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水体的富营养化加剧了蓝藻水华的频繁爆发。这不但影响水体景观效果，还会释放藻毒素，严重威胁水生态系统的稳定和公共卫生安全[1]。在众多藻毒素中，微囊藻毒素(microcystins, MCs)是一种具有显著肝脏毒性的七肽环状毒素，是世界各地水体中最为常见且危害最大的藻毒素。微囊藻毒素-LR(MC-LR)是MCs单体中分布最广毒性最强的一类，世界卫生组织(WHO)规定其在饮用水中最高含量不得超过1.0 µg·L−1[2]。鱼腥藻毒素(anatoxin, ANTXs)是一类毒性大、活性高的神经毒素，不慎接触会导致人和动物迅速中毒死亡。鱼腥藻毒素-a(ANTX-a)是鱼腥藻毒素中含量最高的一种单体，饮用水中最大安全剂量为3.0 µg·L−1[3]。在蓝藻水华频发水域，70%以上监测水体中都同时检测到MCs与ANTXs，表明两种毒素时空共存已普遍存在，且MCs或ANTXs浓度通常在1—100 µg·L−1，极端状况下会在短时间内高达1000 µg·L−1以上[4]。这些藻毒素通过灌溉、溢流、打捞堆放、堆沤还田(特别是蓝藻堆肥后施入农田)等途径进入农田系统[5-6]。研究发现，MCs被农作物吸收积累后，不仅影响农作物生长发育，如降低光合效率、破坏激素平衡、抑制抗氧化酶活性等[7-8]，也会在植物可食部分积累并通过食物链传递威胁人体健康[9-10]。在调查35种农作物暴露于MCs的结果显示，MCs残留量最高的是生菜(Lactuca sativa)、欧芹(Petroselinum crispum)、茴香(Foeniculum vulgare)和卷心菜(Brassica oleracea)等蔬菜，其次是玉米(Zea mays)、胡萝卜(Daucus carota)和小麦(Hordeum vulgare)等作物[11]。因而关于藻毒素的植物毒理学研究近年来也备受关注。然而已有研究大多集中在MCs对植物生理生化代谢的影响，关于ANTXs的研究多集中在水生植物[12]，关于MCs和ANTXs对植物的复合影响却鲜有报道。农作物在人类膳食结构中占有重要地位，如能明确MCs和ANTXs对农作物的复合作用机制，将为客观评价藻毒素的生态风险提供新依据，也为保障食品安全提供新的数据。
活性氧(reactive oxygen species, ROS)是植物有氧代谢中具有很强毒性的副产物，主要包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2·－)、羟基自由基(·OH)等[13]。作为信号分子，逆境迫使植物细胞中积累大量ROS以诱导防御基因的表达，进而调控植物对逆境的适应性。同时大量积累的ROS会引发氧化损伤，甚至导致细胞死亡[14]。因此，逆境下植物维持胞内ROS稳态是提高植物耐受性的重要机制之一。例如，MCs胁迫下水稻(Oryza sativa)中抗氧化酶清除ROS的能力强于黄瓜(Cucumis sativus)，这也是水稻耐受MCs胁迫能力强于黄瓜的主要因素[8]。基于ROS水平与植物耐受环境胁迫机制的密切关系，从活性氧稳态(即产生与清除间的平衡)的角度去理解MCs和ANTXs对植物生长影响的复合作用特征，可为清晰植物耐受蓝藻毒素胁迫的适应机制提供新数据。鉴于此，本文选取广泛种植的生菜(Lactuca sativa)为研究对象，以调控活性氧生成与去除的重要酶类为切入点，探究MCs与ANTXs对生菜中活性氧稳态影响的内在机制，为客观评价蓝藻毒素的生态风险提供新的数据。
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本研究所采用的MCs和ANTXs均提取自蓝藻细胞。用于提取微囊藻毒素(MCs)的新鲜蓝藻打捞自无锡太湖，提取与分析方法参照文献[9]。通过酶联免疫(ELISA)测定总MCs浓度，再通过高效液相色谱(HPLC)确定各MC变体占比(其中MC-LR、MC-RR和MC-YR分别占62.66%、28.48%和0.68%)。产生ANTXs的水华鱼腥藻(FACHB-1255)采购自中国科学院淡水藻种库(FACHB)，提取与分析方法参照文献[15]。同样通过ELISA测定总ANTXs浓度，再通过HPLC确定ANTXs各变体占比(ANTX-a: HANTX-a=76.4%:23.6%)。
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将籽粒饱满的生菜(Lactuca sativa L.)种子用0.1% HgCl2去离子水浸泡4 h，在黑暗中发芽(温度20 ℃；相对湿度70%)。待生菜长出两片真叶后移入含有营养液的5 L周转箱进行培养(每箱6株)，培养条件为光强为350 µmol·m−2·s−2(日/夜：14 h/10 h)，温度为25 ℃/18 ℃(日/夜)，相对湿度80%。营养液每7 天更换1次，培养30 d后处理。参考自然水体中MCs与ANTXs出现频率较高的环境浓度范围, 将培养成熟的生菜移至含不同浓度MCs、ANTXs及MCs+ANTXs的营养液中进行处理。实验对照(CK，营养液中无藻毒素)，单一MCs处理(营养液中MCs浓度分别为5 µg·L−1和100 µg·L−1)，单一ANTXs处理(营养液中ANTXs浓度分别为5 µg·L−1和100 µg·L−1)和MCs+ANTXs复合处理(营养液中MCs和ANTXs浓度为(5+5) µg·L−1和(100+100) µg·L−1。每处理重复3次，处理7 d后收获。
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采用电子天平测量生菜生物量。参考张清航等[16]的方法测定植物体内MDA含量，采用硫酸钛法测定H2O2含量[17]和羟氨氧化法测定O2·−含量[18]。参照关美艳[19]的方法测定NADPH氧化酶活性。采用Zhang等[20]的方法进行LsRbohA引物设计和扩增程序，基因相对表达量采用2−ΔΔCT法进行计算。采用FRAP法测定植株的总抗氧化能力[21]。SOD和CAT活性的测定参考顾艳芳等[22]的方法并稍作改动。MCs和ANTXs对生菜的复合影响作用使用Abotts公式[23]进行具体评估。
其中，A是单一MCs引起生菜指标的抑制程度；B是单一ANTXs引起生菜指标的抑制程度；C是MCs+ANTXs复合处理引起生菜指标的抑制程度；Cexp是预期抑制率；RI为抑制比率。
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所有数据均以3次独立试验的平均值±标准误差(Mean±SD)表示。采用Levene检验分析各组方差的同质性，组间差异通过LSD检验的单因素方差进行评估(P<0.05)。
