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苯、甲苯、二甲苯等芳烃是重要的工业原料和挥发性溶剂[1-2]，其具有强的血液毒性和致癌作用，均被列入美国EPA 的129 种优先污染物名单[3]. 美国职业苯暴露量为16 mg·m−3[4]，而在发展中国家，职业性苯暴露量比美国还要高1—2个数量级[4-6]. 为此，许多研究人员进行了苯及苯系物暴露人群的代谢组学[7] 研究，并通过代谢组学软件筛选出内源性生物标志物与相应的代谢路径，这对于疾病诊断与监测、生物标志物鉴定和毒性机制探索等都能起到非常重要的作用[8-16]. 如：Sun [17-18]与Campo等[19]近几年开展了对苯及苯系物暴露的代谢组学研究. 已报道的苯及苯系物暴露的代谢组学方法是基于代谢物的非手性总量定性与定量分析，但对代谢产物的手性分析领域并没有涉及到. 代谢产物的手性分析在医学领域有重要的应用，如Kimura等[20]报道了手性氨基酸代谢物用于慢性肾炎诊断的新型的生物标志物监测. L-型氨基酸的异构体即D-型氨基酸越来越多地被认为是新型的生物标志物. 这项研究测试了多种手性氨基酸是否与肾功能、并发症以及慢性肾炎（CKD）的诊断有关并确认了手性氨基酸可作为肾炎疾病中的潜在生物标志物. 而人类机体的组成部分及其代谢产物一般也都具有手性[21-22]. 多糖和核酸中的糖是右旋的D-构型；除某些细菌以外，蛋白质都是由左旋的L-氨基酸组成；在机体的代谢过程中的细胞表面的受体和生物酶，一般也都具有手性. 当它们与环境中污染物相互作用时，通常要经过复杂的手性生物代谢过程[23-24]. 因此，从立体化学的角度研究代谢物的手性和含量变化对于深入评价污染物的药物功能和毒理学具有重要意义[25]. 将代谢组学技术与手性毒理学分析结合在疾病的病理、药理及食品、环境安全等领域的应用文献报道较少[26-33]，在职业卫生领域的研究尚未见报道.
本研究借助自制的手性固定相，通过代谢组学技术和统计学软件筛查出职业场所苯及苯系物暴露人群尿液中有差异性的靶向手性代谢产物及相应的代谢途径，这对于揭示其体内代谢机理，评价职业场所相关从业人员的职业危害，以及职业卫生管理部门加强行业监管、职业性防护干预等都具有重要的现实意义.
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QTRAP4500 LC-MS/MS系统（美国ABSCIEX），使用Analyst®1.6.3 工作站并采用3.0.2版本的MultiQuant定量分析软件，主要用于尿液代谢物定量分析；GC-2010 PLUS 气相色谱仪（日本SHIMADZU，配有FID检测器）主要用于工作场所中“三苯”的定量分析；Vario EL Ⅲ元素分析仪（德国Elementar）；5700傅立叶变换红外光谱仪（美国Nicolet）；AW-60柱填充机（美国Haskel公司）；TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-100E超声波清洗装置（昆山超声仪器有限公司）；MS-3微型涡旋振荡器（德国IKA公司）；HSC-12A氮吹仪（南京科杰分析仪器有限公司）；Milli-Q超纯水制备装置（美国Millipore公司）.
球形硅胶（粒径5 μm，孔径12 nm，比表面积约为290 m2·g−1）由济南博纳生物技术有限公司提供；HLB和SAX固相萃取柱（美国Waters公司）；FFAP毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）由美国Agilent公司提供；6-对甲苯磺酰化-β-环糊精（纯度 ≥99.5%，山东滨州智源生物科技有限公司）；DL-苯巯基尿酸（简称PMA），DL-苄巯基尿酸（简称BMA）和同位素标记的PMA内标DL-d2-PMA，其纯度均大于99%，购自加拿大CDN公司；N-乙酰基-S-（3，4-二羟基丁基-L-半胱氨酸）（DHBMA），（R,S）-N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸（MHBMA-1）+（R,S）-N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸（MHBMA-2） 1:1，纯度均大于95%，由加拿大Toronto Reasearch Chemicals公司提供；甲醇和乙腈均为色谱纯级（美国Honeywell Burdick＆Jackson）；153种常见的内源性氨基酸、脂肪酸和外源手性标志物等MRM负离子模式参数由美国AB SCIEX公司提供；异氰酸丙基三乙氧基硅烷（纯度 ≥95%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；6-对甲苯磺酰基-β-环糊精（纯度≥98%，武汉欣欣佳丽生物科技有限公司）； 分析纯级别的乙二胺、丙酮、无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等试剂均购自中国上海国药集团；甲酸为质谱纯级别（美国 AnAQUA公司）；实验用水是由Milli-Q装置制备的超纯水（≥18.2 MΩ·cm）；60名非吸烟工人（男40名，女20名，年龄21—53岁, P>0.05）的尿液样本是由景德镇市职业病防治所现场采集的班后尿.
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手性固定相是参照实验室以前的报道[34-36]并进行了一些改进来制备的. 制备路线简要描述如下：将市售的6-对甲苯磺酰化-β-环糊精（A）用水多次重结晶，80 ℃下真空干燥10 h. 称取3.0 g（2.33 mmol） A于圆底烧瓶中, 慢慢加入30 mL乙二胺温升至80 ℃磁力搅拌反应8 h后减压蒸馏. 冷却至室温,加入丙酮-水溶液（10:1, V/V）, 析出的固体重结晶2—3次,得到产物B. 产物通过ESI质谱来鉴定，[M + H]+ 峰（m/z） 1177.82（理论值1177.88）,与理论值相符，产物为6-乙二胺单衍生化-β-环糊精，单步产率为62%.
称取1.0 g产物B，慢慢加入30 mL无水DMF使其溶解，在磁力搅拌下于冰浴中加入0.20 mL异氰酸丙基三乙氧基硅烷反应1 h，然后在氮气保护下85 ℃下反应6 h，得到产物C. 直接加入2.0 g实验室以前合成的SBA-15 （Santa Barbara Amorphous 15）升温至110 ℃反应12 h，过滤，然后将固体粗产品分别用DMF、丙酮和甲醇洗涤，用丙酮萃取16 h. 在60 ℃下减压干燥10 h后，得到乙二胺单衍生化-β-环糊精手性固定相（简称EACDP）. EACDP的结构表征是通过元素分析仪和红外光谱仪获得的. 最后在恒定压力下将EACDP的匀浆填充不锈钢柱（4.6 mmI.D.×150 mm），并用溶剂依次冲洗此色谱柱.
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以江西景德镇某汽车制造厂喷漆车间的工人及行政管理人员为研究对象，车间苯及苯系物暴露水平在 8 h轮班期间进行监测. 健康的没有职业苯暴露的受试者是办公室行政管理人员并与苯及苯系物暴露人群按照年龄、吸烟史和饮酒史（表1）进行了匹配.
