柱加入1.0 mL尿样. 接着萃取柱分别加入3.0 mL甲醇，3.0 mL 5mmol·L−1磷酸缓冲液（pH=7.0）洗涤，空气蒸干5 min，然后分别用3.0 mL 乙腈，3.0 mL 5%氨化乙酸乙酯洗脱. 用氮气将洗脱液缓慢吹至近干，并用0.1%甲酸-甲醇（50:50，V/V）定容至1.0 mL. 过滤后，进10 μL样液并通过LC-MS/MS进行分析.

      • 1.5.   仪器分析

    • 将从工作场所收集“三苯”用的0.2 g活性炭放入溶剂解吸瓶中，然后加入1.0 mL二硫化碳解吸剂，最后将1.0 μL解吸液注入GC-2010 PLUS气相色谱仪. 气相色谱仪的氮气流速为40 mL·min−1，空气流速为400 mL·min−1，氢气流速为40 mL·min−1. 检测器为 FID 检测器，进样量为 1.0 μL，柱温为70 ℃. 进样口温度为150 ℃，检测器温度为 200 ℃，色谱柱为FFAP毛细管柱. 测量峰面积以计算苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯的相应浓度.

      尿样通过ABSCIEX的LC-MS/MS以多反应监测（MRM）模式来检测4种生物标志物和内标（I.S.）的MS信号完成定量分析工作，5种内源性代谢物完成定性鉴定工作，离子对信息如表2所示，色谱柱为自制的EACDP.

      色谱条件：25 ℃柱温，0.5 mL·min−1流速等度洗脱，流动相的构成为 5.25 mmol·L−1甲酸铵（pH=2.70）（A）与甲醇（B），V（A）/V（B）=10/90, 进样量为10 μL.

      质谱条件：电喷雾离子源，负离子模式，雾化气的压力均为50 psi，气帘气的压力为35 psi，离子源温度为500 ℃，碰撞气为中等压力，电离电压为−4.5 kV.

      • 1.6.   统计学方法分析

    • 本实验首先用液质分析得到MRM数据，然后用MultiQuant软件（3.0.2版本）积分得到153种靶向代谢物与4种外源性生物标志物的峰面积数据，接着导出存为CSV文件格式，将Sample ID和Sample type行删除，在第二行增加sample group行并在相应的组下面进行标识出control 与expose.

      通过开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件进行数据分析处理来找出差异性的化合物和差异通路，其网址为https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml，接着选择statistical Analysis[one factor]进入界面后可以进行t值分析，PCA分析，PLS-DA分析，Heatmap，Correlation Heatmaps等找出有显著差异的内源性代谢物和外源性标志物进行统计学分析.

      本文进行代谢路径分析是通过进入MetaboAnalyst 5.0 软件后选择The Pathway Analysis界面找出有显著差异的代谢路径.

    2.   结果与讨论 （Results and discussion）

      2.1.   乙二胺-β-环糊精固定相的结构表征

    • 具有脲键的环糊精三乙氧硅烷与SBA-15硅胶反应键合在硅胶上形成了衍生化环糊精固定相. 通过红外光谱、元素分析对新固定相进行了相应的结构表征.

      红外光谱如图1所示. 环糊精配体和残留的硅醇羟基的O—H吸收峰及胺基的N—H伸缩峰出现在约3474 cm−1处；有机配体在2926 cm−1和2852 cm−1处出现C—H伸缩振动峰；1656 cm−1为氨基甲酸酯的C=O伸缩振动峰；胺基的N—H面内弯曲峰位于1552 cm−1；环糊精配体和硅胶基质的C—O和Si—O—Si吸收峰是出现在1252、1191、1126、1052 cm−1处的重叠峰.

      元素分析结果如下：C 3.67%，H 6.35%，N 0.23%. 根据碳含量计算，乙二胺-β-环糊精固定相EACDP上配体的键合量为0.102 μmol·m−2，这表明有一层有机配体键合在硅胶上.