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实验中以生物量(FW)表征生菜生长情况，以丙二醛(MDA)含量衡量植物氧化损伤程度[24]，结合ROS中重要成员H2O2和O2·−含量变化，探究MCs与ANTXs对生菜中ROS稳态的影响。如表1所示，与CK相比，低浓度(5 µg·L−1)MCs、ANTXs及MCs+ANTXs((5+5) µg·L−1)复合处理分别促进生菜生物量增加75.3%、85.6%和63.3% (P<0.05)，其中MCs+ANTXs((5+5) µg·L−1)组生物量低于单一MCs(5 µg·L−1)或ANTXs(5 µg·L−1)。同时，低浓度(5 µg·L−1)MCs或ANTXs对叶片中MDA、H2O2和O2·−含量无显著影响(P>0.05)，其中MCs+ANTXs(5+5) µg·L−1复合处理诱导H2O2和O2·−含量小幅上升且MDA含量略高于CK(P<0.05)。综上结果可知，低浓度MCs、ANTXs及MCs+ANTXs复合处理促进生菜生长，呈现Hormesis效应。这种低浓度毒素促进作用可能与刺激植物体内生长促进型激素(生长素IAA、玉米素ZT和赤霉素GA3)含量升高有关[25]。此外，低浓度毒素未引起生菜活性氧大量积累，也未引起脂膜过氧化损伤，表明此时毒素胁迫强度未超出生菜的自调节范围，这也可能是生菜生长仍能正常进行的又一原因。与低浓度处理不同，高浓度(100 µg·L−1)MCs与MCs+ANTXs(100+100) µg·L−1复合处理降低生菜生物量达27.7%、5.1%和16.8%(P<0.05)，其中高浓度(100 µg·L−1)ANTXs对生菜生物量无明显影响(P>0.05)，这可能与毒素本身的理化性质，如分子量、作用方式以及毒性差异等原因有关[26]。Ariel等[12]发现ANTX-a浓度高达5000 µg·L−1时才会严重抑制品藻的生长。高浓度MCs、ANTXs及MCs+ANTX处理导致叶片中MDA、H2O2和O2·−含量显著增加(P<0.05)，其中MDA、H2O2和O2·−含量增幅排序为MCs>MCs+ANTXs>ANTXs。以上结果说明100 µg·L−1MCs或ANTXs诱导了ROS含量升高而导致脂膜损伤，这可能是导致高浓度MCs和MCs+ANTX抑制生菜生长的原因之一。其中高浓度MCs+ANTXs抑制生菜生长的程度低于单一MCs，可能与MCs+ANTXs诱导生菜中产生ROS含量低于单一MCs有关。前期研究也发现MCs对植物细胞中ROS平衡的影响程度受MCs浓度、暴露时间以及植物种类等因素调节，可以反映植物耐受MCs的能力[8]。结合生物量、ROS水平和MDA分析，生菜能够耐受低浓度(5 µg·L−1)毒素胁迫，但不能耐受高浓度(100 µg·L−1)胁迫，且对高浓度MCs+ANTXs复合胁迫的耐受性强于单一MCs却弱于单一ANTXs，这可能与维持细胞内活性氧稳定的能力有关。
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质膜上的NADPH氧化酶是植物细胞活性氧产生的主要酶之一[27]，它能够将O2催化成O2·−，因此可用来表征植物ROS生成能力[28]。LsRbohA是编码生菜NADPH氧化酶的关键基因。与CK相比，低浓度(5 µg·L−1)MCs或ANTXs处理对生菜叶片中NADPH氧化酶活性及LsRbohA相对表达量均无显著影响(P>0.05)(图1)，MCs+ANTXs复合处理显著提高了NADPH氧化酶活性，LsRbohA的相对表达量上调137.8%(P<0.05)。这表明低浓度MCs或ANTXs对生菜叶中ROS的生成无影响，这是生菜叶片中ROS维持稳态的原因之一。而低浓度(5+5) µg·L−1MCs+ANTXs复合下生菜叶片中LsRbohA表达量的上调可能是NADPH氧化酶活性上升的原因之一。结合生菜生物量、ROS含量和MDA含量(表1)分析可知，低浓度MCs+ANTXs复合处理通过促进NADPH氧化酶活性诱导ROS生成增多，促使防御系统及时对外界环境变化做出适应性应激，避免氧化损伤而不影响植物生长[29]。高浓度MCs、ANTXs和MCs+ANTXs复合处理显著上调LsRbohA表达272%—657%，且诱导NADPH氧化酶活性上升(P<0.05)，其中酶活性增幅排序为MCs>MCs+ANTXs>ANTXs。表明高浓度(100 µg·L−1)MCs、ANTXs和MCs+ANTXs复合处理下生菜叶片中LsRbohA表达量大幅上升，合成酶蛋白增多，这可能是NADPH氧化酶活性上升的原因之一。NADPH氧化酶催化生成大量ROS，促发防御系统应激，但仍无法抵御高浓度毒素的伤害，最终引起氧化损伤而抑制生长(表1)。Pérez等[30]也发现，NADPH氧化酶是植物响应非生物胁迫下初始ROS升高的主要原因之一。同时H2O2可以诱导NADPH氧化酶基因Rboh表达[28],这是植物遭受非生物逆境的威胁时，信号分子H2O2启动一系列抗逆相关基因表达来缓解或抵御非生物逆境胁迫对植物造成的危害[31-32]。因而本实验中高浓度MCs+ANTXs复合处理下生菜NADPH氧化酶活性高于单一ANTXs却低于MCs, 这可能是MCs+ANTXs处理组生菜中ROS含量高于单一ANTXs而低于单一MCs的主要因素之一。
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植物细胞中ROS平衡也受抗氧化系统的调节。SOD作为植物抗氧化系统的第一道防线，将胁迫诱导的过量O2·−歧化为H2O2和O2。H2O2在第二道防线CAT的催化下分解为H2O和O2。考虑到植物拥有众多抗氧化酶类和非酶类，将抗氧化酶活性与总抗氧化能力(FRAP)结合能更全面地反映植物细胞清除ROS的能力[21]。如图2所示，与CK相比，低浓度(5 µg·L−1)MCs、ANTXs和MCs+ANTXs(5+5) µg·L−1复合处理显著提高生菜的FRAP (P<0.05)，促进SOD活性上升(除单一ANTXs处理组外)，而对CAT活性无显著影响(P>0.05)。表明低浓度毒素处理组诱导SOD活性和FRAP上升，维持胞内ROS稳定。低浓度毒素处理下第二道防线的CAT未应激启动再次证实，该强度胁迫未超出生菜耐受范围。高浓度(100 µg·L−1)MCs、ANTXs和MCs+ANTXs显著促进生菜叶片中的SOD和CAT活性上升(P<0.05)，增幅排序为MCs>MCs+ANTXs>ANTXs。生菜叶片的FRAP变化却不尽一致，在100 µg·L−1 MCs处理下降低(P<0.05)，在100 µg·L−1 ANTXs处理下上升(P<0.05)，而在MCs+ANTXs(100+100) µg·L−1处理下无显著变化(P>0.05)。结合FW、MDA和ROS含量变化(表1)分析发现，高浓度(100 µg·L−1)毒素促发SOD和CAT活性升高不足以清除过量生成的ROS，胞内ROS稳态被破坏，氧化损伤发生，这也是生长受抑制的原因之一。不同高浓度毒素处理下生菜FRAP变化不一致，这可能是由于植物体内抗氧化酶类和非酶类对不同毒素胁迫的响应程度有差异。例如酸雨胁迫下水稻幼苗SOD、CAT和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性增加，而抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性降低[33-34]。此外，酚类和类黄酮物质也属于植物的非酶抗氧化剂防御系统的成员，其含量或状态变化也会影响细胞总抗氧化能力[35]。因此，生菜叶中SOD、CAT和FRAP对高浓度(100 µg·L−1)MCs、ANTXs和MCs+ANTXs处理响应存在差异，其中较高的SOD和CAT活性及FRAP有助于缓解高浓度毒素诱导的ROS过量积累，对维持ROS稳态有利，这也许是MCs+ANTXs组ROS含量高于单一ANTXs而低于单一MCs的又一原因。
