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氮素是农作物生长发育过程中必不可少的营养元素，近年来由于过量施用化肥一方面加剧了硝酸盐淋失，另一方面氮素通过反硝化作用生成N2O、N2释放到大气中，导致氮素利用率下降[1]. 氮素形态转换的本质是氮素在相关微生物功能基因调控下的转化过程，刻画氮循环功能基因与农田氮素利用率间耦合关系，明确主导氮素利用率提升的关键基因种类有利于为进一步开展土壤健康管理和促进农业增产提供科学依据. 现有研究表明，过量施加氮肥会导致土壤中积累的氨通过硝化作用在氨氧化细菌（AOB）的作用下将环境中的氨转化为亚硝酸，而亚硝酸盐氧化细菌（NOB）通过亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）将亚硝酸盐氧化为硝酸盐，加剧了土壤酸化[2]. 同时，施肥可以改变土壤nosZ型反硝化细菌基因丰度，并且提高土壤反硝化速率[3-4]. 陈娜等[5]研究发现，增施氮肥可以提升（narG、nosZ）型反硝化功能基因丰度，从而使NO3−、NO2−被还原为N2O、N2释放到大气中，导致农田氮素损失. 研究表明抑制硝化作用功能基因丰度不仅可以缓解氮素以硝酸盐形式流失，还可以促进植株对氮素吸收，从而提升氮素利用率[6]. 综上，研究土壤中氮素的生物化学转化，明确施入土壤的氮素去向进而刻画氮循环功能基因丰度与氮素利用率间的耦合关系可以为减缓农田氮素流失，促进氮素增效提供理论基础.
红黄壤主要分布在我国南方地区，土壤pH为5.25—5.44、降雨量充沛、土壤质地较黏、容重较高. 由于红黄壤本身的性质和当地气候的作用使施入土壤中的氮素通过挥发、淋失、反硝化等进入大气环境以及湖泊河流中[7]. 因此，减少氮素流失，提高农田氮素利用率已成为提高农作物增产增收的的关键所在. 生物质炭和沼液作为典型的土壤改良剂，通过增加土壤有机碳含量为氮循环微生物提供碳源，直接或间接调控氮循环过程相关功能基因丰度和关键环节，从而提高土壤氮素利用效率以及作物产量. 生物质炭是农作物秸秆或动物粪便残渣在厌氧的条件下经过高温热解所产生，具有巨大的比表面积，可以吸附土壤中的营养物质，而且作为肥料的载体，它们还影响着土壤持水性能，可以提高农作物对养分的吸收、改良土壤结构、促使土壤微生物繁殖[8-9]. 沼液作为改善土壤质量的有机物料对氮循环功能基因同样具有显著的调控作用. 由于单独施用沼液易产生氨挥发、硝酸盐淋失和N2O排放等主要环境问题，因此采用生物质炭-沼液联合施用的方式，利用生物质炭吸附和负载氮素，在降低硝酸盐淋失的同时减少N2O排放，提高土壤养分保蓄能力[10-11]. 现有研究发现生物质炭施加到土壤中可以影响硝化作用的限速步骤，促进氨氧化作用的进行，提高氨氧化菌的基因丰度，从而达到促进硝化作用的发生[12]. 而Dempster等[13]的研究则得出生物质炭的施加会对土壤氨氧化作用产生抑制的影响，这可能是由于生物质炭能释放硝化抑制剂，阻碍土壤中铵根离子向硝酸根离子的转化. 而生物质炭对土壤反硝化作用的影响至今仍有不同的观点，刘杰云等[14]研究表明，生物质炭作为土壤改良剂可以显著提高narG、nirK、nosZ基因相对丰度. 王伟等[15]研究发现，通过施加生物质炭可以改善土壤孔隙度，增加了土壤的透气状况，阻碍了厌氧条件下反硝化作用的进行. 施加沼液可以增加土壤微生物的数量，并且沼液的施加也放大了反硝化（nirK、narG）功能基因信号强度、氨化作用（ureC）功能基因信号强度[11].
