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我国正在推行生活垃圾分类制度，建设分类收集、分类处置的生活垃圾处理体系[1-2]。厨余废弃物是生活垃圾的主要组成部分，具有高含水率、高有机质的特点[3-4]，含有丰富的有机质、氮、磷、钾等资源，利用高温好氧发酵技术将厨余废弃物进行快速无害化、减量化和资源化利用符合我国国情，是我国厨余废弃物处理和处置的重要研究方向。
厨余废弃物的好氧发酵是通过好氧微生物将厨余废弃物中大分子有机物降解成可被作物利用的小分子和矿化的过程，得到高肥力、高稳定性的腐殖质[5]。在发酵过程中需要通过辅料的添加来调节发酵堆体中含水率和养分等理化指标，为好氧微生物的快速代谢和繁殖提供必要的条件，达到微生物最佳的生长繁殖条件[6-7]。我国是农业大国，农作物秸秆资源丰富，花生壳、玉米秆和玉米芯中含有丰富的有机碳和营养元素，粗纤维含量高，在有机废弃物好氧发酵过程中常被当作调理剂使用[8-11]。
经热水解预处理后的厨余废弃物由于表面结构和理化性质的改变，更容易被微生物利用，高温发酵阶段更有利于纤维素、木质素的分解，驱动腐殖化进程[12]。因此本文研究热水解后的厨余废弃物与不同辅料进行高温好氧发酵，利用高通量测序技术对不同辅料发酵过程高温区细菌在门与属分类水平下的优势菌群进行鉴定，并对不同辅料与热水解后厨余废弃物好氧发酵过程菌群结构进行解析，以期为厨余废弃物的无害化处置和资源化利用技术提供理论依据和技术支撑。
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本研究所用的厨余废弃物采集自烟台市农贸市场，目测主要种类有大葱、南瓜、土豆、地瓜、玉米、胡萝卜、鲜玉米叶等，采集厨余废弃物约1000 kg统一运送至烟台市生活垃圾处理场。
试验所用的辅料分别为粉碎后的花生壳、玉米秆和玉米芯，采集自烟台市周边农庄，秸秆采集后利用卧式粉碎机粉碎，粉碎机出料口设置5 cm的筛网，经粉碎后的秸秆直径为1—3 cm，3种粉碎的辅料装袋运送至场内发酵场地，厨余废弃物和3种辅料理化指标见表1。
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分别用花生壳、玉米秆、玉米芯经过粉碎后的秸秆与热水解后的厨余废弃物进行好氧发酵试验，分别定义为HS处理组、YM处理组、YX处理组，并设置1组不添加辅料的对照组（CK），好氧发酵试验共4组。每组分别取粉碎后的秸秆25 kg、热水解产物48 kg、复合菌种1 kg，经过充分混匀后装入到发酵箱中；发酵箱长宽高均为60 cm，侧面均匀设置4块宽15 cm的木挡板，挡板间距为5 cm，发酵箱有较好的透气性。对照组中没有添加秸秆，直接取热水解产物48 kg、菌种1 kg，混匀后装入发酵箱内，各处理组处置完成后，堆肥箱中分别插入数字显示温度计，记录当时的堆体温度。
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完成好氧发酵试验的混料和装箱后，记录当时的发酵箱堆体的温度，测温时分别量取堆体上1/3部位、中心和下1/3部位，各测3个点，计算平均温度；首次完成混料装箱后记作第0天，以后每天记录堆体温度的变化，每3 d取样1次检测有机质等理化指标，其余样品保存至-20 ℃冰箱储藏，留作微生物多样性检测使用，整个厨余废弃物好氧发酵试验共持续到第21天；每次取样采用无菌操作将样品放入无菌袋中，同时测量取样部位温度，堆体上1/3处、中心和下1/3处各取等量样品，每点取3个平行样。
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理化指标检测方法[13-14]：温度用LCD-105型461探针数字温度仪，有机质采用重铬酸钾容量法，pH值采用pH计测定，种子发芽指数（GI）采用油麦菜种子进行测定[15]。
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DNA提取步骤：添加0.5 g样品、978 µL磷酸钠缓冲溶液和122 µL MT缓冲液到裂解介质管E中；在MP研磨仪中振荡40 s，速度为6 m·s−1；在14000 r·min−1条件下离心10 min后转移上清至1.5 mL离心管中，加入250 µL蛋白沉淀溶液（PPS）混匀；室温14000 r·min−1，离心5 min。转移上清至已加入900 µL结合基质悬浮液的2 mL管中，混匀，上下颠倒3 min；瞬离5 s弃上清液。加入500 µL 5.5 mol·L−1的异硫氰酸胍溶液，混匀后转移到SPIN过滤器中；加入500 µL SEWS-M溶液，14000 r·min−1离心1 min，弃滤液，再重复洗涤1次；弃去收集管中液体，14000 r·min−1离心3 min，去除残留溶液，晾干3 min；加入100 µL 55 ℃预热的低共熔溶剂（DES）洗脱液，静置5 min；室温14000 r·min−1离心2 min，弃SPIN过滤器，得到总DNA。
DNA完整性检测方法为1%琼脂糖凝胶电泳，电压5 V·cm−1，时间为20 min；DNA纯度和浓度检测设备为NanoDrop 2000超微量分光光度计。
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PCR扩增反应体系按以下步骤进行：5×FastPfu缓冲溶液4 µL, 2.5 mmol·L−1 dNTPs 2 µL，正向引物（5 µmol·L−1） 0.8 µL，反向引物（5 µmol·L−1） 0.8 µL, FastPfu聚合酶0.4 µL，牛血清白蛋白0.2 µL，模板DNA 10 ng,补ddH2O至20 µL。
细菌16S rRNA基因在V3-V4区的PCR扩增条件： 95 ℃预变性3 min；然后在95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，循环数30次；最终在72 ℃延伸45 s，10 ℃冷却。
每个样本3个PCR重复，将3个重复的PCR产物混合；使用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物。