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两种不同污染物对受试生物的影响可能呈现独立作用、协同作用、加和作用或者拮抗作用。为客观评价MCs和ANTXs对生菜活性氧稳态的复合影响，分析了MCs+ANTXs对生菜ROS稳态相关指标复合影响的特征(表2)。当RI值>1时，呈现协同效应；RI=1，呈现加和效应；RI<1，则呈现拮抗效应[36]。
如表2所示，MCs+ANTXs(5+5) µg·L−1对MDA含量、H2O2、NADPH氧化酶与CAT活性抑制比率RI值均显著>1，呈现协同效应；而MCs+ANTXs(100+100) µg·L−1对MDA含量、H2O2、NADP氧化酶与CAT活性抑制比率RI值均显著<1，呈现拮抗效应。表明随着MCs和ANTXs浓度升高，两者间复合作用特征由协同作用转为拮抗作用。Wang等[36]研究发现低浓度MC-LR和多环芳烃(菲)对浮萍生长和抗氧化系统产生协同作用，而高浓度呈现拮抗或加和作用。因此，MCs与ANTXs对生菜生长与ROS稳态的复合作用特征受毒素浓度的影响。其中，MCs+ANTXs(100+100) µg·L−1对以上所有参数的抑制比率(RI)均<1，表明高浓度MCs+ANTXs对生菜复合作用特征主要呈拮抗效应，这与Li等研究结果一致[37]，他们也发现MC-LR和ANTX-a对苦草生长和蛋白质的复合作用呈现拮抗效应。这与MCs或ANTXs进入细胞存在竞争有关，也可能与铜绿微囊藻与水华鱼腥藻之间存在竞争关系有关。例如在共培养的条件下，水华鱼腥藻对铜绿微囊藻有显著的抑制作用[38]。以上可以推测，水体中一定浓度的ANTXs可以减轻MCs对生菜的氧化伤害。
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(1)低浓度(5 µg·L−1)MCs、ANTXs与MCs+ANTXs诱导生菜中SOD活性和总抗氧化能力(FRAP)上升，利于维持ROS平衡，避免了氧化损伤，促进生物量增加63.3%—85.6%，表明低浓度(5 µg·L−1)MCs、ANTXs和MCs+ANTXs对生菜生长有利。
(2)高浓度(100 µg·L−1)MCs、ANTXs与MCs+ANTXs上调生菜叶片中LsRbohA表达并提高NADPH氧化酶活性，生成大量ROS促发防御系统应激，而SOD和CAT活性的上升不足以清除大量ROS，诱发氧化损伤而抑制生菜生长，降幅为MCs(27.7%)>MCs+ANTXs(16.8%)>ANTXs(5.1%)。
(3)复合特征分析发现，MCs+ANTXs(5+5) µg·L−1对MDA含量、H2O2、NADP氧化酶与CAT活性影响呈现协同效应，而MCs+ANTXs(100+100) µg·L−1则呈现拮抗效应。表明MCs+ANTXs对生菜复合作用受毒素浓度的影响，高浓度ANTXs共存在一定程度上减轻了MCs对生菜的氧化伤害。
微囊藻毒素与鱼腥藻毒素对生菜活性氧稳态的复合影响
Compound effects of microcystin and anatoxin on homeostasis of reactive oxygen species in lettuce
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摘要: 水体富营养化导致水体中蓝藻毒素浓度高于安全值。为客观评价灌溉水中蓝藻毒素的生态风险，本研究探析了微囊藻毒素(MCs)和鱼腥藻毒素(ANTXs)对生菜生长和活性氧(ROS)稳态的复合影响。采用5 µg·L−1或100 µg·L−1MCs、ANTXs和MCs+ANTXs((5+5) µg·L−1或(100+100) µg·L−1)处理生菜7 d后发现，低浓度(5 µg·L−1)MCs、ANTXs或MCs+ANTXs促进生菜鲜重增加63.3%—85.6%，可能是低浓度毒素诱导SOD活性和总抗氧化能力(FRAP)上升以维持H2O2和O2·−平衡进而避免氧化损伤。高浓度(100 µg·L−1)MCs、ANTXs或MCs+ANTXs抑制生菜生长，降幅为MCs(27.7%)>MCs+ANTXs(16.8%)>ANTXs(5.1%)。同时，MDA、H2O2和O2·−含量、NADPH氧化酶活性及LsRbohA表达量、SOD和CAT活性均升高，增幅为MCs>MCs+ANTXs>ANTXs，而FRAP变化不一致。推测高浓度藻毒素上调LsRbohA表达有助于增强NADPH氧化酶活性，生成的ROS增多以刺激防御应激，而SOD和CAT活性上升不足以维持ROS稳定，导致氧化损伤而抑制生长。进一步分析MCs+ANTXs对生菜中ROS稳态复合影响的作用特征发现，MCs+ANTXs(5+5) µg·L−1对MDA、H2O2、NADP氧化酶与CAT活性影响呈现协同效应，在MCs+ANTXs(100+100) µg·L−1处理下呈拮抗效应，表明MCs和ANTXs对生菜ROS稳态的复合影响受毒素浓度的调控，一定浓度的ANTXs共存减轻了MCs对生菜的氧化伤害，为指导灌溉安全提供新的理论依据。Abstract: The eutrophication of water leads to the increase of cyanobacteria toxin concentration in water. To objectively evaluate the ecological risk of cyanobacteria toxins in irrigation water, we studied compound effects of microcystin (MCs) and anatoxin (ANTXs) on growth and homeostasis of reactive oxygen species (ROS) in lettuce. After Hydroponic lettuce being treated with MCs (5 µg·L−1 or 100 µg·L−1), ANTXs (5 µg·L−1 or 100 µg·L−1) and MCs+ANTXs (5+5) µg·L−1 or (100+100) µg·L−1 for 7 d, we found that low concentration (5 µg·L−1) of MCs, ANTXs or