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钴（Cobalt, Co）是海洋中一种关键的无机痕量金属，在海洋生物地球化学过程中扮演着重要角色。Co是海洋浮游生物的必需元素。浮游生物可利用Co作为金属因子构成体内一些有机结构，如作为维生素B12的中心原子在海洋生物中广泛存在[1-3]；或利用Co作为辅基参与形成生物体内的金属酶，如替代锌参与碳酸酐酶的辅酶或利用Co胺素在体内合成蛋氨酸等[4-9]。生物吸收实验表明，在海洋环境中浮游生物对Co的需求可能介于锰和营养型金属元素（如锌等）之间[10]，且与浮游生物的需求相比，海水中的生物可利用Co处于匮乏状态[11-12]。溶解态Co在海水中主要以自由离子或络合物的形态存在，且活性Co相对稳定络合态有着更高的生物活性[13]。
开阔大洋Co分布大多为营养盐型分布模式，表层的溶解态Co被生物消耗而浓度较低，随着再矿化作用浓度从表层到中深度呈上升趋势，中深度到深海呈稳定或下降的趋势。海盆尺度上的Co分布状况为：北冰洋表层Co的浓度极高，可达0.80 nmol·L−1，10倍于北大西洋和南太平洋的表层浓度；北冰洋深层水Co含量约为0.05—0.06 nmol·L−1，略高于太平洋深层水（0.03—0.04 nmol·L−1），而略低于大西洋深层水（0.01—0.09 nmol·L−1）[14-20]。大洋中Co的主要来源是陆地径流、沉积物再悬浮、热液活动及大气沉降[13,15,17-18]。Co从大洋的移除过程主要包括清除作用、生物吸收作用以及随铁锰氧化物等的共沉降[10,18,21-23]。全球大洋Co的通量模型估算结果表明：每年海底沉积物向海输送量达4.0×1010 g，大气沉降为3.8×109 g，河流输送为3.4×108 g。Co在大洋的平均停留时间约为70 a，其中上层海洋受到强烈的生物消耗、颗粒物沉降及再生等共同作用停留时间仅7 a，而深层海洋可长达250 a[24]。
河流是大洋Co的一个重要来源，并显著影响河口及近海Co的分布。例如，北冰洋在极点处受到穿极流携带的河流输入的补充，Co浓度高达0.21 nmol·L−1 [22]；地中海和墨西哥湾表层水Co与盐度的显著负相关关系也表明河流输入对河口或和边缘海Co分布的重要影响 [15,25-27]。人类活动会导致河流中Co含量的增加，例如伊比利亚半岛南部工业区附近的河流体系中Co含量可达背景值的17700倍。这也意味着随着人类活动程度的加剧，河流向大洋输送Co的通量可能会增加[28]。
河口是河流向海物质输送的通道和关键界面，是生物地球化学循环中一种重要的环境体系[29-31]。河流中携带的Co在河口区域受移除作用、颗粒物解吸及悬浮颗粒物再生等作用的影响，并非完全参与全球海洋的生物地球化学循环。因此，Co在河口的行为决定了河流向海洋Co输送的最终通量。例如对圣劳伦斯河的研究指出，由于河口的移除效应，河流中携带的Co最终只有约8%能进入开阔大洋[23,32]。目前，河口区域Co的生物地球化学的行为及其影响因素尚未得出明确的结论，例如：韩国Geum河口Co表现为移除型[33]；日本Sagami湾和Wakasa湾的河口区域在低/中盐度区域呈现出溶解态Co的最大值，且保守性随季节变化[34]；加拿大Mackenzie河口区域Co则表现出非保守的添加行为[35]。河口Co的行为的不确定性限制了对河流向海洋Co输送通量的估算。
长江是我国第一大河，世界第三长河，河流总长度达6300 km，流域覆盖面积达180万km2，多年径流量平均值达9000亿 m3[36-37]。长江贡献了东海90%以上的淡水输入量，也是我国近海痕量金属的重要来源[37-38]。长江中的Co主要来自于流域岩石矿物的风化与侵蚀[39-40]，已有报道长江上、中、下游水体中Co的平均浓度分别为1.53、0.85、0.85 nmol·L−1，若忽略河口的过滤器效应，长江每年向东海Co的输送通量可达40 吨[41]。而Co在长江口行为研究的缺失，限制了对长江向大洋Co输送通量及其生物地球化学规律的认识。为此，本文通过对长江口盐度梯度变化下Co浓度的观测，结合水文和化学辅助参数探讨长江口及其附近海域海水中痕量金属Co的生物地球化学行为及其季节变化。
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本研究通过搭载同济大学海洋地质国家重点实验室共享航次（KECES-2019）和国家自然科学基金委员会共享航次，分别于2019年9月（秋季），2021年3月（春季）和2021年7月（夏季），在121.05°E—124.00°E，29.60°N—31.77°N的长江口区域，搭载“浙渔科2号 ”和“润江1号”科考船开展长江口及其附近海域痕量金属Co的季节性分布的研究。分别获取了24个秋季、32个春季和24个夏季长江口的表层水样品（图1）。
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表层水样品采用实验室自制的痕量采水器，在船头位于水流的上游区域采集表层水样品。所取水样立即在船舱内搭建的洁净环境中使用蠕动泵经Pall® 0.8/0.2 μm的囊式滤器过滤后装入60 mL 低密度聚乙烯（Nalgene）样品瓶，并装入3层自封袋后封入样品箱，常温保存带回。
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样品带回后的所有实验操作均在上海交通大学1000级微量金属洁净实验室的100级高效微粒空气（high efficiency particulate air，HEPA）过滤通风橱中进行。实验所用试剂及材料见表1。
seaFAST使用的缓冲液由氨水和醋酸按比例混合制备（pH=6.0±0.2），使用的洗脱液为0.5 mol.L−1的硝酸。ICP-MS自动进样器和seaFAST的润洗液均为0.5%的硝酸。小瓶、离心管和背板均在洁净实验室中按照以下步骤进行清洗[42-43]：在2％Citranox清洁剂中浸泡24 h，用超纯水冲洗7次，然后在10％盐酸中浸泡7 d，用超纯水冲洗7次，使用三层塑料自封袋密封。用于ICP-MS的氩气和氦气为超纯级（＞99.999%）。
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Milli-Q纯水机：Merck公司。seaFAST S2：Elemental Scientific公司。ESI-2DX自动进样器：Elemental Scientific公司。ICP-MS/MS：Thermo Fisher iCAP TQ电感耦合等离子质谱仪。ICP-MS/MS的工作条件见表2。
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样品带回实验室后使用盐酸l按照1:1000的比例进行酸化并摇匀，静置保存3个月及以上，使未络合的各种形态的Co在酸介质中充分分解[44]。静置后的样品先使用以盐酸l酸化至pH=2的Milli-Q水进行适当稀释，以盐度（Salinity, S）为划分标准进行稀释，0≤S<1‰稀释100倍，1‰≤S<15‰时稀释20倍，S≥15‰时稀释10倍，以避免金属浓度过高而污染seaFAST系统。稀释后的样品使用seaFAST进行分离和富集[45-46]，主要经过如下步骤。1. 上样：10 mL样品进入定量环，样品和缓冲液在线混合进入预浓缩柱。在这个过程中，元素被螯合树脂选择性吸附；2. 基质淋洗：超纯水和缓冲液在线混合后通过预富集柱后弃去，从而去除干扰离子和未被螯合的离子；3. 柱洗脱：0.5 mL的0.5 mol·L−1硝酸通过预富集柱，将被分析物从螯合树脂上洗脱至低密度聚乙烯背板，供ICP-MS/MS分析。
本研究用西太平洋表层标准海水（LEMON）为基体配制浓度梯度为0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg.L−1的标准曲线进行定量。本方法经过严格的验证，Co的方法检出限为0.003 nmol·L−1，流程空白低于检测限。对加拿大国家研究委员会（National Research Council, Canada）认证的标准样品SLEW-3，SLR-6，CASS-6和NASS-7的分析结果见表3。