PCR产物纯化使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，将PCR产物用QuantusTM Fluorometer进行检测定量，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合，使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit进行建库，利用Illumina公司的MiseqPE 300平台进行测序。
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用Microsoft Excel 2010和SPSS 26统计分析软件对于试验数据进行整理计算和分析，用OriginPro 8绘图软件绘制点线图等。
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温度是好氧发酵过程中堆体微生物活性的重要指标，也是评价发酵效果的重要指标[15-16]。不同的发酵温度直接影响不同微生物种群的生长繁殖和微生物酶的活性，进而影响发酵效率和发酵产品的品质[17-18]。
发酵试验开始时记作第0 d，此时室外温度为20.0 ℃，各试验组堆体温度均为26.0 ℃，不同试验组发酵过程温度的变化见图1。温度的动态变化显示，前3天，各处理组温度呈上升趋势，第3天，HS、YM和YX处理组温度分别为65.3 ℃、64.5 ℃和49.7 ℃；第4天开始，各处理组温度开始缓慢下降，第5天，对3个处理组进行翻堆处理。翻堆处理后，HS和YM处理组第6天温度略有波动，但变化不大，此后温度逐渐降低，直至发酵结束的第21天，堆体温度接近室温；YX处理组在第6天温度有较大提升，首次超过60.0 ℃，达到65.2 ℃，第7天持续保持高温状态，此后开始缓慢下降，与HS和YM处理组相比，HX处理组温度下降速率较慢。整个发酵过程中对照组温度略高于室温，堆体温度变化不大。
堆体温度保持在50.0 ℃ 5—7 d，或者55.0 ℃ 3 d，可以杀灭堆体中的虫卵和种子，达到无害化处理要求[19]，由此可见，除对照组外，HS、YM和YX组3种辅料处理的厨余废弃物均达到无害化处理要求。与HS和YM处理组相比，YX处理组温度上升较慢，持续时间较长，这可能因为经过粉碎的玉米芯相比于花生壳和玉米秆，比表面积较小，不能被微生物快速附着，内部营养物质持续释放，降解效率相对较低，发酵组温度变化分析表明，3种辅料发酵效果HS优于YM和YX。
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各处理组在发酵过程中pH随发酵时间变化情况见图2。第0—2天，由于发酵过程中有机酸的产生会降低堆体的pH值[20]，导致各处理组pH均出现下降趋势。第3 d，各处理组pH均有较大提升，这是因为蛋白质类有机物在微生物的作用下降解产生氨氮，使pH值快速上升[21-22]。第4天和第5天，YM处理组pH持续降低，可能是因为堆体氨气挥发导致；HS处理组由于孔隙率高，比表面积大，对产生的氨气有较好的吸附性，pH值处于较高水平，除了第6天由于翻堆导致氨的外溢pH突然降低，自第7天至发酵结束，HS处理组pH值一直处于较高水平。发酵结束的第21天，HS组pH最高，为9.64，YX和YM组pH值差别不大，分别为8.03和7.91。
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各处理组有机质随时间的变化曲线见图3。第0 d到第6 d，HS、YM处理组有机质含量下降明显，YX组有机质含量逐渐降低但下降的比例要小于HS和YM组，HS、YM和YX组第6天的有机质含量与第0 d相比分别降低了8.3%、9.6%和1.8%；第6天至第9天，HS、YM和YX处理组有机质分别减少了4.6%、2.8%、4.4%；第9天到第21天，HS和YM组有机质含量出现波动，但变化不大，YX组有机质含量呈持续降低趋势；第21天与第0天相比，HS、YM、YX和CK有机质减少比例分别为13.2%、14.0%、10.6%和2.3%。
发酵初期HS和YM处理组可被微生物利用的小分子有机物充足，温度快速上升，有机碳快速消耗导致有机质含量明显降低[23]。YX处理组温度上升相对较慢，有机碳的消耗量也相对较小；第6天至第9天，YX处理组温度一直处于高温区，高温发酵菌群处于活跃期，导致有机质含量快速下降[24]。
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有研究表明种子发芽指数（GI）可作为发酵是否腐熟的标准，当GI值超过80%可以认为发酵完全腐熟[25-26]。将各处理组第0—21天每3天的发酵产物做种子发芽率检测，计算不同处理组在好氧发酵期间的GI值，见图4。
HS和YM处理组随着发酵时间的持续GI迅速蹿升，第9天分别达到了97.5%和86%，说明HS和YM处理组在第9 d即达到了腐熟标准，此后GI持续增大，HS处理组在第15天后增速减缓，YM处理在第18天后增速减缓，第21 d两组GI分别达到122.6%和119.5%，HS组略优于YM组。YX处理组GI在0—3 d增长明显，第3天后GI增长幅度明显放缓，但仍然呈快速增长趋势，在第18天，YX处理组GI首次超过80%，达到96%，第21天达到105%，完全达到腐熟标准。CK处理组在发酵结束的第21天，GI仅为25.69%，没有达到腐熟要求。
通过对好氧发酵过程中种子GI动态变化的研究，结果表明，HS、YM和YX处理组均达到腐熟标准，GI值的动态变化与好氧发酵过程中温度的变化存在一定的相关性，花生壳组和玉米秆组第2天温度即超过60.0 ℃，首先达到高温区，而玉米芯组首次超过60.0 ℃为第6天，说明好氧发酵过程中快速进入高温期有助于有机物料的快速腐熟。
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由于升温速率不一致，HS和HM处理组测序样本取自第3天，HX处理组样本取自第6天。高温发酵阶段在门分类水平下对样本进行分类学分析，得到Circos图（见图5）。图5中左半圆表示不同样本相对应的物种组成情况，右半圆表示物种在不同样本中的分布情况。在门水平下，将样品中丰度均小于0.01的菌门归类为其他，单个样品中丰度大于0.01的菌门显示菌门名称，在HS、YM和YX高温组发酵试验中，细菌主要的菌门包括厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）和放线菌门(Actinobacteriota)，4种菌门在各处理组中的占比存在差异，其中在HS处理组中的占比分别为：38%、27%、25%、8.1%，YM组占比64%、16%、1.0%、19%，YX组占比60%、31%、7.4%、0.85%。
