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全氟化合物（perfluoroalkyl substances，PFASs）是一类碳原子连接的氢原子全部被氟原子取代的有机化合物，因其优良的理化性能，被广泛用于化工、皮革和医药等工业及日常生活领域中[1]. 近年来已在大气、水和土壤等[2-4]环境介质及生物体中[5]被广泛检出. 现有的研究已经充分证明PFASs具有内分泌毒性、致癌性、神经毒性及生殖毒性等毒理效应，对环境和生物均存在潜在风险[6-7]，因此2009年和2019年，全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS）及其盐类、全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）先后被列入《斯德哥尔摩公约》并加以限制生产和使用. 然而由于经济和生产需求，PFASs的生产逐步转移到亚洲，尤其是中国[8]. PFASs一旦进入环境后能够随着大气发生长距离迁移，到达海拔较高的地区发生“高山冷凝效应”，从而导致高海拔地区成为污染物的“接收器”[9].
现有的研究证实，树木能够有效截留大气中的有机污染物[10]，对有机污染物的全球迁移及分布有重要影响[11-12]. 近年来，树木年轮因其分布广泛、样本易得、连续性强等特点，已经作为环境监测的一种手段[13]. 已有学者利用树木年轮作为指示研究大气环境中的多环芳烃、多溴联苯醚等持久性有机污染物（persistent organic pollutants, POPs）[14-15]的迁移及污染特征. 然而，PFASs不同于传统的持久性有机污染物，具有高表面活性、水溶性强等特点，能否用树木年轮来指示大气中的PFASs，并且对其污染历史进行反演，目前尚不清楚. 因此，有必要展开相关研究，探讨树木年轮对大气中PFASs的指示及污染历史重建，以期为偏远地区PFASs的生态风险评估提供科学依据. 目前公认的PFASs在全球的蓄积库为海洋沉积物，而森林植被占陆地面积的31%[16]，若对PFASs有富集，其蓄积量不能忽视. 然而目前鲜有研究报道PFASs在森林中的蓄积能力，因此，本研究以横断山区雅砻江下游的云南松（Pinus yunnanensis）年轮为研究对象，分析其PFASs的污染特征与来源，反演PFASs在该地区的污染历史，并计算PFASs在云南松树干中的积累量，明确森林植被对PFASs迁移蓄积的重要性.
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横断山区位于青藏高原东南部，覆盖四川、西藏、青海、云南等省区，总面积达50余万km2，由一系列南北走向的高大山脉和深切河谷组成[17]. 研究区域位于横断山区南部，雅砻江下游河谷地带，气候为干湿分明的亚热带气候，垂直方向的变化明显，植被以云南松为主. 该地人口密度小、地区社会经济不发达，因而本地污染源较少，能够反映污染物通过大气长距离迁移对该地区的影响. 云南松属乔木，是我国西南地区的特有树种，平均高达5—20 m，胸径70—150 cm，横断山区云南松常见树龄为30年左右，适用于对PFASs的历史重建分析[18].
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采样地点位于雅砻江河谷二滩水电站库区周边山坡，位于四川省攀枝花境内（101°30′54″E，26°54′7″N）. 为避免污染，采样所使用的工具均提前用超纯水和甲醇清洗并干燥，采用内径为5.15 mm的生长锥钻取树芯样，采集位置为距离地面1.3 m处树干位置，分别于2017年8月和2018年1月采集3个（E1、E2、E3）和2个（N1、N2）年轮样品，采样点位置及周边植被情况见图1.
将采集的云南松树芯样品装入聚丙烯采样袋中带回实验室，进行捆绑处理后风干、打磨，通过LINTAB年轮仪测量年轮宽度，利用COFECHA程序辅助交叉定年（排除伪轮、缺轮的影响），实现已知年龄和未知年龄的年轮衔接，最终精确定出每个年轮的生长年份. 树芯基本信息见表1.
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甲醇（色谱纯/99.8%，成都市科龙化工试剂厂）、氨水（25%，成都市科龙化工试剂厂）、Milli-Q超纯水.
实验所用标准样品为高纯度混合标准品PFAC-MXB（Wellington公司），含有全氟羧酸类和全氟磺酸类化合物. 其中，羧酸类包括：全氟丁酸（perfluorobutanoic acid，PFBA）、全氟戊酸（perfluoropentanoic acid，PFPeA）、全氟己酸（perfluorohexanoic acid，PFHxA）、全氟庚酸（perfluoroheptanoic acid，PFHpA）、全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）、全氟壬酸（perfluorononanoic acid，PFNA）、全氟癸酸（perfluorodecanoic acid，PFDA）、全氟十一酸（perfluoroundecanoic acid，PFUnDA）和全氟十二酸（perfluorododecanoic acid，PFDoDA）. 磺酸类包括：全氟丁烷磺酸（perfluorobutanesulfonic acid，PFBS）、全氟己烷磺酸（perfluorohexanesulfonic acid，PFHxS）和全氟辛烷磺酸（perfluorooctanesulfonic acid，PFOS）. PFAC-MXA为高纯度混合碳同位素标记品（Wellington公司），包括：13C4-PFBA、13C2-PFHxA、13C4-PFOA、13C5-PFNA、13C2-PFDA、13C2-PFUnDA、13C2-PFDoDA、13O2-PFHxS和13C4-PFOS.
