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多溴联苯醚（PBDEs）是一种广泛使用的溴代阻燃剂. 据统计，截至2020年，全球PBDEs的总产量已达约200万吨[1].PBDEs的大量生产和使用，使其不可避免地被释放至天然环境中[2-4]. 水体是PBDEs污染的主要环境介质之一，全球多数地区的水体，甚至南北极海洋，均有PBDEs检出[5-6]. 作为全球主要的PBDEs生产国 [1]，我国也面临着严峻的水体PBDEs污染形势. 目前，我国华东、华北、华南地区的多数湖泊、河流、海洋均受到了不同程度的PBDEs污染，检出浓度为0.007—43.000 ng·L-1[2]. 水中的PBDEs不但可进入水生生物体内，产生神经发育毒性和内分泌干扰效应，还具备较高的生物放大系数（0.06）和生物蓄积潜力，可通过鱼、贝类等水生食物进入人体，增加神经发育障碍、生殖功能受损和遗传变异的风险[7-9]. 因此，PBDEs的监管对保障水环境安全具有重要意义. 发展水体PBDEs的高灵敏检测方法十分必要.
PBDEs在水体中的赋存浓度通常为痕量或超痕量水平，因此在对其进行检测时需要对样品进行富集等前处理. 固相微萃取（SPME）是一种新型、绿色的样品前处理技术[10]. 与液-液萃取、固相萃取等传统方法相比，SPME技术无需大量有机溶剂，灵敏度更高，且集采样、富集、浓缩、解吸于一体，极大地简化了前处理过程[11]，已在多种有机污染物的分析检测中显示了优异的应用性能[12].SPME的技术关键是其涂层. 现有的商用涂层多以石英纤维为基底、机械性能较差，涂层材料热稳定性较低，对PBDEs这类高沸点污染物的分析性能不佳. 因此，亟需开发新型、稳定、可高效富集PBDEs的SPME涂层[13].
共价有机骨架（COF）是一类由C、N、O、H、B等有机元素共价整合而成，具有周期性骨架和有序纳米孔结构的结晶多孔聚合物[14]. 自2005年首次被报道以来，COF已在气体存储、催化、传感、吸附等领域广泛应用[15]. 这类材料比表面积大、孔径范围宽、官能团丰富、热稳定性和化学稳定性好，是理想的SPME涂层材料[12].
本研究采用水热法合成了酮胺型COF材料（TpBD），用硅酮胶黏附法在刻蚀的钢丝表面制得SPME涂层，并对其进行了结构表征. 研究了TpBD涂层对PBDEs的萃取性能，探讨了萃取温度、萃取时间、搅拌速度、解吸温度、解吸时间等条件对萃取过程影响. 优化了萃取条件，建立了基于TpBD涂层的PBDEs分析方法，并在实际水体样品中验证了检测方法的适用性.
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2,4,4′-三溴联苯醚（BDE-28，97.9%）、2,2′,4,4′-四溴联苯醚（BDE-47，100.0%）、2,2′,4,4′,5-五溴联苯醚（BDE-99，99.1%）、2,2′,4,4′,6-五溴联苯醚（BDE-100，100.0%）、2,2’,3,4,4’,5’-六溴联苯醚（BDE-138，97.9%）、2,2’,4,4’,5,5’-六溴联苯醚（BDE-153，98.6%）均购自美国AccuStandard公司，其理化性质如表1所示[16]. 6种PBDEs的混合标准溶液配制于异丙醇（99.8%，美国Tedia）中，于4 ℃避光保存. 联苯胺（98.0%）和1,3,5-三甲苯（98.0%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司. 三醛基间苯三酚（97.0%）和1,4-二氧六环（99.5%）购自上海麦克林生化科技有限公司. 乙酸（99.5%）购自南京化学试剂有限公司. 中性硅酮胶购自陶氏有机硅有限公司. 甲苯（99.5%）购自上海凌峰化学试剂有限公司.
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本研究选用不锈钢丝作为自制SPME纤维的涂层基底. 不锈钢丝的预处理过程如下：将直径为0.15 mm、长度为10 cm的不锈钢丝依次浸泡在氢氟酸、甲醇、纯水中超声20 min、晾干，以提高基底表面粗糙度.
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TpBD的制备方法参考文献[17]. 分别称取63.0 mg三醛基间苯三酚和82.8 mg联苯胺，溶于均三甲苯/1,4-二氧六环的混合溶液（1:1，V:V），边搅拌边滴加1.50 mL乙酸溶液（9.00 mol·L−1）. 超声5 min后，将上述混合液转移至高压釜的聚四氟乙烯内衬中，于120 ℃水热反应72 h.反应完成后，过滤、收集暗红色固体，并以丙酮为溶剂对材料进行12 h索氏提取，除去材料孔道中残留的反应物. 最后，将材料于60 ℃真空干燥12 h，即得TpBD粉末.