综上，前人在探讨氮循环功能基因对氮素形态调控以及影响土壤氮素循环过程做了大量研究，为明确氮循环功能基因对农田氮素利用率的影响奠定了基础. 然而，现有研究主要集中在研究功能基因丰度对氮素活化的影响，氮素增效与功能基因间的内在联系仍有待探索[16]，其次，目前的研究多采用生物质炭/无机肥料或沼液/无机肥料配施的方式改良土壤，而生物质炭-沼液协同施用的研究手段仍较为少见. 因此，本研究聚焦农田氮素增效的关键问题，从氮循环功能基因角度入手，以浙江省杭州市红黄壤为试验对象，采用生物质炭-沼液联合施用的方式研究了其对土壤肥力因子、氮循环功能基因和氮素利用率的响应特征，刻画氮循环功能基因与氮素利用率间耦合关系，为改善土壤性质，提高氮素利用率以及为缓解因过量施肥而造成的农业污染问题提供理论依据.
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该试验地点位于浙江省杭州市浙江科技学院（30°13′N，120°1′E）. 该试验土壤为红黄壤，属于亚热带季风气候，年平均气温17.8 ℃、年平均日照数1970 h、年平均降雨量为1573 mm. 基本理化性质为：土壤容重1.45 g·cm-3，pH为5.44，硝态氮含量3.54 mg·kg−1，铵态氮含量0.79 mg·kg −1，全氮含量0.6 g·kg−1.
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供试生物质炭原材料来自浙江省开化县顺康牧业猪粪，由浙江金华市金锅公司厌氧炭化制成猪粪生物质炭，理化性质为：硝态氮含量11.37 mg·kg−1、铵态氮含量15 mg·kg−1、全氮含量18.95 g·kg−1、有机碳含量605 g·kg−1、pH 8.5. 沼液为浙江省开化县顺康牧业猪场废水厌氧发酵制备的沼液，试验站建有专门蓄水调节池，可对沼液进行标准化处理，经标准化处理的沼液符合农田灌溉水质标准（GB5084-2005）. 沼液理化性质为：硝态氮含量10 mg·L−1、铵态氮含量220 mg·L−1、全氮含量2.95 g·L−1、pH 8.5.
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2021年4月开始试验，采用生物质炭和沼液完全交互试验设计：生物质炭设置4个水平，分别为0%、0.5%、1%、2%，沼液设置3个水平分别为0%、50%、100%（详见表1），其中0%沼液处理采用等体积超纯水代替. 按照当地栽培方式最佳施肥量为：尿素（折合纯氮90 kg·hm−2）、氯化钾（195 kg·hm−2）、钙镁磷肥（375 kg·hm−2）. 每个处理3个重复，同时设置对照（CK）处理，共计39个小区. 各小区面积3 m2（2 m×1.5 m）. 试验基地种植农作物为包菜，种植采取育苗方式，再移栽至每个试验小区. 行距为40 cm，株距为20 cm. 于试验开始前两周将猪粪生物质炭一次性均匀的施于土壤表面，人工翻至15—30 cm土层，后期不再施加生物质炭. 对照组（CK）处理不施生物质炭和沼液，但仍需人工翻耕. 农作物的种植方式与当地保持一致，沼液和化肥于农作物种植一周前均匀施入其对应试验小区，并且后期每季作物种植前均需再次施用沼液和化肥，各小区每隔一个月施1次沼液，共施加3次.
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供试土壤于包菜成熟前两周采集，用S形采样方法采样，每个小区采集5个样本并混合均匀冷藏于带有冰块的泡沫箱内运回实验室. 2 d内除去样品中沙粒、枯叶等，把样品均匀分成3份. 一份风干，用于测土壤基本理化性质，参照《土壤农业化学分析方法》鲁如坤[17]. 一份冷藏于4 ℃冰箱测定土壤硝态氮、铵态氮，另一份储存于-80 ℃冰箱中用于提取土壤DNA. 土壤容重采用环刀法测定，土壤pH采用pH计电位法测定（水土比5:1），土壤硝态氮、铵态氮采用氯化钾浸提-流动分析仪测定，土壤全氮的测定采取浓硫酸消煮-流动分析仪测定. 每季包菜收获期各小区按照包菜颗数进行收获计产，再换算得至每公顷包菜产量. 所有植株样品经105 ℃杀青烘干，烘干样品粉碎过100目筛，经H2SO4-H2O2消解后测定全氮含量，计算氮素利用率. 氮素利用率测算公式参照Yang所述方法[18].