MCs+ANTXs increased fresh weight of lettuce by 63.3%—85.6%, indicating that the increase of SOD activity and total antioxidant capacity (FRAP) induced by low concentration of toxin can maintain H2O2 and O2·− balance and then avoid oxidative damage. However, high concentration (100 µg·L−1) of MCs, ANTXs or MCs+ANTXs inhibited lettuce growth, and the decreased degree of each treatment was MCs(27.7%)>MCs+ANTXs(16.8%)>ANTXs(5.1%). Meanwhile, MDA, H2O2 and O2·− contents, NADPH oxidase activity and LsRbohA expression, SOD and CAT activities were increased with the order for increased degree as MCs>MCs+ANTXs>ANTXs. In addition, FRAP showed different change among treatments. These results indicate that high concentration treatments up-regulated LsRbohA expression for contributing to enhancing NADPH oxidase activity to produce more ROS for stimulating defense systems. While the increase in SOD and CAT activities was not enough to maintain the stability of ROS, resulting in oxidative damage and inhibition on growth. Furthermore, characteristic analysis of compound effects of MCs+ANTXs on ROS homeostasis in lettuce showed that MCs+ANTXs (5+5) µg·L−1 posed synergistic effects on MDA and H2O2 contents as well as NADPH oxidase and CAT activities in lettuce whereas MCs+ANTXs (100+100) µg·L−1 showed antagonistic effects on them. It can be included that compound effects of MCs and ANTXs on homeostasis of ROS in lettuce was dependent on their concentrations, and the coexistence of ANTXs at a certain concentration could reduce the oxidative damage caused by MCs to lettuce, providing a new theoretical basis for guiding the safety of irrigation water.
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Key words:
- microcystins /
- anatoxin /
- NADPH oxidase /
- antioxidant enzymes /
- reactive oxygen species /
- lettuce
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酸雨作为工业过程伴生的环境问题，关乎全球环境. 作为酸雨污染大国，我国近40%面积受酸雨污染，对农业生产危害不容忽视[1-2]. 酸雨作用于叶面，诱发H+与叶片中阳离子竞争结合位点与离子替换，致细胞酸化坏死，酸雨中SO2经气孔对植株产生伤害[3-5]. 细胞内酸性物质累积使线粒体和叶绿体超微结构改变，导致叶绿素功能异常，呼吸及光合作用减弱[6]；酸雨胁迫还引发活性氧累积，引起细胞膜脂质过氧化损伤[7]，抑制抗氧化酶基因表达及活性[8]. 种子萌发和苗期生理生化指标受酸雨影响巨大[7]. 酸雨导致土壤酸化，使土壤中铝、镉等有害元素析出，抑制根系活性[9-10]、养分吸收、代谢及生长. 土壤酸化进一步造成微生物多样性[10]及活性降低[8]，阻滞植物生长发育. 大量研究表明，玉米[11-12]、水稻[13]、小麦[14]其生长发育过程中物质转运吸收效率在pH低于5的条件下会明显受阻，当pH进一步降低到3以下时，多种作物的生理生态过程将出现停滞的现象[12]. 随着全球人口激增，酸雨威胁粮食生产安全. 人们通过农药及化肥增强作物抗性以期产量增加的努力，对环境和人体健康存在隐患. 因此，在当下无法控制酸雨污染、培育抗逆（酸雨）植株的现实条件下，寻找一种低污染、见效快、易推广的化控减灾技术与产品，迫在眉睫.
农业上稀土元素（rare earth elements, REE）镧使用广泛[15-17]. 稀土施用水稻[13]、油菜[12]和黄瓜幼苗[18]，其处理组氮、磷、钾等含量远高于对照组，生长更优. 油菜叶绿素含量、硝酸还原酶活性及根系活力、产量增效明显[12]. REE提高糯玉米幼苗PSⅡ最大量子产额和电子传递率，增强光合作用与抗氧化酶活性（减少丙二醛累积）及幼苗抗逆性[19]. 众多实践证明，La3+能提高玉米、苏丹草、紫花苜蓿[20-22]抗盐碱能力，降低玉米和小麦[14, 20]叶片蒸腾速率，增强植株抗逆性. 作为植物成分的氨基酸，既是植物生存的养分，也可凭其络合能力对植物的生理生态形成调节作用[23]. 如氨基酸浸种能缩短水稻与高粱种子萌发时间，提高淀粉酶活性与种子活力[24]. 甘氨酸缩短小油菜生育周期[24]，提高烟草叶面积[25]、叶绿素含量及光合作用[25]. 色氨酸增加草莓叶厚（密）度，促进生长发育[26]. 脯氨酸能提高水稻细胞抗氧化酶活性及叶绿素和类胡萝卜素含量，减少丙二醛累积，增加植株抗逆性及生物量[27]；氨基丁酸能提高烟草抗氧化酶活性，缓解盐碱对生长发育胁迫[25]. 谷氨酸提高严寒中小白菜叶含水量、鲜重、光合效率及对低温耐受性，甘氨酸增加棉花过氧化物酶等活，控制细胞活性氧水平，增强植株抗逆性[28].