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将预处理后的不锈钢丝插入甲苯稀释的硅酮胶溶液、迅速抽出钢丝，重复数次，在钢丝表面形成均匀硅酮胶层. 用滤纸吸去硅酮胶层表面多余溶液后，将钢丝置于TpBD粉末中旋转，再于120 ℃烘箱中干燥20 min，获得涂覆均匀的TpBD涂层. 最后，将涂层长度截至1 cm.
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采用D8 ADVANCE型X射线衍射仪（XRD，德国Bruker）测定涂层材料的XRD图谱. 利用QUANTA FEG 250场发射环境扫描电子显微镜（SEM，美国FEI）观察涂层的微观形貌. 采用ASAP 2020型比表面积和孔径测定仪（美国Micromeritics）测定涂层材料的孔径分布和孔体积. 通过Pyris1 DSC热分析仪（TGA，美国Perkinelmer）对材料进行热重分析. 利用Nicolet 6700型傅立叶红外光谱仪（FTIR，美国Thermo）测定材料的FTIR光谱.
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在40.00 mL具有聚四氟乙烯垫片的玻璃样品瓶（美国Supelco）中加入30.00 mL的PBDEs溶液，将SPME涂层插入溶液中进行萃取. 萃取温度和搅拌速度由加热磁力搅拌器（美国Scilogex）控制. 萃取完成后，将涂层置于气相色谱（GC，6890N，美国Agilent）进样口进行热解吸，并利用电子捕获检测器（ECD）测定PBDEs浓度. GC-ECD具体检测条件如下：分离色谱柱为TG-5MS毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm，美国Thermo）；载气为1.60 mL·min−1高纯氮（≥99.999%，南京天泽气体有限公司）；柱温初始温度为80 ℃，保持1 min，再以20 ℃·min−1升至280 ℃，保持5 min，最后以2 ℃·min−1升至300 ℃，保持2 min；检测器温度为310 ℃[18].
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图1为TpBD涂层材料的表征结果. 在XRD图谱中（图1a），2θ=3.42°（100）处的强尖峰体现了TpBD的高结晶度；2θ=26.35°（001）处的宽峰来源于TpBD中芳香结构的π-π堆积[19-20]. FTIR图谱（图1b）中也出现了TpBD的特征峰，包括芳香C=C在1573 cm−1和1450 cm−1处的振动峰，以及C—N在1284 cm−1处的振动峰，说明形成了β-酮胺连接的骨架结构[21]. 氮气吸附-脱附等温线测定结果（图1c）显示，所合成材料的BET比表面积达695.56 m2·g−1，孔体积为0.50 cm3·g−1，主要孔径分布在0.54—2.34 nm 之间，与文献报道的TpBD孔结构一致[17]. 以上结果证实TpBD的正确合成.TGA图谱表明（图1d），TpBD材料在30—360 ℃范围内无明显失重（低于10%），说明TpBD具有良好的热稳定性，适用于PBDEs等高沸点污染物的分析.
图2为TpBD粉末及涂层的SEM图.TpBD呈球状颗粒（图2a和b），直径在10 μm以内，与文献报道的形貌一致[17].图2c和d显示，在TpBD涂层中，TpBD粉末均匀分布于不锈钢丝基底表面，涂层厚度约为50 μm.
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利用正交实验（L16（45）），对TpBD涂层萃取PBDEs的条件进行优化[22]. 其中PBDEs加标浓度为50.00 ng·L−1，所考察萃取条件因素包括萃取温度（30、45、60、75 ℃）、萃取时间（30、45、60、75 min）、搅拌速度（0、400、800、1200 r·min−1）、解吸温度（270、280、290、300 ℃）和解吸时间（1.0、2.5、4.0、5.5 min），以每个因素每个水平下萃取PBDEs的峰面积总和作为正交实验结果的响应值（图3）[23].
表2为正交实验的极差分析和方差分析结果. 可以看出，萃取温度和搅拌速度对TpBD涂层的萃取效率具有显著影响（P<0.05）. 萃取温度的升高可以提高PBDEs的扩散速率，进而提高萃取效率. 如图3a所示，当萃取温度由30 ℃升至75 ℃时，TpBD涂层的萃取效率持续提高（图3a），故取75 ℃为最优萃取温度.图3b为搅拌速度对萃取效率的影响. 随着搅拌速度的提高，PBDEs的扩散加快[24]，涂层的萃取效率也提高，因此选择1200 r·min−1为最优搅拌速度.图3c—e为其它因素对萃取过程的影响. 综合考虑萃取效率和分析速度，取最优萃取时间为45 min，解吸时间为1.0 min，解吸温度为290 ℃.