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由于一年的年轮生物量较少，处理起来误差较大，因此将年轮样品从1991—2012年以每两年为一个样品进行切割. 样品的萃取及净化方法参照Jin等[19]处理树皮中PFASs的方法，并在此基础上进行优化. 树木年轮经真空冷冻干燥后研磨粉碎，称取0.1 g左右至15 mL聚丙烯离心管中，加入2 ng内标，涡旋混合均匀后静置过夜. 加入5 mL甲醇，涡旋30 s，超声30 min，以250 r·min−1振荡1 h，再以3000 r·min−1离心10 min，提取上清液至新的15 mL PP管中. 重复上述过程2次，将3次上清液合并，温和氮吹至5 mL后用Envi-Carb固相萃取小柱（500 mg/6 mL）净化. 过柱前分别用5 mL 0.1%氨水甲醇溶液、5 mL超纯水、5 mL甲醇对固相萃取柱进行活化，活化完成后将样品溶液以每秒1滴的流速过萃取柱并用新的15 mL PP管收集流出液，然后使用5 mL甲醇洗脱收集残留在固相萃取柱上的PFASs，两部分溶液合并后氮吹至1 mL转移至样品瓶中，于4 ℃保存，待测.
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实验采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪（1290-6470），C18色谱柱（Zorbax SB-C18，2.1 mm×50 mm，1.8 μm）. 色谱条件：柱温35 ℃，进样量5 μL，流动相采用5 mmol·L−1乙酸铵溶液（A相）和甲醇（B相），流速0.4 mL·min−1. 流动相梯度洗脱程序：0.00—0.10 min，A相比例为90%；0.10—6.00 min，A相比例由90%降为5%；6.00—8.00 min，A相比例为5%；后运行2 min. 质谱条件：电喷雾离子源；负离子模式（ESI）；多反应离子检测（MRM）模式分析；雾化气压力0.24 MPa；电喷雾电压3000 V；干燥气温度250 ℃.
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本研究采用内标法定量，标准曲线浓度为0、0.5、1、2、5、20、40 ng·mL−1，线性关系r > 0.99. 为降低实验背景及误差，样品在前处理过程中均避免接触和使用玻璃以及聚四氟乙烯容器. 样品前处理过程中每10个样品设置1个方法空白；测定时，每10个样品设置1个溶剂空白. 回收率实验设置两个不同浓度（2 ng·g−1，20 ng·g−1），每个浓度水平3个平行，方法回收率为72.5%—100.7%（表2），满足实验要求.
对于没有在空白样品中检测出的PFASs，其方法检出限（MDLs）为3倍信噪比时对应的浓度；对于在空白样品中检测到的PFASs，其MDLs值为空白样品中浓度的均值加上3倍的标准偏差. 在处理数据时，检测值低于MDLs值时，用MDLs值除以
√2 代替；未检出时，用零代替. 本实验方法的检出限为0.002—0.022 ng·g−1（表2）. -
本研究参照王荣芬[20]的方法对单位面积云南松树干中PFASs的积累量进行计算，具体方法如下：采用木材密度法即平均材积与木材密度的乘积计算得到云南松树干的生物量，平均材积根据样方内云南松树干高度和胸径在标准立木材积表[21]中查得后取平均值，木材密度采用树芯重量与树芯体积之比的平均值；然后根据树芯中PFASs的平均含量计算出单株云南松树干中PFASs的平均积累量. 再根据样方大小和样方内云南松密度计算单位平方千米内云南松树干对PFASs的储量，结果可为横断山区森林系统对PFASs的蓄积提供基础数据，计算公式如下：
公式（1）中，M为单位面积云南松树干中PFASs储量（g·km−2），
−w 为树芯中PFASs平均含量（ng·g−1），−N 为单株云南松树干的平均生物量（g），m为树芯干重（g），−V 为单株云南松树干的平均材积（m³），r为树芯横截面半径（m，均为5.15×10−3 m），R为1.3 m取样处树木半径（m），n为单位平方千米内云南松密度（株·km−2）. -
5个树芯样品中检出率最高的单体物质为PFOA和PFPeA，分别为91.8%和89.8%；其次为PFUnDA （22.4%）> PFBS（12.2%）> PFDoDA（10.2%）> PFHxA（6.12%）；PFBA、PFHxS、PFHpA、PFOS、PFDA和PFNA均未检出. ΣPFASs浓度范围为nd—75.7 ng·g−1，平均值为30.9 ng·g−1，其中浓度最高的物质是PFPeA，平均值为12.7 ng·g−1；其次为PFOA，平均值为12.5 ng·g−1；然后依次为PFUnDA（1.99 ng·g−1）>PFHxA（1.43 ng·g−1）> PFBS（1.33 ng·g−1）> PFDoDA（0.95 ng·g−1），PFOA和PFPeA的浓度显著高于其余单体浓度. 5个树芯样品中ΣPFASs浓度分别为E1（31.0 ng·g−1）、E2（21.9 ng·g−1）、E3（34.6 ng·g−1）、N1（31.7 ng·g−1）和 N2（31.9 ng·g−1）（图2），平均浓度为（30.2±4.4 ）ng·g−1. 魏明翠等[22]研究氟化学工业园周边树叶和树皮样品中的PFASs，得到树叶中ΣPFASs范围为4.90—185 ng·g−1，树皮中∑PFASs范围为0.240—95.4 ng·g−1；Shan等[23]以江苏省受污染地区的樟脑树叶为研究对象，测定树叶中PFASs浓度范围为10—276 ng·g−1. 与受污染地区植物的树叶及树皮中PFASs浓度相比，雅砻江下游云南松年轮样品中PFASs浓度约低1个数量级，此结果与研究地区的人口密度和工业发展程度相吻合. 此外，E为海拔1300 m的树木年轮（（28.5±5.4）ng·g−1），N为海拔2045 m的树木年轮（（31.8±0.1）ng·g−1），二者ΣPFASs浓度无显著差异. Taniyasu等[24]测定日本偏远山区与周边城市降雪中PFASs的浓度发现其与海拔高度无关；而Wang等[25]测定了山区中不同海拔高度的土壤中PFASs浓度，发现PFOA浓度随海拔高度增加而升高. 说明PFASs浓度的影响因素较复杂，即使是同一研究区域，也可能因样本不同、样本性质、周围环境等因素出现差异.