在门分类水平下，HS、YM和YX发酵组中，好氧发酵优势细菌菌门为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门，王秀红等[27]利用玉米秸秆与牛粪混合，用少量石膏粉和尿素等进行调配，C/N比30左右，水分65%—70%，进行高温好氧发酵试验，对试验过程的细菌群落多样性进行连续检测，得到在好氧发酵过程中，主要的优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门(Actinobacteriota)、拟杆菌门（Bacteroidota），与本试验研究结果一致；Wei等[28]对玉米秸秆发酵过程微生物群落代谢进行研究，用稻草和尿素调整C/N必为30:1，水分65%左右，发酵样品厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门占比92.2%，虽然随着发酵时间的延长，厚壁菌门丰度相对下降，但仍是发酵过程中的优势菌门。
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在属水平下对HS、YM和YX组高温区占比位于前50的细菌进行分析，菌群丰度见图6。
HS组高温阶段细菌菌群丰度超过1%的菌属共有15个，其中黄杆菌属（Flavobacterium）11.44%，魏斯氏菌属（Weissella）10.2%，鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）9.47%，芽孢杆菌属（Bacillus）8.2%，苍白杆菌属（Ochrobactrum）4.91%，丛毛单胞菌属（Comamonas）4.52%，短芽孢杆菌属（Brevibacillus）4.52%，类芽孢杆菌属（Paenibacillus）4.00%，纤维菌属（Cellulosimicrobium）3.81%，norank_f__Bacillaceae 3.54%，unclassified_f__Rhizobiaceae 3.01%，DSSF69 2.86%，沉积物漠河杆菌属（Moheibacter）2.58%，赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）2.44%，微杆菌属（Microbacterium）1.18%。
YM组高温阶段细菌菌群丰度超过1%的菌属共有12个，其中芽胞杆菌属（Bacillus）18.96%，魏斯氏菌属（Weissella）16.81%，葡萄球菌属（Staphylococcus）16.33%，肠杆菌属（Enterobacter）11.04%，小短杆菌属（Brachybacterium）5.6%，短芽孢杆菌属（Brevibacterium）5.29%，李斯特氏菌属（Listeria）3.34%，微杆菌属（Microbacterium）2.39%，水原拉梅尔芽孢杆菌属（Rummeliibacillus）2.15%，库特氏菌属（Kurthia）1.94%，居白蚁菌属（Isoptericola）1.44%，norank_f__Bacillaceae 1.22%。
YX组高温阶段细菌菌群丰度超过1%的菌属共有12个，其中，不动杆菌属（Acinetobacter）22.75%，乳杆菌属（Lactobacillus）20.38%，魏斯氏菌属（Weissella）14.37%，库特氏菌属（Kurthia）8.03%，肠球菌属（Enterococcus）5.27%，稳杆菌属（Empedobacter）3.62%，乳球菌属（Lactococcus）3.38%，明串珠菌属（Leuconostoc）2.65%，丛毛单胞菌属（Comamonas）2.62%，醋杆菌属（Acetobacter）1.72%，Dysgonomonas 1.45%，弗氏弧菌属（Vagococcus）1.01%。
魏斯氏菌属（Weissella）在HS、YM和YX处理组中均大量存在，其主要功能是对发酵过程中产生的糖类化合物快速消耗[29]；黄杆菌属（Flavobacterium）具有代谢复杂有机化合物的能力[30]；鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）是对木质素的降解有较高活性的微生物[31-32]；芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）可以产生纤维素酶，对纤维素和半纤维素的降解有促进作用[33-34]；苍白杆菌属（Ochrobactrum）、丛毛单胞菌属（Comamonas）对多环芳烃（PAHs）的降解有较好的效果[35-38]；短芽孢杆菌属（Brevibacillus）可以分泌功能性的代谢产物将芳香族化合物转化为没有毒性的中间体[39]；纤维菌属（Cellulosimicrobium）可以分泌烃类降解酶，对烷烃进行降解，是降解纤维素的优势菌群[40]。
葡萄球菌属（Staphylococcus）、肠球菌属（Enterococcus）具有代谢芳环化合物的能力[41-44]；乳杆菌属（Lactobacillus）适宜在兼性厌氧的条件下生长繁殖，可将发酵堆体中的糖转化为有机酸[45]，由于YX比表面积和孔隙率较小，通透性不足，堆体中的氧气含量不足，所以高温阶段乳杆菌属（Lactobacillus）大量存在。
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（1）花生壳、玉米秆和玉米芯作为辅料与热水解后的厨余废弃物高温好氧发酵可以使厨余废弃物有效降解，发酵结束后有机质含量分别降低13.2%、14.0%、10.6%，发酵产物达到腐熟标准；堆体温度变化表明，花生壳处理组对厨余废弃物的降解效果最好，优于玉米秆和玉米芯处理组。