表1中所有信息均来自问卷调查，包括人口学特征、工作史、吸烟史和酒精史、医疗病史、理化因素暴露、尿液疾病的用药史和家族病史等. 根据调查问卷，排除标准如下：（1）尿液病史，如尿毒症、尿道感染、前列腺炎等；（2） 其他已知的尿液毒性因素（如氯霉素使用和电离辐射）； （3） 长期或目前用药或感染史. 本研究中涉及人类参与者的所有程序均符合世界医学协会“涉及人类受试者的医学研究伦理原则”中提到的伦理标准和人权准则. 该项目已经通过豫章师范学院审批，所有项目都给出了书面知情同意书，并在整个尿样采集等过程中都符合规范.
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使用带有盖子的PVC塑料瓶收集班后尿（每份尿样约50 mL）. 同时用6 mol·L−1盐酸酸化样品，尿液与酸的体积比为100:1（V/V），并于-20 ℃冷冻保存. 使用时将冷冻的人尿样品在室温下解冻并在使用前用水稀释10倍. 根据前人及本实验室报道的一些方法[35, 37-39]稍加改进进行样品的提取与净化.
将250 μL同位素内标D,L-d2-PMA储备液（2.0 μg·mL−1）加入到50 mL稀释的尿样中，混匀15 min. 将SAX SPE小柱分别用5.0 mL甲醇，5.0 mL 水，5.0 mL 1%的无水乙酸活化，然后向SAX小柱加入1.0 mL尿样. 接着萃取柱分别加入3.0 mL甲醇，3.0 mL 5mmol·L−1磷酸缓冲液（pH=7.0）洗涤，空气蒸干5 min，然后分别用3.0 mL 乙腈，3.0 mL 5%氨化乙酸乙酯洗脱. 用氮气将洗脱液缓慢吹至近干，并用0.1%甲酸-甲醇（50:50，V/V）定容至1.0 mL. 过滤后，进10 μL样液并通过LC-MS/MS进行分析.
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将从工作场所收集“三苯”用的0.2 g活性炭放入溶剂解吸瓶中，然后加入1.0 mL二硫化碳解吸剂，最后将1.0 μL解吸液注入GC-2010 PLUS气相色谱仪. 气相色谱仪的氮气流速为40 mL·min−1，空气流速为400 mL·min−1，氢气流速为40 mL·min−1. 检测器为 FID 检测器，进样量为 1.0 μL，柱温为70 ℃. 进样口温度为150 ℃，检测器温度为 200 ℃，色谱柱为FFAP毛细管柱. 测量峰面积以计算苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯的相应浓度.
尿样通过ABSCIEX的LC-MS/MS以多反应监测（MRM）模式来检测4种生物标志物和内标（I.S.）的MS信号完成定量分析工作，5种内源性代谢物完成定性鉴定工作，离子对信息如表2所示，色谱柱为自制的EACDP.
色谱条件：25 ℃柱温，0.5 mL·min−1流速等度洗脱，流动相的构成为 5.25 mmol·L−1甲酸铵（pH=2.70）（A）与甲醇（B），V（A）/V（B）=10/90, 进样量为10 μL.
质谱条件：电喷雾离子源，负离子模式，雾化气的压力均为50 psi，气帘气的压力为35 psi，离子源温度为500 ℃，碰撞气为中等压力，电离电压为−4.5 kV.
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本实验首先用液质分析得到MRM数据，然后用MultiQuant软件（3.0.2版本）积分得到153种靶向代谢物与4种外源性生物标志物的峰面积数据，接着导出存为CSV文件格式，将Sample ID和Sample type行删除，在第二行增加sample group行并在相应的组下面进行标识出control 与expose.
通过开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件进行数据分析处理来找出差异性的化合物和差异通路，其网址为https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml，接着选择statistical Analysis[one factor]进入界面后可以进行t值分析，PCA分析，PLS-DA分析，Heatmap，Correlation Heatmaps等找出有显著差异的内源性代谢物和外源性标志物进行统计学分析.
本文进行代谢路径分析是通过进入MetaboAnalyst 5.0 软件后选择The Pathway Analysis界面找出有显著差异的代谢路径.
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具有脲键的环糊精三乙氧硅烷与SBA-15硅胶反应键合在硅胶上形成了衍生化环糊精固定相. 通过红外光谱、元素分析对新固定相进行了相应的结构表征.
红外光谱如图1所示. 环糊精配体和残留的硅醇羟基的O—H吸收峰及胺基的N—H伸缩峰出现在约3474 cm−1处；有机配体在2926 cm−1和2852 cm−1处出现C—H伸缩振动峰；1656 cm−1为氨基甲酸酯的C=O伸缩振动峰；胺基的N—H面内弯曲峰位于1552 cm−1；环糊精配体和硅胶基质的C—O和Si—O—Si吸收峰是出现在1252、1191、1126、1052 cm−1处的重叠峰.
元素分析结果如下：C 3.67%，H 6.35%，N 0.23%. 根据碳含量计算，乙二胺-β-环糊精固定相EACDP上配体的键合量为0.102 μmol·m−2，这表明有一层有机配体键合在硅胶上.
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在已发表的文献中检测三苯（BETX）和1.3-丁二烯（BD）暴露的尿液代谢产物，应用固相萃取（SPE）方法更为方便有效[35, 40]. 在本研究中，评价了两种类型的SPE小柱，即OASIS®HLB和SAX小柱（6 cc/200 mg，美国Waters 公司）. 目前，苯巯基尿酸（PMA）和苄巯基尿酸（BMA） [41-42]被认定为最可靠的苯系物职业危害经尿液排泄的生物标志物，是苯和甲苯在人体中具有较强特异性和较高敏感性的代谢产物. BD是一种大量生产的石化产品，也是一种致癌性空气污染物，其主要环境来源是生物质燃烧产生的废气以及汽车尾气，尤其是香烟烟雾. 丁二烯是人体致癌风险最高的环境污染物之一[43]，其致癌作用的靶器官是淋巴-造血系统. 然而，丁二烯并不是直接致癌物，它的致癌作用源于其代谢产物[44]，如：DHBMA与MHBMA等，而且研究发现MHBMA 被证明在监测近期的丁二烯暴露方面比 DHBMA 更敏感[45]. 为此通过分离和检测香烟中1,3-丁二烯成分所引起人体尿液代谢产物中DHBMA和MHBMA这两种手性生物标志物的含量变化及可能引起的手性转化来较为精准地预估非吸烟人群，这为后续的苯及苯系物暴露人群尿液的代谢组学筛查垫定了基础. 故尿液的前处理优化主要是针对PMA，BMA，MHBMA与DHBMA这四种代谢产物展开的.