PFASs各单体在年轮中比例特征如图2所示，总体上PFASs的比例特征较为一致，均以短碳链和PFOA为主，其中PFPeA和PFOA占比分别高达54.5%和43.9%. PFOA作为树木年轮中PFASs的主要贡献者之一，和Jin等[19]及魏明翠等[22]的研究结果一致. E点年轮中均有检出PFBS，占比最高为16.8%；N点年轮中均检出了PFHxA，占比最高为12.1%，说明分别存在PFBS和PFHxA的污染来源. 在所有树芯中，长碳链的PFDoDA和PFUnDA基本上均被检出，占比最高分别为4.86%和11.2%.
采用主成分分析法对云南松年轮中检出的6种PFASs解析，得到主成分分析图（图3），筛选出2个特征值 > 1的因子，累计方差贡献率达到84.4%. 其中，因子1可以解释年轮中51.1%的PFASs来源，PFUnDA、PFPeA和PFOA具有较高载荷值，分别为0.990、0.973和0.800；因子2可以解释年轮中33.3%的PFASs来源，PFHxA具有较高载荷值（0.911）. 由于研究区域远离工业区，周围人类活动较少，说明该区域树木年轮中的PFASs大部分来自于大气远距离传输，PFASs到达偏远地区通常有两个传输途径：第一种为直接路径，PFASs因其较低的挥发性，能随大气和洋流直接在全球范围内进行迁移；第二种为间接途径，PFASs前体物质具有较强的挥发性或半挥发性，可随大气迁移后经过干湿沉降、降解进入偏远地区[26-28]. 研究表明，全氟烷磺酰胺（FASA）和全氟烷磺酰胺乙醇（FASE）可以转化为PFCAs和PFSAs[29]，氟调醇（FTOHs）可以通过非生物或生物方式转化为PFCAs[30-31]. 相比于挥发性较强的PFASs前体物的长距离迁移，PFASs吸附到颗粒物上的迁移能力较弱，因此，树木年轮中较高浓度的PFASs可能是其前体物长距离迁移至横断山区河谷发生转化导致的. 横断山区地处川西高原，海拔较高，PFASs及其前体物可通过“蚱蜢跳效应”和“高山冷凝效应”逐步实现从大气到地表的迁移并在高海拔地区累积[32]. 因而森林成为偏远地区PFASs的“蓄积库”，应展开进一步研究，估算横断山区森林系统对PFASs的积累量，为高海拔地区的森林生态安全提供基础数据.
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PFPeA与PFOA在E3、N1及N2中的检出率较高，因此，可以通过这3个树芯的年轮探讨PFPeA与PFOA在该区域的污染历史. 如图4所示，PFPeA在E3中1993—2008年的年轮间均有检出，其浓度随时间先降低后升高；在N1和N2中1992—2010年的年轮间均有检出，浓度随时间的变化没有规律性. PFOA在3个树芯年轮的1993—2010年均有检出，整体有升高趋势，尤其是2006年以后上升趋势较为明显，可能是因为全球将氟调聚物作为中间体广泛应用于生产的兴起，而氟调聚物的大气长距离迁移和光化学转化被认为是偏远地区环境中PFCAs主要来源[33].
数据结果显示PFPeA自1991年始就有检出，而PFPeA的生产及使用约从2000年后开始，与其生产使用历史存在明显差异，这可能是前体物的转化导致或者存在横向迁移. 物质的横向迁移表现为在年轮中的含量变化比实际污染历史相位超前或不存在年代变化规律[34]，PFASs性质随碳链长度不同存在差异，可能导致不同的物质在年轮中存在不同程度的横向迁移. 另一方面，皮尔逊相关性分析发现PFPeA和PFOA存在显著相关性（r=0.887，P=0.045），PCA分析中也聚为一类，说明两者来源相似，进一步证明云南松年轮中的PFASs来源于大气中前体物的转化. 这也就说明年轮中PFASs的含量变化不符合其生产使用历史且无规律性主要是由于相关前体物的影响. 研究表明，FTOHs可通过生物转化和非生物转化的方式生成PFPeA和PFOA，在微生物接种实验中8:2 FTOH和6:2 FTOH均可以转化为PFPeA和PFOA[35]；Ellis等[30]将4:2 FTOH、6:2 FTOH、8:2 FTOH等3种FTOHs在光化学烟雾箱中进行降解反应，结果检测到PFOA及其它代谢产物. 说明FTOHs能够经生物降解和光化学转化生成PFCAs，这些产物以及PFASs颗粒物可通过植物根系和叶片吸收向植物体内传输. 另外PFASs前体物可在植物体内经生物代谢转化为PFASs，如6:2 FTOH和8:2 FTOH能被大豆根吸收向茎和叶传输并逐级代谢生成PFPeA、PFOA及其他代谢产物[36-37]. 因此，在利用树木年轮对PFASs进行历史重建可能会受自身横向迁移以及前体物转化的影响，不能直接用于PFASs的历史反演.