（2）门分类水平下，各处理组高温发酵阶段优势菌群具有相似性，优势菌门为：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。
（3）属分类水平下，花生壳、玉米秆和玉米芯为辅料的优势细菌菌属存在差异。花生壳处理组优势菌属为：黄杆菌属、魏斯氏菌属、鞘氨醇杆菌属、芽孢杆菌属；玉米秆处理组优势菌属为：芽胞杆菌属、魏斯氏菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属、小短杆菌属和短芽孢杆菌属；玉米芯处理组优势菌属为：不动杆菌属、乳杆菌属、魏斯氏菌属、库特氏菌属和肠球菌属。
不同辅料对热水解厨余废弃物好氧发酵过程理化性状和微生物菌群的影响
Effect of different additives on physicochemical properties and microflora during aerobic fermentation of thermal hydrolysis kitchen waste
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摘要: 本文对经过热水解预处理的厨余废弃物与3种不同辅料进行好氧发酵对比研究，测定热水解后厨余废弃物分别以花生壳、玉米秆和玉米芯作为辅料好氧发酵过程中温度、pH、有机质和GI的动态变化，并对3种辅料高温发酵处理阶段样品进行高通量测序，鉴定不同辅料高温区优势菌群。结果表明，花生壳对热水解后厨余废弃物处理效果优于玉米秆和玉米芯。高温发酵阶段样品高通量测序结果显示，门分类水平下花生壳、玉米秆和玉米芯的3种辅料堆体中优势菌群具有相似性，样本丰度大于0.01的细菌菌门共4个，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）和放线菌门(Actinobacteriota)；属分类水平下各组优势细菌菌属存在差异，其中花生壳处理组适宜添加的主要细菌菌属为黄杆菌属、魏斯氏菌属、鞘氨醇杆菌属、芽孢杆菌属；玉米秆处理组适宜添加的主要细菌菌属为芽胞杆菌属、魏斯氏菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属、小短杆菌属和短芽孢杆菌属；玉米芯处理组适宜添加的主要细菌菌属为：不动杆菌属、乳杆菌属、魏斯氏菌属、库特氏菌属和肠球菌属。Abstract: In this paper, a comparative study was conducted on the aerobic fermentation of kitchen waste pretreated by thermal hydrolysis and three different additives, the dynamic changes of temperature , pH, organic matter and GI of kitchen waste after thermal hydrolysis were measured during aerobic fermentation with peanut shell, corn stalk and corn cob as additives, and high-throughput sequencing was performed on the samples of the three additives in the high temperature fermentation stage to identify the dominant bacterial community in the high temperature region of different additives. The results showed that the treatment effect of peanut shell on kitchen waste after thermal hydrolysis was better than that of corn stalk and corn cob. The results of high-throughput sequencing of samples at the high temperature fermentation stage showed that the dominant bacterial communities of peanut shell, corn stalk and corn cob were similar at the gate classification level. There were four bacterial phylas with a sample abundance greater than 0.01 which are Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidota and Actinobacteriota. At the level of genus classification, there were differences among the dominant bacterial genera in each groups. The main bacterial genera suitable for peanut shell treatment group were Flavobacterium, Weissella, Sphingobacterium and Bacillus. The suitable bacterial species in corn stalk treatment group were Bacillus, Weissella, Staphylococcus, Enterobacter, Brevibacterium and Brevibacterium. The main bacteria suitable to be added in corn cob treatment group were Acinetobacter, Lactobacillus, Weissella, Kurthia and Enterococcus.