SPE小柱的净化过程是使用不同的活化液和洗脱剂，比较OASIS®HLB和SAX固相萃取小柱（6 cc/200 mg，美国）的萃取效果（回收率比较见图2）[40]. 使用5.0 mL甲醇，5.0 mL 水和5.0 mL 1%的无水乙酸依次活化固相萃取柱. 加入1.0 mL尿样上样后，用3.0 mL甲醇，3.0 mL 5 mmol·L−1 磷酸缓冲液（pH=7.0）洗涤. 为了确认乙腈是否能较为有效洗脱出PMA、BMA、MHBMA与DHBMA，先将这两种固相萃取小柱分别用3.0 mL乙腈洗脱，然后用氮气吹干，加入1.0 mL甲醇溶液过0.45 µm有机相滤膜后进LC-MS/MS分析. 结果发现HLB小柱能将这4种物质洗脱出来，但对DHBMA与MHBMA的回收率却较低；SAX小柱中的洗脱产物中只有MHBMA与DHBMA，PMA与BMA却基本没有检出. 分析原因可能是PMA与BMA的酸性较MHBMA与DHBMA酸性强，故在SAX小柱中有较好的保留，用乙腈不能将其洗脱出来；而HLB小柱却是依据其极性大小进行吸附，MHBMA与DHBMA较PMA与BMA的极性小，故可能在前面的净化过程中已经被甲醇洗脱出来，这可能是造成MHBMA与DHBMA回收率不高的原因. 继续用3.0 mL 5% 氨化甲醇洗脱SAX小柱，合并乙腈洗脱液然后用氮气吹干，加入3.0 mL甲醇溶液过0.45 µm有机相滤膜后进LC-MS/MS分析，结果发现4种物质都能检出.
选择OASIS® SAX固相萃取小柱是由于其对这4种生物标志物较高的回收率、稳定性及较宽的pH适用范围. 在洗脱步骤中，发现PMA、BMA、MHBMA与DHBMA不能被3.0 mL乙腈完全洗脱，而后续加入3.0 mL 5% 氨化甲醇洗脱则能实现. 因此，选择乙腈与氨化甲醇可作为本实验中的最佳分步洗脱溶剂.
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本研究共招募了60名参与者，包括30个暴露组人群和30个健康对照组人群. 暴露组与对照组平均年龄分别为（31.93±8.93）岁和（31.60±7.61）岁，男女比例为2:1（参见表1）. 暴露组和对照组的性别、年龄、吸烟和饮酒的分布没有观察到统计学差异（P > 0.05）.
苯及苯系物暴露强度测定结果分别为（4.94±0.0094）mg·m−3（甲苯）、（0.99±0.013）mg·m−3（邻二甲苯）、（1.44±0.036）mg·m−3（间二甲苯），平均暴露持续时间为（7.80±6.90）a. 暴露组和对照组的特点总结在表1中.
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从m/z100到1000的负离子模式下的全扫描用于数据收集. LC-MS总离子流来自暴露组与对照组的尿液TIC色谱图，如图3所示. 观察到暴露组与对照组之间存在显著性差异的保留时间是在10—12 min和18—22 min，分别对应上述4种标志物中为DHBMA与MHBMA，谱图如图4所示）.
基于已知的尿样代谢物生成热图（图5），每行代表特定的代谢物的离子强度，每列代表30个对照组与30个暴露组工作场所人群的个体代谢特征. 红色块代表区域代表健康对照组，对应的每条线代表每个对照组工人；图中的绿色块代表区域代表暴露组，对应的每条线代表每个暴露组工人. 代谢水平的折叠变化是色标：黄色，上调；蓝色，下调；绿色，无显著性变化（见表3所示）. 这揭示了暴露组和对照组之间的差异. 热图表明暴露组主要由于其代谢变化的内在差异与对照组能够分开聚集.
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为了揭示暴露组的内源性与外源性的代谢变化，主成分分析（PCA）被选为无监督法. 如图6 所示，PCA 得分图显示来自不同样本的数据组倾向于聚集在一起，并且暴露组与健康对照组能够分开. 该分析表现出令人满意的性能，因为超60% 的变异性是通过使用5个组件来解释的.
然后确定了哪些代谢物是造成上述差异的原因. 使用学生t检验法测量了暴露组和健康对照组之间具有相对较低的严格性（P < 0.05，倍数变化≥2）的显著差异的不同分子特征的数量. 结果表明，暴露组尿样与对照组尿样相比有50种代谢物发生显著变化. 通过随机森林识别（图7所示），这些特征在排列时按分类准确度的平均下降进行排序，最终识别出7种生物标志物（表3），有5种内源性的与2种外源性的. 即泛酸（pantothenate）、酮戊二酸（oxoglutarate）、D-苯丙氨酸（D-phenylalanine）、2-羟基-戊二酸（2-hydroxy-gluarate）、焦谷氨酸（pyroglutamic acid）、D-苯巯基尿酸（D-PMA）、D-苄巯基尿酸（D-BMA）. D-PMA在对照组中均为阴性，暴露组在0—98.60 µg·L−1间变化；D-BMA在对照组中均为阴性，暴露组在0—11.04 µg·L−1间变化. 其他代谢物可通过峰面积变化得出含量变化. 人体的氨基酸一般为L型的，并且苯与苯系物暴露后生成的巯基尿酸生物标志物如PMA与BMA，正常的人群也应为L型的，这几种D型代谢物的出现可能意味着某种疾病的发生，应引起高度的重视[35].
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可利用开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件进行数据分析和处理来找出差异的代谢通路，其网址为https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml. 统计学分析中选择Pathway Analysis进入界面后输入一列代谢物化合物列表名，得出化合物相应的KEGG代谢物通路（如表4所示），由于给定的化合物列表均为内源性化合物，而外源性化合物PMA与BMA的代谢通路只能通过文献报道[41-42]的方法进行分析. 内源性化合物有6组代谢通路有显著性差异（D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（D-glutamine and D-glutamate metabolism）、谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism）、丁酸代谢（butanoate metabolism）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）、柠檬酸循环（citrate cycle （TCA cycle））、嘌呤代谢（purine metabolism））.
D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢会生成L-谷氨酰胺与D-谷氨酰胺,而代谢过程形成的酮戊二酸（2-oxoglutarate）参与到柠檬酸循环中. 谷氨酰胺（glutamine）是肌肉和血液中数量最多的氨基酸. 人体不能自己生产必需氨基酸，只能通过饮食摄取，而谷氨酰胺却是一种有条件必需氨基酸. 这意味着健康和无压力的身体条件能自己产生足够的谷氨酰胺，但在人患病或遭受创伤时，对谷氨酰胺的需求量会超过供应量，就使这种氨基酸变成必需. 故在人体在有苯或苯系物暴露环境中，可能会通过谷氨酸代谢生成酮戊二酸（2-oxoglutarate）. 同时代谢形成的酮戊二酸（2-oxoglutarate）也参与丁酸代谢（butanoate metabolism）过程中，从而生成2-羟基-戊二酸（2-hydroxy-gluarate）. 杨臻峥[46] 曾报道了人体代谢产物2-羟基戊二酸（2-HG）可诱发神经胶质瘤和白血病, 尿液中2-羟基-戊二酸代谢产物的升高也能在一定程度上表明由于苯及苯系物暴露导致的血液毒性.
