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有机亚磷酸酯抗氧化剂（organophosphite antioxidants, OPAs）被广泛用于印刷油墨、塑料、石油、个人护理产品甚至食品中，以延缓氧化反应并延长其保质期[1]。其中，亚磷酸三（2,4-二叔丁基苯基）酯（tris（2,4-di-tert-butylphenyl） phosphite，AO168）能够显著提高聚合物的稳定性并延长使用寿命，被广泛应用于聚丙烯（PP）、聚乙烯（PE）、苯乙烯及其共聚物等高分子材料中[2-3]。在美国，AO168的年产量为4536—22680 t[4]。2020年，在中国的PP和PE塑料制品中，AO168的添加量为63 t[3]。研究表明，AO168的大鼠急性注射毒性LD50≥2000 mg·kg−1，并且在生产和使用过程中，AO168主要转化为三（2,4-二叔丁基苯基）-磷酸酯（tris（2,4-di-tert-butylphenyl）-phosphate，AO168O）和2,4-二叔丁基苯基（2,4-di-tert-butylphenyl，2,4DtBP）（结构式见图1）[5]。
近年来，AO168O和2,4DtBP在大气颗粒物[6]、室内灰尘[7]和日常用品[8-9]中广泛检出，受到了越来越多的关注[10]。AO168作为抗氧化剂[11]，在塑料生产过程使用过程中不断被消耗[12-13]，AO168O的含量逐渐上升[14]。进入环境中的AO168也可能通过生物和非生物途径降解，导致AO168O和2,4DtBP在环境中检出[14]。毒理学研究表明，2,4DtBP能够与雌激素受体结合，减少17β-E刺激细胞的生长，具有内分泌干扰作用[15-16]。虽然AO168O的毒理学机理尚未明确，但通过呼吸暴露和皮肤暴露途径进入人体的每日摄入量（estimated daily intake, EDI）计算结果表明，其对人体健康产生的潜在风险仍不容忽视[4, 17]。
血清作为评估有机污染物人体内暴露的重要介质，可以反映污染物对人体长时间的暴露水平[18]。目前，有关血清中AO168O和2,4DtBP的研究较少，相应的分析方法及人体健康风险也未见报道。因此，开发血清中AO168O和2,4DtBP的分析方法，对评估AO168O和2,4DtBP人体暴露水平及潜在的健康风险具有重要意义。
目前，AO168O和2,4DtBP的分析方法主要有气相色谱-质谱法（GC-MS/MS）[5-6]和液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）[19]。本研究基于GC-MS/MS检测，通过对液相萃取和固相萃取方法的优化和比较，建立了血清中AO168O和2,4DtBP的前处理方法，并对采集自天津市部分青年人群的66份血清样品进行测定，验证了方法在实际样品分析中的可行性。该方法可为评估AO168O和2,4DtBP的人体健康风险提供技术支持。
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正己烷、二氯甲烷（色谱纯，美国Honeywell公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯，美国Merck公司）；AO168O标准品（纯度：95%；加拿大Toronto Research Chemicals公司）；2,4DtBP标准品（纯度：99%，美国Sigma-Aldrich公司）；内标TPHP-d15（纯度：98.8%，天津阿尔塔科技有限公司）；Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL，美国Waters公司）；Sprague Dawley大鼠血清（SD大鼠血清，上海研尊生物科技有限公司）。
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气相色谱-质谱仪（7890A-7000B，美国Agilent公司），配有电子轰击源（EI）；固相萃取设备（美国Supelco公司）；氮吹仪（美国Organomation公司）；Milli-Q纯水仪（美国Barnsteead International公司）；万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）。
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样品采集：血清样品来源于天津市某医院的备孕男性体检人群，随机选取66份血清样品进行测定。受试者均自愿参与本研究项目并签署了《知情同意书》。将全血样品收集在不加抗凝剂的真空采血管中，以3000 r·min−1离心10 min，采集血清上清液。采集后的血清样品存放在-80 ℃冰箱中冷冻保存直至分析。
前处理分析：将血清样品从-80 ℃冰箱中取出，先置于−20 ℃保存1 h，然后转移至4 ℃保存1 h，最后转移至25 ℃室温保存1 h。准确量取0.5 mL的血清样品并转移至10 mL玻璃离心管中，加入3 mL乙腈，振荡10 min，然后在3000 r·min−1条件下离心10 min，取出上清液至玻璃试管中，萃取过程重复3次。萃取完成后，合并上清液并氮吹浓缩。使用0.5 mL正己烷复溶并加入10 μL的内标TPHP-d15（1 ng·μL−1），使用GC-MS/MS进行测定。