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Key words:
- additives /
- kitchen waste /
- aerobic fermentation /
- flora structure
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“双碳”背景下，绿色低碳的污水处理技术成为发展重点。好氧颗粒污泥 (aerobic granular sludge，AGS) 是微生物自凝聚形成的颗粒状活性污泥，具有沉降性能好、生物量高、可同步去除碳氮磷等优点，而相比于传统活性污泥工艺，AGS能节省50%~75%的占地面积、20%~25%的运行费用和23%~40%的电耗，故该技术符合当前减污降碳的发展目标，具有一定应用前景[1]。世界范围内已有80余座污水处理厂在序批式反应器 (sequencing batch reactor，SBR) 中成功应用了AGS技术，但在连续流反应器中成功应用AGS技术的仅10余座，连续流AGS的推广应用还未取得实质性的突破[2]。尽管SBR更易于培养AGS，但存在处理量小、设备使用率低等缺陷。而连续流是现有污水处理厂的主要运行模式，故连续流AGS的培养备受关注。
丰盛-饥饿条件[3-4]、基于污泥沉降速度[5-6]、尺寸或密度[7-8]的选择压及水力剪切力[9]等被认为是SBR-AGS颗粒化的关键影响因素。但连续流的培养环境与SBR截然不同，这些关键影响因素更难实现。SUN等[10]采用系列串联的完全混合反应器组成整体推流的连续流系统，同时沉淀池采用1 min进水→4 min静态沉淀→1 min排水的间歇运行模式，创造基于沉降速度的选择压，研究了丰盛-饥饿条件对连续流AGS形成的必要性。LIU等[11-12]应用双区沉淀池，通过调整沉淀区上方挡板的高度设置污泥选择压，在AAO系统中培养出平均粒径为210 µm的AGS。以上研究证实了丰盛-饥饿条件和选择压在连续流AGS培养中的必要性和可行性，但沉淀池的运行策略仍较复杂。在厌氧颗粒污泥的研究中，顶部为三相分离器的升流式反应器[13-14]能很好地富集颗粒污泥，但这些研究大多采用大高径比的柱式反应器，与现有污水处理厂的平铺式构筑物不兼容，开发的培养策略难以直接应用。再加上现有研究多为接种成熟AGS的小试实验，缺乏直接在连续流模式下培养AGS的更大尺度研究。
基于此，本团队提出一种新型的连续流AGS反应器，将三相分离器与传统活性污泥工艺组合，构成反应耦合沉淀一体式的反应器，以中试尺度在现有污水处理厂进行改造应用。通过向系统中接种活性污泥，以低浓度市政污水为基质，探究AGS的形成过程及其形貌和结构特性，并通过监测中试系统对NH4+-N和TN的去除效果，再结合微生物群落结构角度以探索系统的脱氮机理，以期为连续流AGS这一绿色低碳处理工艺的应用推广提供参考。
1. 材料与方法
1.1 中试系统及运行方法
中试系统位于河北省某市政污水处理厂原厌氧池，日处理量为3 000 m3。该厂出水标准由《城镇污水处理厂污染物排放标准》 (GB18918-2002) 一级A改为执行地方标准，其中COD、NH4+-N和TP的排放浓度限值分别由50、5 (8) 和0.5 mg·L−1降为40、2.0 (3.5) 和0.4 mg·L−1，SS、BOD5和TN不变。根据该厂2019年的运行数据，提标后现有工艺出水NH4+-N和TN存在超标风险。
中试系统由原厌氧池改造而来 (图1) ，该系统分为I和II两个系列，均由微氧池、好氧池及置于好氧池内部、基于三相分离器的沉淀分离装置组成。系列I：微氧池11.0 m×6.0 m×6.5 m，好氧池13.5 m×6.0 m×3.8 m，好氧池内沉淀分离装置13.5 m×6.0 m×1.0 m；系列II：微氧池13.8.0 m×6.0 m×6.5 m，好氧池13.5 m×6.0 m×3.8 m，好氧池内沉淀分离装置13.5 m×6.0 m×1.0 m。进水流量、污泥回流量、剩余污泥外排量及曝气量均采用变频控制器控制。污泥质量浓度保持在4~7 g·L−1，采用气提回流控制污泥回流比约200%，每日排泥控制污泥龄26~30 d，调整曝气量使得微氧池溶解氧 (DO) 为0.2~0.5 mg·L−1，好氧池DO为1.0~3.0 mg·L−1。与传统活性污泥工艺相比，中试系统有如下特点：1) 未设缺氧池，前置的反应器为微氧池，旨在通过控制微量曝气以充分利用原水中的碳源实现同步硝化反硝化脱氮；2) 通过好氧池内置的沉淀分离装置完成固-液-气三相分离，省去二沉池，减少占地面积，同时内、外回流合二为一，可降低运行能耗。
1.2 原水水质及接种污泥
中试系统进水为该污水处理厂旋流沉砂池出水，其水质指标如下：COD (236.5±51.6) mg·L−1，NH4+-N (57.3±14.6) mg·L−1，TN (67.2±14.7) mg·L−1，TP (6.0±1.7) mg·L−1。原水C/N仅为3.6，生物脱氮碳源不足，故在微氧池定量投加乙酸钠作为外加碳源。这使得实际进水COD为 (328.1±73.6) mg·L−1，C/N为4.9。
中试系统接种该厂生化池活性污泥，其混合液悬浮固体浓度 (MLSS) 为4.2 g·L−1，挥发性悬浮固体浓度 (MLVSS) 为1.9 g·L−1，污泥指数 (SVI30) 为59.4 mL·g−1，粒径分布 (D50) 为28.9 μm，是典型的絮状活性污泥。
1.3 分析与检测方法