谷胱甘肽（GSH）是一种多功能三肽，它既是磷酸甘油醛脱氢酶的辅基，又是乙二醛酶和丙糖脱氢如酶，所以是细胞内重要的调节代谢物. 氢化酶的辅酶参与体内的三羧酸循环（TCA循环）和葡萄糖代谢，可以激活多种酶，巯基（SH）酶-辅酶等，从而促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢. GSH分子以活性巯基（—SH）为特征，这是最重要的官能团. 它可以参与体内多种重要的生化反应，保护体内的蛋白质和一些重要酶的巯基不被氧化和失活，保证能量代谢和细胞利用. 同时通过巯基与体内自由基结合，可直接将自由基还原为酸性物质如巯基尿酸，可以加速自由基的排泄，以抵抗对重要器官的损害. 参考相关文献[40-41, 47]，外源性标志物PMA与BMA的代谢路径如图8 所示. 谷胱甘肽多为L型的，但是代谢过程中由于苯及苯系物毒性较大，可能会破坏谷胱甘肽-SH的活性进而造成构型的转化（如D-PMA与D-BMA的生成），从而影响人体的身体健康，这可为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定基础.
在谷胱甘肽循环中，焦谷氨酸也是一种重要的代谢物. 在某些多肽中谷氨酸的氨基与5-羧基脱水而成焦谷氨酸, 在一些活性肽类的N端的谷氨酸，其侧链羧基与N端的氨基脱水后形成的环化衍生物. 它也可通过5-氧代脯氨酸酶转化为谷氨酸. GSH循环是一种非酶促抗氧化防御，可防止在体内形成氧化剂并修复氧化损伤[48]. 文献报道在随访期间发现患有咽喉癌的吸烟者血清焦谷氨酸（GSH 代谢）水平升高[49]. 与上述文献报道的结果相一致，本研究在苯及苯系物暴露人群尿液中发现了焦谷氨酸水平的升高.
丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）生成L-丙氨酸参与到D-氨基酸的代谢（D-amino acid metabolism）中可以形成诸如D-苯丙氨酸（D-phenylalanine），而丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）形成L-谷氨酸再通过一系列代谢路径形成R-pantothenate（泛酸）. Sun等[17]进行了苯暴露C3H/He小鼠骨髓细胞和血浆内源性代谢物变化的研究，在他们的研究中，发现可能是由于线粒体的功能障碍从而导致了骨髓细胞中苯丙氨酸水平的显著升高，这就需要苯丙氨酸、蛋白质、黑色素和酪氨酸的合成. 这两种氨基酸能够为糖异生和分解代谢为三羧酸循环（TCA）循环提供中间体. 本文的研究中也同样通过TCA循环出现了D-苯丙氨酸的升高，这可能是苯及苯系物暴露对细胞的毒性与TCA循环有关. 尿液中苯丙氨酸水平升高的相关的通路可能是苯及苯系物暴露导致血液毒性的重要机制.
嘌呤代谢（purine metabolism）会生成环状磷酸腺苷cAMP（cyclic adenosine monophosphate）. 环磷酸腺苷（cAMP）是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”. 此外，对核酸、蛋白质、糖、脂肪代谢的合成及代谢调节等方面起着重要的作用.
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本研究基于自制的手性固定相EACDP来优化色谱分离与人尿的样品前处理条件，借助开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件结合多元统计分析，结果显示苯及苯系物暴露人群尿液中检测到5种内源性的代谢物与2种外源性的代谢物. 6组代谢通路受到显著影响，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环和嘌呤代谢. 2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸及D-苯丙氨酸会引起明显的升高，苯巯基尿酸与苄巯基尿酸也可能发生由L-型向D-型的手性转化，这为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定了基础，也为全面评估苯及苯系物暴露人群的健康风险提供了科学依据. 在后续研究中将进一步拓展代谢产物的研究范围，由靶向代谢物转向全面的非靶向代谢物，将具有显著性差异的代谢物进行动物学实验或建立代谢模型以进一步确认其危害性.
苯及苯系物暴露人群尿液的靶向代谢组学手性分析
Targeted metabolomics chirality analysis of human urine exposed to benzene and benzene series
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摘要: “三苯”具有强的人体血液毒性和致癌作用，是一类重要的环境污染物. 以往常通过代谢组学软件筛查出工作场所中苯及苯系物暴露人群的内源性代谢物与相应的代谢路径，而未考虑机体的立体化学作用对代谢的影响. 基于自制的手性固定相，优化色谱分离与尿样的前处理条件后，借助开放平台MetaboAnalyst 5.0 软件结合多元统计分析，分析出有显著差异的代谢物和代谢通路的变化. 暴露组检测到5种内源性的代谢物即泛酸、酮戊二酸、D-苯丙氨酸、2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸与2种外源性的代谢物即D-苯巯基尿酸与D-苄巯基尿酸. 6组代谢通路受到显著影响，包括D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环和嘌呤代谢. 结果表明，苯及苯系物暴露人群尿液代谢产物中2-羟基-戊二酸、焦谷氨酸及D-苯丙氨酸会引起明显的升高，苯巯基尿酸与苄巯基尿酸也可能发生由L-型向D-型的手性转化，这为进一步研究苯及苯系物引起血液毒性的潜在机制奠定了基础，也为全面评估苯及苯系物暴露人群的健康风险提供了科学依据.Abstract: "Triphenyl" has strong human blood toxicity and carcinogenic effects, which is an important environmental pollutants. As usual, metabolomics software was used to screen the endogenous metabolites and corresponding metabolic pathways of benzene and benzene series exposed people in the workplace, without considering the influence of stereochemistry on metabolism. Based on the home-made chiral stationary phase, after optimizing the chromatographic separation and pretreatment conditions of urine samples, the open platform MetaboAnalyst 5.0 software being combined with multivariate statistical analysis was used to analyze the changes of significantly different metabolites and metabolic pathways. Five endogenous metabolites (pantothenate, oxoglutarate, D-phenylalanine, 2-hydroxy-gluarate, pyroglutamic acid) and two exogenous metabolites (D-phenylmercapturic acid and D-benzylmercapturic acid) were detected in the exposed group. Six groups of metabolic pathways were significantly affected, including D-glutamine and D-glutamate metabolism, Glutathione metabolism, Butanoate metabolism, Alanine, aspartate and glutamate metabolism, Citrate cycle (TCA cycle) and Purine metabolism. Results show that 2-hydroxy-glutaric acid, glutamate and D-phenylalanine can cause obvious rise in human urine metabolites exposed to benzene and benzene series, the configurational transformation may also occur from L-type of D-type for phenylmercapturic acid and benzylmercapturic acid, which laid a foundation for further research on the potential mechanism of blood toxicity caused by benzene and benzene series, and also provides a scientific basis for comprehensive assessment of the health risk of benzene and benzene series exposed population.
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Key words:
- workplace /
- benzene and benzene series /
- human urine /
- targeted metabolomics /
- chiral analysis.
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水体富营养化导致水体异味（off-flavor）是一个严重且普遍存在的环境问题. 异味将直接对饮用水和水产品的质量造成影响，并最终危害到饮用水和水产品的品质，造成消费者不安全感和渔业经济损失，因此水体中的异味物质研究受到越来越多的关注. 水体中最常见的两种异味物质是土臭素（geosmin）和 2-甲基异莰醇（2-methylisoborneol，2-MIB），这两种物质已经得到了较多的研究，在生活饮用水卫生标准[1]当中也规定了限量值. 但随着工业的发展和各种环境问题的爆发，仅仅关注这两种异味物质是不够的. 其他的水体异味，如土霉味、氯味、草木味、沼气味、芳香味、鱼腥味、药水味及化学品味等也需要引起我们的关注. 了解水体中异味物质的种类、分布和浓度水平是判断异味物质来源、采取针对性控制措施的基础，因此建立准确可靠并且可同时分析多种异味物质的方法十分必要.