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实验数据显示，高低海拔树芯中PFASs平均含量
−w 分别为31.8 ng·g−1和28.5 ng·g−1，据采样调查数据估测（在高低海拔处分别布设35 m×35 m 和 20 m×20 m 样方，样方内云南松密度分别为16株和13株），样方内单株云南松树干的平均生物量−N 分别为71760 g和24397 g. 因此，根据公式（1）可以计算出，单位面积内云南松树干对PFASs的积累量在高低海拔处分别为91.3 g·km−2和22.6 g·km−2（图5），说明高海拔处的云南松树干对PFASs的蓄积量远高于低海拔处. 王褚等[38]发现，随着海拔升高，光照强度也逐渐增强，因此海拔越高处单株植物可生存的空间更多、受光照强度更强，单株植物的生长状况相对更好. 万娟等[39]对三峡库区的植物群落生长特征进行了研究，也发现植被的生长高度随着高程的增加而增加. 说明随着海拔的升高，树干的生物量增大，从而导致全氟化合物在云南松中的积累量增大，因而高海拔地区森林对PFASs的积累更当引起关注. 单位平方千米内云南松树干中ΣPFASs积累量已高达克级别，横断山区森林植被丰富，蓄积的PFASs通量不容小觑，说明森林已经成了继海洋、河流沉积物之后的PFASs的另一个重要蓄积库，一旦随着树木利用再次进入环境，对生态系统和人类健康的风险不可忽视. -
（1）横断山区河谷云南松年轮中共6种PFASs被检出，ΣPFASs浓度范围为nd—75.7 ng·g−1，检出率最高的物质是PFOA（91.8%）和PFPeA（89.8%），二者占比分别高达43.9%和54.5%. 主成分分析结果表明以PFOA、PFPeA、PFUnDA和PFHxA为主要标志物的2个主成分可以解释该地区年轮中84.4%的PFASs来源，主要来源于PFASs及其前体物的大气长距离迁移.
（2）年轮中PFPeA含量随时间变化不符合其生产使用历史，主要是因为前体物发生了生物转化和光化学转化，因此不能直接用于PFASs历史重建，要考虑相关前体物的影响.
（3）单位平方千米内云南松树干对PFASs的积累量已高达克级别，高、低海拔分别为91.3 g·km−2和22.6 g·km−2，说明云南松是PFASs的蓄积库之一，应该引起进一步的关注.
横断山区河谷云南松中全氟化合物的历史反演及赋存特征
Historical inversion and occurrence of perfluoroalkyl substances in Pinus yunnanensis in Valley of Transverse Mountain Area
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摘要: 为研究森林树木对全氟化合物（PFASs）污染的历史变化及积累，采集了横断山区河谷云南松（Pinus yunnanensis）年轮，采用超高效液相色谱-质谱联用仪分析了树木年轮中12种PFASs的浓度水平. 分析结果表明，年轮中共有6种PFASs检出，ΣPFASs浓度范围为nd—75.7 ng·g-1，其中检出率最高的物质是PFOA（91.8%）和PFPeA（89.8%）. 以PFOA、PFPeA、PFUnDA和PFHxA为主要标志物的2个主成分可以解释该地区年轮中84.4%的PFASs来源，主要来源于PFASs及其前体物的大气长距离迁移. 年轮中PFPeA含量随时间变化不符合其生产使用历史，主要受前体物的生物转化和光化学转化影响. 单位面积内云南松树干的积累量在高低海拔分别为91.3 g·km-2和22.6 g·km-2，说明云南松已成为PFASs在环境中的重要蓄积库之一，今后应进一步加强对横断山区和高海拔地区森林树木的研究，为环境中PFASs的管控提供基础数据.
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关键词:
- 全氟化合物(PFASs) /
- 横断山区河谷 /
- 云南松 /
- 历史反演 /
- 赋存.
Abstract: In order to study the historical change and accumulation of perfluoroalkyl substances in forest trees, twelve PFASs in Pinus yunnanensis’s tree rings collected in Valley of Transverse mountain area were analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The results showed that only six PFASs were detected in the tree rings, and ΣPFASs concentrations ranged in nd— 75.7 ng·g-1, with the greatest detection frequency found in PFOA (91.8%) and PFPeA (89.8%). Two principal components with the main markers of PFOA, PFPeA, PFUnDA and PFHxA could explain 84.4% of the sources of PFASs in the growth rings in this region, which mainly came from the long-distance atmospheric migration of PFASs and their precursors. The temporal distribution of PFPeA concentrations in tree rings was not consistent with its production and use history, which was mainly affected by the biotransformation and photochemical transformation of its precursors. The accumulation of Pinus yunnanensis trunk per unit area were 91.3 g·km-2 and 23.3 g·km-2 at high and low altitudes, respectively, indicating that Pinus yunnanensis has become one of important reservoirs of perfluoroalkyl substances in the environment. Future research on the Transverse mountain area and high altitude areas should be carried out to provide basic data for the control of perfluoroalkyl substances in forest vegetation. -
邻苯二甲酸酯类化合物（phthalate esters， PAEs）是邻苯二甲酸酐与醇反应生成的化合物，它是提高聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）弹性的重要添加剂，其中邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是目前使用量最大的一种邻苯二甲酸酯，用量高达80%[1]. DEHP广泛应用于儿童玩具、塑料包装、化妆品及各类医疗器械[2-3]. DEHP的广泛使用导致了不可避免的环境释放以及人体摄入. 大量实验指出我国人群DEHP的暴露剂量约为11—116 μg·kg−1·d−1，接近DEHP的每日可耐受摄入量（TDI）（20—140 μg·kg−1·d−1），表明 DEHP对人群的健康构成重大危害[4].