包菜氮素农学利用率（ANUE，kg·kg -1） = （施氮区包菜产量－不施氮区包菜产量）/施氮量
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取所需土壤鲜样0.5 g，每个处理取3个平行. 使用中国Tian-Gen公司的土壤基因组DNA快速提取试剂盒TIANNAMP Soil DNA Kit提取土壤微生物总DNA，提取完成后分别利用TBS-380、NanoDrop200对土壤样品DNA进行浓度及纯度检测.
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采用BIO-RAD T100TM扩增仪进行，扩增反应体系为：5 μL 10×Ex Taq buffer （Mg2+ Plus），4 μL dNTP（2.5 mmol·L−1），0.5 μL上游和下游引物（20 μmol·L−1），0.25 μL Ex Taq DNA聚合酶（5 U·L−1），1 μL DNA模板，无菌去离子水补足至50 μL. 采用质粒试剂盒（Plasmid Miniprep Kit，Biomiga） 进行质粒提取，质粒DNA提取液经2%琼脂糖凝胶电泳检测、纯化后测定质粒浓度，由质粒浓度换算出质粒拷贝数. 标准曲线用无菌去离子水稀释10倍后的质粒DNA作为模板，在Bio-Rad miniopticon扩增仪上进行扩增，功能基因PCR扩增引物序列见表2[19].
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采用Microsoft Excel 2016、Origin 2021及SPSS 20.0软件对试验数据进行方差分析、均值的多重比较和相关性分析，显著性水平设为P=0.05，采用CANOCO 5软件 （CANOCO, Microcomputer PowerInc, Ithaca, NY, USA） 进行土壤环境因子与氮循环功能基因间的冗余分析 （redundancy analysis, RDA），采用Amos刻画功能基因与氮素利用率间的结构方程模型.
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本研究结果表明施加生物质炭、沼液以及生物质炭-沼液配施均可降低土壤容重，提升土壤氮素含量（表3）. 单施化肥（C0B0）处理的土壤容重、pH、硝态氮、全氮、总有机碳含量与空白处理（CK）相比差异性不显著（P>0.05）. 单独施用生物质炭可以显著提升土壤pH，本研究中C3B0处理土壤pH值较C0B0提升了45.43%，同时，生物质炭-沼液配施（C3B2）处理土壤pH提升幅度较大，比单施化肥处理（C0B0）提升了44.85%，其原因是由于生物质炭本身所具有的含氧官能团在土壤中发生了质子化作用导致土壤pH增加[20]. 施加生物质炭、沼液可降低土壤容重，其中C1B0、C1B1、C1B2处理土壤容重均比单施化肥（C0B0）处理显著降低了13.79%、11.72%、11.03%. 生物质炭施加量为0.5%、沼液0%替代化肥（C1B0）处理中土壤容重较单施化肥（C0B0）处理降幅最为显著（P<0.05），下降了13.79%. 由于生物质炭具有巨大的比表面积和孔隙度，施入土壤后其稀释效应增加了微生物与土壤颗粒物间的相互作用, 促进了土壤微团粒向大团粒的聚合，降低了土壤容重[21]. 土壤有机碳和氮素含量以生物质炭-沼液配施（C3B2）处理效果最佳，均较单施化肥（C0B0）处理有显著提升，并且均高于单独施生物质炭（C3B0）处理，其中C3B2处理土壤硝态氮含量较C3B0处理增加了86%，铵态氮较C3B0处理增加了23.79%. 因为生物质炭对于施入土壤中的养分具有吸附作用，沼液则富含有机质并且其主要氮素含量以无机氮为主，因此生物质炭和沼液联合施用可以提高土壤硝态氮、有机碳含量. 沼液中富含腐殖酸，其中的官能团与土壤中含氮物质形成络合物减少了土壤铵态氮的流失，并且沼液作为有机碳库，施入土壤中提升了土壤微生物的活性，从而增加了土壤速效养分含量[22].
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试验发现单施化肥处理可以显著提高硝化作用功能基因丰度，而施加生物质炭则能显著提高反硝化作用功能基因丰度，土壤氮循环相关基因丰度变化如图1所示.