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本文用于认识长江口Co生物地球化学规律的辅助参数，例如温度、盐度、营养盐、溶解氧及叶绿素等环境参数，通过同济大学海洋地质国家重点实验室共享航次和国家自然科学基金委共享航次的数据共享获取。所得数据以Ocean Data View进行平面图绘制，使用IBM SPSS statistics数据编辑器对样品各参数之间进行双变量相关性检验，相关性采用Pearson相关系数，显著性检验采用双尾检验。
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本研究3个季节长江口及其邻近水域各站位表层水的盐度（S）、温度（T）及Co浓度详细数据见表4。2019年9月秋季航次的水温范围为26.39—29.46 ℃，盐度范围为0.00—32.10‰；2021年3月春季航次水温范围为10.10—17.00 ℃，盐度范围为0.19‰—34.82‰；2021年7月夏季航次水温范围为22.89—28.77 ℃，盐度范围为0.11‰—31.39‰。春季航次中长江口的水温偏低，而研究范围表层水整体盐度较高。在2021年7月和9月的夏秋两季，观测到的温盐范围接近。
本研究采取咸淡水划分模式，将研究区域划分为淡水区、冲淡水区及海水区。具体以盐度（S）1和30为界限[47-48]，将S＜1‰划分为淡水区域，1‰≤S≤30‰为冲淡水区域，S＞30‰为海水区域，对各站位所属海域进行详细区分可知，2019年9月航次C1—C5位于淡水区，C18、Y6和Y7位于海水区，其余在冲淡水区；2021年3月航次B1—B2、C1—C3位于淡水区，A5的3—8号站、A6的3—8号站及A7的4—8号站位于海水区，其余站位在冲淡水区；2021年7月B1—B3、C1—C4位于淡水区，A5—3/5/6位于海水区，其余在冲淡水区。
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长江口金属Co的浓度在不同季节有所差异：秋季Co浓度分布范围0.05—0.24 nmol·L−1，均值0.10 nmol·L−1；春季Co浓度分布范围为0.05—0.37 nmol·L−1，均值为0.13 nmol·L−1；夏季Co浓度较高，其分布范围在0.03—0.54 nmol·L−1，均值高达0.26 nmol·L−1，几乎达到春秋季节的最高值；以Co含量的均值来看，Co在长江口浓度的季节变化表现为夏季＞春季＞秋季。
从季节变化的角度对本研究中各水域的盐度、温度及Co浓度进行统计（表5）。对于全水域，秋季Co的平均浓度淡水>海水>冲淡水；春夏两季趋势一致Co浓度表现为淡水>冲淡水>海水的规律。区分咸淡水域后观察其在不同季节的浓度数据可知，淡水Co浓度随季节变化幅度最大，表现为秋季＜春季＜夏季；海水Co浓度随季节变化幅度较小，其含量春季＜秋季＜夏季；冲淡水中Co含量受到淡水及海水的共同作用，其浓度介于二者之间，表现为秋季＜春季＜夏季。
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海水中Co的生物地球化学循环受到水团输运混合、盐度变化、吸附与解吸、生命活动等过程的影响。为解析驱动长江口Co生物地球化学行为的主要因素，在不考虑季节变化的前提下，将长江口所采样品按水域分析Co浓度与盐度（salinity, S）、温度（temperature, T）、溶解无机氮（dissolved inorganic nitrogen , DIN）、溶解无机磷酸盐（dissolved inorganic phosphates , DIP）、溶解态无机硅酸盐（dissolved inorganic silicate , DSi）、溶解氧（dissolved oxygen, DO）及叶绿素（chlorophyll, Chl）等环境因子的皮尔逊相关性（表6）。结果表明，在统计学上Co的浓度与环境参数之间存在一定程度上的相关，且不同水域和不同季节的相关性存在差异。
较好的相关性可以证明来源上的相关或生物地球化学行为上的相似[49]，长江口及其邻近海域Co与盐度、3种营养盐及溶解氧表现出极显著相关，与叶绿素显著相关；相较于其他因子，盐度和氮营养盐与Co相关性较强。着眼于不同水域，淡水区域Co与水体中Chl和DO含量极显著正相关，与DIN、DSi显著相关；冲淡水区域Co与环境因子的相关性则较为复杂，与S、DIN及DO极显著相关，与DSi和Chl含量呈现显著相关；海水区域 Co的生物地球化学行为与环境因子的关系较为单一，仅与DIP表现出极显著的正相关关系。
DSi与Co的相关性或为来源上的相关。有研究表明，上游岩石矿物的强烈风化剥蚀或为长江中Co的主要来源[50-53]，且Co与铝硅酸盐和其他风化条件等有着较好的相关性[54-55]，因此越靠近淡水区二者相关性越强。DIP与Co则主要为生物地球化学行为上的相似，溶解态Co和可溶性活性磷酸盐（Co: DIP）在海洋透光带内表现为正相关，可以解释为该区域主要浮游生物群落对Co的利用程度及其随后从生物颗粒相再矿化在时间尺度上的综合积累信号[56-57]；同时在海洋环境中浮游植物对 Co的比吸收率高于锰，这可能使得Co成为具有介于锰和更多营养类型元素（如锌）之间的生物地球化学效应的中间体，从而被更多浮游生物利用[10]，因此Co与DIP的相关性在海水区域明显高于淡水区和冲淡水区。
当忽略地理位置，仅对Co随季节变化加以讨论，对长江口及其邻近海域Co浓度与环境因子做皮尔逊相关性分析（表7），以分析不同季节、水域条件下Co的生物地球化学循环可能的驱动因素。
盐度与Co在每个季节都表现出极显著的负相关，可以认为盐度是主导河口Co的重要影响因子，对墨西哥湾的研究也指出Co浓度与水体盐度有很强的线性关系[15, 25]，且盐度升高时颗粒态Co更容易被移除[34]，因此盐度升高时通常伴随着Co的浓度的降低。对于营养盐，DIN与Co始终表现出较好的相关性，且春季＞夏季＞秋季；DSi次之，春季＞秋季＞夏季；DIP与Co的相关性在3种营养盐中相对较低，仅在春夏季节表现出相关性，秋季相关性不显著。春秋两季Co与DSi的相关性大于夏季，或为 Co随铝硅酸盐的风化侵蚀作用较强所致。
对于各季节的特殊影响因子，秋季Co与温度存在较好的相关性，或为温度影响水体中的氧化细菌的活性所致[24]；结合盐度及营养盐数据，温度也可以通过咸淡水混合程度或浮游生物消耗程度产生影响。春季时Co与营养盐相关性更强，同时与Chl也有着极显著的相关性，表现出生物吸收作用的主导地位。夏季与DO的极显著的负相关关系，可能是因为溶解氧会影响水体中Co的存留状态[18]，由于夏季水温较高使得水体中溶氧较低，伴随氧化颗粒物的移除的Co减少，此外当沉积物中氧化颗粒物被还原时Co也将随之释放到水体中[26]；夏季Co与DSi的强相关性或也指示来源上的增多。
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Co在长江口及其邻近海域的浓度随盐度梯度的上升呈现降低趋势（图2）。西班牙Vigoria河口的研究指出河流输送是该区域Co的主要来源[26]，本研究表明长江携带的Co也是影响河口Co分布的重要因素。其中，长江口的春季淡水端元Co浓度明显高于秋季，夏季的Co分布类似春季，但其浓度显著高于秋季与春季，河口处浓度可达0.5 nmol·L−1。
对不同季节Co浓度随盐度梯度的变化进行分析（图3），可见Co在长江口的生物地球化学行为除物理意义上的咸淡水混合导致的稀释作用外还存在其它因素的干扰，总体表现为移除型分布。相较而言，锦江（韩国）河口及麦肯齐河河口处Co在盐度为9‰—12‰范围内存在一个Co的峰值[33,35]，加尔沃斯顿湾Co在河口中盐度区域表现出非保守的补充行为[58]，但本研究在中盐度范围的样品量有限，导致对长江口中盐度Co行为的认识尚不清晰。
采用Vieira的方法[59]计算3个季节的Co移除率：对各航次中高盐度站位数据点进行线性拟合，拟合线见图3中3条虚线，拟合回归方程如图所示；取其截距（y0）与本研究在河口处0盐度区域的Co浓度平均值（C0）进行比对，最终对其移除率（removal rate, RR）进行量化（式1，表8）。
基于本研究3个季节的河口端Co浓度及移除率，采用长江水利网发布的《长江流域重要控制断面水资源监测通报》 （数据来源：www.cjw.gov.cn）所报道的大通站各季节长江向海输水量（Q），对3个季节长江向海输送的有效Co通量（flux）进行计算（式2），结果见表8。如表8所示，Co在长江口的移除效果秋季最为明显，夏季次之，春季较微。