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首先考察了TpBD涂层对PBDEs的萃取效率. 如图4所示，TpBD涂层可高效萃取水中的PBDEs，其对所测试6种PBDEs的富集倍数高达1970—3820（表3）. 在相同萃取条件下，TpBD涂层的萃取效率是商用100 μm PDMS（聚二甲基硅氧烷）涂层的1.2—2.0倍，85 μm PA（聚丙烯酸酯）涂层的1.8—10.7倍，65 μm PDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）涂层的3.2—11.9倍，50/30 μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷）涂层的6.0—39.5倍.TpBD涂层的高萃取效率一方面源于其较高的比表面积和较强的表面疏水性，可通过疏水作用吸附PBDEs[25]. 与此相一致，实验发现除BDE-28之外，其余5种PBDEs在TpBD涂层上的富集倍数（表3）随其疏水性（表1）的增强而增大. 另一方面，TpBD富含芳香结构（见XRD和FTIR表征结果），因此能与PBDEs的苯环发生π-π相互作用，进而增强对PBDEs的富集. Li等[21]和Gao等[26]的研究也指出，π-π相互作用是TpBD吸附双酚A、四溴双酚A等芳香性污染物的重要机制. 此外，TpBD具有发达的孔道结构，其中孔径在1.00—1.36 nm之间的孔含量尤为丰富（图1c）. 这些孔道的尺寸与PBDEs分子的大小（1.00 nm左右，表1）接近，因而可通过孔填充效应引起的吸附势能叠加，进一步促进TpBD涂层对PBDEs的富集[27-28].
除萃取效率外，稳定性也是SPME涂层的重要性能参数.TpBD在360 ℃时的热失重仅为10%（图1d），表明其具有优秀的热稳定性. 为进一步探究TpBD涂层的化学稳定性，将其依次浸入0.10 mol·L−1盐酸溶液（pH 1）、0.01 mol·L−1氢氧化钠溶液（pH 12）、极性溶剂甲醇和非极性溶剂正己烷中，分别浸渍12 h[29]，对比浸渍处理前后涂层对PBDEs的萃取效果. 如图5所示，各项浸渍处理对TpBD涂层的萃取性能均没有显著影响，处理前后涂层萃取效率的相对标准偏差（RSD）为1.0%—14.6%.
图5表明，TpBD涂层在较宽的pH范围内（1—12）具有良好的稳定性，且对极性和非极性有机溶剂均具有较高的耐受性. 此外，重复使用实验显示，TpBD涂层在使用100次之后萃取效率没有明显降低，说明其具有较长的使用寿命.
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利用TpBD涂层，在优化的萃取条件下建立了所测试6种PBDEs的分析方法. 该方法测定PBDEs标准样品的色谱图如图6所示，方法的线性范围、检出限、精密度、重现性等分析参数列于表3. 结果表明，BDE-28、BDE-47、BDE-100、BDE-99和BDE-153在1.00—50.00 ng·L−1，BDE-138在2.00—50.00 ng·L−1范围内具有良好的线性（R2 > 0.992）. 方法对PBDEs的检出限为0.16—0.45 ng·L−1，优于文献报道的其它自制SPME涂层，如石墨烯溶胶-凝胶涂层（0.2—5.3 ng·L−1）[30]、蚀刻的不锈钢丝（0.2—0.6 ng·L−1）[22]和基于四氧化三铁纳米粒子涂层的竹炭纤维（0.25—0.62 ng·L−1）[31]. 此外，该方法还具有良好的重复性，同批次涂层日内多次萃取的RSD为8.2%—14.7%（n=5），日间多次萃取的RSD为8.7%—13.5%（n=3）；3批次涂层萃取的RSD为7.2%—13.1%.
为了验证所建立方法的实际应用性，采用该方法分析了某废旧电器拆解污染场地地下水中的PBDEs浓度. 如表4所示，在实际污染水样中检测出了4种PBDEs（BDE-100、BDE-99、BDE-153和BDE-138），浓度范围为0.25—4.26 ng·L−1；其它2种PBDEs的浓度低于本方法检出限. 我们进一步开展了实际水样的加标回收实验（水样3#，加标浓度5.00 ng·L−1），测得回收率为81.1%—106.5%，RSD低于12.5%（n=3）. 这些结果表明，基于TpBD涂层的SPME/GC-ECD方法可用于检测实际环境水样中的PBDEs.
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本研究通过水热法合成TpBD型COF，以不锈钢丝为基底，利用物理黏附法制得基于TpBD材料的SPME涂层，并将其应用于萃取和检测水体中的PBDEs. 研究结果显示，TpBD涂层具有优越的PBDEs萃取性能，其萃取效率是商用涂层的1.2—39.5倍. 这是因为TpBD具有较高的比表面积和表面疏水性，还可与PBDEs产生π-π作用和孔填充作用，能高效富集水体中的PBDEs. 此外，TpBD涂层还具有良好的热稳定性和化学稳定性，使用寿命较长. 基于该涂层的PBDEs检测方法线性范围较宽、检出限低、精密度和重现性好，在实际环境水样的分析中具有良好的应用潜能.