中试系统于2021年1月24日完成改造和接种工作，进出水采样时间为4月21日至7月5日。这段时间中试系统处于稳定运行状态，出水水质足以评估中试系统的污染物去除效果。采用纳氏分光光度法测定进出水NH4+-N；采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定TN；DO和pH采用便携式测定仪 (HACH，HQ30d，美国) 测定。
采用激光粒度仪 (Beckman，LS13320，美国) 测定接种污泥的粒径分布，并于7月13日和9月13日在中试系统中进行采样。采用数码相机观察AGS的宏观形态，通过扫描电子显微镜 (SEM) 观察AGS的微观结构及微生物形态。SEM样品制备过程[15]：用4%戊二醛固定；再用去离子水多次浸泡冲洗；经50%、70%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水；临界点干燥、粘样、镀膜观察。通过流变仪 (Aaton Paar Physica MCR301，奥地利) 测定动态粘弹性。并分析了中试AGS与接种污泥的流变特性差异。具体步骤如下：采用平板-平板测量系统，平板直径50 mm，用一次性滴管滴加样品，刮除平板外多余样品后，在固定角频率5 rad·s−1、温度25 ℃条件下测定[16]。此外，为探究AGS中微生物群落结构的变化，使用孔径0.2 mm的筛网收集中试中粒径<0.2 mm (命名为F) 和>0.2 mm (命名为G) 及接种污泥样品 (命名为AS) 委托上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA高通量测序及种群分析。
2. 结果与讨论
2.1 污泥形态与粒径变化
图2 (a) 表明，在宏观上中试系统好氧池中的原始污泥与接种污泥几乎没有差别，但中试系统中的污泥经孔径为0.2 mm的筛网筛分后可得到粒径较大的AGS，采用数码相机和SEM观察AGS的形貌，结果如图2 (b)~(d) 所示。中试系统筛分得到的AGS轮廓清晰、紧致饱满，为形状规则的球形和椭球形。SEM图像表明AGS微观上主要由球状菌紧密相连，表面有少量丝状菌，这与文献[17]报道的实验室培养AGS形貌非常相似。这表明中试系统在连续流模式下，接种絮状活性污泥后使用实际低浓度低C/N的市政污水已成功培养出了AGS。
图3为接种污泥及中试系统稳定运行过程中污泥粒径分布的变化情况。粒径分布曲线右移表明随着中试系统的运行，污泥粒径逐渐增大。接种污泥的D50为28.9 μm。到了7月13日，中试系统中污泥D50为57.8 μm；到了9月13日，D50进一步增大到90.1 μm，较接种污泥粒径增大了3.1倍。粒径区间分布发现，接种污泥粒径主要分布在<50 μm，其占比高达76.8%，少量污泥粒径分布在50~100 μm，占比17.1%。但到7月13日，中试系统中污泥粒径较均匀地分布到了<50 μm、50~100 μm及100~150 μm，占比分别为42.2%、31.7%及20.3%。粒径为150~200 μm的污泥占比由初始的1.0%增至4.9%。到了9月13日，更是增加到10.3%。而粒径>200 μm的污泥占比由初始的0.9%增至9.4%，实现了数量级跃增。连续流模式下培养的AGS粒径小于SBR中培养的AGS粒径[18]，这是由于连续流系统往往处于完全混合的状态，反应器内的基质浓度与出水浓度相当，更低的基质浓度意味着更小的扩散内径，从而限制了连续流中AGS的粒径。此外，本研究中污泥的颗粒化比例 (粒径>200 μm的污泥占比) 低于文献[12, 19]的报道值。这是由于中试系统中没有设置污泥选择压，系统中形成的AGS与絮状污泥一起作为剩余污泥被排出，不利于AGS的富集，从而导致颗粒化比例较低。
2.2 污泥流变特性
接种污泥及中试系统培养的AGS的流变特性如图4所示。通过动态应变扫描确定污泥的线性黏弹区，接种污泥和AGS的临界应变点均在1%左右。当应变超过线性黏弹区后，储能模量G´开始下降，这表明污泥样品的结构开始被破坏。2份污泥样品的G´均大于G´´，说明污泥样品具有凝胶状或固体状的结构，可被称为黏弹性固体。此外，由实验数据可得到污泥样品的屈服应力τy，即黏弹性极限处的剪切应力和流动应力τf，即样品变形过程G´=G´´处的剪切应力。接种污泥和AGS的τy分别为2.2和37.3 Pa，τf分别为7.9和390.3 Pa。这说明中试系统培养的AGS机械强度远高于接种的活性污泥。这主要是由于AGS中胞外多聚物 (extracellular polymeric substance，EPS) 的含量往往高于活性污泥，EPS将AGS中的微生物团聚在一起，从而使得AGS比絮状污泥有更高的机械强度。
2.3 污染物去除效果
中试系统处理水量情况如图5 (a) 所示。除6月3日、6月14日和15日由于进水泵故障，其余时间中试系统处理量均略高于设计值，I、II系列平均日处理量分别为1 454.9和1 722.4 m3·d−1。由图5 (b) 可知，原水COD呈现出明显的雨季降低的变化趋势，在进入雨季前 (4—5月) ，原水COD稳定在 (267.7±30.2) mg·L−1，而进入雨季 (6—7月) 后，平均COD降至 (200.1±54.9) mg·L−1。这是由于尽管该厂收水区域的排水体制为分流制，但可能存在管网的错接、混接等问题，导致雨季部分雨水进入污水管网，从而使得污水处理厂进水COD偏低。原水C/N为 (3.6±0.6) ，属于典型的低C/N污水，生物脱氮难度大。因此，需要定量投加乙酸钠作为碳源，而保证进水COD达到 (328.1±73.6) mg·L−1，C/N达 (4.9±0.6) 。