表8展示了由3个航次长江口Co分布推算出的移除率，表现为秋季>夏季>春季。夏季移除率较高，但由于夏季淡水端元Co浓度最高且径流量极高，夏季向海输送Co通量最高；秋季移除率最高且淡水端元浓度最低，因此向海洋输送Co最少；春季虽径流量较低，但淡水端元Co浓度高于秋季，且移除率最低，因此Co的向海输送通量高于秋季，但受径流量及淡水端浓度限制，输送通量仍然低于夏季。综上所述，长江口Co的有效入海通量表现为夏季>春季>秋季。
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目前对河流中Co的研究主要集中在重工业区域，人为因素造成的影响愈发显著，在工业区或点源污染的河流区域所采样品浓度显著高于本研究报道数据，如汉江[60]污染区Co浓度达38.01 nmol·L−1，印度Mahanadi河[61]污染区达57.35 nmol·L−1、Manjira河[62]达47.51 nmol·L−1，意大利的Po河[63]甚至可达103 nmol·L−1。全球河流向海输送Co通量估算见表9。Co浓度采用河流或河口处溶解态Co浓度的平均值，同时以河流径流量对各区域Co浓度进行归一化得Cn，计算其在全球各河流向海输送Co浓度的平均值。归一化系数即为河流径流量在给出的全部河流径流量之和中的占比。
对上述河流基于流量归一化估算出全球河流向海输送平均Co浓度为1.61 nmol·L−1。河流向海年输水量以3.80×1019 g计[76-77]，在不考虑移除效果时，全球河流年向海输送Co通量可达3.60×109 g。当考虑移除效果时，假设移除率采用本研究长江口3个季度移除率的平均值（36%），计算可得河流有效年向海输送通量仅为2.32×109 g。
Gaillardet等根据全球河流溶解Co浓度计算所得的年通量为5.5×109 g[74]，而Tagliabue等基于Co/C为12 μmol·mol-1[24]估算出河流对全球大洋的Co年贡献值为3.4×108 g。两种估算方法得到的通量相差1个数量级。在不考虑移除效果时，本研究的估算通量与Gaillardet的估算结果类似，但考虑到Co在河口区域的移除，Gaillardet估算的河流向海年输送Co的通量可能被高估。本研究表明了河口界面Co行为研究的重要性。如果考虑到河流携带颗粒物可能通过输运和解吸向海洋输送，河流向海年输送Co的通量达2.48×1010 g[23,32,78]。本文目前的数据无法对长江颗粒态Co的贡献进行定量，相关结论需待进一步研究。
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本研究对Co在长江口的生物地球化学行为及其可能存在的机理做出如下阐释：（1）长江口及其临近海域的Co浓度分布呈现出明显的自河口向远海降低的趋势，整体表现出河口的移除行为；（2）从季节来看，长江口表层水Co浓度夏季>春季>秋季，春秋两季较为接近；（3）相关性分析表明Co浓度与盐度表现出强烈的相关性，表明咸淡水混合是调控长江口Co分布的主要因素；（4）长江口表层水Co在不同季节与不同营养盐种类呈现了不同的相关性，在春季显现出与叶绿素的相关性，夏季则与水体中溶解氧显著负相关；（5）长江口Co的移除率秋季>夏季>春季，向海有效输送通量夏季>春季>秋季；（6）河口的行为影响河流向海输送Co的通量，本研究表明了河口界面Co行为研究的重要性。
致谢：感谢国家自然科学基金委员会共享航次计划项目提供的共享航次（航次编号：NORC2021-03），以及同济大学海洋地质国家重点实验室共享航次（航次编号：KECES-2019）的资助。感谢“浙渔科２”号/“润江１”号科考船的船员帮助样品采集。感谢航次期间协助完成采样的同事和同学。感谢在样品分析、数据分析等方面提供帮助的同学。
长江口及其邻近海域表层水体Co的季节分布
Seasonal distribution of Co in the surface waters of the Changjiang Estuary and its adjacent waters
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摘要: 钴（Co）对海洋中的生物地球化学循环过程起着不可或缺的作用。河口是陆源物质进入海洋的重要界面，而Co在长江口界面的生物地球化学行为尚不明确。本文使用自动固相萃取-电感耦合等离子体联用技术对长江口及其附近海域2019年9月（秋季）、2021年3月（春季）和2021年7月（夏季）的表层水中的溶解Co进行了分析。结果显示，秋季Co浓度的范围在0.05—0.24 nmol·L−1，均值为0.10 nmol·L−1；春季为0.05—0.37 nmol·L−1，均值为0.13 nmol·L−1，略高于秋季；夏季为0.03—0.54 nmol·L−1，均值高达0.26 nmol·L−1，浓度最高。Co与盐度、营养盐、叶绿素及溶解氧在不同季节表现出不同的相关性，表明长江口Co的行为受多因素的影响。长江口溶解Co浓度自河口向外海逐渐降低，整体表现为移除型分布类型。长江口Co移除率秋季>夏季>春季，向海有效输送通量夏季>春季>秋季。Abstract: Cobalt (Co) plays a crucial role in biogeochemical cycling processes in the ocean. Estuaries are the important interface for terrigenous materials to enter the ocean, and the biogeochemical behavior of Co at the interface of the Changjiang (Yangtze) estuary remains unclear. In this study, dissolved Co in the surface waters of the Changjiang River Estuary and its adjacent waters in September 2019 (autumn), March 2021 (spring) and July 2021 (summer) was analyzed by automatic solid phase extraction and inductively coupled plasma technology. The results show that the concentration of Co ranges from 0.05 to 0.24 nmol·L−1 with an average of 0.10 nmol·L−1 in autumn; 0.05 to 0.37 nmol·L−1 with an average of 0.13 nmol·L−1 in spring, slightly higher than that in autumn; 0.03 to 0.54 nmol·L−1 with an average of 0.26 nmol·L−1 in summer, which was the highest concentration. Co shows different correlations with salinity, nutrients, chlorophyll and dissolved oxygen in different seasons, indicating that the behavior of Co in the Changjiang Estuary is affected by multiple factors. The dissolved Co concentration in the Changjiang River Estuary gradually decreases from the estuary to the sea, showing a general removal-type distribution. The removal rate of Co in the Changjiang Estuary behaves as autumn> summer> spring, and the effective transport flux to the sea follows the order of summer> spring> autumn.