基于酮胺型共价有机骨架固相微萃取的水体多溴联苯醚检测
β-Ketoenamine-linked covalent organic framework coated solid-phase microextraction fiber for the determination of polybrominated diphenyl ethers in water
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摘要: 采用水热法合成了酮胺型共价有机骨架材料（TpBD），硅酮胶黏附法制得固相微萃取纤维涂层，探究了该涂层对水中多溴联苯醚（PBDEs）的萃取性能. 利用正交实验优化了TpBD涂层的萃取条件，结合气相色谱技术建立了基于该涂层的水体PBDEs定量分析方法. 研究结果显示，TpBD涂层不但具有良好的热稳定性和化学稳定性，还可高效富集水中的PBDEs，在相同萃取条件下，TpBD涂层对PBDEs的萃取效率是商用涂层的1.2—39.5倍. 基于TpBD涂层的PBDEs检测方法线性范围较宽（2.00—50.00 ng·L−1）、灵敏度高（检出限为0.16—0.45 ng·L−1）、精密度和重现性好（同批次涂层测定结果的日内相对标准偏差（RSD） <14.7%，日间RSD <13.5%；3批次涂层测定结果的RSD <13.1%），在实际环境水样的分析中表现出良好的适用性（加标回收率为81.1%—106.5%）.Abstract: In this study, a β-ketoenamine-linked covalent organic framework (TpBD) coating was applied for the solid-phase microextraction (SPME) of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in water. The TpBD was prepared by the hydrothermal method and was coated on a stainless steel wire by physical adhesion using silicone glue. The PBDE analysis method was established by coupling the TpBD coated fiber with gas chromatography. The extraction conditions were optimized using the orthogonal experiment. The TpBD coating not only had good thermal and chemical stabilities, but also afforded high extraction efficiency for PBDEs (1.2—39.5 times higher than commercial coatings). The method based on TpBD coated fiber for PBDE determination exhibited relatively wide linear ranges (2.00—50.00 ng·L−1), high sensitivity (detection limits of 0.16—0.45 ng·L−1), high precision (intra-day relative standard deviations (RSD) < 14.7% and inter-day RSD < 13.5%), good reproducibility (RSD < 13.1%), and good recoveries (81.1%—106.5%) in real water samples.
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自20世纪以来，抗生素对医药的发展具有重要的贡献，极大地保护了人类和动植物免受细菌性疾病的危害[1]. 由于抗生素在临床和养殖业上的滥用，加剧了细菌抗生素抗性（耐药性）的进化和传播[2]. 抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）作为编码细菌抗生素耐药性的功能基因，于2006年被定义为一种新型“污染物”[3]. 致病菌可以通过水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT）获得外源性抗生素抗性基因，并通过食物链或环境接触等途径进入人体，使抗生素药效明显降低，对人类健康造成极大威胁[4].
自然环境中的一些微生物可以生物合成抗生素，抑制其它微生物生长并获得更多的营养物质，这些微生物必然携带抗生素抗性基因以免受抗生素的影响[5]. 此外，与外排泵耐药机理相关的蛋白也参与信号分子的运输或中间代谢产物的排放等过程[6]. 在深海、高原等几乎没有人类活动干扰的地区能检测到抗生素抗性基因[7-9]. 然而，在人类活动影响严重的水、土壤、大气等环境介质中均检测到多样性和丰度更高的抗生素抗性基因[10-13]. 上述研究表明，抗生素耐药性是一种自然现象，但人类活动，特别是抗生素的生产和使用，加速了抗生素抗性基因在环境中的传播和富集.
大陆边缘海是陆源污染物向远洋传输的重要过渡区域. 渤海是处于半封闭状态的内海，水体更新周期较长，易于富集陆源污染物，是中国污染最严重的海域之一[14- 15]. 黄海和南海海域也受到不同程度的人类活动影响[16-19]. 目前，对中国边缘海中抗生素抗性基因和致病菌的研究较少，且缺乏边缘海沉积物中抗生素抗性基因和致病菌的完整图谱信息. 因此，研究我国边缘海中抗生素抗性基因和致病菌的多样性和丰度，不仅有助于认识海洋环境中的抗生素抗性基因的特征，而且对进一步评价陆源污染对边缘海的影响有着重要的意义. 本研究旨在使用宏基因组学方法分析我国边缘海沉积物中抗生素抗性基因的组成、丰度及其潜在致病菌群落，探讨抗生素抗性基因和致病菌的组成特征和污染现状.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 样品采集
本研究的两个珠江口沉积物样品是于2011年6月在狮子洋通道水域（PRE1）与珠江口中部（PRE2）采集，代表人类活动干扰严重的河口区域. 4个南海沉积物样品（SCS1至SCS4）来源于2011年8月的南海北部航次. 2016年7月采集了3个黄海沉积物样品（YS1至YS3）以及靠近渤海海峡处的1个渤海沉积物样品（BS1）. 所有沉积物样品均使用表层沉积物采样器采集，在采集后都储存在无菌的密封聚乙烯塑料袋中并在4 ℃冰箱保存，运送至实验室后立即进行DNA的提取.