由于异味物质的嗅觉阈值极低，例如，土臭素和2-甲基异莰醇的嗅觉阈值分别为5—10 ng·L−1和1—10 ng·L−1，因此需要高效的样品前处理和高灵敏度的检测方法. 样品富集方法目前用的比较多的有吹扫捕集法[2-3]、分散固相萃取法[4]、闭环捕集[5-6]、液液萃取[7-8]、固相萃取[9-10]、搅拌棒吸附萃取[11-12]等. 这些方法大多费时费力，需要用到有机溶剂，前处理设备如果管路多，容易存在样品残留，引起交叉污染的状况. 而20世纪80年代发展起来的固相微萃取技术由于其富集能力强，无需使用有机溶剂而深受广大科研工作者的青睐，越来越多的应用于水中异味物质的分析检测[13-17]. 2016 年，我国颁布了国家标准检测方法《GB/T 32470—2016 生活饮用水臭味物质 土臭素和 2-甲基异莰醇检验方法》[18]. 该方法采用固相微萃取技术吸附样品中的土臭素和2-甲基异莰醇，顶空富集后用气质联用仪进行分离、测定. 但是手动固相微萃取，耗时长，每天能够检测的样品数量非常少，特别不利于大批量样品的检测，并且萃取头寿命较短.
本研究中采用新的箭型固相微萃取（SPME Arrow）技术对水中的异味物质进行在线富集，涂层体积更大，加大了吸附容量，从而大大提高了富集倍数，进而提高了方法的灵敏度. 异味物质的检测技术方面，目前大多采用气相色谱-单四极杆质谱进行检测，检测的目标物种类比较少，不能满足当前水中异味物质多样化的检测需求，并且对复杂基质中的目标物检测存在基质干扰的情况. 本方法采用气相色谱-三重四极杆质谱对异味物质进行检测，提高了方法对复杂基质的抗干扰能力. 选取了57种常见的异味物质作为目标物，优化了萃取过程中对萃取效率有显著影响的关键参数，建立水体中多种异味物质的高效、稳定、全自动的SPME Arrow -气相色谱/三重四极杆质谱联用分析方法.
1. 实验部分（Experimental section）
1.1 仪器
PAL3自动样品前处理平台，包含孵化炉、SPME Arrow 老化模块、加热磁力搅拌模块（瑞士CTC Analytics公司）；Agilent 7890B/7000D 三重四极杆气质联用系统，配备 EI 源（美国Agilent公司）.
1.2 标准品与试剂
异味物质标准品（固体标准品或溶液，上海安谱实验科技股份有限公司，标准品物质名称详见表1）；氯化钠，乙酸，碳酸钠，均为优级纯（国药集团）；甲醇，色谱纯（美国Merck公司）；所用实验用水为现制备的超纯水.
表 1 57种化合物保留时间、名称、CAS、定量离子对Table 1. Retention time, name, CAS, quantitative ion pair of 57 compounds序号No. 保留时间/minRT 英文名称Name 中文名称Name CAS 定量离子对Quantitative ion pair 1 2.94 1-Propanethiol 1-丙硫醇 107-03-9 76.0 -> 42.0 2 3.16 1-Bromopropane 1-溴丙烷 106-94-5 122.0 -> 43.0 3 4.87 n-Valeric aldehyde 正戊醛 110-62-3 44.0 -> 43.0 4 4.47 2,3-Butandione 2,3-丁二酮 431-03-8 86.0 -> 43.0 5 6.20 Dimethyl disulfide 二甲基二硫 624-92-0 94.0 -> 79.0 6 6.63 β-Pinene β-蒎烯 127-91-3 93.0 -> 93.0 7 6.79 Diethyl carbonate 碳酸二乙酯 105-58-8 91.0 -> 63.0 8 6.81 n-Amylformate 甲酸正戊酯 638-49-3 70.0 -> 42.0 9 7.20 Isoamyl methyl ketone 甲基异戊酮 110-12-3 43.0 -> 43.0 10 7.91 Cumene 异丙苯 98-82-8 105.0 -> 77.0 11 8.52 Cineole 桉叶素 470-82-6 139.0 -> 43.0 12 8.25 Pyridine 吡啶 110-86-1 79.0 -> 52.0 13 8.63 Pyrazine 吡嗪 290-37-9 80.0 -> 53.0 14 9.43 p-Cymene 对伞花烃 99-87-6 119.0 -> 119.0 15 9.62 Terpinolene 萜烯 586-62-9 136.0 -> 121.0 16 9.59 pyrimidine 嘧啶 289-95-2 80.0 -> 53.0 17 9.82 Cyclohexanone 环己酮 108-94-1 98.0 -> 55.0 18 9.90 1,3-Diethylbenzene 1,3-二乙苯 141-93-5 105.0 -> 77.0 19 10.29 2,5-Dimethylpyrazine 2,5-二甲基吡嗪 123-32-0 108.0 -> 108.0 20 10.37 4-tert-Butyltoluene 4-叔丁基甲苯 98-51-1 133.0 -> 105.0 21 10.42 1,2,3-Trimethyl benzene 1,2,3-三甲基苯 526-73-8 105.0 -> 105.0 22 10.42 tert-Amylbenzene 叔戊苯 2049-95-8 91.0 -> 91.0 23 10.51 Anisole 苯甲醚 100-66-3 108.0 -> 108.0 24 10.53 n-Butyl glycidyl ether 正丁基缩水甘油醚 2426-08-6 57.0 -> 57.0 25 11.48 Pentyl valerate 戊酸戊酯 2173-56-0 85.0 -> 57.0 26 12.61 Acetonylacetone 丙酮基丙酮 110-13-4 99.0 -> 99.0 27 13.02 2-Isobutyl-3-methoxypyrazine 2-异丁基-3-甲氧基吡嗪 24683-00-9 124.0 -> 94.0 28 13.04 N,N-Dimethylacrylamide N，N-二甲基丙烯酰胺 2680-03-7 98.0 -> 42.0 29 13.23 Linalool 芳樟醇 78-70-6 93.0 -> 93.0 30 13.83 Isoborneol acetate 乙酸异冰片 125-12-2 136.0 -> 121.0 31 13.93 2-Methylisoborneol 2-甲基异莰醇 2371-42-8 108.0 -> 93.0 32 14.44 L-Menthol L-薄荷醇 2216-51-5 81.0 -> 81.0 33 14.44 Dicyclohexylamine 二环己基胺 101-83-7 138.0 -> 55.0 34 14.45 trans-2-Decenal 反-2-癸烯醛 3913-81-3 55.0 -> 55.0 