稀土-氨基酸络合物具优良性能、稳定结构、原料获取便捷、合成过程精炼，较单独施用更有优势，其以较高的性价比已成为提高植物抗逆性、用途广泛的产品之一. Zhong等[29]发现，镧螯合氨基酸能缓解铜离子对水稻胁迫；周芸[30]在研究氨基酸稀土微肥时也看到，它能有效提高花生果实干物质累积、果实密度及出仁率，促进增产. 遗憾的是，有关特定稀土螯合氨基酸用于作物化控减灾的研究尚少.
本文采用模拟酸雨（pH3.0）处理玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryza sativa L.）、小麦（Triticum aestivum L.）等3种作物的实验设计，运用生理生化等技术手段，初步研究新型氨基酸螯合镧（La（Ⅲ）-AA）对酸雨胁迫下植物质膜透性（MP）、抗氧化系统（过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT、超氧阴离子自由基ROS产生速率、丙二醛MDA含量）、光合作用能力（叶绿素含量）、脯氨酸（PRO）含量及氮代谢（硝酸还原酶NR）等生理指标影响，为酸雨胁迫下作物化控减灾，以及调控产品的选择提供依据.
1. 材料及方法（Materials and methods）
1.1 氨基酸螯合镧（La（Ⅲ）-AA）及其供试溶液的配制
参照ZHONG等人[29]的研究成果，在60 ℃及pH8的条件下以10%碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白（SPI） 2 h，随后经100 ℃高温灭活10 min，取上清液在4 ℃、10000 r·min−1下离心10 min. 50 ℃条件将上述制备液与La (NO3)3·6H2O以1.5∶1的体积比反应5 h制得螯合液. 将螯合液置于4 ℃、10000 r·min−1下离心10 min，上清液用丙酮沉淀干燥，最终得到氨基酸螯合镧（La（Ⅲ）-AA）供试品.
经过前人研究可知，植物体生长发育过程中其表面叶绿素含量与逆境情况呈现负相关[31]，且在酸雨胁迫过程中植物体内叶绿素含量会出现明显的降低，因此本次研究综合参照Zhong等[29]有关La（Ⅲ）-AA对Cu2+胁迫研究以及前期预实验针对La（Ⅲ）-AA对3种作物的喷施后叶绿素表现结果综合研判，确定20 mg·L−1的施用浓度作为本轮研究的施用浓度.
1.2 模拟酸雨溶液的配制
模拟酸雨配制参考江南地区酸雨降水条件，并参照陈俊彤等[4]有关茼蒿的研究和实验用书方案[32]进行配制，其比例为
SO2−4 NO−3 1.3 供试材料预处理及实验设计
玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryza sativa L.）、小麦（Triticum aestivum L.）由相城区种苗繁育基地提供，选取苗种茁壮，高度约为60 cm，5—6叶玉米（Zea mays L.）幼苗、高度约为45 cm，4—5叶水稻（Oryza sativa L.）幼苗和高度约为35 cm，2—3节小麦（Triticum aestivum L.）幼苗的种苗移栽，随后在实验室预栽培5—10 d以适应新的生长实验条件，选取繁育室温度控制在（25±2） ℃[32]，以T5型全光谱组培灯作为辐射光源（OPPLE、T5-1058-18 W），光子通量密度设置为2000 μmol·m−2·s−1，光照距离为15 cm，并随幼苗生长而随时调整辐射光源高度[4, 19, 32]. 实验过程中，光暗比为9 h/15 h[32]，每3 d进行一次换水，每日早晚各通气1次，实验过程均采用Hoagland培养液水基培养以满足植株幼苗的生长需求[30]. 实验过程中不同组别的设置方式如表1中所示.
表 1 实验组叶片喷施方式Table 1. Spraying method of leaves before experiment时间 Period 对照组 BK Group 酸雨组 AR Group 叶喷组 BS Group 第一天 蒸馏水 蒸馏水 20 mg·L−1 La（Ⅲ）-AA 第二天 蒸馏水 酸雨（pH 3.0） 酸雨（pH 3.0） | Show Table
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为增加喷施溶液在植物叶片表面的沾附能力，在蒸馏水中添加3—5滴聚山梨酯-80，La（Ⅲ）-AA 20 mg·L−1溶液及酸雨处理液中添加1—2滴为宜[4,33]，实验周期内植株幼苗均栽种于15穴育苗盘（高度×边长为98 mm×75 mm）中，每穴1株幼苗以便处理.
供试植株经表1方式处理后培养24 h开始计算实验时间，随后在实验时间第1、5、10、15 天对3种供试植株幼苗的组织进行生理指标测定，为减少人为测定误差，每个时间节点每个品种均随机选取3株进行测定，单一样本进行5次测定取平均值作为实验数据.
1.4 生理指标测定种类及方法
质膜透性测定（MP），采用电导率法[34]；过氧化物酶（POD）、超氧阴离子自由基产生速率（ROS）以及硝酸还原酶（NR）活性，其测定方法参照植物生理学实验指导（第五版）执行[32]；丙二醛（MDA）含量，采用硫代巴比妥酸法测定[3]；叶绿素含量，通过SPAD502手持式叶绿素仪直接测定法来表示[35]；脯氨酸含量（PRO），采用磺基水杨酸-茚三酮法[35].
1.5 数据采集与分析
研究中数据分析统计均采用SPSS 22.0软件进行，平均值、标准差和相对值，单因素方差分析差异性，采用最小显著性差数法（LSD），即以P＜0.05作为差异显著的判断标准，图表采用Origin Pro 2017进行绘制.