      • 2.2.   优化样品前处理

    • 在已发表的文献中检测三苯（BETX）和1.3-丁二烯（BD）暴露的尿液代谢产物，应用固相萃取（SPE）方法更为方便有效[35, 40]. 在本研究中，评价了两种类型的SPE小柱，即OASIS®HLB和SAX小柱（6 cc/200 mg，美国Waters 公司）. 目前，苯巯基尿酸（PMA）和苄巯基尿酸（BMA） [41-42]被认定为最可靠的苯系物职业危害经尿液排泄的生物标志物，是苯和甲苯在人体中具有较强特异性和较高敏感性的代谢产物. BD是一种大量生产的石化产品，也是一种致癌性空气污染物，其主要环境来源是生物质燃烧产生的废气以及汽车尾气，尤其是香烟烟雾. 丁二烯是人体致癌风险最高的环境污染物之一[43]，其致癌作用的靶器官是淋巴-造血系统. 然而，丁二烯并不是直接致癌物，它的致癌作用源于其代谢产物[44]，如：DHBMA与MHBMA等，而且研究发现MHBMA 被证明在监测近期的丁二烯暴露方面比 DHBMA 更敏感[45]. 为此通过分离和检测香烟中1,3-丁二烯成分所引起人体尿液代谢产物中DHBMA和MHBMA这两种手性生物标志物的含量变化及可能引起的手性转化来较为精准地预估非吸烟人群，这为后续的苯及苯系物暴露人群尿液的代谢组学筛查垫定了基础. 故尿液的前处理优化主要是针对PMA，BMA，MHBMA与DHBMA这四种代谢产物展开的.

      SPE小柱的净化过程是使用不同的活化液和洗脱剂，比较OASIS®HLB和SAX固相萃取小柱（6 cc/200 mg，美国）的萃取效果（回收率比较见图2）[40]. 使用5.0 mL甲醇，5.0 mL 水和5.0 mL 1%的无水乙酸依次活化固相萃取柱. 加入1.0 mL尿样上样后，用3.0 mL甲醇，3.0 mL 5 mmol·L−1 磷酸缓冲液（pH=7.0）洗涤. 为了确认乙腈是否能较为有效洗脱出PMA、BMA、MHBMA与DHBMA，先将这两种固相萃取小柱分别用3.0 mL乙腈洗脱，然后用氮气吹干，加入1.0 mL甲醇溶液过0.45 µm有机相滤膜后进LC-MS/MS分析. 结果发现HLB小柱能将这4种物质洗脱出来，但对DHBMA与MHBMA的回收率却较低；SAX小柱中的洗脱产物中只有MHBMA与DHBMA，PMA与BMA却基本没有检出. 分析原因可能是PMA与BMA的酸性较MHBMA与DHBMA酸性强，故在SAX小柱中有较好的保留，用乙腈不能将其洗脱出来；而HLB小柱却是依据其极性大小进行吸附，MHBMA与DHBMA较PMA与BMA的极性小，故可能在前面的净化过程中已经被甲醇洗脱出来，这可能是造成MHBMA与DHBMA回收率不高的原因. 继续用3.0 mL 5% 氨化甲醇洗脱SAX小柱，合并乙腈洗脱液然后用氮气吹干，加入3.0 mL甲醇溶液过0.45 µm有机相滤膜后进LC-MS/MS分析，结果发现4种物质都能检出.

      选择OASIS® SAX固相萃取小柱是由于其对这4种生物标志物较高的回收率、稳定性及较宽的pH适用范围. 在洗脱步骤中，发现PMA、BMA、MHBMA与DHBMA不能被3.0 mL乙腈完全洗脱，而后续加入3.0 mL 5% 氨化甲醇洗脱则能实现. 因此，选择乙腈与氨化甲醇可作为本实验中的最佳分步洗脱溶剂.

      • 2.3.   人群特征分析

    • 本研究共招募了60名参与者，包括30个暴露组人群和30个健康对照组人群. 暴露组与对照组平均年龄分别为（31.93±8.93）岁和（31.60±7.61）岁，男女比例为2:1（参见表1）. 暴露组和对照组的性别、年龄、吸烟和饮酒的分布没有观察到统计学差异（P > 0.05）.

      苯及苯系物暴露强度测定结果分别为（4.94±0.0094）mg·m−3（甲苯）、（0.99±0.013）mg·m−3（邻二甲苯）、（1.44±0.036）mg·m−3（间二甲苯），平均暴露持续时间为（7.80±6.90）a. 暴露组和对照组的特点总结在表1中.