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色谱条件：DB - 5MS 色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；不分流进样模式；高纯氦气（99.999%）作为载气；载气流量为1.5 mL·min−1；进样量为2 μL；溶剂延迟为5 min；进样口温度为280 ℃；升温程序：起始温度80 ℃（保持1 min），升温（15 ℃·min−1）至200 ℃，然后升温（30 ℃·min−1）至300 ℃（保持15 min）。
质谱条件：电子轰击（EI）离子源（70 eV）；离子源和传输线温度均为280 ℃；检测方式为多重反应监测模式（MRM）（具体参数见表1）。
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本研究中使用SD大鼠血清进行空白及加标实验。为了避免本底污染，实验材料均使用玻璃容器。玻璃容器在使用前依次用超纯水、丙酮和正己烷润洗3次，120 ℃烘干后备用。仪器分析前，多次测定纯正己烷监测仪器本底值，确保目标物的本底值低于检出限后进行实际样品测定。对优化后的方法进行性能验证，包括线性范围、检出限、定量限、精密度等。
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基质效应（Matrix effect，ME）指前处理分离时共洗脱的基质成分影响待测组分的离子化效率，导致仪器分析信号的抑制或增强，影响实验测定结果的重复性和准确性[20-21]。由于AO168O和2,4DtBP没有相应的同位素内标，因此选择与其结构类似的TPHP-d15作为评估基质效应的内标。基质效应使用公式1进行计算：
其中，A是纯溶剂中加入20 μL内标TPHP-d15（0.5 ng·μL−1）的峰面积，B是血清样品经过不同前处理步骤后加入20 μL内标TPHP-d15（0.5 ng·μL−1）的峰面积。ME为90%以下时，基质效应表现为抑制作用；ME为90%—110%时，基质效应适中，可忽略不计；ME为120%—150%时，基质效应表现为中等增强作用；ME大于150%时，基质效应表现为强基质作用[22]。
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配制AO168O和2,4DtBP标准溶液并进行质谱参数优化，在电子轰击源（EI）模式下进行一级质谱扫描，选择各化合物丰度最高的特征离子碎片作为母离子；再进行二级质谱扫描，选择对应的特征碎片离子作为子离子。经过优化后，采用多重反应监测模式（MRM）对所有化合物进行检测，各目标物的检测参数见表1。
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色谱条件基于目标物性质（表2）及文献[6]报道进行优化。2,4DtBP和AO168O均属于非极性化合物（lg Kow：5.19和16.16），实验采用非极性色谱柱DB-5MS（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）进行分离，升温程序见“1.4”部分。结果表明，在此条件下，2,4DtBP和AO168O均能实现分离，且分析时间较短，没有目标物残留，能够应用于目标物的测定。
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目前，环境样品中（大气颗粒物、土壤等）对AO168O和2,4DtBP的前处理大部分采用超声萃取法[17, 23]。血清中主要的前处理方法包括液液萃取法和固相萃取法[24-27]。本研究通过在SD大鼠血清中加入10 μL的目标物（0.5 ng·μL−1），对液相萃取法和固相萃取法两种前处理方法分别进行实验，通过加标回收率等参数进行评估。
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在本研究中，重点评估了不同极性溶剂（正己烷、乙酸乙酯和乙腈）对血清中2,4DtBP和AO168O的提取效率。每种溶剂重复5次，并平行开展过程空白实验（n=3），对背景污染进行评估，结果见图2。对2,4DtBP和AO168O，乙腈的加标回收率分别为100%—132%和126%—189%；正己烷和乙酸乙酯对2,4DtBP的萃取效果较差，加标回收率分别为31%—98%和27%—58%，对AO168O的加标回收率最高可达200%以上。通过对比平行空白发现，并未发生过程污染，因此判断这可能与基质效应有关。
进一步考察基质效应的影响（n=5），结果表明，乙腈和正己烷萃取物表现出中等基质增强作用[28]，基质效应平均值分别为128%和122%。当乙酸乙酯作为萃取剂时，有强基质增强作用（217% ± 12%）。这可能是由于乙酸乙酯萃取血液样品（血清或血浆）时，共萃取物易在质谱检测中产生基质增强效应，Liu等[29]在测定血清中的淫羊藿黄酮类化合物时，同样发现乙酸乙酯作为萃取溶剂表现出基质增强的效果（ME：104%—187%）。Xu等[30]使用乙酸乙酯萃取大鼠血浆中的特女真苷和橙皮苷也表现出中等基质增强效应（ME：130%—137%）。本研究在经过乙腈前处理后的样品中加入10 μL的内标TPHP-d15（1 ng·μL−1），校正基质效应，达到对目标物准确定量的目的。
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基于文献[31]报道，本研究选择Oasis HLB柱（200 mg，6 mL）作为萃取柱。过程空白（n=3）结果表明，HLB柱存在明显的本底干扰，甲醇洗脱可检出高浓度的2,4DtBP和AO168O，浓度值分别为184.3—232 ng·mL−1和847.5—1604.6 ng·mL−1。在上样前采用甲醇对SPE柱进行润洗，以减少HLB柱本底引入。通过实验发现，当甲醇的润洗体积为27 mL时，并未在润洗液中发现目标物（图3）。