DEHP具有内分泌干扰效应，可以诱发生殖发育毒性、肝脏毒性、胚胎毒性等多种毒性[5-6]. DEHP通过消化道进入人体后在胃肠道的脂肪酶作用下水解成初级代谢物乙基己醇（2-EH）和邻苯二甲酸单乙基己基酯（mono-ethylhexyl phthalate，MEHP），再通过尿液排出体外[7]. 通过对尿液的单酯类物检测发现，原尿和酶解后的尿液中 MEHP 的检出率最高，平均检出率超过60% [8]. 此外，试验结果表明DEHP的毒性主要来源于其代谢物 MEHP，其毒性作用高达DEHP的10倍[9]. 同时，MEHP的动物实验表明，其主要分布在肾脏、膀胱和肝脏，其中肝脏为MEHP最主要的靶器官[10]. Thomas等的研究中，大鼠口服500 mg·kg−1 DEHP，30 min后，肝脏MEHP水平为12.5 mg·g−1 [11]. MEHP毒性作用主要体现在增加肝脏亲脂活性，导致肝脏中出现脂肪堆积，继而引发肝细胞脂肪变性[12].
肝脏在体内发挥着外源物质解毒和代谢脂类物质的主要作用. 肝脏内游离脂肪酸增加和甘油三酯沉积是肝脏脂质代谢紊乱的主要表现. 近年来，全球肥胖病与非酒精性脂肪肝患病率快速上升. 体内体外实验提示脂肪代谢紊乱会增加肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝病的患病危险度. 流行病学和毒理学研究报告称，接触DEHP会影响机体脂肪代谢，从而促进肥胖[13]. 体内实验表明大鼠用DEHP处理后，肝脏重量增加，主要机制可能与肝代谢酶改变有关[14]. 有体外实验表明，MEHP处理HepG2细胞后，激活了PPARα使脂肪酸的氧化分解受到抑制[9]，导致肝细胞内的脂质堆积并造成肝脏损伤. 在本课题组的前期研究发现，MEHP 处理后的HepG2 细胞的乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）的亚型ACC1蛋白表达水平增加，最终使肝脏细胞中脂肪酸合成增加. 这些结果表明，MEHP 可能通过影响脂质合成相关基因或蛋白的表达，从而导致肝细胞脂肪代谢出现紊乱. 为此，本实验以HepG2细胞为实验对象，通过MEHP染毒，观察细胞内脂质代谢情况，并通过基因芯片高通量筛查差异基因，探讨MEHP对体外脂质合成的影响及其可能的作用机制.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 细胞培养与染毒
从中国科学院上海生命研究院细胞资源中心购买HepG2细胞. 细胞培养基含 10%胎牛血清、1%青霉素庆大霉素双抗. 细胞培养条件为37 ℃、5% CO2. 取指数生长期的细胞进行染毒，参考相关文献[9]及我国人群接触水平设置染毒浓度. 共设置5个染毒浓度 ：阴性对照（完全培养基）、阳性对照（1 mmol·L−1油酸）、0.01 、1 、10 μmol·L−1MEHP. 染毒48 h后进行相关实验.
1.2 细胞油红 O 染色
为了研究细胞中脂滴的蓄积，用油红O法对HepG2细胞进行染色. 5个实验组的细胞染毒48 h后进行染色. 主要步骤为：弃去孔中废弃培养基，用 PBS 漂洗细胞，4%（质量分数）多聚甲醛固定细胞，油红O染色30 min，60%（体积分数）异丙醇洗去多余染料，苏木精复染细胞核10 s. 用显微镜获取图像并观察细胞内脂滴情况.
1.3 芯片数据以及数据前处理
用1 μmol·L−1 MEHP处理的细胞进行芯片分析，Agilent （人）表达谱芯片由博奥晶典公司完成. 步骤如下：以待检测样品的 total RNA 为起始，进行体外扩增和荧光标记，然后用Oligo（dT）Primer 引物合成cRNA并进行纯化和反转录得到cDNA. 最后用 Klenow Fragment 酶合成带有荧光基团的DNA 进行芯片杂交. 用 Feature Extraction 提数软件对芯片杂交扫描后的图片数据进行处理分析.
1.4 差异基因的筛选
通过Ｒstudio limma包将芯片基因的数据进行处理，以表格格式导出并进一步筛选差异表达基因. 差异表达基因（DEG）定义为差异倍数 FC大于 1.5或小于0.67且 P值小于 0.05的基因.
1.5 DEG功能富集分析
将上述分析得出的DEG导入 DAVID在线数据库（
https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp ），进行GO分析. 通过对显著表达的基因进行功能注释分析，包括生物学过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF），进而了解差异表达基因的生物学意义. 以 P<0.05认为具有显著性.1.6 PCR验证
按照1.1节对处于指数生长期的细胞进行染毒，每个实验组设置6个平行对照，染毒48 h后提取RNA. 细胞样品用Trizol试剂裂解，提取总RNA. 用超微量分光光度计测定RNA的含量和纯度. 将符合条件的RNA （A260/A230>2.0，和A260/A280=1.8—2.0）样本用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA备用.
从具有显著性且参与脂质代谢过程的差异基因中选取丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化亚基2（PDP2）、磷脂酶A2组 IVE（PLA2G4E）、脂肪酸去饱和酶 6（FADS6）、Q型蛋白酪氨酸磷酸酶受体（PTPRQ）、CD28、甾醇-C5-去饱和酶（SC5D）、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）作为目的基因，检测mRNA表达水平（荧光定量PCR仪为Line Gene 9600）. 引物信息如表1所示. 以GAPDH为内参，数据分析时取Ct值的平均值，用相对定量法2−△△ct法计算目的基因表达的变化情况. 采用 SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析，多组间比较使用单因素方差分析，事后比较用LSD 检验进行，P<0.05认为具有统计学意义.