2. 结果与讨论（Results and analysis）
2.1 La（Ⅲ）-AA 对酸雨胁迫下植株幼苗质膜透性（MP）的影响
细胞质膜是分隔细胞内外环境屏障，用以维持细胞微环境稳态. 图1显示，随酸雨胁迫时间延长，玉米、水稻、小麦幼苗质膜透性较对照组（BK）增加（小麦15 d除外）；预喷施La（Ⅲ）-AA组（BS）的3种作物，质膜透性增幅弱于酸雨组（玉米1 d除外），甚至低于BK组（玉米10 d、15 d，水稻10 d、15 d，小麦组5 d、10 d、15 d）；BS组相对于AR组则是呈现降低态势（玉米1 d除外），其差异极值分别出现在10 d（玉米）、10 d（水稻）、10 d（小麦），BS组相对电导率仅为AR组的51.42%、54.22%和45.95%. 其质膜透性结果与姚梦婕等[34]对稀土铈对酸雨胁迫过程中水稻幼苗的防护具有相似的情况，表明质膜是非生物胁迫过程中逆境作用靶位，大量自由基攻击膜脂不饱和脂肪酸双键，细胞质膜氧化分解受损[4]，失去离子筛选功能，进而导致大量有害离子和游离基团涌入胞内形成强大破坏力，最终造成加剧细胞膜脂过氧化，对质膜形成更严重破坏，植株生理功能不断恶化[5]. 酸雨胁迫下，质膜透性与相对电导率增加，植物受害加重，抗逆性减弱[36]. 而随着La（Ⅲ）-AA的施加其在植物叶片表面形成保护膜，氨基酸成分在提供营养物质的同时对酸性环境起到了良好的缓冲作用，进而对质膜起到良好保护 [4, 7]，从而减少外界H+、SO2等有害物质输入诱发的植株体自由基成分的代谢失衡. La（Ⅲ）-AA所表现出的缓冲作用与冯宗炜[2]早期所提出的提高土壤缓冲能力进而防治酸雨的对策具有异曲同工之妙. 上述结果可知，酸雨胁迫使作物膜损伤、质膜透性增加. La（Ⅲ）-AA可明显增强植株细胞质膜稳定性，降低质膜透性，从而减轻酸雨胁迫对植株造成伤害.
图 1 La（Ⅲ）-AA 对植株MP的影响Figure 1. Effects of La（Ⅲ）-AA on Plant MP注：同一列中含有不同字母的数值间差异达到显著水平（P<0.05）（下同）Note: The difference between the values of different letters in the same column reaches a significant level （P<0.05） （the same below）2.2 La（Ⅲ）-AA 对酸雨胁迫下植株幼苗过氧化氢酶（CAT）活性的影响
CAT酶能清除植物体内过氧化氢，防止质膜过氧化损伤，延缓植物衰老. 图2中数据直观的表明，小麦CAT活性相较于玉米和水稻，总体偏低，其酶活最高点也仅为玉米种BK组最低酶活的80.51%；植株体内CAT活性AR组低于BK组（水稻1 d、10 d、15 d除外），表明酸雨对于作物CAT酶活性有着抑制，且随着时间延长，系统的CAT酶活均出现了增长（水稻10 d除外）；BS组其CAT活性相较于BK组有较为显著的提升，说明La（Ⅲ）-AA对作物体内CAT酶活有促进作用；而BS组酶活均高于AR组，且在3种作物中的差异极值分别出现在5 d（玉米）、1 d（水稻）、10 d（小麦），La（Ⅲ）-AA使得BS组相较于AR组种CAT活性显著提高了48.68%、29.43%、78.61%，结果表明酸雨使得作物体CAT酶活性受抑. 而La（Ⅲ）-AA 能够很好的消除酸雨对CAT酶的抑制作用，且使得CAT酶活大幅度提高，有效地对植株体内产生的过氧化氢起到应答作用，将植物体内过氧化氢含量维持在较为稳定的水平，更好地为作物生长发育提供保障.
2.3 La（Ⅲ）-AA 对酸雨胁迫下植株幼苗过氧化物酶（POD）活性的影响
POD酶活性及同工酶表达形式与植物生长发育过程相关，其酶活随植株老化不断升高[4]. 图3数据可知，POD酶活在不同作物中呈现出较大差异，其在玉米植株中活性表现最低而在小麦中活性最高；单一植株组内数据比对不难发现，POD活性随着时间的延长总体呈现出下降的趋势，且酸雨胁迫下植株体内POD酶活性显著升高（除小麦1 d）；La（Ⅲ）-AA则有效降低了酸雨胁迫下POD酶活，且在1 d（玉米）、10 d（水稻）、15 d（小麦）时使得其与AR组相差最大，分别为AR组的48.3%、57.92%、50.44%，以至于玉米1 d、10 d、15 d，水稻5 d、10 d，小麦5 d、10 d、15 d时，其POD活性低于BK组. 上述结果表明，酸雨胁迫下植株内过氧化物及游离自由基含量逐步增多，加速植株体的老化. 而La（Ⅲ）-AA有效地为植株提供了防护作用，减少其机体内过氧化物产生量，进而表现为POD含量大幅度降低，由此可见其某种程度上不仅能够有效地缓解酸雨胁迫对作物机体的破坏，而且对植物生理发育具有促进作用.
植物体中两大标志性抗氧化酶系统（CAT和POD）的结果变化表明，植物在系统演化过程中，构建出修复逆境伤害的机制[13]. 酸雨胁迫下，作物自身应答机制发挥作用，体内抗氧化物酶协同作用，维持细胞稳态. 此轮研究结果中AR组CAT活性在出现显著低于BK组的现象，其与唐加红等[14]对小麦抗旱的研究有所出入，小麦在干旱胁迫下其体内的三大抗氧化酶系均呈现出明显的增长. 推测造成此次变化的主要原因是由于POD作用于不同底物，在氧化底物同时将氧还原成H2O2，后者被CAT再次分解（CAT活性增长存在一定延迟性），因此本轮研究中CAT酶活随时间延续呈渐增趋势（图2），而POD酶活增幅则明显趋前（图3）. 而此种CAT略微延迟的现象在任鹏辉[22]对紫花苜蓿的抗盐胁迫过程中得以呈现. 植株通过CAT及POD酶活变化，不断调节自身机能，从而更好适应酸雨胁迫，为植株生长发育提供保障. 而通过上述BS组与AR组的数据分析结果可以了解到，La（Ⅲ）-AA能够有效缓解酸雨胁迫对抗氧化酶所产生的影响，因此La（Ⅲ）-AA对植物体抗氧化酶系起到了积极的促进作用.
2.4 La（Ⅲ）-AA 对酸雨胁迫下植株幼苗超氧阴离子自由基（ROS）产生速率的影响
逆境条件下，植物产生较多ROS给机体造成不可逆转伤害，抑制植物长发育[22]. 玉米、水稻、小麦作物体内ROS含量如图4所示，由于物种差异ROS产生速率在玉米中远高于水稻和小麦；酸雨胁迫下AR组ROS产生速率相较BK组均有显著的增长；BS组在La（Ⅲ）-AA 作用下ROS速率得以降低，且均低于AR组和BK组（小麦10 d除外），BS组相较于AR组，在10 d（玉米）、1 d（水稻）、15 d（小麦）ROS降低最为明显，分别降低了28.44%、39.47%、42.31%. 以上数据得以证明酸雨对植株体的生长发育产生了较为严重的胁迫作用，其植株体的质膜受损从而加大其体内ROS的不断升高和累积，如不加以控制最终会造成不可逆的伤害，其与金琎等[11]对玉米的酸雨抗性研究具有相同的结果趋势. 而随着La（Ⅲ）-AA的施用其ROS速率得到了较为有效的抑制，其不仅能够缓解酸雨胁迫给植物体所带来的危害，而且能够对植株体生长发育环境形成优良的缓冲，减少植物所受到的环境胁迫影响.