因此，选用30 mL的甲醇对HLB柱润洗，以减少本底引入。进一步采用正己烷、正己烷-二氯甲烷（1∶1，体积比）、二氯甲烷、甲醇4种溶剂作为洗脱溶剂考察洗脱效率（n=3）。结果表明，采用甲醇洗脱时，2,4DtBP和AO168O的加标回收率分别为45%—98%和74%—112%。然而，正己烷、正己烷-二氯甲烷（1∶1，体积比）、二氯甲烷对目标物的回收率均高于200%，并且过程空白中仍存在较高的本底（见图4）。上述结果表明，固相萃取柱中的本底仍未能完全去除，即使经过甲醇润洗后仍存在本底干扰的风险。进一步对玻璃材质的固相萃取柱进行了考察，结果表明，AO168O和2,4DtBP加标回收率范围为82%—114%，定量限分别为0.6 ng·mL−1和0.3 ng·mL−1，过程空白未检出本底污染。
综上，通过对比液相萃取法和固相萃取法，表明常用的塑料材质SPE柱可能造成过程污染，严重影响检测结果的准确性。采用玻璃材质的固相萃取柱以及液相萃取法可去除本底污染，其方法性能基本一致。但是采用玻璃固相萃取柱进行前处理时，其步骤相对复杂，耗时较长，检测成本高昂，液相萃取法与之相比操作更为简单快速，更加适用于大批血清样品的检测。因此，选择液相萃取法作为血清中2,4DtBP和AO168O的前处理方法，并采用此方法进行实际血清样品的分析。
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配制AO168O（0.8—100 ng·mL−1）和2,4DtBP（0.6—100 ng·mL−1）的标准溶液，直接进样测定，以化合物浓度为横坐标，样品峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。AO168O和2,4DtBP在配制浓度范围内线性关系良好，相关系数R2分别为0.9992和0.9995。在SD大鼠血清中加入目标物，按照样品前处理方法进行分析，经过内标校正后，测定方法的检出限（LOD，S/N = 3）和定量限（LOQ，S/N = 10）。结果表明，AO168O的检出限和定量限分别为0.4 ng·mL−1和0.8 ng·mL−1，2,4DtBP的检出限和定量限分别为0.2 ng·mL−1和0.6 ng·mL−1（见表3）。在SD大鼠血清中加标10 μL（0.5 ng·μL−1）进行回收率实验并采用外标法计算加标回收率（见表3）。AO168O和2,4DtBP的平均回收率分别为103%和95%，相对标准偏差（RSD）分别为8.9%和4.7%，表明本方法具有较好的准确性和重复性。采用超纯水模拟血清，按照实际样品的操作步骤进行处理，过程空白中没有检测出AO168O和2,4DtBP。当前，生物样品（血清、尿液等）中AO168O和2,4DtBP同时检测的方法仍鲜有报道。Liu等[32]使用液液萃取法-UPLC-MS/MS法测定人体血清中2,4DtBP，其方法定量限为0.12 ng（血清：3 mL）。Du等[33]使用液液萃取法-LC-MS/MS法测定人体血浆中2,4DtBP，方法定量限为0.076 ng（血浆：2 g）。本研究在使用0.5 mL血清样品的条件下，2,4DtBP的灵敏度与已报道的方法基本相当。
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本研究应用液相萃取-气相色谱-质谱法对66份血清样品进行测定，每份血清样品量为0.5 mL。结果如图5所示，在血清中AO168O检出率为33%，2,4DtBP的检出率为98%。其中，AO168O是血清中检测出浓度最高的单体，浓度范围为ND（未检出）—492.33 ng·mL−1；2,4DtBP在血清中的浓度范围为ND—21.63 ng·mL−1。Liu等[32]在美国50名献血者的血清中发现，2,4DtBP在92%的血清样品中检出，平均浓度远高于其它的合成酚类抗氧化物，浓度范围为ND—14.8 ng·mL−1。尽管本研究测定的血清数量有限，但其检出率相对较高，表明天津市居民可能面临AO168O和2,4DtBP暴露风险。目前，在室内灰尘的报道中，AO168O和2,4DtBP的EDI远高于其他有机污染物[7, 34]。在室内环境中，儿童（14.8 ng·kg−1·d−1体重）的AO168O灰尘摄入量要远高于成年人（0.77 ng·kg−1·d−1体重）。在电子垃圾拆解地[35]，职业工人（20.1 ng·kg−1·d−1体重）的暴露风险是当地居民（3.6 ng·kg−1·d−1体重）的5倍。而在电子垃圾拆解地的主要工作场所中，相比于灰尘摄入暴露，通过手对口接触的暴露风险更高，AO168O和2,4DtBP的EDI可达69 ng·kg−1·d−1体重和82.5 ng·kg−1·d−1体重[34]。以上研究表明，AO168O和2,4DtBP对人体具有较高的暴露风险，本研究通过人体血清分析进一步证实了该类物质在人体内的存在，所建立的方法可用于后续AO168O和2,4DtBP人体暴露的风险评估。
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本研究建立了液相萃取-气相色谱-质谱法同时测定血清样品中AO168O和2,4DtBP。该方法具有本底干扰少、灵敏度高、前处理简单等优点，能够满足测定血清中AO168O和2,4DtBP的需求。应用本方法对66个血清样品进行分析检测，同时检出高浓度的AO168O和2,4DtBP，验证了方法可行性。目前，关于血清中AO168O和2,4DtBP的赋存浓度研究较少，相应的测定方法还不完善。因此，本研究所建立的测定方法可为后续监测相关污染物的人体暴露风险提供方法支持。
液相萃取-气相色谱-质谱法快速分析血清中有机磷酸酯类三（2,4-二叔丁基苯基）-磷酸酯（AO168O）和2,4-二叔丁基苯基（2,4DtBP）