1.2 沉积物DNA提取和高通量测序
使用FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedical，Santa Ana，CA）试剂盒提取沉积物中的DNA，提取方法见试剂盒使用手册[20]. 由于海洋沉积物中的DNA丰度低，为减少批次效应或样品异质性产生的误差，对每个沉积物样品进行多次DNA提取后合并. 使用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度计测定DNA的纯度和浓度. 每个样品约5 μg的DNA被超声剪切后使用T4 DNA聚合酶与Klenow酶进行末端修复，随后使用T4多核苷酸激酶进行修复末端的磷酸化. 使用T4 DNA连接酶将接头与DNA片段连接，并通过凝胶电泳得到长度合适的DNA目标片段，随后使用PCR扩增目标片段，以此构建样品的DNA文库. DNA在安诺优达基因科技有限公司（浙江，中国）使用Illumina HiSeq 2500平台完成测序. 所有样品总宏基因组数据约60 Gb，每个样本的测序数据约为2—6 Gb不等. 对所有原始测序数据进行数据过滤，去除低质量碱基序列（含有测序质量值低于20的碱基或者包含不明确碱基的序列）.
1.3 生物信息学分析
使用BLAST（Linux版本2.2.29）程序将测序数据与相关的数据库进行数据比对[21]. 使用BLASTN将宏基因组测序数据与SILVA数据库（SILVA_132_SSURef_Nr99）进行比对，识别样品中的16S rRNA基因，E-value阈值为10-20[22]. 随后，使用MEGAN（MEGAN community 6.21.16）最低共同祖先（Lowest Common Ancestor）算法来注释沉积物中的细菌群落，其中BLAST的绝对截止值为50[23].
从NCBI RefSeq数据库（NCBI Reference Sequence Database）下载质粒序列并建立质粒数据库，从INTEGRALL数据库中挑选整合酶及基因盒序列建立整合子数据库. 将样品DNA序列与质粒和整合子数据库进行了比对，识别这两种可移动遗传元件（Mobile genetic elements, MGEs）相关的基因序列. 识别质粒序列的阈值是比对长度大于90%且相似度大于95%[24]；识别整合子序列的阈值是比对长度大于70%且相似度大于90%[25].
DeepARG数据库（deepARG-DB，v1.0.2）是将CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）、ARDB（Antibiotic Resistance Genes Database）以及UNIPROT（Universal Protein）合并后去除重复序列得到的抗生素抗性基因数据库[26]. 使用BLASTX将样品测序数据与deepARG数据库进行比对，抗生素抗性基因序列的识别阈值是序列相似度大于90%且比对长度大于75%的测序读长. 此外，从测序宏基因组数据中提取抗生素抗性基因序列，再与质粒数据库比对，识别质粒携带的抗生素抗性基因[27]. 通过PHI-base和VFDB提供的致病菌分类和NCBI参考序列，从SILVA数据库中提取致病菌16S rRNA基因序列，建立非冗余的致病菌16S rRNA基因数据库. 使用BLASTN算法将样品测序数据与致病菌16S rRNA基因数据库进行比对，识别致病菌16S rRNA序列的E-value阈值为10-20，比对结果也使用MEGAN进行物种注释.
1.4 统计分析
使用RStudio（版本4.1.3）中的vegan软件包（版本2.6-2）进行Pearson相关性分析与ANOSIM检验，置换检验次数为999次，P < 0.05被认为具有统计学意义. 使用OriginPro 2021（版本9.8.0.200）绘制直方图、韦恩图与主成分分析图.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 细菌群落组成和结构
通过数据比对和MEGAN注释中国边缘海沉积物样品中的16S rRNA基因，并输出在门、种水平上的细菌分类结果，如图1所示. 图1A是各采样点种水平上的细菌多样性，所有中国边缘海沉积物中共发现542种细菌，各样品的检出率从12.7%（SCS2和SCS4，69种）到28.4%（YS2，154种）不等. 南海的细菌物种多样性显著低于其他边缘海，可能由于南海沉积物的采样深度大，深海极端环境中细菌多样性较低. 在我国边缘海沉积物中占比最高的是变形菌门（Proteobacteria, 42.5%），随后是浮霉菌门（Planctomycetes, 8.0%），拟杆菌门（Bacteroidetes，7.8%），厚壁菌门（Firmicutes，5.8%），绿弯菌门（Chloroflexi，5.2%），如图1B所示.