35 15.64 4-Ethylbenzaldehyde 4-乙基苯甲醛 4748-78-1 134.0 -> 105.0 36 15.67 Naphthalene 萘 91-20-3 128.0 -> 128.0 37 16.31 Perillaldehyde 紫苏醛 18031-40-8 122.0 -> 79.0 38 16.44 Ethyl salicylate 水杨酸乙酯 118-61-6 120.0 -> 92.0 39 16.65 Anethole 茴香脑 104-46-1 148.0 -> 105.0 40 16.69 Geosmin 土臭素 16423-19-1 112.0 -> 97.0 41 16.79 2-Chlorophenol 2-氯酚 95-57-8 128.0 -> 64.0 42 16.87 α-Ionone 2-紫罗兰酮 127-41-3 121.0 -> 77.0 43 16.91 2-Methylnaphthalene 2-甲基萘 91-57-6 142.0 -> 142.0 44 16.93 Guaiacol 愈创木酚 90-05-1 109.0 -> 81.0 45 17.42 2,6-Dimethylphenol 2,6-二甲基苯酚 576-26-1 107.0 -> 77.0 46 17.53 p-Ethylaniline 对乙基苯胺 589-16-2 106.0 -> 106.0 47 19.19 Methyl cinnamate 肉桂酸甲酯 103-26-4 131.0 -> 103.0 48 19.51 2,6-Dichlorophenol 2,6-二氯苯酚 87-65-0 164.0 -> 63.0 49 20.07 2,4-Dichlorophenol 2,4-二氯苯酚 120-83-2 162.0 -> 162.0 50 21.12 Dihydrojasmonic acid methyl ester 二氢茉莉酸甲酯 24851-98-7 153.0 -> 97.0 51 21.81 2,4,6-Trichlorophenol 2,4,6-三氯酚 88-06-2 196.0 -> 97.0 52 22.41 4-Chlorophenol 4-氯酚 106-48-9 128.0 -> 65.0 53 22.97 4-Chloro-m-cresol 4-氯-3-甲酚 59-50-7 142.0 -> 107.0 54 23.16 Ethyl vanillin 乙基香兰素 121-32-4 166.0 -> 137.0 55 23.53 Vanillin 香兰素 121-33-5 152.0 -> 151.0 56 23.83 p-Bromophenol 对溴苯酚 106-41-2 172.0 -> 65.0 57 24.09 Benzyl benzoate 苯甲酸苄酯 120-51-4 212.0 -> 105.0 | Show Table
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1.3 样品前处理参数
取 5.0 mL 水样，加入 1.0 g 氯化钠，置于 20 mL 螺口顶空瓶中. 旋紧瓶盖，置于顶空样品盘中，待测定.
萃取前，将样品置于40 ℃ 下孵化3.0 min，然后将样品转移到加热磁力搅拌模块中，将 SPME Arrow 伸入样品上方顶空气相中，在40 ℃ 下顶空萃取30.0 min，最后在进样口解吸5.0 min.
1.4 仪器检测参数
色谱柱：Agilent DB-WAX UI 气相色谱柱，30 m×0.25 mm×0.25 µm. 多模式（MMI）进样口：不分流进样，250 ℃. 载气类型及流速：He，恒流模式，流速1 mL·min−1. 炉温升温程序：在40 ℃ 下保持3.0 min，然后以10.0 ℃·min−1的速率升至250 ℃ 并保持10.0 min. 传输线温度280 ℃. 质谱离子源温度250 ℃. 检测模式：MRM模式，57种化合物保留时间及定量离子对详见表1.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 实验条件的优化
固相微萃取技术中吸附效率的影响因素主要包括萃取头涂层（固定相）、萃取时间、萃取温度、样品pH值和离子强度等. 本方案中着重考察了萃取时间、萃取温度、样品pH的影响. 另外在实验过程中发现了萃取头在进样口进入的深度对解析效率有显著影响，因此也对萃取头在进样口的深度进行了优化.
萃取涂层的选择上考虑到水中的异味物质既有极性化合物，也有弱极性和非极性化合物，分子量比较小，沸点较低，所以一般选用三相复合涂层DVB/CAR/PDMS来满足多种异味物质的萃取要求[16]. Arrow萃取头的长度为2 cm，直径为1.1 mm和1.5 mm两种型号，比表面积大，吸附速度快，涂层体积大，灵敏度高. 本实验中，选择了1.1 mm直径的DVB/CAR/PDMS作为萃取涂层，能够得到非常优异的结果.
2.1.1 萃取温度
萃取温度对固相微萃取有双重作用：温度升高，可以加快目标物的分子扩散速度，有利于尽快达到平衡，但是温度的升高，又使得涂层对待测物的吸附减弱，降低了灵敏度. 在本实验中，考察了萃取温度对57种分析物的影响，考察的温度范围从30 ℃到70 ℃. 结果表明，对于保留时间在21.0 min之前的化合物，萃取温度40 ℃能够达到最优的萃取效果. 当萃取温度高于40 ℃后，随着萃取温度的升高，这些化合物的响应值逐渐降低，这是由于温度的升高减弱了目标物在涂层上的吸附而导致的结果（图1）. 而对于保留时间在21.0 min之后的化合物，随着萃取温度的升高，萃取效率一直是升高的趋势. 对于这些化合物而言，温度增加，分子扩散速度的增加更为明显. 考虑到保留时间21.0 min之前的化合物占了大多数，并且温度过高，水汽的量会增加，对Arrow也会有不利的影响，因此选择40 ℃为本实验的萃取温度.
2.1.2 萃取时间
萃取时间即萃取达到平衡所需的时间，由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定. 本实验中，考察了萃取时间对萃取效率的影响，考察的时间范围从10 min到50 min. 结果表明，对于出峰时间较短的化合物，萃取时间10 min能够达到最优的萃取效果. 而对于出峰时间较长的化合物，随着萃取时间的加长，萃取效率一直是升高的趋势（图2）. 在实际的实验中，通常选择具有较大萃取量且萃取时间不太长作为实际的萃取时间，考虑到本实验中仪器的运行时间为34 min，因此最终选择30 min为本实验的萃取时间.
2.1.3 盐析效应和pH的影响
两者在实质上是一样的，都是影响了基质的离子强度，从而影响了待分析物在样品和顶空气相之间的分配系数. 盐析是向待测样品中加入氯化钠或其他盐，使得溶液中的离子强度增加，从而减少了待测物在基质中的溶解，提高了待测物在顶空气相中的含量，从而提高了萃取效率. 本实验中向待测溶液中加入20%的氯化钠，增强离子强度，从而提高萃取效率[16] .