表 1 实时定量PCR引物序列Table 1. Primer sequences for real-time quantitative PCR基因Gene 引物Primer PDP2 S——GAAGATGAGGTGACAAGGAA F——GCCAGCACAAG MVD GAACTTA PLA2G4E S——TTCTGTCCTATGGCTCCTT F——GTTCTTCACTCGGCTCTG FADS6 S——CCTCAACCGCTATGTCTAC F——CGATGTGCTGGAAGATGT PTPRQ S——ATGTCTATATTGCGGCTGAA F——TTCTTACTTGCGTGGATTCT CD28 S——GCTCTTGGCTCTCAACTTA F——CCTGCTCCTCTTACTCCT SC5D S——CTTGCTGGAGATAAGAGGTT F——TATGGTGGTCTGTATGATGAG MVD S——CAAGGACTTCACCGAGGA F——GTAGGCTAGGCAGGCATA | Show Table
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1.7 基因表达谱数据动态分析
将细胞脂质代谢通路的基因输入 GEPIA 在线分析网站（http://gepia.cancer-pku.cn/），分析其在肝癌组织中的表达. P<0.05认为具有统计学意义.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 油红O 染色结果
如图1所示，阴性对照组细胞有明显的边界，细胞内没有脂滴存在. 油酸染毒的细胞可见大量明显着色的脂滴，主要分布在细胞膜内侧区域，大小不等. 与阴性对照组相比，0.01 μmol·L−1 MEHP剂量组未见明显改变；1、10 μmol·L−1 MEHP剂量组可观察到少量红色脂滴，且随着染毒浓度的增大，脂滴的数量也逐渐增加，暂时未见对细胞边界的影响. 在前期实验中本课题组对MEHP染毒的HepG2细胞中的甘油三酯（TG）含量进行了定量检测， TG含量结果与油红O染色结果相一致，提示较高剂量 MEHP 暴露可提高细胞中的脂质水平[8]. 这一结果表明， MEHP暴露后，导致HepG2细胞中的甘油三酯蓄积，从而引起肝细胞中的脂质沉积.
图 1 不同浓度MEHP染毒对HepG2细胞内脂肪积累的影响（×400）Figure 1. Effects of different concentrations of MEHP on lipid accumulation in HepG2 cells（×400）A:光镜下未染色HepG2细胞；B:阳性对照组；C:阴性对照组；D、E、F：0.01、1、10 μmol·L−1 MEHP组. →为 HepG2 细胞内红色脂滴.A: HepG2 cells were not stained under light microscope; B: Positive control group; C:Negative control group; D、E and F: 0.01、1 and 10 μmol·L−1 MEHP groups; →represents red lipid droplets.2.2 差异基因筛选
如图2所示，根据P<0.05，FC>1.5或<0.67的筛选标准，共筛选出93个差异表达基因（表2），其中上调的基因57个，下调的基因36个.
表 2 差异基因的表达情况Table 2. The expression of differentially expressed genesUp Down symbol lgFC P.Value symbol lgFC P.Value DPPA3 0.743871 0.000032637 TTTY14 −0.75345 0.000683968 MYLIP 0.685596 0.000320629 XLOC_008352 −0.691 0.001413602 XLOC_000888 0.664559 0.000498704 LOC100129112 −0.83639 0.001799658 LOC100127994 0.609364 0.00056601 SC5D −0.92097 0.002090916 SYT17 0.650856 0.000986627 XLOC_004178 −0.72657 0.002192512 XLOC_008003 0.727595 0.00115933 C14orf119 −0.78947 0.003595082 LOC100506487 0.589801 0.001543009 XLOC_l2_012082 −0.61338 0.004605101 FADS6 0.784036 0.002373877 XLOC_012908 −0.92876 0.006283058 AQP10 0.603687 0.00355145 GABRG1 −1.01945 0.007994 XLOC_001387 0.675839 0.003916862 NUMB −0.57939 0.008775398 KCNE4 0.831973 0.003949384 FLJ21408 −0.61905 0.009899712 XLOC_005215 0.65671 0.004608305 LOC100505657 −0.89616 0.010826125 OR5L1 0.922639 0.004609802 ZNF554 −0.60913 0.011699612 C14orf180 0.649561 0.005207664 XLOC_012871 −0.78553 0.01385829 RHOXF1 0.622636 0.007822227 XLOC_007131 −0.7273 0.014006601 PTPRQ 0.739332 0.008548009 XLOC_l2_014785 −0.66169 0.01855114 LOC286382 0.586815 0.008726912 PRO0611 −0.78996 0.018748849 ACOD1 0.61305 0.008957375 CREG2 −0.70749 0.018758137 LOC100130744 0.85844 0.009748146 XLOC_l2_004857 −0.66225 0.023632428 ZAP70 0.625018 0.010183849 PDP2 −0.80976 0.023933353 PLA2G4E 1.427762 0.011394311 XLOC_l2_011207 −0.57923 0.026335268 LOC652586 0.614123 0.011818286 XLOC_007761 −0.58384 0.027416794 XLOC_006019 0.666199 0.012002598 GNL3LP1 −0.6286 0.027632132 SLAMF7 0.896594 0.013447959 XLOC_l2_013646 −0.89314 0.028992205 XLOC_005433 0.588529 0.014072632 MVD −0.63712 0.031037423 KRTAP13-2 0.681023 0.014111061 LOC728065 −0.58089 0.031598939 XLOC_008237 0.804098 0.01445258 XLOC_l2_011011 −0.60147 0.033573436 XLOC_008244 0.677154 0.01652238 XLOC_001687 −1.03697 0.037696163 LOC100505966 0.836326 0.01818776 XLOC_004804 −0.68571 0.039579631 XLOC_001422 2.454291 0.018227482 LOC100507110 −0.60107 0.041523521 