图1A中单施化肥（C0B0）处理较对照组（CK）硝化作用基因（amoA-1、amoA-2、amoB和nrxA）丰度提升显著，差异达显著水平（P<0.05）. 而单独施加生物质炭（C3B0）处理较单施加化肥（C0B0）处理硝化作用功能基因（amoA-1、amoA-2、amoB和nrxA）显著降低，分别下降了93%、35%和16%. 说明施加生物质炭对土壤硝化作用起到了抑制作用，进而可缓解土壤中硝酸盐淋失的问题. 这与Clough的研究得到了一致的结果，其认为生物质炭可释放一种硝化抑制剂α-松萜从而抑制了土壤硝化作用[23]. 而在本试验中单施化肥处理（C0B0）与空白处理（CK）相比硝化作用功能基因丰度有显著提升，但随着生物质炭与沼液的施加导致其功能基因丰度增长率逐渐降低. 由于亚硝酸细菌的适宜生长环境为偏酸性，而生物质炭与沼液的施加提升了土壤pH，因此pH的提高抑制了硝化作用功能基因丰度的提升. 单施生物质炭（C3B0）处理较单施化肥（C0B0）处理反硝化作用基因（narG、napA、nirS-1、nirS-2和nirK-1）丰度则提升了33%、182%、189%、131%和102%（图1B）. 同时，生物质炭-沼液配施（C3B2）处理与单施化肥（C0B0）处理相比，反硝化作用基因丰度提升较为显著（P<0.05）. 可能是由于生物质炭、沼液的投入增加了土壤中的氮源以及土壤有机碳的含量，补充了土壤反硝化细菌所需的的底物. 也有研究发现，有机肥部分替代化肥增加了反硝化功能微生物（narG、nirK、nirS和norZ）数量与丰度，甚至形成一些较为特殊的反硝化微生物群落结构[24]. 单施化肥（C0B0）处理、单施沼液（C0B2）处理均较（CK）处理显著提升了土壤厌氧氨氧化功能基因丰度，单施生物质炭（C3B0）处理、生物质炭-沼液配施显（C3B2）处理与单施沼液（C0B0）处理相比，著降低了土壤氨氧化作用功能基因丰度（P<0.05）（图1D）. 研究表明，厌氧氨氧化菌的数量与土壤尿素呈正相关，但与土壤铵态氮、硝态氮含量呈负相关趋势. 因此施肥改变了土壤肥力，提升了土壤氨氧化细菌的数量，而随着生物质炭、沼液的施加增加了土壤硝态氮与铵态氮的含量，进而阻碍了土壤厌氧氨氧化作用[25-26]. 单施加生物质炭（C3B0）处理、生物质炭-沼液配施（C3B2）处理与单施化肥（C0B0）处理相比氨化作用功能基因（ureC）均有显著增加，分别提升了36.5%、62.5%，差异均达到显著水平（P<0.05）（图1C），由于有机物料施入到土壤中后，需经过土壤中的微生物将有机氮肥转化为无机氮才能被植株所吸收，所以有机物料的施加提升了土壤氨化作用功能基因丰度[27].
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不同处理包菜产量与氮素利用率如图2所示，单施化肥（C0B0）处理的包菜产量较对照组（CK）提高了33.31 t·hm−2，差异达显著水平（P<0.05）. 单施用生物质炭可以显著提高包菜产量，其中（C3B0）处理包菜产量为59.93 t·hm−2，较单施化肥（C0B0）处理提高了41.08%. 生物质炭-沼液配施（C3B2）处理包菜产量最高，与单施化肥（C0B0）处理相比差异显著（P<0.05），增幅为44.13%. 单独施用生物质炭可以显著提升包菜氮素利用率，其中C3B0处理包菜氮素利用率最高，较单施肥（C0B0）处理提升42.80%，差异达显著水平（P<0.05）. 生物质炭-沼液配施（C3B2）处理较单施化肥（C0B0）处理包菜氮素利用率有显著提升（P<0.05）且升高了44.99%. 由于生物质炭、有机物料的投入与替代化肥提升了土壤肥力，可为作物的生长发育提供适宜的生存环境与充足的氮源，因此可对包菜的氮素利用率起到提升作用.