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Key words:
- Changjiang Estuary /
- Co /
- seasonal distribution /
- estuarine behavior
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电化学厌氧消化（electrochemical anaerobic digestion，EAD）是一种利用微生物电解池（microbial electrolysis cell，MEC）的耦合厌氧消化（anaerobic digestion，AD）的新技术，其原理是利用MEC的制氢功能，对系统内的二氧化碳（CO2）进行固定和转化，生成更多的CH4，从而减少CO2的排放[1]，并极大地提高了CH4的转化率和沼气的品质[2]，所以，EAD作为一种新型的沼气制备技术，因其具有甲烷转化率高、能量回收率高、能耗低、适用于多种有机废弃物和废水的降解等优势而受到了广泛的关注，是目前AD领域的最新发现[3-5].
但不管是AD，还是EAD，绝大多数相关研究仍然停留在提高消化能力或者副产物的产率等方面[6-8]，很少涉及代谢过程的研究. 代谢通量分析（metabolic flux analysis，MFA）是一项研究胞内代谢状态和分析系统代谢能力的强有力技术，通过MFA：（1）可以确定细胞或者系统内存在的不同代谢途径，明确物质的流向和流量[8]；（2）可以计算胞内的中间产物的通量，对未知途径加以辨别[9]；（3）可以识别代谢节点的刚柔性[10]，和对环境扰动的影响做出评价，从而对代谢途径中具有特殊地位的途径实施有效调控[11]（如优化目标产物代谢途径、计算最大理论转化率等[12]）. 因此，本文将利用MFA中的通过通量平衡分析（flux balance analysis，FBA）的方法，构建EAD代谢网络，研究EAD代谢网络中的相关代谢途径的通量分布信息.
在代谢通量分析中，通量是反映各代谢产物在整个代谢网络中参与程度的重要参数[7]，可以依据通量的大小评价各代谢途径在整个代谢网络中所发挥的作用[13]. 然而由于EAD代谢网络中的相关代谢途径，往往是在相应的酶催化下进行的，在EAD代谢途径中，乙酸的形成和转化是EAD产甲烷过程中最为关键的节点. 乙酸的形成主要的途径是乙酰辅酶A通过磷酸转乙酰酶（PTA）转化为乙酰基-P，然后再通过乙酸激酶（AK）从乙酰基-P转化为乙酰基-P，AK催化反应产生ATP[14]. 厌氧消化EMP途径所产生的丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳，然后乙醛通过ADH还原成乙醇[15]. 丁酸的产生则与磷酸转丁酰酶（PTB）与丁酸激酶相关. 此外，ADP/ATP转运酶也发挥着重要的作用. ADP/ATP转运酶又被称为腺嘌呤核苷酸易位子或ADP/ATP载体蛋白，ADP/ATP转运酶通过ADP 与ATP相互转化产生能量从而为细胞提供能量[16]. 而在乙酸转化中，CoF420参与产甲烷菌中的氧化还原反应，充当电子载体. CoF430是甲基辅酶M还原酶的辅助因子，在甲烷生成的最后一步释放甲烷. 而辅酶M是古菌产甲烷菌代谢中甲基转移反应所需的辅酶.
综上所述，利用FBA不仅可以对EAD系统的代谢过程进行表征，还能对代谢通量进行分析和直观地了解代谢网络中不同代谢途径的产物生成情况以及代谢关键节点处的酶活性变化水平.
1. 实验部分（Experimental section）
1.1 实验装置
EAD实验装置由 电解电流及电压记录单元、 EAD反应单元和排水集气单元组成，EAD反应单元主要包含400 mL的发酵罐，其中电极距离为3.0 cm，一端的电极片完全地浸于发酵液中，另一端通过导线与宽屏无纸记录仪（SIN-R7000A，中国）相连；在EAD系统中，阳极为石墨电极，阴极为铂电极，参比电极为饱和的Ag/AgCl电极. EAD实验装置如图1所示.
图 1 EAD实验装置Figure 1. EAD experimental setupa. 电解电流及电压记录单元，b. EAD反应单元，c. 排水集气单元a. electrolysis current and voltage recording unit, b. EAD reaction unit, c. drainage gas gathering unit.1.2 接种物、缓冲营养液和微量元素液
厌氧活性污泥来自云南师范大学昆明实验室通过猪粪厌氧发酵. 经检测，pH值为8.07，TS为17.11%，VS为10.08%.
缓冲营养液配比：NaH2PO4∙2H2O（5.54 g·L−1）、Na2HPO4∙12H2O（23.09 g·L−1）、KCl（0.26 g·L−1）和NH4Cl（0.62 g·L−1）.
微量元素液配比：Na2WO4∙2H2O（0.03 g·L−1）、NaCl（1 g·L−1）、FeCl2∙7H2O（0.07 g·L−1）、CuSO4∙5H2O（0.01 g·L−1）、NiCl2∙6H2O（0.02 g·L−1）、C6H9NO6（1.50 g·L−1）、MgSO4（3.00 g·L−1）、AlK（SO4）2∙12H2O（0.01 g·L−1）、ZnCl2（0.13 g·L−1）、CaCl2∙2H2O（0.10 g·L−1）、H3BO3（0.01 g·L−1）、MnCl2∙4H2O（0.60 g·L−1）、CoCl2∙6H2O（0.10 g·L−1）、Na2MoO4（0.03 g·L−1）和复合维生素（1 粒·L−1）.
1.3 实验方法
EAD实验设置3个实验组，每组3个平行. 首先在每个实验组的发酵罐中添加：葡萄糖1.0 g，接种物120.0 g，缓冲营养液100.0 mL，微量元素液10.0 mL，再补加蒸馏水使物料的总质量为360.0 g；其次将密封好的发酵罐连接气体收集装置，再利用高纯氮排出体系内的溶解氧和空气（通气时间为3 min），使EAD体系处于厌氧状态；最后施加恒定电压1.0 V，进行培养.
培养阶段：将发酵罐置于恒温磁力搅拌器中，设置温度为30.0 ℃；每天监测pH值变化，待其恢复到7.0左右，立即添加等量的葡萄糖将体系培养至稳定.
扰动阶段：培养阶段结束后，测定发酵液中底物和代谢产物的浓度，同时记下该时间点为扰动的初始点，随后添加1.0 g的葡萄糖，施加扰动后，通过监测体系中底物的消耗量和代谢产物的生成量，然后进行代谢通量分析.
1.4 常规检测分析
日产气量：采用排水法法，每天定时记录产气量. TS和VS：在（105±5）℃下干燥并在（550±10）℃下马弗炉燃烧1 h后，测量污泥的. pH值：采用pH计（HAOSHI H-1008A，中国）.
VFAs：样品经离心分离，取上清液，采用气相色谱仪（FULI, GC9790II，中国），以FID为检测器进行测量[17]. 色谱柱为KB- FFAP（30 m×0. 32 mm×0. 25 μm）毛细管柱.
气体含量：采用气相色谱仪（FULI, GC9790II，中国），以TCD 检测器对H2、CH4和CO2含量进行测量. 色谱柱为TDX-01填充柱. 葡萄糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定[18].
1.5 酶活测量与分析
酶活测量采用改良的双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）方法[19-21]在测量过程中，以ADP/ATP转运酶、磷酸转乙酰酶（PTA）、乙酸激酶（AK）、磷酸转丁酰酶（PTB）、丁酸激酶（BK）、辅酶M（CoM）、甲基丙二酰CoA变位酶（MCM）、辅酶F420（F420）、辅酶F430（F430）为标准酶. 检测时在酶标包被板上设定空白孔、标准孔、待测样品孔. 空白孔不加样品及标准酶，作为对照，标准孔加标准酶，待测样品孔中先加酶试剂盒中的样品稀释液，然后再加待测样品. 按照酶试剂盒说明书进行操作，最后采用Epoch酶标仪在450 nm波长下进行测定，以空白孔调零依序测量各孔的吸光度（OD值），并通过标准曲线计算样品中酶的活性.