图 5 中试系统处理水量及进出水情况Figure 5. Water inlet and outlet and the treatment capacity of the pilot system中试系统对NH4+-N和TN的去除情况如图5 (c) 和 (d) 所示。与进水COD类似，进水NH4+-N和TN在雨季呈现出明显降低的趋势。在进入雨季前，进水NH4+-N和TN分别为 (68.5±4.5) mg·L−1和 (78.2±4.5) mg·L−1；在进入雨季后，分别降为 (45.9±14.7) mg·L−1和 (55.6±15.7) mg·L−1。I系列和II系列出水NH4+-N分别为 (1.3±1.1) mg·L−1和 (1.0±0.8) mg·L−1，平均去除率分别为97.7%和98.2%。出水NH4+-N基本保持在2 mg·L−1以下，满足地方标准要求的2.0 mg·L−1，达标时间占比分别为81.8%和93.5%。其中，I系列由于曝气设备故障导致超标时间多于II系列。出水TN分别为 (9.9±2.8) mg·L−1和 (9.1±2.6) mg·L−1，平均去除率分别为84.8%和85.7%。出水TN基本保持在10 mg·L−1左右，满足地方标准要求的15.0 mg·L−1，达标时间占比分别为94.8%和96.1%。此外，中试系统不仅获得了良好的出水水质，而且由于二沉池耦合在好氧池内部，省去了二沉池，可减小占地面积，同时硝化液回流和污泥回流合二为一，能降低系统的运行能耗。
2.4 微生物群落结构分析
为探究中试系统中污泥微生物群落结构的变化，使用孔径0.2 mm的筛网收集粒径<0.2 mm (F) 和>0.2 mm (G) 及接种污泥样品 (AS) 进行高通量测序。如表1所示，Coverage指数均大于99%，表明测序的结果具有代表性。Alpha多样性分析中的Simpson和Shannon指数均用于反映群落多样性；Simpson指数越大说明群落多样性越低；而Shannon值越大说明群落多样性越高。中试系统中F和G的Simpson指数均大于AS的，而Shannon值则均小于AS的。这表明中试系统污泥群落多样性减少，这可能与中试系统条件下能选择性富集功能微生物有关。
表 1 样本Alpha多样性指数Table 1. Alpha-diversity of the samples样本 Simpson Shannon Coverage AS 0.013 5.5 99.3% F 0.059 4.7 99.2% G 0.060 4.9 99.3% | Show Table
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微生物群落结构组成分析如图6所示。在门水平上，AS、F和G中优势菌群类似，均为Proteobacteria (34.45%、46.53%和50.51%)，Chloroflexi (17.36%，19.74%和16.58%) 和Bacteroidota (15.03%，9.92%和13.00%) 。这3类微生物在营养物的去除中具有重要作用[20]，是污水处理中常见的微生物。除这3类优势菌群外，其余菌群丰度也发生了较大变化，如Actinobacteriota在AS中的相对丰度为13.08%，但在F中为6.37%，在G仅为4.39%；类似的还有Patescibacteria，其在AS中的相对丰度为5.27%，但在F和G的相对丰度仅为1.56%和1.19%；而Firmicutes在AS中的相对丰度为3.11%，尽管在F中增加到了6.26%，但在G中仅为2.30%。这表明相比于接种污泥，中试系统中的污泥微生物群落结构发生了变化，而且粒径<0.2 mm的污泥与粒径>0.2 mm的污泥微生物群落结构也有显著的差异。在属水平上，接种污泥中的优势属为Methylophilaceae (6.10%) ，Microtrichales (5.28%) ，Methylotenera (4.81%) ，Saprospiraceae (4.28%) 和Saccharimonadales (4.30%) 。而在中试系统中，Methylophilaceae和Methylotenera得到了显著富集，F和G中的丰度分别为23.73%和6.34%，24.61%和7.16%，丰度和为AS的3倍以上。Methylophilaceae和Methylotenera普遍存在于自然环境中，包括淡水、土壤、污水等生态位，是一种兼性厌氧、以甲醇等为生长基质的甲基营养型细菌，因其能在有氧条件下进行反硝化而受到关注[21]。中试系统由微氧池和好氧池组成，而没有设置缺氧池，NH4+-N在微氧池或好氧池中被氧化，同时生成的NO2−-N/NO3−-N的也只能在微氧池或好氧池被还原成N2，这可能是中试系统大量富集好氧反硝化菌Methylophilaceae和Methylotenera的原因。同时，异养菌Microtrichales和Saccharimonadales的丰度则显著下降，由AS中的5.28%和4.30%分别降低至1.80%和1.11%，1.09%和0.57%，这可能与系统中有机物利用的途径有关。
图 6 门和属水平下微生物群落结构图Figure 6. Map of bacterial community structure at phylum, genus level2.5 颗粒化及脱氮机理分析