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利用氮循环功能基因与所选取的6个环境因子（pH、SBD、NH4+-N、NO3−-N、TN、SOC）做冗余分析. 氮循环功能基因分别选取amoA、amoB、napA、ureC、nirK、nosZ、nirS，由图3可知，第一排序轴和第二排序轴分别解释了94.63%、4.6%. 影响土壤硝化作用功能基因丰度amoA的环境因子依次是NO3−-N>NH4+-N>TN，amoB功能基因丰度与NO3−-N、NH4+-N、TN呈正相关，amoA功能基因丰度与pH、NO3−-N、NH4+-N、SOC呈负相关，与土壤TN含量呈正相关. 对反硝化作用功能基因nosZ、nirK丰度影响作用较为显著的环境因子是NO3−-N、NH4+-N、SOC、pH、nirK、nirS功能基因丰度分别与pH、NO3−-N、NH4+-N、SOC呈显著正相关关系. 在六种环境因子（pH、SBD、NH4+-N、NO3−-N、TN、SOC）当中，NH4+-N（P=0.02）、NO3−-N（P=0.002）、SOC（P=0.04）对土壤氮循环功能基因影响较为显著. 其分别解释了土壤中氮循环功能基因丰度变异的21.5%、66.5%、13.7%.
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氮循环作为土壤养分循环的重要组成部分之一，而作为硝化、反硝化又是氮循环的重要组成部分，其组成细菌的丰度和群落结构直接影响施入土壤中氮素的转化，并影响农作物对氮素的吸收利用[28]. 以氮循环功能基因和作物产量为观测变量，农田氮素利用率为潜变量构建一阶SEM（图4），模型的拟合度指数良好（CMIN/DF = 3.286<5，RMSAE = 0.078<0.08，AGFI、GFI、CFI、NFI>0.8）. 由图4可以看出，土壤反硝化作用可以由narG、napA、nirS和nosZ这4个观测变量来测量，其中narG、napA、nirS，对反硝化作用影响较为显著且为正相关效应，相关系数分别为0.89、0.89、0.90，土壤硝化作用可以由amoA、amoB、nrxA和hao的4个观测变量来测量，amoA、nrxA对硝化作用的影响显著，路径系数分别为0.98、0.77. 结构方程模型结果表明，反硝化功能基因丰度的提升有利于包菜农学氮素利用率的提升（路径系数0.94），而硝化作用功能基因（amoB、hao）丰度的提升对包菜氮素农学利用率呈现负相关趋势（路径系数-0.21）. 产生这一趋势的原因可能是由于施入土壤的氮肥在氨氧化细菌的参与下将氮素转化为硝态氮，导致了土壤中氮素淋失，也可能是因为铵态氮被土壤胶体吸附不易被作物吸收[29]. 同时，氨化作用、同化氮还原和厌氧氨氧化功能基因也是农田氮素利用率的正向影响因素（路径系数分别为0.10、0.17和0.22）. 另外，农田氮素利用率的提升显著促进了包菜的增产（路径系数0.98）.
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生物质炭的输入可以缓解土壤酸化问题、降低土壤容重，施加沼液可以增加土壤氮素含量提高土壤肥力. 单独施加化肥增加了土壤硝化作用（amoA、amoB）功能基因丰度，但随着施生物炭和沼液的施加会使其增长率逐渐降低. 生物质炭与沼液配施提升了土壤反硝化作用（narG、nirS、nirK）功能基因丰度. 因此，可以根据包菜在不同生理期对硝态氮和铵态氮吸收比例的不同适当减少化肥的供应量以减少因硝化作用而产生的硝酸盐淋失. 生物质炭与沼液配施提升了土壤肥力，丰富了土壤氮循环微生物群落结构，促使包菜增产并提高了包菜氮素农学利用率. 因此结合当地种植背景，生物质炭与沼液部分替代化肥模式为绿色、可持续发展的施肥管理模式.