Rapid determination of tris(2,4-di-tert-butylphenyl)-phosphate (AO168O) and 2,4-di-tert-butylphenyl (2,4DtBP) in human serum by liquid phase extraction - gas chromatography - mass spectrometry
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摘要: 本研究建立了液相萃取-气相色谱-质谱法快速测定血清中三（2,4-二叔丁基苯基）-磷酸酯（tris(2,4-di-tert-butylphenyl)-phosphate， AO168O）和2,4-二叔丁基苯基（2,4-di-tert-butylphenyl， 2,4DtBP）。血清样品经乙腈提取，离心分离，浓缩定容后进行仪器分析。采用DB-5MS（30 m × 0.25 mm， 0.25 μm）色谱柱进行分离，多重反应监测模式（MRM）进行测定。结果表明，AO168O在0.8—100 ng·mL−1范围内线性关系良好，2,4DtBP在0.6—100 ng·mL−1范围内线性关系良好，相关系数R2分别为0.9992和0.9995；方法检出限分别为0.4 ng·mL−1和0.2 ng·mL−1；加标回收率分别为103%和95%，相对标准偏差（n=5）分别为8.9%和4.7%。采用本方法对天津市青年人群的66份血清样品进行检测，AO168O的检出率为33%，2,4DtBP的检出率为98%，浓度范围分别为ND（未检出）—492.33 ng·mL−1和ND—21.63 ng·mL−1。本研究所建立的方法适用于快速测定血清中的AO168O和2,4DtBP，对进一步评估AO168O和2,4DtBP的人体暴露风险具有重要意义。
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关键词:
- 气相色谱-串联质谱 /
- 液相萃取 /
- 三(2,4-二叔丁基苯基)-磷酸酯 /
- 2,4-二叔丁基苯基 /
- 血清
Abstract: A liquid phase extraction-gas chromatography-mass spectrometry method was established for rapid determination of tris(2,4-di-tert-butylphenyl)-phosphate (AO168O) and 2,4-di-tert-butylphenyl (2,4DtBP) in human serum. The samples were extracted by acetonitrile and the supernatant was centrifuged and concentrated for further instrumental analysis. The separation was performed on a DB-5MS (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) column, and the determination was performed in multiple reaction monitoring mode (MRM). The results showed good linearity for AO168O and 2,4DtBP, in the range of 0.8—100 ng·mL−1 and 0.6—100 ng·mL−1, respectively. The correlation coefficient of AO168O and 2,4DtBP were 0.9992 and 0.9995, respectively. The limits of detection for AO168O and 2,4DtBP were 0.4 ng·mL−1 and 0.2 ng·mL−1, respectively. The spiked recoveries (n=5) of AO168O and 2,4DtBP were 103% and 95%, and the relative standard deviations (RSDs) were 8.9% and 4.7%, respectively. The method was applied to the determination of AO168O and 2,4DtBP in 66 serum samples from a young population in Tianjin, China. The detection frequencies of two analytes were 33% and 98%. The concentrations of AO168O and 2,4DtBP ranged from not detected (ND) to 492.33 ng·mL−1 and ND to 21.63 ng·mL−1, respectively. The method is suitable for rapid determination of AO168O and 2,4DtBP in human serum and is important for further risk assessment of human exposure.-
Key words:
- gas chromatography-mass spectrometry /
- liquid phase extraction /
- AO168O /
- 2,4DtBP /
- serum