      • 2.4.   暴露组的尿液代谢组学分析

    • 从m/z100到1000的负离子模式下的全扫描用于数据收集. LC-MS总离子流来自暴露组与对照组的尿液TIC色谱图，如图3所示. 观察到暴露组与对照组之间存在显著性差异的保留时间是在10—12 min和18—22 min，分别对应上述4种标志物中为DHBMA与MHBMA，谱图如图4所示）.

      基于已知的尿样代谢物生成热图（图5），每行代表特定的代谢物的离子强度，每列代表30个对照组与30个暴露组工作场所人群的个体代谢特征. 红色块代表区域代表健康对照组，对应的每条线代表每个对照组工人；图中的绿色块代表区域代表暴露组，对应的每条线代表每个暴露组工人. 代谢水平的折叠变化是色标：黄色，上调；蓝色，下调；绿色，无显著性变化（见表3所示）. 这揭示了暴露组和对照组之间的差异. 热图表明暴露组主要由于其代谢变化的内在差异与对照组能够分开聚集.

      • 2.5.   PCA分析

    • 为了揭示暴露组的内源性与外源性的代谢变化，主成分分析（PCA）被选为无监督法. 如图6 所示，PCA 得分图显示来自不同样本的数据组倾向于聚集在一起，并且暴露组与健康对照组能够分开. 该分析表现出令人满意的性能，因为超60% 的变异性是通过使用5个组件来解释的.

      然后确定了哪些代谢物是造成上述差异的原因. 使用学生t检验法测量了暴露组和健康对照组之间具有相对较低的严格性（P < 0.05，倍数变化≥2）的显著差异的不同分子特征的数量. 结果表明，暴露组尿样与对照组尿样相比有50种代谢物发生显著变化. 通过随机森林识别（图7所示），这些特征在排列时按分类准确度的平均下降进行排序，最终识别出7种生物标志物（表3），有5种内源性的与2种外源性的. 即泛酸（pantothenate）、酮戊二酸（oxoglutarate）、D-苯丙氨酸（D-phenylalanine）、2-羟基-戊二酸（2-hydroxy-gluarate）、焦谷氨酸（pyroglutamic acid）、D-苯巯基尿酸（D-PMA）、D-苄巯基尿酸（D-BMA）. D-PMA在对照组中均为阴性，暴露组在0—98.60 µg·L−1间变化；D-BMA在对照组中均为阴性，暴露组在0—11.04 µg·L−1间变化. 其他代谢物可通过峰面积变化得出含量变化. 人体的氨基酸一般为L型的，并且苯与苯系物暴露后生成的巯基尿酸生物标志物如PMA与BMA，正常的人群也应为L型的，这几种D型代谢物的出现可能意味着某种疾病的发生，应引起高度的重视[35].

      • 2.6.   代谢通路分析

    • 可利用开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件进行数据分析和处理来找出差异的代谢通路，其网址为https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml. 统计学分析中选择Pathway Analysis进入界面后输入一列代谢物化合物列表名，得出化合物相应的KEGG代谢物通路（如表4所示），由于给定的化合物列表均为内源性化合物，而外源性化合物PMA与BMA的代谢通路只能通过文献报道[41-42]的方法进行分析. 内源性化合物有6组代谢通路有显著性差异（D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（D-glutamine and D-glutamate metabolism）、谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism）、丁酸代谢（butanoate metabolism）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）、柠檬酸循环（citrate cycle （TCA cycle））、嘌呤代谢（purine metabolism））.

      D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢会生成L-谷氨酰胺与D-谷氨酰胺,而代谢过程形成的酮戊二酸（2-oxoglutarate）参与到柠檬酸循环中. 谷氨酰胺（glutamine）是肌肉和血液中数量最多的氨基酸. 人体不能自己生产必需氨基酸，只能通过饮食摄取，而谷氨酰胺却是一种有条件必需氨基酸. 这意味着健康和无压力的身体条件能自己产生足够的谷氨酰胺，但在人患病或遭受创伤时，对谷氨酰胺的需求量会超过供应量，就使这种氨基酸变成必需. 故在人体在有苯或苯系物暴露环境中，可能会通过谷氨酸代谢生成酮戊二酸（2-oxoglutarate）. 同时代谢形成的酮戊二酸（2-oxoglutarate）也参与丁酸代谢（butanoate metabolism）过程中，从而生成2-羟基-戊二酸（2-hydroxy-gluarate）. 杨臻峥[46] 曾报道了人体代谢产物2-羟基戊二酸（2-HG）可诱发神经胶质瘤和白血病, 尿液中2-羟基-戊二酸代谢产物的升高也能在一定程度上表明由于苯及苯系物暴露导致的血液毒性.