生物质炭-沼液联合施用对调控氮循环功能基因促进氮素增效的影响
Effects of combined application of biochar and biogas slurry on regulating nitrogen cycle function genes and promoting nitrogen efficiency
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摘要: 为探讨生物质炭-沼液配施条件下氮循环功能基因调控农田土壤氮素转化并影响农作物氮素吸收利用机制. 本试验以浙江省杭州市红黄壤作为研究对象，设置生物质炭和沼液两个因素，探究生物质炭-沼液配施条件下土壤基本理化性质和氮循环功能基因丰度变化情况，刻画功能基因与农田氮素利用率间的耦合关系. 结果表明，生物质炭-沼液配施可以显著降低土壤容重，提升土壤pH和土壤氮素含量，其中，高剂量生物质炭-沼液配施(C3B2)处理较单施化肥(C0B0)处理铵态氮、硝态氮、全氮含量增幅均达到显著水平(P＜0.05). 与空白处理(CK)相比，生物质炭-沼液配施(C3B2)处理则显著提高了反硝化功能基因丰度，较单施化肥(C0B0)处理增幅30.98%和44.99%. 冗余分析结果显示，铵态氮、硝态氮和有机碳含量对土壤氮循环功能基因影响较为显著，结构方程模型则表明硝化作用功能基因丰度的提升对包菜氮素农学利用率呈现负相关趋势. 研究结果表明，在相同养分施用量的条件下，生物质炭-沼液配施可显著提高土壤肥力. 氮素和有机碳含量是影响功能基因丰度的关键因素，硝化作用功能基因丰度的降低可以提高农田氮素利用率. 本研究结果可以为促进农业废弃物资源化利用，提升农田土壤氮素活性提供理论依据.Abstract: The objective of this study was to investigate the mechanism of nitrogen cycling function genes regulating soil nitrogen transformation and affecting crop nitrogen uptake and utilization under combined application of biochar and biogas slurry. In this study, red yellow soil was used as the research subject in Hangzhou, Zhejiang Province. The changes of soil basic physicochemical properties and nitrogen cycling gene abundance as well as the correlation between functional genes and nitrogen use efficiency were explored under the combined application of biogas slurry and biochar. The results were as follow: the combined application of biochar and biogas slurry could significantly reduce soil bulk density, increase soil pH and soil nitrogen content, among which, the contents of ammonium nitrogen, nitrate nitrogen and total nitrogen in the combined application of biochar and biogas slurry (C3B2) increased significantly compared with that in the single application of chemical fertilizer (C0B0) (P<0.05). The C3B2 treatment significantly increased the abundance of denitrifying functional genes by 30.98% and 44.99%, respectively, compared with (CK) and (C0B0) treatments. The results of redundancy analysis showed that the contents of NH4+-N, NO3−-N and organic carbon had significant effects on soil nitrogen cycling functional genes, while the structural equation model showed that the increase of the abundance of nitrification functional genes had a negative correlation with the nitrogen agronomic efficiency of cabbage. The results showed that under the same nutrient application rate, the combined application of biochar and biogas slurry could significantly improve soil fertility. The nitrogen and organic carbon contents were the key factors affecting the abundance of functional genes, the decrease of nitrification gene abundance could improve nitrogen use efficiency. The results of this study can provide a theoretical basis for promoting the resource utilization of agricultural waste and improving the activity of nitrogen in farmland soil.
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Key words:
- biocher /
- biogas slurry /
- nitrogen cycling function gene /
- nitrogen use efficiency.
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图 1 不同生物质炭-沼液处理下土壤氮循环功能基因丰度
Figure 1. Abundance of functional genes of soil nitrogen cycling under different biochar and biogas slurry treatments
图 2 不同处理包菜产量与氮素利用率
Figure 2. Production and nitrogen use efficiency in different treatments
图 3 功能基因与环境因子冗余分析（RDA）
Figure 3. Redundancy analysis（RDA） of functional genes and environmental factors
图 4 氮循环功能基因与氮素利用率路径分析图
Figure 4. Path analysis of nitrogen cycling functional genes and nitrogen use efficiency
表 1 试验设计方案
Table 1. Test design scheme
处理
Treatment生物质炭a/%
Biocher沼液b/%
Biogas slurry处理
Treatment生物质炭/%
Biocher沼液/%
Biogas slurry处理
Treatment生物质炭/%
Biocher沼液/%
Biogas slurryC0B0 0 0 C0B1 0 50 C0B2 0 100 C1B0 0.5 0 C1B1 0.5 50 C1B2 0.5 100 C2B0 1 0 C2B1 1 50 C2B2 1 100 C3B0 2 0 C3B1 2 50 C3B2 2 100 a代表生物质炭占小区耕层土壤总重比，b代表所施沼液全氮量占施氮总量比. 根据本项目小区面积和沼液全氮含量，0%生物质炭施用量为0 kg，0.5%生物质炭施用量为13.5 kg，1%生物质炭施用量为27 kg，2%生物质炭施用量为54 kg，0%沼液施用量为0 L，50%沼液施用量为22.7 L，100%沼液施用量为45.4 L.