新型微氧-好氧耦合沉淀一体式反应器构型对AGS的形成、系统脱氮性能及微生物群落结构变化有着重要影响。在好氧池内，底部曝气和微氧池出水 (即好氧池进水) 产生推动力，使得好氧池内部混合液向上流动，与内置的三相分离器碰撞并实现固液气三相分离。分离的气体经三相分离器间的气-液平面逸散到空气中，液体经出水渠排出系统，而泥水混合液只能向下继续流动，在好氧区与三相分离器间形成剧烈的内循环流动，为AGS的形成提供关键的驱动力-水力剪切力。水力剪切力在颗粒化初期能促进微生物的随机运动，增加微生物间的有效碰撞，有利于形成初始可逆的微生物聚集体[22]。诱导EPS的分泌可增强细胞表面的疏水性，增加聚集体的密度，从而进一步形成不可逆的微生物聚集体[23]。在稳定阶段，水力剪切力不断剥离成熟AGS表面附着生长的丝状菌，维持AGS的形貌和优势地位[5]。这与DAI 等[24]的发现类似，即由反应器内部纵向循环产生水力剪切力培养AGS的机理。此外，沉淀耦合在好氧池内部，省去了二沉池，可节省占地面积，同时将内、外回流合二为一，降低运行能耗。
在微氧池中，DO控制在0.2~0.5 mg L−1，当微氧池COD为50~100 mg L−1时，DO可渗透AGS外表层10~18 µm处[25]，故粒径大于20~36 µm的AGS内可形成外层好氧、内层缺氧/厌氧的分层结构。进水中的NH4+-N在外层好氧条件下被氧化成NOx−-N，生成的NOx−-N扩散至内层，在内层缺氧/厌氧的条件下发生反硝化，使得系统可在微氧池中完成生物脱氮。但这一脱氮途径只存在于AGS形成后。在启动初期，接种的絮状污泥无法通过该途径完成生物脱氮，系统脱氮性能较差；在启动中期，随着中试系统的运行，尽管AGS还未形成，但系统富集了大量的好氧反硝化菌Methylophilaceae和Methylotenera，能通过好氧反硝化途径完成脱氮；而在AGS形成后的稳定运行阶段，两种脱氮途径共同完成生物脱氮过程。此外，微氧池中的反硝化过程不仅能充分利用原水中的碳源，还能降低进入好氧池中的有机物浓度，创造微氧池丰盛-好氧池饥饿的运行条件，有利于AGS的长期稳定性。
3. 结论
1) 以低浓度市政污水为基质、接种活性污泥，在中试规模 (3 000 m3 d−1) 的连续流运行模式下，可培养出长期稳定存在的AGS，平均粒径由接种污泥的28.9 μm增至90.1 μm，其中粒径>100 μm的占47.8%，>200 μm的占9.4%。
2) 中试系统I、II系列出水NH4+-N分别为 (1.3±1.1) mg·L−1和 (1.0±0.8) mg·L−1，出水TN分别为 (9.9±2.8) mg·L−1和 (9.1±2.6) mg·L−1，系统具有良好的脱氮效果，能满足该厂的提标改造要求。
3) 中试系统大量富集了好氧反硝化菌Methylophilaceae和Methylotenera，好氧反硝化途径可能在脱氮中起重要作用。微氧池中的反硝化过程能充分利用原水碳源，降低进水有机物浓度，有利于维持系统的稳定高效低碳运行。
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图 1 不同处理组温度动态变化
Figure 1. Temperature Changes Dynamically in Different Treatment Groups
图 3 不同处理组有机质动态变化
Figure 3. Organic Matter Changes Dynamically in Different Treatment Groups
图 4 好氧发酵过程中GI的变化
Figure 4. The Percentage of GI during the Aerobic Composting Processes
图 5 高温发酵阶段细菌门水平下样本与物种关系
Figure 5. Relationship between Samples and Species at Phylum Level during High Temperature Fermentation
图 6 高温区属分类水平细菌群落结构
Figure 6. Composition of Bacterial Flora at The Level of Genus Classification in High Temperature Region
表 1 原料基本理化性质
Table 1. Basic physical and chemical properties of raw material
名称Name 有机质/(g·kg−1)Organic matter 总氮/(g·kg−1)Total nitrogen 总磷/(g·kg−1)Total phosphorus 总钾/(g·kg−1)Total potassium 含水率/%Water content 花生壳 834.23±30.08 3.91±0.14 1.51±0.05 6.52±0.24 9.73±0.35 玉米秆 941.38±33.94 7.43±0.27 1.79±0.06 4.63±0.17 9.37±0.34 玉米芯 705.33±32.32 5.62±0.26 4.93±0.23 7.08±0.32 6.83±0.31 厨余废弃物 846.17±22.39 16.29±0.43 5.42±0.14 13.51±0.35 92.43±2.45
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