1.6 通量分析
通量分析采用通量平衡分析（FBA）的方法，采用代谢通量分析软件Cell Net Analyzer进行代谢网络的构建及分析. FBA是MFA中基于质量守恒的代谢过程研究常用的一种数学建模分析法[22]，在拟稳态条件下，模型中代谢产物处于平衡状态，此时，可将代谢物的通量描述为一个线性方程，只需对底物和相关产物的浓度变化进行测量，再采用线性规划或者计量矩阵分析方法则可确定每种产物的代谢通量[23].
2. 结果与讨论 （Results and discussion）
2.1 EAD培养阶段的产气及含量分析
EAD反应过程中产气特性的变化是表征反应器效能的重要因素. 图2为培养过程中的产气变化情况，从图2可以发现，在反应器启动阶段，气体中以CO2为主，随着反应器的运行，产甲烷菌逐渐生长富集. 在稳定阶段，其甲烷含量最高可以达到55%左右，葡萄糖厌氧消化中理论产甲烷含量在50%左右，也就是说，MEC的引入明显提升了葡萄糖的理论产甲烷率，而且此时CO2的含量降低到11%左右，明显的降低了CO2的排放. 在反应器稳定后，日产气量也得到了明显的提升，从最初的50 mL·d−1左右增加到了200 mL·d−1左右. 对于氢气含量，除启动阶段有氢气产生外，反应中后期基本没有氢气产生，这可能是由于前期pH较低，适于产氢菌的生长，中后期pH值恢复较快，可以迅速恢复至已6.5以上，不利于产氢菌的生长，导致氢气含量极低. 此外，也可能是由于电化学辅助促进了H2还原CO2途径产甲烷，使得反应器中的H2迅速被噬氢产甲烷菌消耗，从而提高了CH4的含量，降低了H2的含量.
图 2 EAD培养阶段中产气体积及气体组分含量Figure 2. Gas production volume and gas component content in EAD operation stage2.2 EAD培养阶段的VFAs的分析
VFAs是厌氧消化中重要的中间产物，其产生和分解过程受多种因素影响，同时也关系到EAD产甲烷过程的稳定性. EAD体系中 VFAs的浓度一旦超过 200 mmol·L−1 就有可能发生酸抑制问题[24]，并对产甲烷过程产生严重的影响，然而本次实验研究并未出现VFAs累积的现象. 图3显示了EAD培养过程中各短链有机酸的变化情况. 从图3可以看出，各短链有机酸的变化与底物补充时间相关，培养前期VFAs波动较大且浓度较高，但15 d后，因阳极上形成了电活性微生物膜，致使VFAs能够在阳极表面降解，尽管进料时间间隔缩短为3 d，也没有产生VFAs累积，表明EAD具有较强的抗酸化的能力.
图 3 EAD运行阶段中VFAs的含量变化Figure 3. Changes in the content of VFAs during the EAD operation stage在厌氧消化中丁酸累积是抑制厌氧消化的重要因素之一，由于丁酸的产氢产乙酸过程必须依赖氢还原CO2产甲烷过程，否则本身不能自发进行，一旦产氢产乙酸和产甲烷过程失衡，将会产生严重的丁酸抑制作用。然而在EAD中丁酸的降解除了依赖氢还原CO2产甲烷过程外，还可以在电活性微生物的作用下，在电极表面降解. 在这条途径中，丁酸分解为CO2、H+和电子， H+向阴极迁移在阴极上获得电子而形成H2，这部分H2同样被氢营养型产甲烷菌利用还原CO2，加强H2还原CO2产甲烷途径.
2.3 代谢网络构建
对于纯培养体系而言，由于体系内菌种单一，代谢产物和途径比较明确，构建与之相对应的代谢网络相对比较容易. 但对于复杂的混合培养而言，特别是像EAD这种由多种微生物构成的体系，变量较多，对于代谢网络的构建及分析难度较大[25]，为了使代谢通量分析能适用于混合体系，提出了“统一微生物”这一个概念[26]，同时国内外一些学者已经在部分混合体系中作了应用上的尝试，并且成功地建立了发酵制氢体系的代谢网络[27]，还有在新型多级厌氧甲烷反应器中也进行了FBA的研究[28]，但还需进一步地完善，才能使其适用于EAD的混合培养体系中. EAD是在AD中引入MEC，由于MEC的引入，使H+向阴极迁移，在阴极上生成H2，这在AD基础上增加了一条重要的产氢途径. 根据相关研究表明[9, 12]，在严格的厌氧条件下，丙酮酸几乎不会流向三羧酸循环，甲酸也不是所有严格厌氧菌都能产生. 结合相关研究[29-33]，构建了如图4所示的EAD代谢网络该网络包含了37个主要的代谢反应式，每一步的代谢的具体生化反应过程如表1所示.
表 1 EAD体系葡萄糖代谢过程包含的主要生化反应Table 1. The main biochemical reactions included in the glucose metabolism process of the EAD systemNO. 反应式 Equation NO. 反应式 Equation R1 GLC+PEP ∀ G6P + Pyr R20 HPr + 2 H2O ∀ HAc + CO2 +3 H2 R2 NADH + Pyr ∀ HLa + NAD R21 HBu + 2 H2O ∀ 2 HAc + 2 H2 R3 Pyr + NADH ∀ NAD + HFo +AcCoA R22 HPr = HPr （ext） R4 2 Fd + Pyr + CoA ∀ CO2 + AcCoA + 2 FdH R23 EtOH+ HPr ∀ Hva （ext） + H2O R5 2 Fd + NADH = 2 FdH + NAD R24 HFo = HFo （ext） R6 NADPH + NAD ⇌ NADH + NADP R25 CO2 = CO2 （ext） R7 2 NADH = H2 + 2 NAD R26 CO2 + 4 H2 = CH4 + 2 H2O R8 2 FdH = H2 + 2 Fd R27 H2 = H2 （ext） R9 HLa = HLa （ext） R28 2 AcCoA + H2 ∀ PrOH（ext） +2 CoA + CO2 R10 HLa + NADH ∀ HPr + NAD R29 HAc ∀ CO2 + CH4 R11 HFo ∀ CO2 + H2 R30 HAc = HAc （ext） R12 AcCoA + ADP + iP ∀ATP + HAc + CoA R31 EtOH = EtOH （ext） R13 AcCoA + 2 NADH ∀ EtOH + CoA + 2 NAD R32 HBu + EtOH ∀ HCa （ext） + H2O R14 2 AcCoA + NADH ⇌ CoA + H2O + CroCoA + NAD R33 HBu = HBu （ext） R15 CroCoA + 2 Fd + NADH ∀ ButCoA + 2 FdH + NAD R34 HBu + 2 NADH ∀ BuOH（ext） + CoA + 2 NAD R16 CroCoA + NADH ∀ ButCoA + NAD R35 Pyr ⇌ Pyr （ext） R17 ButCoA + ADP + iP ∀ HBu + ATP + CoA R36 CH4 = CH4 （ext） R18 2 CO2 + 4 H2 ∀ HAc +2 H2O R37 2 H+ + 2 e- = H2 R19 EtOH + 2H2O ∀ 4 H+ + HAc 注：iP为磷酸根离子，CoA为辅酶A，H+为氢离子，e-为转移电子或者电解协助装置提供的电子. Note: iP is the phosphate ion, CoA is the coenzyme A, H+ is the hydrogen ion, and e- is the electron provided by the transfer electron or electrolysis assistance device. | Show Table
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2.4 电压扰动对EAD产甲烷代谢通量的影响
在培养阶段中，当EAD运行稳定后，从取样口取样，检测残余葡萄糖和相关代谢物的含量，然后添加1 g的葡萄糖，以此时的状态为FBA的初始状态，实施电压扰动. 在对照组电压为1.0 V的基础上，扰动组1电压降低至0.6 V，而扰动组2增加至1.4 V. 14 h后，再次检测残余葡萄糖和相关代谢物，产气量和气体含量. 经过计算得到EAD扰动前后的发酵液中代谢产物的净生成速率，如表2所示.