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随着我国城镇化进程和新农村建设的不断推进，村镇生活污水排放量也在逐渐增长。考虑到农村地区对优美生态环境的客观需要，有针对性地对农村污水进行治理是社会发展的必然趋势。目前，我国农村污水处理方式主要包括两类：一是靠近城镇排水管道的，纳入排水管道处理，通过管网将农户污水收集并统一处理；二是采用小型污水处理设备，以及自然生态处理等形式将单户或几户的污水就近处理利用[1]。相对于城镇污水而言，农村污水具有以下特点：污水来源复杂，不同地区的排放强度及规律各有差异；农村污水水量波动较为明显；村镇规模相对较小，且分布极为分散，不利于将污水集中处理；污水排放量不稳定，夜间排放量可以忽略[2]。这些不利因素对农村污水的高效治理构成了巨大挑战。
2018年9月29日，住建部和生态环境部联合发布了《关于加快制定地方农村生活污水处理排放标准的通知》[3]。通知提到，农村生活污水500 m3·d−1以上规模(含500 m·d−1)的农村生活污水处理设施可参照执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)[4]执行；而处理规模在500 m3·d−1以下的农村生活污水处理设施，由各地可根据实际情况进一步确定具体处理规模标准。在此政策基础上，各省市纷纷制定了各自地方的排放标准。有些地方标准相对宽松，但有些却比较严格，对氮磷要求很高，例如北京市、天津市等。
根据《室外排水设计规范》[5]，为了达到良好的脱氮效果，要求进水的BOD5/TKN宜大于4，而农村污水常常不满足这一要求。农村污水浓度往往较低，低浓度生活污水对生物脱氮影响的后果往往是出水总氮(TN)不达标[6]。其原因主要包括：雨污水合流的稀释作用、地下水渗入稀释作用、化粪池的不合理设置等[7-8]。为了满足日益严格的TN出水标准，尽管外加碳源一定程度上加重了污水厂的经济负担。但是，在缺氧区投加碳源是一条最为稳妥的方法，也是目前不同运营单位最常采用的一种方法。不同污水厂(站)在外加碳源时，采用的外加碳源不尽相同。选择合适的碳源，确定适合的碳源投加量是保证村镇低浓度污水处理达标排放的一条重要途径。
对于农村污水而言，虽然处理工艺具有一定的差异，但主要脱氮原理基本上仍为传统的硝化-反硝化过程。其中，COD与磷酸盐浓度可分别通过曝气以及投加沉淀剂的方式达到排放标准，而脱氮过程则难以通过投加药剂这种立竿见影的形式迅速达标。因此，在农村污水处理的过程中，面临的主要困境往往是出水TN无法达标，为此需要进行深入研究，探究适宜的碳源类型。反硝化菌对不同类型有机物的代谢方式具有差异，其代谢速率各不相同；且不同反硝化菌属最适利用的碳源种类同样具有差异，投加不同种类的碳源可富集不同的反硝化菌属。为摸清不同碳源作为补充碳源对反硝化过程脱氮效果的影响，本研究采用乙酸钠、乙醇、葡萄糖和蔗糖作为碳源，对不同的反硝化过程的脱氮效果进行了探究。本研究可为农村污水处理过程中选用外加碳源的种类提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 实验装置
实验装置采用4组SBR，用以驯化和培养反硝化污泥。其有效容积均为4.8 L，装置结构如图1所示。 SBR通过自控装置每天运行6个周期，每个周期包括：进水(10 min)→缺氧反应(160 min)→曝气(10 min)→沉淀(30 min)→排水/闲置(15 min)→搅拌(15 min)。缺氧段采用电动搅拌器搅拌，转速为96 r·min−1。曝气段采用曝气头曝气，控制DO在1.5~2 mg·L−1。设置曝气段的目的为，反硝化细菌体内某些酶只有在有氧条件下才能合成[9]；同时，曝气可以吹脱缺氧阶段产生的氮气，提高反硝化污泥的沉降性能。在下一个周期之前15 min开始搅拌以恢复反硝化细菌活性，使反硝化细菌保持最佳状态。每个周期排出1.6 L处理过的废水，并用蠕动泵泵入1.6 L人工配水，水力停留时间(HRT)=12 h。每天定时在搅拌结束后曝气开始前排一次泥，保证SRT为10 d左右。反应装置由定时装置控制周期循环运行。
1.2 接种污泥
以乙酸钠、乙醇和葡萄糖为碳源的反硝化污泥接种北京某污水厂二沉池回流污泥；以蔗糖为碳源的反硝化污泥接种于已经驯化成功的以乙酸钠为碳源的反硝化污泥。将种泥按比例稀释，使得MLSS为1500 mg·L−1左右。
1.3 实验水质
SBR采用人工配水，分别以乙酸钠、乙醇、蔗糖和葡萄糖作为碳源，分别维持乙酸钠、乙醇、葡萄糖、蔗糖4种碳源的碳氮比为4.5、5、6.5、6.5，以获得活性污泥的最佳驯化效果。硝酸钠为氮源。磷酸二氢钠为磷源。由于自来水里含有微生物生长所需的微量元素，故不再另外投加。进水水质主要指标如表1所示。
表 1 不同水质条件下的COD与NO−3 -N浓度Table 1. COD andNO−3 -N concentration under different water quality碳源类型 COD/(mg·L−1) 
-N /(mg·L−1)COD∶N 乙酸钠 450 100 4.5 乙醇 500 100 5 葡萄糖 650 100 6.5 蔗糖 650 100 6.5 | Show Table
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1.4 批次实验
批次实验的反硝化污泥混合液分别取于稳定运行的SBR曝气之后，取出的污泥经沉淀、离心去除上清液，加入清水后再次进行沉淀、离心、去除上清液，重复上述步骤至少3次，以确保污泥中不再残留化学物质。将去除上清液后的污泥置于500 mL广口瓶中，加入不含