CSN2 1.0231 0.020348553 CACNG8 −0.61314 0.041704333 XLOC_003782 0.639271 0.021116476 SNORD70 −0.92894 0.044259091 XLOC_005572 0.585382 0.02204518 LOC100128126 −1.05439 0.044856832 XLOC_003349 1.233979 0.022738339 NPPA-AS1 −0.59523 0.048087643 XLOC_l2_00770 0.610547 0.023106187 XLOC_001550 −0.64752 0.04894801 SNORD115-48 0.719119 0.024508996 INE1 −1.017 0.0496582 SNORD115-4 0.688309 0.026211298 XLOC_001755 0.605516 0.028061446 ANK2 0.906401 0.029169596 CD28 0.589859 0.029610282 LOC100506563 1.019834 0.029837404 ANXA10 0.626939 0.030222491 CYBB 1.151916 0.03336549 XLOC_012064 1.019834 0.0345969 XLOC_013649 0.624561 0.035226312 XLOC_010183 1.380268 0.035959747 XLOC_006983 0.862151 0.040708371 XLOC_004274 0.720596 0.040795527 XLOC_008690 0.686422 0.041491936 XLOC_007888 0.852148 0.04152697 XLOC_l2_011145 0.704819 0.042378972 SLC24A4 0.757531 0.043335006 XLOC_013458 0.71734 0.043999913 TREML1 0.800135 0.047577606 TRIM49 0.796312 0.048328175 ANKDD1B 0.683738 0.049447534 DUSP21 0.604901 0.049510457 | Show TableDownLoad:
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2.3 差异基因的功能富集分析
通过对差异基因进行GO分析探讨差异基因所涉及的生物学过程，包括基因的３个部分：分子功能（MF）、细胞组分（CC）、生物过程（BP）. 结果显示，可以识别的基因一共有48个，显著富集的GO条目一共有13条（P<0.05），其中生物过程7条（图3）. 前5条通路及具体信息见表3，主要包括细胞脂质代谢过程（cellular lipid metabolic process）、T细胞阴性选择（negative T cell selection）、跨膜运输（transmembrane transport）、跨膜转运的调控（regulation of transmembrane transport）、先天免疫反应（innate immune response）；分子功能2条,包括被动跨膜转运活性（passive transmembrane transporter activity）、基质特异性跨膜转运蛋白活性（substrate-specific transmembrane transporter activity）；细胞组分4条，包括膜的外部成分（extrinsic component of membrane）、等离子体膜（plasma membrane）、质膜部分（plasma membrane part）.GO 分析表明, 最显著激活的通路是细胞脂质代谢通路，他由上调基因 FADS6、PTPRQ、CD28、 PLA2G4E 和下调基因 SC5D、PDP2、MVD 组成.
图 3 DAVID分析中生物过程通路的GO条目与基因Figure 3. Chord plot depicting the relationship between genes and GO terms of biological process表 3 DAVID分析中前5个通路（BP）与基因Table 3. Top 5 GO terms （BP） of the genes with the DAVID analysisGO TermGO 条目 Count数量 Genes基因 Fold Enrichment富集倍数 P Value P值 GO:0044255cellular lipid metabolic process 7 PDP2, PLA2G4E, FADS6, PTPRQ, CD28, SC5D, MVD 3.85628326776209 0.0068 GO:0045087innate immune response 5 TREML1, ZAP70, CYBB, ACOD1, SLAMF7 3.042438312 0.0494 GO:0055085transmembrane transport 7 SLC24A4, CACNG8, KCNE4, AQP10, CYBB, ANK2, GABRG1 3.024137931 0.0204 GO:0006629lipid metabolic process 7 PDP2, PLA2G4E, FADS6, PTPRQ, CD28, SC5D, MVD 5.660947851 0.0210 GO:0034762regulation of transmembrane transport 4 CACNG8, KCNE4, CYBB, ANK2 3.43652037617554 0.0300 | Show TableDownLoad:
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2.4 PCR验证
MEHP染毒后相关基因mRNA表达水平的变化如图4所示. 与阴性对照组相比，基因FADS6 在1 μmol·L−1 MEHP染毒样品内基因表达水平明显增加（P<0.05）；基因SC5D、PDP2在1 μmol·L−1 MEHP剂量组基因表达水平明显降低（P<0.05），MVD在10 μmol·L−1 MEHP剂量组基因表达水平明显降低（P<0.05）. 其中，基因SC5D、PDP2、MVD、FADS6的mRNA表达水平与芯片结果表达一致，基因PTPRQ、CD28、PLA2G4E结果不一致.
图 4 不同浓度MEHP染毒对 HepG2 细胞相关基因mRNA表达水平影响Figure 4. Effects of different concentrations of MEHP on mRNA expressions of relative genes in HepG2 cells本研究通过转录组数据分析探讨MEHP在HepG2细胞脂质代谢过程中发挥作用的基因，发现细胞脂质代谢通路上的基因FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E在代谢过程中起重要作用. 脂肪酸去饱和酶（FADS6）在多不饱和脂肪酸（PUFA）的合成途径中起关键作用，参与了PUFA合成过程中的限速步骤，并调节PUFA的代谢通量[15]. 据报道，FADS6的活性是调节生物体中多不饱和脂肪酸比例的主要因素,其活性改变会影响一些疾病，如炎症和肿瘤发生，2型糖尿病，心血管疾病，代谢紊乱和神经精神疾病[16]. Montell的研究发现，含不饱和脂肪酸的二脂酰甘油（DAG）比饱和脂肪酸的DAG对二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）有更强的亲和力，即肝脏合成 TG 首先利用不饱和脂肪酸, 更容易导致甘油三酯积累，而饱和脂肪酸多以 DAG 的形式蓄积[17].