图 1 中国边缘海沉积物中细菌的多样性（A）和群落结构（B）Figure 1. The diversity （A） and structure （B） of bacterial communities in the sediments of Chinese marginal seas有研究报道，渤海沉积物中变形菌门、拟杆菌门、放线菌门（Actinobacteria）和浮霉菌门是渤海海域的优势菌门[28]. 也有研究发现，变形菌门与浮霉菌门在渤海、黄海和南海的沉积物中相对丰度都是最高的[29]. 这些研究与本研究的分析结果一致，说明变形菌门和浮霉菌门是中国边缘海沉积物中的优势菌门. 在沉积物细菌群落的相对组成上，黄渤海的拟杆菌门占比显著高于其他海域，南海的浮霉菌门占比显著高于其他海域. 绿弯菌门是一类通过光合作用产能的细菌，该菌门在珠江口沉积物的占比明显高于边缘海沉积物.
2.2 抗生素抗性基因的丰度和多样性
各海域沉积物中的抗生素抗性基因总丰度以及比对上的抗性基因参考序列数和亚型数如图2A所示. 南海沉积物中抗生素抗性基因总丰度约是黄渤海的2倍. 与珠江口相比，边缘海沉积物中的抗生素抗性基因总丰度较低. 沉积物中抗生素抗性基因亚型与序列多样性在各区域的分布趋势与其总丰度相似. 其中，5个抗生素抗性基因亚型在渤海、黄海和南海沉积物中均被检出，包括多黏菌素（arnA）、多重耐药（mexF, rpoB2, smeR）、硝基咪唑（msbA）抗性基因（图2B）. 同时，上述5个抗生素抗性基因亚型在珠江口沉积物中也均有检出.
图 2 中国边缘海沉积物中抗生素抗性基因的丰度和多样性（A）、抗生素抗性基因亚型数韦恩图（B）以及抗生素抗性基因的相对组成（C）Figure 2. Total abundance and diversity of ARGs （A）, Venn diagram of ARG subtypes （B） and relative composition of ARGs （C） in the sediments of Chinese marginal seas各个区域沉积物中的抗生素抗性基因按照抗性类型分类，相对百分比如图2C所示. 在我国边缘海沉积物中多重耐药基因的丰度最高，其平均相对占比为89.1%（南海：85.9%；黄海：93.6%；渤海：88.0%）. 在人类活动干扰严重的珠江口水域，沉积物中多重耐药基因的相对丰度仅为64.4%，但对人类常用抗生素（如磺胺类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类等）相关的抗性基因相对占比显著提高，与人类常用抗生素相关的抗性基因普遍具有单一耐药特性. 比较我国边缘海和珠江口，发现珠江口沉积物中表达单一抗性的抗性基因平均相对占比是边缘海沉积物的约3倍，平均总丰度比边缘海高约13倍.
在几乎不受到人类活动影响的海洋环境中，微生物抗生素抗性基因组有其自身特征，这些抗性基因除抗生素耐药性之外，还具有其他生物学功能. 例如，在我国边缘海沉积物中都检出的rpoB2基因所编码的蛋白能参与碳和氮循环，mexF和mexW两种多重耐药基因编码的蛋白可参与磷循环[30]. 相比自然环境，受到人类活动影响大的区域中对人类常用抗生素具有单一抗性的抗性基因丰度大，占比高，且出现了许多抗生素的新型抗性基因[31-32]. 这一差异可能是由于抗生素的使用污染周边环境，诱导产生新型抗生素抗性基因并加速抗性基因在微生物之间传播[33]. 区域性抗生素抗性基因的组成特征说明了人类活动和环境抗性基因污染之间的关系，其中一些抗生素抗性基因亚型可以作为基因标志物指示环境受人类影响的程度[34].
2.3 可移动基因元件丰度和质粒携带的抗生素抗性基因
在中国边缘海沉积物中可广泛检测到可移动遗传元件相关的基因，包括质粒和整合子基因. 如图3A所示，中国边缘海沉积物中整合子基因丰度在1.44 × 10−6—5.31 × 10−6之间，显著低于珠江口沉积物中整合子基因的平均丰度（1.75 × 10−5）；中国边缘海沉积物中质粒基因丰度远高于整合子基因，其丰度范围是2.29 × 10−4—8.68 × 10−4，质粒基因丰度在中国边缘海和珠江口之间差异并不显著. 此外，中国边缘海沉积物中可能由质粒携带的抗生素抗性基因如图3B所示. 结果表明，各边缘海沉积物中检出的质粒携带的抗性基因极少，并且主要是多重耐药基因；珠江口沉积物中可能由质粒携带的抗生素抗性基因在所有抗性基因中的占比约是20%，主要与磺胺类、氨基糖苷类、大环内酯-林可酰胺-链阳菌素类（MLS）和四环素类等常用抗生素相关，其比例和丰度均显著高于边缘海（P < 0.01）.