NO−3 -N和COD的配水液，摇晃均匀以配成悬浮液。用HCl或NaOH稀溶液调节pH为6.5，并向瓶中持续通入5 min氮气以去除混合液中氧气，之后将插有两根橡胶管的瓶塞将瓶口密封。2根橡胶管只有在取气样、水样时打开，其他时候均用夹子夹住。将
NO−3 -N和COD按SBR配水浓度分别配成50 mL浓缩液，在反应开始时，立即注射入广口瓶中，并将广口瓶置于磁力搅拌器上进行搅拌，转速为150 r·min−1。按原SBR的典型周期进行批次实验，温度为22 ℃，反硝化污泥在缺氧条件下运行，时间为160 min。 其中，反硝化速率按照式(1)计算。V=C0−C1CMLVSS·t (1) 式中：V为反硝化速率，g·(g·h)−1；C0为起始
NO−3 -N或NO−2 -N浓度，g·L−1；C1为终点NO−3 -N或NO−2 -N浓度，g·L−1；CMLVSS为混合液体挥发性悬浮固体浓度，g·L−1；t为反应时间，h。1.5 分析方法
活性污泥驯化阶段，每天定时在曝气前取1次水样，检测其
NO−3 -N、COD、pH；并在曝气前和曝气中分别检测DO，以确保反硝化系统正常运行。MLSS，MLVSS采用重量法；
NH+4 -N采用纳氏试剂分光光度法；NO−3 -N采用紫外分光光度法；NO−2 -N采用N-(1萘基)-乙二胺光度法；COD采用重铬酸钾法[10]。温度采用水银温度计测定；pH采用pHTestr 30型pH计测定；溶解氧采用Multi 3620 WTW型溶解氧仪测定。2. 结果与讨论
2.1 驯化时间
以乙酸钠、乙醇、葡萄糖和蔗糖为有机碳源时，认定单周期过程结束后，若反应器出水中不包含
NO−3 -N以及NO−2 -N时，则反硝化菌驯化完全。反应器的反硝化脱氮效果达到稳定的时间如表2所示。由表2可知，乙酸钠的驯化时间最短，蔗糖的驯化时间最长，驯化时间大约为乙酸钠的2倍。有研究[11]表明，相对于乙醇、葡萄糖和蔗糖而言，反硝化细菌对乙酸的降解要更为容易，故反硝化细菌对于乙酸钠的适应性更强，所需的驯化时间则相对较短。表 2 反硝化细菌的驯化时间Table 2. Period for domestication of denitrifying bacteria碳源类型 驯化时间/d MLSS/(g·L−1) MLVSS/(g·L−1) MLVSS∶MLSS 乙酸钠 17 2.65 1.98 0.746 乙醇 24 3.28 2.56 0.78 葡萄糖 26 2.75 2.23 0.812 蔗糖 30 4.4 3.5 0.795 | Show TableDownLoad:
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2.2 不同碳源的反硝化过程
以乙酸钠为碳源时，
NH+4 -N、NO−3 -N、NO−2 -N和N2O的变化情况如图2所示。以乙酸钠为碳源时，NO−3 -N迅速得到降解，在60 min内全部被反硝化完毕。这说明，硝酸盐的还原呈现零级反应[12]。平均比反硝化速率为0.050 g·(g·h)−1。
图 2 乙酸钠为碳源条件下反应器内各指标的变化Figure 2. Variations of indices in reactor with sodium acetate as carbon source
图 3 乙醇为碳源条件下反应器内各指标的变化Figure 3. Variations of indices in reactor with ethanol as the carbon source
图 4 葡萄糖为碳源条件下反应器内各指标的变化Figure 4. Variations of indices in reactor with glucose as carbon sourceNO−2 -N浓度先增加后减少。在反应开始50 min内，NO−2 -N浓度逐渐增加；待反应器内NO−3 -N几乎被耗尽后，积累值达到最大23.2 mg·L−1；此后，NO−2 -N浓度逐渐下降为0。这表明，在反硝化时，硝酸盐还原速率大于亚硝酸盐的还原速率，导致亚硝酸盐的积累，最高亚硝酸盐积累率23.2%，因为碳源充足，反应器出水中NO−2 -N累积将会消失。反应周期内，气态的N2O总量为0.002 8 mg·L−1，溶解态N2O积累量出现2个峰值，分别出现在10 min和50 min，其值为1.23 mg·L−1和1.60 mg·L−1，N2O的产生源于亚硝酸盐的还原。后期N2O没有继续升高，亚硝酸盐还原速率与N2O还原速率基本稳定，而少量的N2O是因为溶液中没有溢出所致。
反应中，
NH+4 -N浓度几乎保持稳定，说明NH+4 -N浓度变化可以忽略。以乙醇为碳源时，各个指标的变化情况如图3所示。以乙醇为碳源时，与乙酸钠为碳源时相似，
NO−3 -N在70 min内迅速被反硝化完毕，平均比反硝化速率为0.031 g·(g·h)−1。NO−2 -N浓度在70 min内达到最大值19.5 mg·L−1，即最高亚硝酸盐积累率19.5%；此后，NO−2 -N浓度逐渐下降为0。NH+4 -N浓度几乎保持稳定。气态的N2O总量为0.001 mg·L−1。溶解态N2O积累量在20 min内迅速升高到0.63 mg·L−1；之后缓慢升高到极大值1.25 mg·L−1；此后开始缓慢下降，至反应结束，浓度为0.67 mg·L−1。以葡萄糖为碳源时，各个指标的变化情况如图4所示。以葡萄糖为碳源时，
NO−3 -N迅速得到降解，在80 min内全部被反硝化完毕，平均比反硝化速率为0.034 g·(g·h)−1。在0~140 min内，NO−2 -N浓度先增加后减少。在70 min内，NO−2 -N积累值达到42.5 mg·L−1，最高亚硝酸盐积累率42.5%；此后，NO−2 -N浓度逐渐下降为0。NH+4 -N浓度在反应期间维持稳定。反应周期内气态N2O总量为0.023 mg·L−1。溶解态N2O首先缓慢增加后开始下降。0~110 min内，N2O浓度逐渐积累至5.43 mg·L−1，之后开始下降。以蔗糖为碳源时，各个指标变化情况如图5所示。以蔗糖为碳源时，