      谷胱甘肽（GSH）是一种多功能三肽，它既是磷酸甘油醛脱氢酶的辅基，又是乙二醛酶和丙糖脱氢如酶，所以是细胞内重要的调节代谢物. 氢化酶的辅酶参与体内的三羧酸循环（TCA循环）和葡萄糖代谢，可以激活多种酶，巯基（SH）酶-辅酶等，从而促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢. GSH分子以活性巯基（—SH）为特征，这是最重要的官能团. 它可以参与体内多种重要的生化反应，保护体内的蛋白质和一些重要酶的巯基不被氧化和失活，保证能量代谢和细胞利用. 同时通过巯基与体内自由基结合，可直接将自由基还原为酸性物质如巯基尿酸，可以加速自由基的排泄，以抵抗对重要器官的损害. 参考相关文献[40-41, 47]，外源性标志物PMA与BMA的代谢路径如图8 所示. 谷胱甘肽多为L型的，但是代谢过程中由于苯及苯系物毒性较大，可能会破坏谷胱甘肽-SH的活性进而造成构型的转化（如D-PMA与D-BMA的生成），从而影响人体的身体健康，这可为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定基础.

      在谷胱甘肽循环中，焦谷氨酸也是一种重要的代谢物. 在某些多肽中谷氨酸的氨基与5-羧基脱水而成焦谷氨酸, 在一些活性肽类的N端的谷氨酸，其侧链羧基与N端的氨基脱水后形成的环化衍生物. 它也可通过5-氧代脯氨酸酶转化为谷氨酸. GSH循环是一种非酶促抗氧化防御，可防止在体内形成氧化剂并修复氧化损伤[48]. 文献报道在随访期间发现患有咽喉癌的吸烟者血清焦谷氨酸（GSH 代谢）水平升高[49]. 与上述文献报道的结果相一致，本研究在苯及苯系物暴露人群尿液中发现了焦谷氨酸水平的升高.

      丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）生成L-丙氨酸参与到D-氨基酸的代谢（D-amino acid metabolism）中可以形成诸如D-苯丙氨酸（D-phenylalanine），而丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）形成L-谷氨酸再通过一系列代谢路径形成R-pantothenate（泛酸）. Sun等[17]进行了苯暴露C3H/He小鼠骨髓细胞和血浆内源性代谢物变化的研究，在他们的研究中，发现可能是由于线粒体的功能障碍从而导致了骨髓细胞中苯丙氨酸水平的显著升高，这就需要苯丙氨酸、蛋白质、黑色素和酪氨酸的合成. 这两种氨基酸能够为糖异生和分解代谢为三羧酸循环（TCA）循环提供中间体. 本文的研究中也同样通过TCA循环出现了D-苯丙氨酸的升高，这可能是苯及苯系物暴露对细胞的毒性与TCA循环有关. 尿液中苯丙氨酸水平升高的相关的通路可能是苯及苯系物暴露导致血液毒性的重要机制.

      嘌呤代谢（purine metabolism）会生成环状磷酸腺苷cAMP（cyclic adenosine monophosphate）. 环磷酸腺苷（cAMP）是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”. 此外，对核酸、蛋白质、糖、脂肪代谢的合成及代谢调节等方面起着重要的作用.

    3.   结论（Conclusion）

    • 本研究基于自制的手性固定相EACDP来优化色谱分离与人尿的样品前处理条件，借助开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件结合多元统计分析，结果显示苯及苯系物暴露人群尿液中检测到5种内源性的代谢物与2种外源性的代谢物. 6组代谢通路受到显著影响，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环和嘌呤代谢. 2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸及D-苯丙氨酸会引起明显的升高，苯巯基尿酸与苄巯基尿酸也可能发生由L-型向D-型的手性转化，这为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定了基础，也为全面评估苯及苯系物暴露人群的健康风险提供了科学依据. 在后续研究中将进一步拓展代谢产物的研究范围，由靶向代谢物转向全面的非靶向代谢物，将具有显著性差异的代谢物进行动物学实验或建立代谢模型以进一步确认其危害性.

    参考文献 (49)

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