图 3 中国边缘海沉积物中质粒基因和整合子基因的丰度（A）和质粒携带的抗生素抗性基因丰度（B）Figure 3. Total abundance of plasmid and integron genes （A） and ARGs possibly carried by plasmids （B） in the sediments of Chinese marginal seas质粒、整合子等可移动遗传元件是功能基因在微生物之间水平转移的重要载体[35]. 在自然环境中（如西藏高原和南极）均可检测到与质粒、整合子相关的基因片段，结合中国边缘海沉积物的分析结果，说明可移动遗传元件在环境中是广泛存在的[9,36]. 但是，自然环境中的可移动遗传元件与抗生素抗性基因传播的关系不大，在中国边缘海沉积物中极少检出可能由质粒携带的抗生素抗性基因. 而珠江口沉积物中可能由质粒携带的抗生素抗性基因的多样性和丰度的显著提高，表明在污染环境中可移动遗传元件有助于抗生素抗性基因的传播，即抗生素抗性基因的高传播性是其在污染环境中的一个重要特征.
2.4 致病菌的多样性和相对组成
中国边缘海沉积物中人类致病菌的群落结构如图4所示. 图4A是各采样点沉积物中门水平上致病菌的相对组成，属于变形菌门的致病菌在中国边缘海沉积物中平均相对占比最高（60.5%），其次是厚壁菌门（27.5%）、放线菌门（7.6%）等. 图4B是各采样点沉积物种水平上致病菌的相对百分比. 在种水平上，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是中国边缘海沉积物中相对丰度最高的致病菌种（24.4%），随后是肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, 19.9%）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae, 9.2%）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, 6.9%）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, 3.4%）. 渤海的肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌和牙龈卟啉单胞菌占比均高于其他区域. 中国边缘海沉积物中检出的相对占比超过1%的致病菌共有16种，其中有3种是生物安全等级为Ⅲ级的高风险致病菌，分别是贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）以及结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）. 研究报道，海洋沉积物中有高丰度的肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，亚穆纳河中也发现了大量肺炎链球菌和铜绿假单胞菌，这些研究与本文的分析结果一致[37-38].
图 4 中国边缘海沉积物中人类致病菌在门水平（A）和种水平（B）的群落结构以及主成分分析（C）Figure 4. Community structure of putative human pathogenic bacteria （HPB） in the sediments of Chinese marginal seas at the levels of phylum （A） and species （B）, and principal component analysis （C）使用16S rRNA基因总丰度对人类致病菌进行归一化处理，并对中国边缘海沉积物样品进行主成分分析，如图4C所示. 前两个主成分可以解释不同区域间人类致病菌总方差的65.7%. 根据人类致病菌的组成特征，沉积物样品可以聚为3类，即黄渤海、南海和珠江口. 与其它区域相比，4种致病菌（包括肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌和铜绿假单胞菌）在黄渤海沉积物中的占比相对较高. 肺炎链球菌是引起败血症、脑膜炎、肺炎等侵袭性疾病的重要病原体，无论是在发达国家还是欠发达国家，其给幼儿以及老年人带来的疾病负担都是最高的[39]. 南海沉积物中的特征人类致病菌是沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）和土拉弗朗西斯菌. 土拉弗朗西斯菌作为生物安全等级为Ⅲ级的高风险人类致病菌，可以通过空气传播，具有高度传染性[40]. 珠江口沉积物中的特征人类致病菌则为副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）. 研究表明河口副溶血性弧菌丰度显著高于近海[41]. 空肠弯曲杆菌能引起食源性细菌感染，可以由水生动物通过食物链感染人类[42]. 空肠弯曲杆菌具有微需氧、适宜中等盐度、低温下难以存活的特性，这可能导致其在珠江口沉积物中含量比边缘海高[43]. 总的来说，各区域人类致病菌群落结构的差异可归因于人类活动、环境因子等多方面因素共同作用[44].
3. 结论（Conclusion）
中国边缘海沉积物中广泛检测到抗生素抗性基因，其中南海沉积物中的抗性基因丰度和多样性比黄渤海高，这些边缘海环境中抗生素抗性基因水平传播能力低. 与边缘海沉积物相比，珠江口沉积物中的抗生素抗性基因具有丰度、多样性以及传播能力高的特征，说明抗生素的使用能引起抗生素抗性基因的进化和传播. 不同区域沉积物中人类致病菌群落结构显著不同，边缘海沉积物中发现3种高风险致病菌，包括贝氏柯克斯体、土拉弗朗西斯菌等，将产生较高的潜在环境健康风险.
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图 1 TpBD材料的（a）XRD图、（b）FTIR图、（c）氮气吸附-脱附等温线和孔径分布图和（d）TGA图
Figure 1. （a） XRD pattern, （b） FTIR spectrum, （c） nitrogen adsorption-desorption isotherms and pore size distribution, and （d） TGA results of TpBD.