NO−3 -N在70 min内全部被反硝化完毕，平均比反硝化速率为0.026 g·(g·h)−1。NO−2 -N的最大积累值为7 mg·L−1，最高亚硝酸盐积累率7.0%，最终NO−2 -N也逐渐变为0。
图 5 蔗糖为碳源条件下反应器内各指标的变化Figure 5. Variations of indices in reactor with sucrose as the carbon sourceNH+4 -N浓度在反应期间浓度保持稳定。气态N2O总量为0.002 5 μg·L−1。与乙醇为碳源时相似，溶解态N2O积累量在10 min内迅速升高到0.44 mg·L−1，之后缓慢升高到极大值0.66 mg·L−1，此后保持稳定。2.3 不同碳源的反硝化效果分析
在传统的城市污水处理过程中，往往采用硝化-反硝化工艺，其中氮磷的有效去除依赖于进水有机物的充分供给。农村污水的进水有机物浓度普遍较低，在处理低浓度污水的农村污水处理设施当中，进水COD浓度往往低于250 mg·L−1，BOD5则通常低于100 mg·L−1；此时，污水厂的同步脱氮除磷效果会由于反硝化菌与聚磷菌对于有机物的竞争过程而恶化，尤其不利于出水TN去除，甚至
NH+4 -N也无法满足排放标准[13]。因此，农村污水的脱氮过程更依赖于外加碳源的投加，选择合适的外加碳源有利于反硝化过程顺利进行，保证农村污水处理设施出水氮素的达标排放。硝酸盐还原包括同化反硝化和异化反硝化两大类。其中，同化反硝化最终形成有机氮化合物；异化反硝化中，包括常规反硝化和异化反硝化为氨两种路径(dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA)[14]。常规反硝化过程中，硝酸盐按照式(1)的路径[15-16]还原为氮气，依次由硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶、氧化亚氮还原酶完成。
NO−3→NO−2→NO→N2O→N2 (1) 本实验中，在不同碳源条件下，
NH+4 -N浓度变化情况基本相似，即反应期间保持稳定。有研究[17]表明，在反硝化过程中，NH+4 -N和NO−2 -N浓度都会发生显著变化。这是因为，在某些特定环境(氧化还原电位小于-200 mV、低DO、氮源受限而碳源丰富等)下，反硝化过程除了由NO−3 -N向氮气转化的异化性硝酸盐还原路径之外，还会发生由DNRA作用[15]，同时某些特定反硝化菌群只具备DNRA能力[18]。YANG等[19]从反硝化污泥中分离出Pseudomonas stutzeri D6菌株，通过控制C/N比、DO、碳源种类(乙酸、葡萄糖、柠檬酸钠)等条件探究了其DNRA作用。而在本实验中，NH+4 -N浓度并未发生明显变化。由此可知，本实验中反硝化过程只涉及常规反硝化过程(式(1))。以乙酸钠、乙醇、葡萄糖和蔗糖为碳源的各典型周期运行过程中，
NO−3 -N的比降解速率分别为0.05、0.03、0.03和0.02 g·(g·h)−1。其中，乙酸钠为碳源时，反硝化速率最快，乙醇和葡萄糖次之，蔗糖最慢。这是因为，乙酸能够与辅酶A结合形成乙酰辅酶A，直接进入三羧酸循环被微生物降解，而乙醇在为微生物利用的过程中需要先转化为乙酸才能进而被降解。葡萄糖作为较复杂的有机物，同样需要经过两个氧化过程才能得以降解：第1步，反硝化细菌将其氧化得到丙酮酸和ATP；第2步，丙酮酸进入三羧酸循环时被丙酮酸脱氢酶复合物转化为乙酰辅酶A[20]。因此，有机物结构越复杂，意味着代谢过程越复杂，反硝化速率也就越慢。由此可知，由1个葡萄糖分子和1个果糖分子组成的蔗糖，有机物结构最复杂，导致其反硝化速率最慢。由图2~图5可以看出，各碳源的典型周期内，反应器中均出现
NO−2 -N积累。以NO−3 -N为氮源的反硝化过程中，NO−2 -N来源于常规反硝化。在反应周期内，NO−2 -N均出现短暂积累情况，浓度均先升高后降低，并逐渐趋于0。葡萄糖为碳源时，最大NO−2 -N积累率最大，为42.5%，乙酸钠和乙醇次之，分别为23.2%和19.5%，蔗糖最小，仅为7.0%。值得注意的是，从图2~图5中还可以发现，在4种碳源条件下，对应的
NO−2 -N浓度均是在NO−3 -N即将耗尽时达到最大值的。计算各最大积累值时刻点对应的NO−3 -N浓度之前和之后的实测降解速率，分别以NO−3 -N左和NO−3 -N右表示，然后用NO−3 -N左减去NO−2 -N实测积累速率，即得到NO−2 -N的真实降解速率(即Nir酶的降解速率)，如图6所示。在SBR乙酸钠中，当NO−2 -N最大积累时，NO−3 -N的降解速率由0.041 g·(g·h)−1骤降为0.016 g·(g·h)−1，由NO−3 -N降解速率减去NO−2 -N积累速率得到的NO−2 -N降解速率为0.036 g·(g·h)−1；若要使得NO−2 -N继进行积累，NO−3 -N的降解速率至少应为0.036 g·(g·h)−1，而此时NO−3 -N的降解速率显然并不能满足，故而NO−2 -N浓度开始下降。这表明，NO−2 -N的降解是滞后于NO−3 -N的。
图 6NO−2 -N最大积累时刻点的参数动力学分析Figure 6. Analysis of kinetic parameters at maximum accumulation ofNO−2 -N从电子传递角度而言，