pH的影响是通过调节酸碱度而影响了溶液中的离子强度从而改变了待测物在基质中的溶解性。在 本实验中，考察了样品的pH值对萃取效率的影响：向样品溶液中加入0.1 mL乙酸，使样品在酸性条 件下萃取，可以看到，对酚类等具有羟基的化合物的萃取有明显的促进作用，对酯类化合物的萃取也 有促进作用（图3）；而 向样品中添加0.1 g碳酸钠，使样品在碱性条件下萃取，对吡嗪类化合物和醚类化合物的萃取有明显的促进作用（图4）。 从图中可以观察到，酸性条件下萃取对吡嗪类化合物 的负面影响非常显著，而碱性条件下萃取对酚类化合物的负面影响非常显著。因此，最终的实验为了兼顾所有化合物的萃取，实现一次萃取进样完成所有化合物的分析，选择的是中性的萃取条件（样品只添加20%的氯化钠）。
图 3 酸性条件下萃取效率提高的代表性化合物Figure 3. Some compounds with high extraction efficiency under acidic conditions（从上至下依次为中性条件、酸性条件、碱性条件）（neutral conditions, acidic conditions and alkaline conditions from top to bottom）
图 4 碱性条件下萃取效率提高的代表性化合物Figure 4. Some compounds with high extraction efficiency under alkaline conditions（从上至下依次为中性条件、酸性条件、碱性条件）（neutral conditions, acidic conditions and alkaline conditions from top to bottom）2.1.4 进样深度的影响
萃取头在气相进样口插入的深度对解析的效率有比较大的影响. 本实验优化了进样口插入深度对解析的影响，考察的进样口深度范围从40 mm到65 mm. 结果如图5所示，对于多模式进样口而言，萃取头在进样口插入的位置越深，峰型越尖锐，说明位置越深，解析的速度越快，解析效率也越高. 分析原因，应该是由于进样口中衬管的中下部位置温度是比较高的区域，因此，Arrow在进样口中的插入深度越深，解析速度越快，解析效率也越高.
2.2 方法评价
2.2.1 线性范围
配制浓度梯度为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 ng·L−1的标准溶液，按照上述优化后的条件，分别进行萃取：加入氯化钠（20%，M/M）以增强离子强度，提高萃取效率；然后在40 ℃下萃取30.0 min，最后在进样口插入深度65 mm的条件下解吸5.0 min. 用外标法建立校准曲线. 所有57个目标物中其线性相关系数均大于0.99.
2.2.2 重复性
实际水样加标水平10 ng·L−1，化合物出峰状况良好，峰型尖锐，基本无干扰. 重复萃取测定10次，其中52种化合物RSD小于10%；两种酚类物质（2,6-二氯酚、2,4,6-三氯酚）和嘧啶的RSD值均大于10%，但小于20%（表2）.
表 2 57种化合物线性范围、相关系数、重复性、检出限Table 2. Linear range, correlation coefficient, repeatability, MDL of 57 compounds序号No. 保留时间/minRT 中文名称Name 线性范围/（ng·L−1） 线性相关系数R2 相对标准偏差RSD 方法检出限/（ng·L−1）MDL 1 2.94 1-丙硫醇 10—500 0.9936 7.21 1.20 2 3.16 1-溴丙烷 10—500 0.9956 7.26 1.24 3 4.87 正戊醛 10—500 0.9991 3.15 2.90 4 4.47 2,3-丁二酮 10—500 0.9973 8.72 2.96 5 6.20 二甲基二硫 1—500 0.9888 1.18 0.49 6 6.63 β-蒎烯 1—500 0.9993 2.72 0.35 7 6.79 碳酸二乙酯 10—500 0.9958 8.12 1.02 8 6.81 甲酸正戊酯 10—500 0.9973 6.99 1.43 9 7.20 甲基异戊酮 10—500 0.9975 5.56 0.81 10 7.91 异丙苯 10—500 0.9997 6.02 0.46 11 8.52 桉叶素 10—500 0.9999 7.00 1.47 12 8.25 吡啶 10—500 0.9933 7.25 5.75 13 8.63 吡嗪 10—500 0.9920 6.79 2.90 14 9.43 对伞花烃 10—500 0.9903 2.13 0.73 15 9.62 萜烯 10—500 0.9006 3.10 1.02 16 9.59 嘧啶 50—500 0.9986 17.35 18.03 17 9.82 环己酮 10—500 0.9902 9.50 3.34 18 9.90 1,3-二乙苯 10—500 0.9993 8.19 1.07 19 10.29 2,5-二甲基吡嗪 10—500 0.9993 7.15 1.10 20 10.37 4-叔丁基甲苯 10—500 0.9994 6.05 1.96 21 10.42 1,2,3-三甲基苯 10—500 0.9989 6.63 1.30 22 10.42 叔戊苯 10—500 0.9990 3.61 1.48 23 10.51 苯甲醚 10—500 0.9978 6.75 0.77 24 10.53 正丁基缩水甘油醚 10—500 0.9960 8.28 1.29 25 11.48 戊酸戊酯 10—500 0.9967 2.15 0.82 26 12.61 丙酮基丙酮 10—500 0.9930 1.21 1.69 27 13.02 2-异丁基-3-甲氧基吡嗪 10—500 0.9975 4.42 1.18 28 13.04 N,N-二甲基丙烯酰胺 200—1000 0.9998 — 204.80 29 13.23 芳樟醇 1—500 1.0000 4.78 0.92 30 13.83 乙酸异冰片 1—500 0.9983 7.65 0.65 31 13.93 2-甲基异莰醇 1—500 1.0000 2.92 0.89 32 14.44 L-薄荷醇 10—500 0.9980 8.71 3.22 33 14.44 二环己基胺 10—500 0.9986 9.37 3.26 34 14.45 反-2-癸烯醛 10—500 0.9989 8.66 1.57 35 15.64 4-乙基苯甲醛 10—500 0.9989 5.74 2.02 36 15.67 萘 10—500 0.9998 9.85 2.98 37 16.31 紫苏醛 1—500 0.9998 4.60 0.65 38 16.44 水杨酸乙酯 1—500 0.9955 1.45 0.93 39 16.65 茴香脑 1—500 0.9991 2.91 0.91 40 16.69 土臭素 1—500 1.0000 1.09 0.22 41 16.79 2-氯酚 1—500 0.9984 5.14 0.77 42 16.87 2-紫罗兰酮 1—500 0.9958 1.97 0.81 43 16.91 2-甲基萘 10—500 0.9990 9.18 2.46 44 16.93 愈创木酚 10—500 0.9996 5.99 1.41 45 17.42 2,6-二甲基苯酚 10—500 0.9998 7.38 1.88 46 17.53 对乙基苯胺 10—500 0.9951 3.13 9.54 47 19.19 肉桂酸甲酯 10—500 0.9971 3.16 1.41 48 19.51 2,6-二氯苯酚 10—500 0.9864 13.83 3.44 49 20.07 2,4-二氯苯酚 10—500 0.9991 4.24 1.43 50 21.12 二氢茉莉酸甲酯 10—500 0.9952 7.96 3.53 51 21.81 2,4,6-三氯酚 10—500 0.9864 12.40 2.87 52 22.41 4-氯酚 10—500 0.9990 6.77 2.40 53 22.97 4-氯-3-甲酚 10—500 0.9992 3.15 1.09 54 23.16 乙基香兰素 100—500 0.9983 — 76.41 55 23.53 香兰素 50—500 0.9972 7.67 15.70 56 23.83 对溴苯酚 10—500 0.9992 5.86 1.85 57 24.09 苯甲酸苄酯 1—500 0.9988 1.77 0.48 | Show TableDownLoad:
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2.2.3 检出限
方法最低检出限（MDL）是根据同一浓度的10次测定的精密度来确定的. 配置1 ng·L−1的加标样品，平行测定10次，以3倍的标准偏差为方法检出限. 计算结果显示，52个化合物检测限小于5 ng·L−1，仅有4个化合物的方法检测限大于10 ng·L−1（详见表2）. 在国家标准检测方法《GB/T 32470—2016 生活饮用水臭味物质 土臭素和2-甲基异莰醇检验方法》中采用传统的固相微萃取纤维的方式，土臭素和2-甲基异莰醇的检出限分别为3.8 ng·L−1和2.2 ng·L−1，而本方法中土臭素和2-甲基异莰醇的检出限分别达到0.22 ng·L−1和0.89 ng·L−1，相比传统的方法，灵敏度分别提高17倍和2.5倍. 因此，本研究建立的方法具有非常高的检测灵敏度.