表 2 EAD体系中关键代谢物的净生成速率①（mmol·L−1·h−1）Table 2. Net formation rate of key metabolites in EAD system①（mmol·L−1·h−1）代谢物Metabolites 对照组1.0 VControl group 1.0 V 扰动组0.6 VDisturbance group 0.6 V 扰动组1.4 VDisturbance group 1.4 V 葡萄糖② 1.1274 ± 0.0154 1.0958 ± 0.0055 1.1195 ± 0.0175 甲 酸 0.0032± 0.0000 0.0086 ± 0.0021 0.0093± 0.0026 乙 酸 0.7511 ± 0.1440 0.5229 ± 0.0770 0.7064 ± 0.1202 丙 酸 0.1061 ± 0.0096 0.0860 ± 0.0049 0.0902 ± 0.0023 丁 酸③ 0.4180± 0.0335 0.4218± 0.0391 0.4026 ± 0.0201 乳 酸 0.0107 ± 0.0046 0.0081 ± 0.0035 0.0128 ± 0.0056 丙酮酸 0.0156 ± 0.0037 0.0335± 0.0074 0.0261 ± 0.0171 戊 酸④ 0.0230 ± 0.0107 0.0107 ± 0.0046 0.0277 ± 0.0093 己 酸 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 乙 醇 0.0173 ± 0.0014 0.0092 ± 0.0019 0.0160 ± 0.0067 丙 醇 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 丁 醇 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 0.0000 ± 0.0000 CO2 0.2258 ± 0.0229 0.2255 ± 0.0376 0.2716 ± 0.0071 CH4 0.2947 ± 0.0127 0.4909 ± 0.0515 0.3924 ± 0.0293 H2 0.0281 ± 0.0231 0.0228 ± 0.0137 0.0039 ± 0.0024 注：表2中的实验数据①为电压扰动实验组的主要代谢物的净生成速率；葡萄糖②的测量值代表底物的净摄取速率；丁酸③为正丁酸和异丁酸的总和，戊酸④为正戊酸和异戊酸的总和. Note: The experimental data① in Table 2 are the net production rates of major metabolites in the voltage disturbance group; The measured value of glucose② represents the net uptake rate of substrate; Butyrate③ is the sum of n-butyrate and isobutyrate, valerate④ is the sum of n-valerate and isovalerate. | Show TableDownLoad:
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根据表2中的净生成速率，采用运行Cell Net Analyzer软件，获得EAD代谢通量分布信息，如图4所示，并以H2、CO2、HAc和CH4代谢物进行评价.
在0.6 V扰动下，NADH通量明显优于1.4 V电压扰动，且此条件下最终产物甲烷通量达到43.52，明显高于1.0 V和1.4 V下的26.14和34.81. 由图4可知，H2的代谢途径主要形成途径为：R7、R20、R21和R37. 由通量值可知，EAD中H2主要来源于电极反应R37，和丁酸降解为乙酸的途径R21，其次是NADH平衡调节产氢R7. CH4为最终的目标代谢物，主要由H2还原CO2途径R26和乙酸转化途径R29两条途径形成. EAD体系中CH4的合成途径是以乙酸转化途径占主导地位，其次为H2还原CO2途径，1.0 V下EAD体系的这两条途径的占CH4产生总量的64.95%和35.05%. 0.6 V和1.4 V扰动下，通过H2还原CO2产生的产甲烷（R26）分别占13.44%和12.76%，相比对照组5.97%均有所提高，表明电压扰动使得EAD产甲烷代谢途径偏向了氢营养型产甲烷. 值得注意的EAD产甲烷系统明显产生了甲酸，但根据代谢通量，CH4和H2并无一来源于甲酸，说明EAD反应体系中可能没有噬甲酸型产甲烷菌存在. 最终产物H2大多由EAD中的阴极产生，但在最终产物中，氢气通量明显下降，说明H2还原为CH4（R26）的途径较为活跃. 本次从发酵液代谢物中未检测到己酸、丙醇和己酸盐. 乙酸的来源有R12、R18、R19、R20和R21途径. 通量值表明乙酰辅酶A转化是乙酸最主要的来源，其次是丁酸转化、H2还原CO2、乙醇转化和丙酸转化. 其通量大小受多个中间产物的影响，但在电压扰动（0.6 V和1.4 V）下，其通量明显增大，其中以0.6 V扰动增幅最大，说明反应器中的产酸微生物在此时相对较活跃. 乳酸和乙醇的产生不利于H2的生产，图中0.6 V扰动下的乳酸通量较高，这也可能是导致了H2较低的原因之一.
2.5 酶活水平变化
表3为葡萄糖代谢过程中关键酶活性的变化. 其中ADP/ATP转运酶的活性，0.6 V和1.4 V扰动时的酶活性均高于对照组1.0 V 的239.28 IU·L−1. ADP/ATP是能量代谢的载体，为微生物生长和繁殖提供能量基础. 当电压扰动时，需要大量能量来使微生物群落发生转变，因此ADP/ATP转运酶酶活性增加. 在乙酸代谢途径中首要的是乙酸的活化，它需要由乙酸激酶AK和磷酸转乙酰酶PTA的先后催化来进行. 在ATP参与下由乙酸激酶AK催化，乙酸被磷酸化为乙酰磷酸，然后乙酰磷酸再在磷酸转乙酰酶PTA催化下生成乙酰辅酶A，进行乙酸代谢[34-35]. 但从图5中可以看出，所产生的乙酸大部分都R12途径逆反应生成乙酰辅酶A，其中当进行0.6 V扰动时，R12逆反应通量最大，这与在0.6 V时PTA活性达到115.69 U·L−1检测结果相吻合. 当进行电压扰动时，EAD体系内在乙酸代谢中PTA和AK的酶活调节现象相似，有研究表明[36]当谷氨酸棒杆菌生长在以乙酸（取代葡萄糖）为碳源的培养基上时，PTA和AK酶活性明显提高，该现象是微生物碳代谢中葡萄糖效应的具体体现，表明酶在基因表达环节上可能存在葡萄糖基质上的负调控效应或乙酸基质上的正调控效应. 降低电压，PTA与AK酶活性增加. PTB和BK酶与丁酸产生有关，由图5代谢通量可知，丁酸的产生是从乙酰基通过PTB与BK的共同催化所形成. 在丁酸代谢中，PTB催化反应产生大量的丁酰辅酶A，但产生的丁酸大部分却通过R21转化为乙酸. 在0.6 V扰动下，PTB的酶活性352.19 U·L−1，明显高于对照组310.19 U·L−1和1.4 V的338.04 U·L−1，但BK酶活性，对照组1.0 V的酶活性52.59 U·L−1，要略高于0.6 V的50.92 U·L−1. PTB酶活性高于BK，这是由于PTB需要先将丁酰辅酶A转化为在丁酰磷酸，最终再由BK催生与ADP反应形成丁酸和ATP. 而BK在1.0 V与0.6 V酶活性差异不大，这是可能是由于电压BK影响不大. 辅酶M在甲烷形成的最终反应步骤中充当甲基的载体. CoM的化学结构虽然很简单，但在甲基还原酶的反应体系中却有高度的专一性，因此在进行电压扰动时，辅酶M的酶活性变化差异不大. 值得一提是，MCM酶活性变化与CoM酶活性变化相似. 在丙酮酸转化为丙酸代谢过程中，关键酶为MCM，在电压扰动下，酶活性变化差异较小. 结合图6中的产丙酸代谢通量图可以看出，丙酸通量变化也差异较小，说明酶活性与所构建的代谢通量有较好的相关性. CoF420在产甲烷途径中电子载体，而CoF430产甲烷古菌形成甲烷最后步骤作为甲基载体的四吡咯化合物，因此产甲烷的总通量应当取决于CoF420与CoF430共同酶活性，在0.6 V电压扰动下，总酶活性为63.01 IU·L−1，对照组为56.94 IU·L−1，1.4 V扰动为59.57 IU·L−1，这与图5中产甲烷代谢通量中，0.6 V时产甲烷最多，1.4 V次之，对照组最少结果相吻合.