NO−2 -N作为电子受体所需的电子需要从细胞质膜的周质获得，这使得其获得电子滞后于NO−3 -N [21]。此外，如果细胞内氧化代谢产生的还原黄素达到饱和，NO−3 -N和NO−2 -N在底物电子的获取上将形成竞争，而Nar酶对电子的亲和力强于Nir酶[22]。同时，有些反硝化细菌种群细胞内只含有Nar酶，而没有Nir酶，也就是其不具备将NO−3 -N向NO−2 -N转化的能力，如Comamonadaceae属[21]。这些都将使得NO−2 -N的降解落后于NO−3 -N，从而导致以NO−3 -N为氮源的反硝化脱氮过程中出现NO−2 -N短暂积累的现象。GE等[20]在研究以乙酸、甲醇、葡萄糖等为碳源的反硝化过程中也发现了相同的现象。由碳源种类导致的
NO−2 -N最大积累值存在差异的情况同样也出现在很多研究[20, 23]中，乙酸、丙酸、乙醇等为碳源时出现较多NO−2 -N积累；但丁酸、戊酸、己酸等却仅出现少量甚至并未出现积累。在本实验中，葡萄糖为碳源时，反硝化过程中NO−2 -N的最大积累值是4种碳源之首，乙醇和乙酸钠次之，蔗糖最少。有研究[24]指出，有机物本身作为电子供体，对Nar酶和Nir酶的亲和力不同使得NO−3 -N和NO−2 -N降解速率的差值不同，将导致NO−2 -N积累值不同。而碳源种类作为营养物质，若长期对反硝化细菌进行培养，将改变菌群结构，使得微生物群落中所含的Nar酶和Nir酶的数量发生改变，从而导致NO−2 -N积累值发生显著变化。LU等[25]发现，在以乙酸和乙醇为碳源的反硝化细菌中，Thauera属占主导，而Thauera中Nar酶的数量要比Nir酶多；而GLASS等[26]发现，以葡萄糖为碳源的反硝化细菌中Comamonadaceae属则占主导，而Comamonadaceae属中的一些菌株，如Acidovorax facilis株，并不具备Nir酶系统，这将导致以葡萄糖为碳源时，NO−2 -N积累现象更显著。但是，在阎宁等[27]的实验中，葡萄糖为碳源时并未出现或只出现少量NO−2 -N积累的现象。这表示，NO−2 -N积累除了与微生物结构和碳源种类有关，还与其他环境控制条件有关，如温度、pH、碳源适应时间等。3. 结论
1)农村污水处理过程中普遍存在碳源不足的问题，通过外加碳源的投加是保证污水处理过程中稳定的TN去除率的有效措施。
2)采用乙酸钠，乙醇，葡萄糖，蔗糖时作为外加碳源时，反硝化脱氮实现稳定的时间分别为17、24、26、30 d，其平均反硝化速率分别为0.050、0.031、0.034和0.026 g·(g·h)−1，即硝酸盐还原速率依次降低。
3)在反硝化过程中，外加碳源均出现了显著的亚硝酸盐积累，在硝酸盐耗尽时，出现亚硝酸盐的最大值。
4)以葡萄糖为碳源时，最大亚硝酸盐积累率为42.5%；而以乙酸钠和乙醇为碳源时，最大亚硝酸盐积累率次之，分别为23.2%和19.5%；以蔗糖为碳源时，最大亚硝酸盐积累率最小，仅为7.0%。
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图 5 血清中AO168O和2,4DtBP的浓度
Figure 5. The concentration of AO168O and 2,4DtBP in human serum
表 1 3种目标化合物的质谱参数
Table 1. GC - MS /MS conditions for 3 analytes
序号No. 化合物Analytes 保留时间/minRetention time 定性离子Qualitative ion（m/z） 定量离子Quantitative ion（m/z） 碰撞能/VCE 1 2,4DtBP 7.8 191.1/163.2 191.1/57.2 10 2 AO168O 20.7 662.2/647.3 662.2/316.3 35 3 TPHP-d15 12.4 341.1/339.2 341.1/243.2 10 2,4DtBP：2,4-二叔丁基苯酚（2,4-di-tert-butylphenyl）；AO168O：三（2,4-二叔丁基苯基）-磷酸酯（tris（2,4-di-tert-butylphenyl）-phosphate）；TPHP-d15：磷酸三苯酯-d15（Triphenyl phosphate-d15）
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表 2 AO168O和2,4DtBP的全称、缩写、CAS号、相对分子质量、沸点和lg Kow
Table 2. Full name, abbreviation, CAS number, molecular weight, boiling point, and lg Kow of AO168O and 2,4DtBP
序号No. 化合物Analytes CAS号CAS No 相对分子质量Molecular weight 沸点/℃Boiling point a 辛醇/水分配系数lg Kowa 1 2,4DtBP 96-76-4 206.33 263.5 5.19 2 AO168O 95906-11-9 662.94 480 16.16 a由EPI Suite 4.1计算得出。aCalculated by EPI Suite 4.1
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表 3 方法性能参数
Table 3. Method performance parameters
化合物Analytes 线性范围/（ng·mL−1）Linear range 相关系数（R2） 检出限/（ng·mL−1）LOD 定量限/（ng·mL−1）LOQ 回收率/%Recovery 相对标准偏差/%RSD（n=5） 2,4DtBP 0.6—100 0.9995 0.2 0.6 95 4.7 AO168O 0.8—100 0.9992 0.4 0.8 103 8.9
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