图 2 （a）、（b）TpBD粉末和（c）、（d）TpBD涂层的SEM图
Figure 2. SEM images of （a）, （b） TpBD powder and （c）, （d） TpBD coating
图 3 （a）萃取温度、（b）搅拌速度、（c）萃取时间、（d）解吸时间和（e）解吸温度对PBDEs萃取效率的影响
Figure 3. Effects of （a） extraction temperature, （b） stirring rate, （c） extraction time, （d） desorption time, and （e） desorption temperature on the mean value of total peak area obtained in the range analysis of orthogonal array.
图 4 TpBD涂层和商业涂层对PBDEs的萃取效率
Figure 4. Comparison of extraction efficiency of PBDEs between TpBD coated fiber and commercial fibers.
图 5 酸、碱和溶剂处理对TpBD涂层萃取效率的影响
Figure 5. Effect of acid/base or solvent treatments on extraction efficiency of PBDEs by TpBD coated fiber
图 6 基于TpBD涂层的SPME-GC/ECD方法检测PBDEs的色谱图
Figure 6. Chromatogram obtained by the SPME-GC/ECD method based on TpBD coated fiber
表 1 PBDEs的理化性质
Table 1. Physico-chemical properties of PBDEs.
同类物Congeners 分子式Molecular formula lg KOW a 蒸气压/（Pa, 25 ℃）Vapor pressure 水溶解度/（mg·L−1, 25 ℃）Aqueous solubility 分子直径/nm bMolecular diameter BDE-28 C12H7Br3O 5.94 2.19×10−3 0.070 0.989 BDE-47 C12H6Br4O 6.55 2.50×10−4 0.002 0.998 BDE-100 C12H5Br5O 6.86 2.86×10−5 0.040 1.078 BDE-99 C12H5Br5O 7.13 6.82×10−5 0.009 0.995 BDE-153 C12H4Br6O 7.62 5.80×10−6 0.001 1.078 BDE-138 C12H4Br6O 7.91 1.58×10−6 0.001 0.995 注：a正辛醇-水分配系数；b由GaussView 5.0计算. a n-octanol-water partition coefficient; b calculated by GaussView 5.0. 
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表 2 正交实验的极差分析和方差分析结果
Table 2. Results of range analysis and analysis of variance （ANOVA） for the orthogonal experiments.
条件Conditions 方差分析 Analysis of variance （ANOVA） 极距（×105）Polar distance 方差和（×1011）Sum of variance 组间自由度Degree of freedom between groups 组内自由度Degree of freedom within the group F P 萃取温度/℃ 4.722 5.656 3 44 4.011 0.013* 萃取时间/min 2.479 6.812 3 44 0.842 0.478 搅拌速度/（r·min−1） 8.462 2.541 3 44 26.911 0.000* 解吸温度/℃ 2.110 6.928 3 44 0.582 0.630 解吸时间/min 2.096 6.960 3 44 0.513 0.676 注：* P<0.05.
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表 3 基于TpBD涂层的SPME-GC/ECD方法对PBDEs的分析性能
Table 3. Analytical performance of the SPME-GC/ECD method based on TpBD coated fiber
同类物Congeners 线性范围/（ng·L−1）Linear range 相关系数Regressioncoefficient 检出限（S/N=3）/（ng·L−1） LOD 定量限（S/N=10）/（ng·L−1） LOQ 日内萃取重复性（n=5）/% Intra-day repeatability 日间萃取重复性（n=3）/% Inter-day repeatability 制备重复性（n=3）/% Fiber-to-fiber reproducibility 富集倍数Enhancement factor BDE-28 1.00—50.00 0.999 0.16 0.52 14.7 8.7 8.0 2990 BDE-47 1.00—50.00 0.998 0.20 0.66 14.1 11.3 7.6 2750 BDE-100 1.00—50.00 0.992 0.30 1.00 13.4 12.0 7.2 1970 BDE-99 1.00—50.00 0.996 0.24 0.80 8.2 9.1 9.7 2560 BDE-153 1.00—50.00 0.995 0.40 1.34 10.3 12.9 6.3 2790 BDE-138 2.00—50.00 0.994 0.45 1.50 13.9 13.5 13.1 3820
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表 4 基于TpBD涂层的SPME-GC/ECD方法对实际水样中PBDEs的分析结果
Table 4. Analytical results for the determination of PBDEs in real water samples
同类物Congeners 1#水样 2#水样 3#水样 4#水样 5#水样 6#水样 加标回收率（n=3）/%Recoveries BDE-28 NDa ND ND ND ND ND 97.6 ± 8.1 BDE-47 ND ND ND ND ND ND 90.8 ± 9.8 BDE-100 0.93 0.32 ND ND ND ND 106.5 ± 11.8 BDE-99 2.45 0.71 0.38 0.25 ND 0.31 96.3 ± 10.6 BDE-153 2.20 0.64 ND ND ND ND 83.7 ± 12.2 BDE-138 4.26 1.05 0.54 ND ND ND 81.1 ± 12.5 注：a 未检出. a not detected.
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