2.5 La（Ⅲ）-AA 对酸雨胁迫下植株幼苗中丙二醛（MDA）含量的影响
植株体过氧化最直接的产物便是MDA，其能够有效地反映植株体当前的健康水平[4]. 图5中数据可以清晰的观察到，玉米和小麦作物中MDA的水平随着培育时间的延长总体呈现上升的趋势，而水稻种的MDA则在5 d达到最高，随后逐步回落；随着酸雨对作物胁迫时间的逐步延长，玉米和小麦中的MDA均出现持续的累积，这两种作物MDA的最高值均出现在15 d的AR组，而水稻作物中的MDA在5 d后呈现稳步回落，直至15 d其组内3种处理方式作物中MDA含量接近，AR组及BS组回归到正常水平；除水稻15 d外，BS组中MDA的含量相较于AR组均有着显著的降低，其降低的峰值在5 d（玉米）、1 d（水稻）和5 d（小麦），分别降低了31.03%、34.78%、38.71%. 其结果与巩东辉等[16]对螺旋藻的生理生态指标研究具有一定的相似性. 在外界环境胁迫下细胞质膜失去了其原本的防护作用， ROS的大量增加加剧其胞内物质的过氧化，其过氧化产物MDA便呈现出增长趋势，进而其反作用于细胞质膜，亦是对其形成更严重破坏，植株生理功能不断恶化[5]. 由此可见，酸雨会加速MDA在植株体内的累积进而对植株体产生破坏作用. 而La（Ⅲ）-AA对酸雨胁迫下植物中MDA的产生具有缓解作用，能够较为有效的减少植物机体损伤.
2.6 La（Ⅲ）-AA 对酸雨胁迫下植株幼苗中叶绿素含量的影响
叶绿素是植物体光合作用及碳代谢的关键节点，其存在对植物体生长发育起到决定性作用. 图6可以了解到，叶绿素在3种作物叶片中的含量随着培育时间的延长总体呈现先扬后抑的趋势，BK组叶绿素最高点分别出现在10 d（玉米）、10 d（水稻）、5 d（小麦）；酸雨的环境胁迫情况总体在水稻种体现的更为明显，其AR组的叶绿素含量均显著低于BK组，而在玉米和小麦体内则出现了分化，玉米组1 d时AR组叶绿素含量高于BK组14.71%，与此同时小麦组1 d和15 d中亦是出现AR组高于BK组的情况；而BS组中水稻和玉米作物的叶绿素含量相较AR组均有一定幅度的增长，水稻中为18.76%（10 d），玉米中为4.21%（10 d），而小麦作物中La（Ⅲ）-AA对其叶绿素含量反而会有降低的影响. 造成小麦作物中La（Ⅲ）-AA表现不佳的因素与李月福等[12]研究中油菜幼苗的应激过程具有一定的相似性，La（Ⅲ）的对植株叶绿素的改观效果与植株本体所受到的胁迫程度具有一定的相关性，其在不同胁迫状况下La（Ⅲ）的左右效果往往具有一定差异，此时适当调整降低La（Ⅲ）浓度便可获得较优的效果. 而酸雨胁迫过程中叶片细胞叶绿体结构受害，色素合成途径受阻，叶绿素合成量减少并伴随叶绿素降解[22]，随胁迫时间延长，叶绿素含量渐降（图6）并因此影响植株体生理活性. 而La（Ⅲ）-AA能够在叶表面进入叶细胞后，供植物生长所需微量元素和必需氨基酸，从而缓解酸雨污染对细胞微环境扰动. 或将叶绿素中心的Mg取代，进而形成夹心螯合物，在提高叶绿素稳定性同时，也使其捕获波长较短能量较高光子的能力大幅提高，有助于光合效率提升[33]，增强其对CO2催化能力，提高机体内糖类物质累积. 综合数据表明，不同植株体对酸雨和La（Ⅲ）-AA的作用不尽相同，但总体来说La（Ⅲ）-AA能够有效缓解酸雨所带来的影响.
2.7 La（Ⅲ）-AA 对酸雨胁迫下植株幼苗中脯氨酸（PRO）含量的影响
游离态PRO在构成植物蛋白的同时在维持渗透压、稳定分子结构、调节细胞氧化过程方面亦是具有重要作用[4]. PRO的改变情况如图7中所示，PRO在不同植物体中的含量总体趋于平稳，3组作物中BK组中PRO均在40 μg·g−1FW上下浮动；酸雨胁迫使得植物体做出对应的应答反应，3种作物中AR组的PRO含量均出现了显著的提高；而BS组中PRO含量相较于AR组均大幅度降低，3种作物中均在1 d出现最大的减少幅度，分别为36.23%（玉米）、47.17%（水稻）、41.82%（小麦），且在玉米和水稻中多次出现BS组低于BK组的现象. PRO并不是独立存在的个体，其在植株体受到外界环境胁迫的过程中会进行大量的累积[5]，体内PRO与抗氧化物酶协同作用，维持细胞稳态. 即当亲水性强的PRO含量升高、游离态PRO广泛存在时，为稳定细胞内大分子蛋白，降低功能蛋白酸解及渗透压调节和平衡等代谢过程[7]提供保障[12]. 上述结果表明，酸雨对植株体生理生化产生了严重的干扰和破坏，PRO在植物体内大量的积累以稳定植物体细胞所带来的渗透压从而为植株更好的生长提供必要条件. 而La（Ⅲ）-AA为作物在酸雨胁迫下提供了优良的缓冲作用，使得酸雨危害大大的减少，为植物体抗逆性提供坚实的保障.