表 3 代谢途径中关键酶活性水平的变化Table 3. Changes in activity levels of key enzymes in metabolic pathways酶名称Enzyme 对照组1.0 VControl group 1.0 V 扰动组0.6 VDisturbance group 0.6 V 扰动组1.4 VDisturbance group 1.4 V 单位Unit ADP/ATP转运酶 239.28±23.54 337.04±7.88 344.23±7.54 IU·L−1 磷酸转乙酰酶（PTA） 99.78±6.39 115.69±11.32 97.69±7.50 U·L−1 乙酸激酶（AK） 106.26±24.23 151.38±28.81 120.25±28.93 U·L−1 磷酸转丁酰酶（PTB） 310.19±1.29 352.19±12.66 338.04±22.08 U·L−1 丁酸激酶（BK） 52.59±6.63 50.92±0.90 36.08±4.89 U·L−1 辅酶M（CoM） 173.84±17.97 191.01±23.53 176.85±12.82 U·L−1 甲基丙二酰CoA变位酶（MCM） 58.17±4.06 51.71±2.71 54.20±3.09 U·L−1 辅酶F420（CoF420） 40.38±2.22 43.72±4.37 36.86±6.48 IU·L−1 辅酶F430（CoF430） 16.56±2.05 19.29±1.55 22.71±2.14 IU·L−1 | Show TableDownLoad:
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3. 结论（Conclusion）
本研究通过外加电压对EAD体系扰动过程中代谢通量的影响，对EAD代谢网络通量上的变化结合关键酶活性的变化，进一步分析电压扰动对EAD系统代谢产物生成上的提高或者降低提供理论依据，由通量分析结果可知，EAD体系中并没有很高的H2生成，相反，EAD体系中产甲烷能力得到提高. 原因可能是由于电解协助装置的引入，极大地促进H2的产生，随后，所产生的H2被用来还原CO2产乙酸和产甲烷的代谢过程，进而提升了EAD系统的产甲烷能力. 结合关键节点处酶活性变化，酶活性与代谢通量有着较好的相关性. 在进行电压扰动时，ADP/ATP转运酶、PTA与AK、PTB与BK，这些酶活性均随电压变化而产生较大的差异. 而CoM与MCM酶活性，具有高度专一性的酶，随电压扰动变化不大. 在0.6 V电压扰动下，CoF420与CoF430酶活性与产甲烷代谢通量变化相吻合.
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图 1 长江口及其邻近海域站位设置
Figure 1. The sampling stations in the Changjiang Estuary and its adjacent waters
图 2 长江口及其邻近海域盐度、温度及钴浓度分布图
Figure 2. The distribution of salinity, temperature and Co in the Changjiang Estuary and its adjacent waters
图 3 长江口Co跨越盐度梯度的分布状况
Figure 3. Distribution of Co across the salinity gradient in the Changjiang Estuary
表 1 试剂与材料
Table 1. Reagents and materials
类别 Category 名称 Name 纯度 Purity 公司 Company 用途 Application 试剂 硝酸 Optima级别 Thermo Fisher 配置洗脱液及润洗液等 盐酸1 Optima级别 Thermo Fisher 样品及超纯水酸化等 醋酸 Optima级别 Thermo Fisher 配制缓冲液等 氨水 Optima级别 Thermo Fisher 配制缓冲液等 盐酸2 Trace Metal级别 Thermo Fisher 实验用具清洗 钴标准溶液 ICP-MS级别 Inorganic Ventures 配置外标 Citranox酸性清洁剂 — Alconox 清洁实验所需用具 材料 低密度聚乙烯瓶 — Nalgene 样品采集及酸化 聚乙烯离心管 — VWR Scientific 样品预处理 低密度聚乙烯背板 — ESI 洗脱液收集
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表 2 ICP-MS/MS的运行条件
Table 2. Operating conditions of ICP-MS/MS
运行参数Operating parameters 取值Value 聚焦透镜Focus Lens/V 1.25 透镜1 Lens/V −350 透镜2 Lens/V −148 碰撞/反应气体流速/ （mL·min−1） 4.5 偏转透镜 Deflection lens/V −30 雾化室温度 Spray Chamber temperature/℃ 2.7 蠕动泵转速/ （r·min−1） 40 冷却气流速 Cool flow /（L·min−1） 14 采样深度 Sampling depth/mm 5 功率 Plasma power/W 1550 辅助气流速 Auxilliary flow/ （L·min−1） 0.8 提取透镜电压 Extraction lens /V −120 载气流速 Nebulizer flow/ （L·min−1） 1.08
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表 3 标准参考物质Co分析结果（ nmol·L−1）
Table 3. Reported analytical results of certified reference seawater（ nmol·L−1）
国际标准物质Certified reference seawater NASS-7（n=10） CASS-6（n=10） SLEW-3（n=10） SLRs-6（n=10） 测试值 0.0007±0.0001 0.0036±0.0004 0.002±0.000 0.003±0.000 标准值 0.0009±0.0001 0.0040±0.0003 0.002±0.001 0.003±0.001 注：n为测试样本数，标准值由加拿大国家研究委员会发布. Note: n is the number of test samples, and the standard value is published by the National Research Council of Canada.
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表 4 本研究三个航次表层水温度（T）、盐度（S）和钴浓度（Co）
Table 4. Temperature （T）, salinity （S） and cobalt concentration（Co） in surface water of the three cruises in this study
2019年9月（秋季）Autumn 2021年3月（春季）Spring 2021年7月（夏季）Summer 站位Site 盐度/‰Salinity 温度/℃Temperature Co/（nmol·L−1） 站位Site 盐度/‰Salinity 温度/℃Temperature Co/（nmol·L−1） 站位Site 盐度/‰Salinity 温度/℃Temperature Co/（nmol·L−1） C1 0.00 28.92 0.15 B1 0.20 12.41 0.22 B1 0.13 28.41 0.45 C2 0.00 28.67 0.19 B2 0.25 12.08 0.23 B2 0.14 28.62 0.46 C3 0.10 28.79 0.15 B3 1.17 11.88 0.22 B3 0.14 28.49 0.42 C4 0.10 28.87 0.24 C1 0.19 12.73 0.37 C1 0.14 28.39 0.40 C5 0.00 28.92 0.19 C2 0.20 12.45 0.28 C2 0.14 28.46 0.54 C6 2.80 27.77 0.10 C3 0.24 12.24 0.27 C3 0.15 28.48 0.52 C7 12.50 27.25 0.06 C4 1.00 11.97 0.26 C4 0.11 28.43 0.48 C8 15.10 27.47 0.06 C5 6.37 11.24 0.25 C5 2.84 28.30 0.41 C9 18.80 — 0.08 A5-1 23.69 10.10 0.13 A5-1 15.98 24.62 0.21 C10 22.10 26.88 0.05 A5-2 28.93 11.04 0.13 A5-2 21.45 25.06 0.19 C11 24.60 26.39 0.05 A5-3 30.64 11.90 0.12 A5-3 31.39 22.89 0.22 C12 22.10 — 0.12 A5-4 30.36 11.37 0.12 A5-4 29.77 26.69 0.27 C13 25.80 26.40 0.09 A5-5 31.63 12.08 0.08 A5-5 30.92 27.61 0.03 C14 23.10 27.42 0.09 A5-6 32.49 12.36 0.09 A5-6 30.06 28.03 0.10 C15 25.60 27.13 0.09 A5-7 32.71 12.52 0.08 A5-7 29.61 28.20 0.09 C16 25.60 27.43 0.06 A5-8 34.07 12.74 0.06 A5-8 29.08 28.24 0.11 C18 32.10 — 0.06 A6-1 21.09 10.66 0.12 A6-1 19.78 26.44 0.22 Y1 28.80 27.14 0.11 A6-2 26.89 11.09 0.07 A6-2 27.49 23.92 0.28 Y2 27.80 29.07 0.06 A6-3 31.37 12.12 0.13 A6-3 27.66 24.22 0.21 Y3 29.50 29.46 0.10 A6-4 33.20 14.14 0.05 A6-4 29.56 28.29 0.19 Y4 28.40 28.82 0.05 A6-5 33.51 14.17 0.06 A6-5 28.19 28.37 0.11 Y5 28.40 28.84 0.12 A6-6 33.94 14.01 0.07 A6-6 28.46 28.53 0.11 Y6 30.40 29.00 0.15 A6-7 34.01 13.49 0.06 A6-7 29.91 28.22 0.09 Y7 30.60 27.63 0.07 A6-8 34.28 14.89 0.05 A6-8 29.97 28.77 0.13 A7-1 25.89 11.08 0.12 A7-2 27.44 11.24 0.12 A7-3 29.62 12.28 0.12 A7-4 31.53 12.41 0.06 A7-5 34.29 15.62 0.10 A7-6 34.50 16.26 0.07 A7-7 34.82 16.74 0.12 A7-8 34.52 17.00 0.05 注：“—”表示数据缺失. Note: “—” means data missing.