The percentage of biocher application represents the percentage of the total weight of residential tillage soil; the percentage of biogas slurry application represents the percentage of total biogas slurry applied for the total nitrogen applied. According to the residential area and total nitrogen content of biogas slurry, The application amount of 0% biochar was 0 kg, The application amount of 0.5% biochar was 13.5 kg, The application amount of 1% biochar was 27 kg, The application amount of 2% biochar was 54 kg, 0% biogas slurry application amount was 0 L, 50% biogas slurry application amount was 22.7 L and 100% biogas slurry application amount was 45.4 L.
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表 2 功能基因PCR扩增引物
Table 2. Primers for PCR amplification of functional genes
目标基因
Target gene引物
Primer引物序列（5'-3'）
Primer sequencesamoA-A Arch-amoAF
Arch-amoARSTAATGGTCTGGCTTAGACG
GCGGCCATCCATCTGTATGTamoA-B amoA-1F
amoA-2RGGGGTTTCTACTGGTGGT
CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCnxrA F1370F
F2843RCAGACCGACGTGTGCGAAAG
TCCACAAGGAACGGAAGGTCnarG narG 1960F
narG 2650RTAYGTSGGCCARGARAA
TTYTCRTACCABGTBGCnirS Cd3Af
R3cdGTSAACGTSAAGGARACSGG
GASTTCGGRTGSGTCTTGAnirK F1aCu
R3CuATCATGGTSCTGCCGCG
GCCTCGATCAGRTTGTGGTTnosZ nosZF
nosZ1662RCGYTGTTCMTCGACAGCCAG
CGSACCTTSTTGCCSTYGCGnapA napAV67F
napAV67RTAYTTYYTNHSNAARATHATGTAYGG
DATNGGRTGCATYTCNGCCATRTT
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表 3 不同生物质炭和沼液处理下土壤理化性质
Table 3. The physicochemical properties of the soil under different biocher and biogas slurry treatments
处理
TrentmentpH 容重/（g·cm-3）
SBD硝态氮/（mg·kg−1）
NO3--N铵态氮/（mg·kg−1）
NH4+-N全氮/（g·kg−1）
Total N有机碳/（g·kg−1）
Organic CarbonB0 CK 5.31±0.16c 1.45±0.01a 3.54±0.74c 0.79±0.10d 0.6±0.01c 4.82±0.97d C0 5.15±0.17c 1.43±0.01ab 4.13±1.37c 2.37±0.52c 0.5±0.01c 4.33±0.64d C1 6.28±2.8b 1.25±0.01c 8.68±1.33b 3.40±0.58c 1.4±0.03b 11.48±1.18c C2 7.15±0.34b 1.41±0.02ab 14.78±2.07a 7.44±0.97b 1.9±0.06b 15.87±2.08b C3 7.49±0.1a 1.36±0.01b 15.02±1.25a 15.72±1.13a 4.5±0.04a 22.44±0.90a B1 CK 5.31±0.09c 1.45±0.01a 3.54±0.23c 0.79±0.10d 0.6±0.02c 4.82±0.97d C0 5.31±0.07c 1.49±0.01a 4.58±0.07c 3.39±0.10c 0.5±0.01c 4.34±0.33d C1 7.14±0.20b 1.28±0.02b 3.51±0.02c 4.11±0.24c 1.3±0.00b 11.92±1.15c C2 7.35±0.06ab 1.43±0.06b 16.24±5.75b 11.16±1.46b 2.3±0.006a 17.78±1.05a C3 7.39±0.23a 1.42±0.06b 28.34±1.19a 18.66±0.61a 2.2±0.016a 14.22±0.59b B2 CK 5.31±0.09b 1.45±0.01ab 3.54±0.72d 0.79±0.10d 0.6±0.02d 4.82±0.97d C0 5.17±0.09b 1.47±0.02a 4.37±0.93d 4.04±0.81c 0.9±0.06cd 4.16±0.19d C1 7.38±0.04a 1.29±0.01c 8.02±0.86c 4.88±0.46c 1.7±0.05bc 10.03±1.77c C2 7.37±0.16a 1.45±0.04ab 15±0.51b 13.54±1.22b 2.7±0.04b 13.71±1.20b C3 7.46±0.05a 1.36±0.02bc 27.9±1.8a 19.46±1.00a 5.2±0.09a 23.05±0.28a 表中不同处理同列数据后不同小写字母表示各处理间差异显著（P<0.05）
Different lowercase letters after different processing of the same column in the table indicate significant differences between treatments （P<0.05）
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