2.8 La（Ⅲ）-AA 对酸雨胁迫下植株幼苗氮代谢的影响
硝酸还原酶（NR）是N元素有效利用的关键酶，其能够较直观地反映出植物体N代谢的强度[32]. NR活性如图7中所示，总体看来3种作物中NR活性呈现出先抑后扬的趋势，BK组均在10 d出现最低值，随后升高；AR组中NR活性均出现了不同程度降低；BS组NR活性具有大幅度提高，玉米（5 d、10 d、15 d）、水稻（5 d、10 d、15 d）、小麦（1 d、5 d）多次高于BK组，相较于AR组，在5 d（玉米）、10 d（水稻）、5 d（小麦）NR增幅最为显著，分别增长了21.37%、60.63%、46.50%，与AR组形成鲜明的对比. 酸雨胁迫下对叶绿素的影响逐渐传递并表现为到氮代谢过程的干扰，叶绿素含量渐降（图6）并因此影响NR酶活. 这是因为，NR酶是以细胞色素作为电子供体[35]，色素合成受阻引起NR酶催化反应减弱（图8），细胞内NO3-还原成NO2-速率降低，降低植物氮代谢水平. 且亚硝酸盐转化NO是多种代谢途径的信号物质，如根系生长、营养物质吸收及有机酸代谢[18]. 植物氮代谢水平降低，影响其生长发育，降低抗逆性，最终表现为酸雨对3种作物伤害.
而La（Ⅲ）-AA 施用后可以使得ROS进一步减少，与此同时保持了细胞微环境稳态，其最直接的结果便是，细胞叶绿体微结构、叶绿素含量与细胞色素电子传递链功能趋于正常，以满足NR酶促反应对光电子需求[30]，确保NR酶活与细胞内NO3-还原成NO2-速率，维持植物氮代谢水平，以及信号物质NO参与的多种代谢途径调控[33]. 植物氮代谢正常对其生长发育、抗逆性不无裨益，并最终促进植物更好生长发育，产量提高.
上述数据不难看出，酸雨对于植物体氮代谢具有较大的抑制作用，不利于植物生长. 而La（Ⅲ）-AA能够显著提升NR活性，增强植株体对酸雨胁迫的抗性，且其在一定程度上能够促进作物本身的氮代谢强度，提高物质积累，进而对作物生长发育过程形成增益.
实验中还观察到，3种作物各项生理生化指标对酸雨胁迫强度、时长存在差异反应（图1—8），根据已有报道推测，或与3种作物对酸雨胁迫的敏感性有关. 如在耐酸性的生态适应上，水稻耐酸性强于小麦、玉米[37-38]. 当然，更准确的答案也许要在酸雨胁迫下，植物逆境基因确认与响应上寻求.
3. 结论（Conclusion）
（1）酸雨胁迫对3中经济作物造成显著损伤，作物体内MP、ROS产生速率、MDA含量、PRO含量、POD活性均显著升高. 与此同时，叶绿素含量、CAT活性、NR活性则显著降低；
（2）预施La（Ⅲ）-AA溶液，可有效缓解酸雨对作物产生的胁迫伤害，MP、ROS产生速率、MDA含量、PRO含量降低，CAT和NR活性提高，POD活性趋于稳定；
（3）预施La（Ⅲ）-AA产生防护效果，为化控酸雨损害作物的研究提供新的可行性.
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图 1 MCs和ANTXs对生菜NADPH氧化酶活性和LsRbohA基因表达的复合影响
Figure 1. Combined effects of MCs and ANTXs on NADPH oxidase activity and expression of LsRbohA in lettuce Note: Different letters represent significant differences between treatments (P<0.05)
图 2 MCs和ANTXs对生菜SOD活性和CAT活性及总抗氧化能力的复合影响
Figure 2. Combined effects of MCs and ANTXs on total antioxidant capacity, SOD and CAT activities in lettuce Note: Different letters represent significant differences between treatments (P<0.05)
表 1 MCs和ANTXs对生菜生物量、MDA、H2O2和O2·-含量的复合影响
Table 1. Combined effects of MCs and ANTXs on biomass and contents of MDA, H2O2 and O2·- in lettuce leaves
处理组Treatments 浓度/(µg·L−1)Concentration FW/g MDA/(µmol·g−1 FW) H2O2/(µg·g−1 FW) O2·−/(µg·g−1 FW) CK 0 20.772±1.292c 0.74±0.06d 6.27±0.74e 4.18±0.07c MCs 5 36.415±1.290a 0.75±0.06d 5.50±0.44e 4.25±0.14c 100 15.093±0.791d 1.57±0.13a 15.83±0.66a 10.71±0.98a ANTXs 5 38.552±0.888a 0.73±0.12d 5.47±0.29e 4.86±0.11c 100 19.720±1.764c 1.24±0.10b 10.06±0.61c 8.57±0.53b MCs+ANTX 5+5 33.913±1.158b 0.89±0.03c 8.83±1.00d 4.78±0.26c 100+100 17.283±0.983d 1.37±0.08b 11.31±0.47b 8.97±0.49b 注：不同字母表示各处理组间差异显著(P<0.05). Note: Different letters represent significant differences between treatments (P<0.05).
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表 2 MCs和ANTXs对生菜ROS稳态影响的复合作用特征分析
Table 2. Characteristic analysis on combined effects of MCs and ANTXs on homeostasis of ROS in lettuce
指标Index MCs/(µg·L−1) A/% ANTXs/(µg·L−1) B/% MCs+ANTXs/(µg·L−1) C/% Cexp/% RI FW 5 −75.31 5 −85.60 5+5 −63.27 −225.36 0.28* 100 27.34 100 5.06 100+100 16.80 31.02 0.54* MDA 5 −2.22 5 1.31 5+5 −28.44 −0.88 32.44* 100 −113.39 100 −68.59 100+100 −85.52 −259.74 0.33* H2O2 5 12.24 5 12.77 5+5 −40.95 23.45 −1.75* 100 −152.58 100 −60.54 100+100 −80.44 −305.49 0.26* O2·− 5 −1.63 5 −16.11 5+5 −14.13 −18.01 0.79* 100 −155.90 100 −104.75 100+100 −114.31 −423.96 0.27* NADPH 5 5.25 5 1.38 5+5 −8.09 6.56 −1.23* 100 −81.90 100 −45.44 100+100 −62.80 −164.55 0.38* SOD 5 −20.59 5 −4.22 5+5 −16.42 −25.67 0.64* 100 −94.40 100 −32.65 100+100 −76.28 −157.86 0.48* CAT 5 2.18 5 1.72 5+5 −4.43 3.87 −1.15* 100 −66.98 100 −18.99 100+100 −49.37 −98.69 0.50* FRAP 5 −70.13 5 −86.76 5+5 −87.78 −217.73 0.40* 100 26.41 100 −17.14 100+100 11.89 13.80 0.86* 注：数据为平均值±标准误差，*代表与1之间的显著性(P<0.05). Note: The data is denoted as mean±standard deviation, * represents the significance between RI and 1 (P<0.05).
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