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表 5 长江口及其临近水域的钴浓度、盐度及温度
Table 5. Co, salinity and temperature of the Changjiang Estuary and its adjacent waters
季节Season 水域Area 盐度/‰Salinity 温度/℃Temperature Co/（nmol·L−1） 样本数Number 最小值Min 最大值Max 均值Mean 样本数Number 最小值Min 最大值Max 均值Mean 样本数Number 最小值Min 最大值Max 均值Mean 秋 全水域 24 0.00 32.10 18.93±11.82 21 26.39 29.46 28.01±0.97 24 0.05 0.24 0.10±0.05 淡水 5 0.00 0.10 0.04±0.05 5 28.67 28.92 28.83±0.10 5 0.14 0.24 0.18±0.04 冲淡水 16 2.80 29.50 22.56±7.20 14 26.39 29.46 27.68±0.99 16 0.05 0.12 0.08±0.02 海水 3 30.40 32.10 31.03±0.93 2 27.63 29.00 28.31±0.97 3 0.06 0.15 0.09±0.05 春 全水域 32 0.19 34.82 23.60±13.56 32 10.10 17.00 12.76±1.76 32 0.05 0.37 0.13±0.08 淡水 5 0.19 0.25 0.22±0.03 5 12.08 12.73 12.38±0.24 5 0.22 0.37 0.27±0.06 冲淡水 10 1.00 29.62 19.21±11.64 10 10.10 12.28 11.26±0.64 10 0.07 0.26 0.16±0.06 海水 17 30.36 34.82 33.05±1.46 17 11.37 17.00 13.75±1.80 17 0.05 0.13 0.08±0.03 夏 全水域 24 0.11 31.39 18.46±13.48 24 22.89 28.77 27.3±1.8 24 0.03 0.54 0.26±0.16 淡水 7 0.11 0.14 0.13±0.01 7 28.39 28.62 28.47±0.08 7 0.40 0.54 0.47±0.05 冲淡水 14 2.84 29.97 24.98±7.73 14 23.92 28.77 26.99±1.80 14 0.09 0.41 0.19±0.09 海水 3 30.06 31.39 30.79±0.68 3 22.89 28.03 26.18±2.8 3 0.03 0.22 0.12±0.10
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表 6 各水域Co浓度与其它环境因子的皮尔逊相关性
Table 6. Pearson correlation between Co and other environmental factors in different areas
水域Area 盐度Salinity 温度Temperature 氮盐DIN 磷盐DIP 硅盐DSi 叶绿素Chlorophyll 溶解氧Dissolved oxygen 全水域 −0.73** 0.2 0.76** 0.33** 0.51** −0.22* −0.36** 淡水 0.27 0.25 0.70* −0.13 −0.72* −0.71** −0.75** 冲淡水 −0.44** −0.17 0.63** 0.22 0.39* −0.38* −0.57** 海水 −0.39 0.18 0.40 0.74** −0.06 0.36 0.02 注：**指相关性在0.01 级别上显著（双尾检验）；*指相关性在0.05级别上显著（双尾检验）. Note: ** indicates a very significant correlation at the 0.01 level （two-sided）, and * indicates a significant correlation at the 0.05 level （two-sided）.
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表 7 Co浓度在不同季节与其他环境参数的皮尔逊相关性
Table 7. Pearson correlation between Co and other environmental factors in different seasons
季节Season 盐度Salinity 温度Temperature 氮盐DIN 磷盐DIP 硅盐DSi 叶绿素Chlorophyll 溶解氧Dissolved oxygen 秋季 −0.65** 0.55** 0.61** 0.10 0.62** −0.40 −0.15 春季 −0.93** −0.34 0.92** 0.56** 0.92** 0.83** −0.30 夏季 −0.92** 0.18 0.78** 0.67* 0.58* 0.15 −0.76** 注：**指相关性在0.01 级别上显著（双尾检验）；*指相关性在0.05级别上显著（双尾检验）. Note: ** indicates a very significant correlation at the 0.01 level （two-sided）, and * indicates a significant correlation at the 0.05 level （two-sided）.
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表 8 各季节长江口Co移除率及有效输送通量
Table 8. Removal rate and effective flux of cobalt in the Changjiang Estuary in different seasons
时间Time 季节Season C0 / （nmol·L−1） y0 / （nmol·L−1） 移除率/%RR 径流量/亿m3Runoff 有效通量/geffective flux 19年9月 秋 0.17 0.04 74.82 632.4 1.60×105 21年3月 春 0.26 0.25 4.23 530.3 7.78×105 21年7月 夏 0.46 0.33 27.74 1 178 2.31×106
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表 9 世界大河Co浓度、径流量及归一化浓度（Cn）
Table 9. Cobalt concentration, runoff and normalized concentration（Cn） in several worldwide rivers
河流River 注入海洋Sea areas Co/（nmol·L−1） 径流量/亿m3Runoff 归一化系数Normalization coefficient Cn/（nmol·L−1） 参考文献References 亚马逊河（Amazon River） 大西洋 2.01 47462 0.47 0.94 [64-65] 密西西比河（Mississippi River） 墨西哥湾 0.16 6307 0.06 0.01 [66-67] 长江（Changjiang River） 东海 0.16 9282 0.09 0.01 本研究，[68] 黄河（Yellow River） 渤海 0.43 443 0.00 0.00 [42,68] 珠江（Pearl River） 南海 4.85 4821 0.05 0.23 [68-69] 锦江（韩国）（Geum River） 黄海 1.2 64 0.00 0.00 [33,70] 加尔沃斯顿湾（Galveston Bay） 大西洋 1.6 13600 0.13 0.22 [58] 万泉河（Wanquan River） 南海 1.16 52 0.00 0.00 [71] 文昌/文教河（Wenchang/Wenjiao River） 南海 3.07 6 0.00 0.00 [71] 麦肯齐河（Mackenzie River） 北冰洋 1.1 3160 0.03 0.03 [35] 淡水河（Tanshui River） 台湾海峡 0.3 70 0.00 0.00 [72] 刚果河（Congo River） 大西洋 1 12331 0.12 0.12 [73-74] 圣劳伦斯河（Saint Lawrence River） 大西洋 1.1 3374 0.03 0.04 [74-75]
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