本实验富集分析与PCR的结果显示，FADS6的mRNA表达水平升高，促进了HepG2细胞中多不饱和脂肪酸合成，这可能是HepG2细胞中甘油三酯合成增多进而出现脂肪堆积的原因. 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）参与胆固醇生物合成过程中的早期步骤. 通过Jump实验中转录组数据的KEGG分析显示，MVD参与SREBP激活基因表达、SREBP调节胆固醇生物合成、脂类和脂蛋白代谢等胆固醇代谢相关的通路，MVD的变化可调控乙酰乙酰-辅酶A的变化，进而改变）胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP）的表达水平[18]，已有研究证明SREBP的上调导致肝细胞内胆固醇合成增加 [19] . 甾醇-C5-去饱和酶（SC5D）是一种胆固醇生物合成酶，它催化乳甾醇（lathosterol）转化为7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol），参与胆固醇合成中的酶促反应通路[20]. 有文献报道SC5D基因缺陷会引起乳甾醇症（Lathosterolosis），一种罕见的常染色体隐性胆固醇生物合成障碍疾病[21]. SC5D基因在HepG2细胞中表达水平的改变导致细胞内胆固醇合成发生紊乱. 磷脂酶A2（PLA2）是一种参与脂蛋白代谢和炎症途径的酶，所产生的脂质介质对细胞代谢起重要调控作用. 有文献报道NAFLD病人血浆中PLA2水平和肝脏的脂肪变性程度呈显著正相关,这说明PLA2可能参与肝细胞代谢过程中[22]. 有研究证实PLA2过表达的肝脏甘油三酯（TG）含量显著增加，同时增加趋势与PLA2的表达趋势相一致[23]. PLA2G4E作为PLA2的一种，对肝脏细胞的代谢也有调控作用. 本研究中发现，芯片结果中PLA2G4E表达水平升高，提示PLA2G4E是MEHP诱导甘油三脂含量增加，扰乱肝细胞脂质代谢的原因之一.
2.5 关键差异基因的在肝癌中的表达
利用在线分析工具GEPIA分析以上基因在肝细胞癌组织的表达水平，如图5所示. 这7个基因在肝细胞癌组织中的表达变化对比正常组织没有显著性. 但是以上基因在HepG2肝癌细胞脂质代谢过程中的表达水平均具有明显改变，导致肝癌细胞脂质代谢紊乱、脂肪堆积.
图 5 关键基因在肝癌中的表达水平Figure 5. Relative expression comparison of key genes in liver cancer samples in GEPIA database非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种可逆性的疾病，但随着研究的不断深入， NAFLD的发病范围由单纯脂肪肝、脂肪肝、肝硬化发展到原发性肝细胞癌[24]. 多项研究证明NAFLD可逐渐发展为非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH），从而导致肝硬化[25]，而肝硬化是除HBV、HCV引起原发性肝癌的另一主要原因. 因此假如高龄、胰岛素抵抗、肥胖等危险因素持续存在，NAFLD最终可引起肝癌. 同时Iris [26]的动物实验和Ertle[27] 的研究证实，NAFLD可不经肝硬化阶段发展为原发性肝癌. 由此可知，虽然以上基因在肝癌组织中的表达没有明显变化，但是对肝癌的前身——NAFLD发生发展具有重要作用.
3. 结论（Conclusion）
本研究以HepG2细胞为研究对象，结合油红O染色以及基因芯片等技术，发现MEHP暴露影响了细胞脂质代谢等信号通路，改变了关键因子FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E的表达水平，导致肝脏细胞中甘油三酯与胆固醇的合成增加，肝脏细胞出现脂肪蓄积. 综上所述，MEHP暴露可以通过改变细胞代谢相关基因引起肝脏细胞内脂质代谢紊乱.
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图 2 树芯中PFASs的浓度水平（a）及比例特征（b）
Figure 2. Concentrations（a）and proportions（b） of PFASs in tree cores
图 4 年轮中PFPeA（左）和PFOA（右）的年代变化特征
Figure 4. Temporal variation characteristics of PFPeA and PFOA in annual rings
图 5 不同海拔云南松树干中PFASs的积累量
Figure 5. Accumulation of PFASs in Pinus yunnanensis trunk at different altitudes
表 1 树芯样本信息
Table 1. The information of tree core samples
树芯Tree cores 位置Location 海拔/mAltitude 胸围/cmDBH 树干高度/mTree height 定年Dating 经度Longitude 纬度Latitude E1 101°41′E 26°53′N 1300 76 12 1993—2012 E2 1300 76 12 1992—2011 E3 1300 73 9 1993—2010 N1 101°39′E 26°55′N 2045 101 16 1992—2011 N2 2045 97 15 1991—2010
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表 2 PFASs在年轮中的检出限及回收率
Table 2. Detection limits and recoveries of PFASs in tree rings
目标物 Objects 检出限/（ng·g−1） MDL 回收率/% Recovery（Avg±SD） 加标2 ng Add standard 2 ng 加标20 ng Add standard 20 ng PFBA 0.003 98.0±1.1 96.1±0.3 PFPeA 0.007 78.9±10.3 74.5±3.0 PFHxA 0.022 100.7±0.6 89.2±1.7 PFHpA 0.002 98.1±4.9 96.5±8.7 PFOA 0.012 98.2±3.2 88.8±1.0 PFNA 0.004 97.0±1.6 86.2±0.5 PFDA 0.011 100.4±1.7 90.1±1.8 PFUnDA 0.006 98.5±5.4 86.2±1.9 PFDoDA 0.006 98.0±1.8 87.5±1.5 PFBS 0.012 76.3±6.8 72.5±8.1 PFHxS 0.008 99.3±5.9 98.9±1.4 PFOS 0.005 97.1±1.8 92.0±1.1
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