3. 结论（Conclusion）
采用新型的箭型固相微萃取技术顶空富集水中的异味物质，然后转移至气相色谱进样口进行热解析，三重四极杆串联质谱进行异味物质的高通量筛查，方法优化过程中主要对萃取时间、萃取温度和样品pH值进行了优化，同时在优化过程中发现，对于多模式进样口来说，萃取头解析时进入进样口的深度对解析的速度和效率有显著的影响. 本方法采用了新型的箭型固相微萃取头萃取水中的异味物质，具有更高的灵敏度；整个方法前处理过程无需使用有机溶剂，减少环境污染，保护操作人员安全；萃取头小巧，方便携带，易于实现原位检测；萃取头采用金属材质，增强了机械性能，延长了使用寿命，箭型末端还能减小对隔垫的损伤. 2022年3月15日，国家卫生健康委员会发布《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2022），对饮用水中土臭素和2-甲基异莰醇的限量作出了明确的规定为10 ng·L−1，本方法完全能够满足该标准对饮用水和水源水的卫生检测要求.
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图 2 HLB与SAX固相萃取小柱中 PMA（A）、BMA（B）、MHBMA（C）和DHBMA（D）的4种生物标志物回收率（n=3）
Figure 2. The recoveries of PMA（A），BMA（B），MHBMA（C） and DHBMA （D）enantiomers by HLB and SAX cartridges （n=3）
图 4 对照组（a,c）与暴露组（b,d）的尿液中MHBMA与DHBMA 的SIM色谱图
Figure 4. SIM chromatograms of MHBMA and DHBMA in urine of control group（a,c） and exposure group（b,d）
图 5 对照组和暴露组的尿样热图分析
Figure 5. Heat map analysis of urine samples in the control and exposure groups
表 1 不同组的相应参数表（n=30）
Table 1. Corresponding parameter table for different groups （n=30）
对照组Control group 暴露组Exposure group 行政人员 油漆工 * 年龄Age 31.93±8.93 31.60±7.61 性别Gender 男 19 21 女 11 9 吸烟Smoke 是 0 2 否 30 28 饮酒Drink wine 是 10 6 否 20 24 遗传病史Whether there is a history of genetic disease 是 0 0 否 30 30 暴露强度/（mg m−3）Exposure intensity 苯 — — 甲苯 — 4.94±0.0094 邻-二甲苯 — 0.99±0.013 间-二甲苯 — 1.44±0.036 对-二甲苯 — — 工作年限/aLength of service 8.43±7.05 7.80±6.90 *与对照组比较，P<0.05.吸烟：指吸烟超过1 d，烟龄超过1 a.饮酒：指饮酒超过1年至少1周1次. — 代表没有检出. *Compared with the control group, P<0.05. Smoking: refers to smoking for more than 1 day and smoking for more than 1 year. Drinking: refers to drinking for more than 1 year at least once a week. — means no detection.
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表 2 PMA, BMA, d2-PMA, MHBMA-1+-2 与 DHBMA的多反应监测优化条件
Table 2. MRM optimization conditions for PMA, BMA, d2-PMA, MHBMA-1+-2 and DHBMA
化合物Compounds 母离子Precusor （m/z） 子离子Product（m/z） 驻留时间/msDwell time 解簇电压/eVDP 碰撞能量/eVCE （1） 苯巯基尿酸 (PMA)* 238.03 108.94 30 −16.91 −16.99 （2） 苄巯基尿酸 (BMA)* 252.07 122.99 30 −32.15 −24.22 （3） 同位素标记的苯巯基尿酸内标 (d2-PMA)* 241.10 109.93 30 −16.84 −17.14 （4） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2)* 232.03 102.94 30 −19.90 −14.14 （5） N-乙酰基-S-（1-羟基甲基-2-丙烯基）-L-半胱氨酸+N-乙酰基-S-（2-羟基-3-丁烯基）-L-半胱氨酸(MHBMA-1+-2) 232.03 128.10 30 −33.14 −14.16 （6） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸） (DHBMA)* 250.05 120.95 30 −11.97 −18.96 （7） N-乙酰基-S-（3,4-二羟基丁基-L-半胱氨酸 ）(DHBMA) 250.05 127.80 30 −14.00 −16.26 （8） 泛酸 Pantothenate 218.01 146.13 30 −25.00 −21.00 （9） 酮戊二酸 Oxoglutarate 145.10 101.12 30 −35.31 −13.00 （10） D-苯丙氨酸 D-phenylalanine 166.1 103.20 30 −16.93 −30.46 （11） 2-羟基-戊二酸 2-hydroxygluarate 147.12 128.74 30 −45.52 −17.12 （12） 焦谷氨酸 Pyroglutamic acid 128.08 82.13 30 −23.16 −19.15 *代表定量离子. *Represent quantitative ion.
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表 3 尿液鉴定出的差异性代谢物
Table 3. Differential metabolites identified in urine
序号NO. 趋势（暴露组/对照组）Tendency（exposure/control） 代谢物Metabolities 相关路径Related pathway 1 ↑ D-苯巯基尿酸D-PMA 谷胱甘肽代谢 2 ↑ D-苄巯基尿酸D-BMA 谷胱甘肽代谢 3 — 泛酸Pantothenate 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 4 ↓ 酮戊二酸Oxoglutarate D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢 5 ↑ D-苯丙氨酸D-phenylalanine 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,柠檬酸循环 6 ↑ 2-羟基-戊二酸2-hydroxy-gluarate 柠檬酸循环 7 ↑ 焦谷氨酸Pyroglutamic acid D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢，谷胱甘肽代谢 注：↑代表上调，↓代表下调，—代表不变. Note：↑represent upward adjustment, ↓represent downward adjustment, and — represent unchanged.
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表 4 代谢路径P值表
Table 4. Metabolic pathway P values
路径名 Pathway Name P −lgP D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢 D-Glutamine and D-glutamate metabolism 0.002683 2.57130 丁酸代谢 Butanoate metabolism 0.006593 2.1578 柠檬酸循环 Citrate cycle （TCA cycle） 0.008706 2.06020 谷胱甘肽代谢 Glutathione metabolism 0.012002 1.92075 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 Alanine, aspartate and glutamate metabolism 0.012006 1.92060 嘌呤代谢 Purine metabolism 0.025953 1.58620
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