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近年来,人类内分泌相关疾病的发病率不断增加引发了人们对环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors,EDCs)的关注,如人体内分泌紊乱[1]、儿童肥胖[2]等。EDCs的影响可以通过该物质对雌激素受体 (estrogen receptor, ER)的激动作用来评估[3]。
对人类雌激素受体有激动作用的雌激素可以分为三类:天然雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇等);合成雌激素(双酚A);以及植物雌激素(金雀异黄酮、β-谷甾醇、豆甾醇等)[4]。目前大量研究已从人体血液、尿液中检测出了天然雌激素[5-7]、合成雌激素[8-9]以及植物雌激素[10-12]。还有研究检测了人从水体环境接触雌激素的风险[13]以及从中草药[14]、豆浆[15]等通过食用摄入雌激素的风险。
雌激素对ER的激动作用可以通过相对结合亲和力 (relative binding affinity, RBA)的数据进行评估,有研究通过实验确定了部分雌激素的雌激素受体相对结合亲和力 [16]。对于部分没有实验数据的物质,一些研究通过分子对接[17]或者使用QSAR建模[18]预测了雌激素受体相对结合亲和力。
本研究对雌激素进行了3D-QSAR计算,得到具有较好预测能力的CoMFA(q2=0.721,r2=0.925)和CoMSIA(q2=0.824,r2=0.961)模型。并通过使用CoMFA和CoMSIA模型预测了部分雌激素的RBA。对我国各地区的鸡饲料和鸡肉样品中的天然雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇等)、合成雌激素(双酚A)、植物雌激素(金雀异黄酮、β-谷甾醇、豆甾醇等)的水平进行了检测,在饲料以及肉样品中均有不同程度检出雌激素。最后利用QSAR模型预测的RBA对全国范围的鸡肉样品进行了雌激素风险评估。
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β-谷甾醇标准品、柚皮素标准品、豆甾醇标准品、大豆苷标准品,购自ANPEL公司;香豆素标准品,购自Dr公司;香芹酚(≥95%)、麝香草酚(≥99%),购自CNW公司;金雀异黄酮(96.0%),购自TCI公司;8种激素类混标(GB31660.2-2019),购自ANPEL公司;硅烷化试剂BSTFA:TMCS=99:1,购自REGIS公司;SPE填料LC-C18(40—63 μm)、PSA(40—63 μm),购自CNW公司。
鸡饲料样品于各地购买后空运至实验室,并于室温下密封保存;鸡肉样品于各地购买后冷冻空运至实验室,并于−40 ℃冰箱保存。鸡饲料及鸡肉样品的采样点设置在我国东北地区、华北地区、华中地区、华东地区、东南地区、西南地区具有代表性的城市,分别是哈尔滨、北京、西安、上海、广州和成都.
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采用QuEChERS法进行样品处理,在进行衍生化后进样。饲料及鸡肉用粉碎机粉碎后,作为样品待测,在室温下密封保存。处理时称取2.0 g左右样品,加入50 mL聚乙烯离心管中,向离心管中加入10 mL超纯水,于涡旋混合器上混合1 min。向离心管中加入10mL 1%乙酸+乙酸乙酯,再于涡旋混合器上混合1 min,在摇床振荡混合90 min。向振荡后的样品中加入4.0 g无水硫酸钠和1.0 g氯化钠萃取盐,于涡旋混合器上混合1 min。将离心管置于离心机中,以4000 r·min−1的转速离心10 min后,取约8 mL上清液于15 mL离心管中。向离心管中加入100 mg C18、50 mg PSA和200 mg无水硫酸钠,于涡旋混合器上混合1 min。在4 ℃冰箱静置过夜后,取5 mL上清液至10 mL样品瓶中,40 ℃氮吹至干,用100 μL BSTFA-TMCS衍生化试剂衍生处理后,转移至2 mL样品瓶中上机测定[19]。
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使用日本岛津GCMS-QP2010气相色谱质谱联用仪进行分析,进样器为岛津AOC-6000多功能自动进样器,使用的色谱柱是Rtx-5ms气相色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。进样量为1 μL,电子能量70 eV,离子源温度230 ℃,进样器温度程序如下:初始温度50 °C,以8 ℃·s−1的速率升温至220 °C,保持2 min;之后以10 ℃·s−1的速率升温至280 °C,保持16 min。载气流速1 mL·min−1,扫描模式为选择离子(SIM)模式。
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相对结合亲和力(relative binding affinity, RBA) 是通过比较测试化学品与雌二醇的IC50(抑制浓度的一半)来计算的。
其中,
ICE250 指的是雌二醇在生物测定中对ER结合产生50%抑制作用的浓度,IC50 指的是测试化学品在生物测定中对ER结合产生50%抑制作用的浓度。在本研究中,使用相对结合亲和力的对数 (log RBA)来衡量结合亲和力,活性数据来自美国EPA[20]。物质结构数据来自PubChem[21],经MarvinSketch软件处理后导入Sybyl-X 2.1.1进行QSAR计算.
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本研究首先在PubChem中搜索了1000多种雌激素结构相似化合物,其中65种化合物具有RBA实验值。从这65种化合物中选取29个能够较好分子叠合的化合物进行3D-QSAR研究,以RBA的对数表征生物活性,建立了CoMFA与CoMSIA模型。构建三维定量构效关系模型时,选用p-Cresol作为模板分子,将所有分子的苯环作为公共结构,进行分子的叠合。训练集中化合物与模板分子叠合后的构象如下图1所示。
对分子叠合后构象进行CoMFA和CoMSIA建模分析得出的各项数据如表1所示。CoMFA模型的交叉验证相关系数(q2)为0.721,非交叉验证相关系数(r2)为0.925, F检验值为64.977,说明CoMFA模型较为可靠。CoMFA立体场(S)贡献率为56.6%,静电场(E)为43.4%,因此立体场和静电场对RBA活性都有着重要的影响。CoMSIA模型的q2和r2分别是0.824和0.961, F检验值为113.157,说明CoMSIA模型较为可靠。CoMSIA模型中贡献率最高的是氢键供体场,为29.4%,空间场、静电场、疏水场、氢键受体场贡献值接近,均在16%—20%之间,因此应该综合考虑各分子场的影响。
对CoMFA和CoMSIA模型预测得到的lgRBA值与RBA的实验值进行了相关性分析,得到r2分别为0.991和0.989,说明CoMFA和CoMSIA模型均具有较为良好的预测能力(图2)。
以模板分子对甲酚绘制了CoMFA和CoMSIA等值线图(图3)。CoMFA模型仅计算立体场和电子场,如图3a和b所示,a代表立体场,b代表静电场,等势线截断比为80% : 20%。立体场中,黄色代表体积增大,分子的RBA值降低;绿色代表体积增大,分子的RBA值增大。电子场中,在红色处添加带负电的基团,分子的RBA值增大;在蓝色处添加带负电的基团,分子的RBA值降低。CoMSIA模型除立体场与电子场外,还计算了疏水场、氢键供体场和氢键受体场,如图3c、d、e、f和g所示,c代表立体场,d代表静电场,e代表疏水场,f代表氢键供体场,g代表氢键受体场,等势线截断比为80% : 20%。疏水场中,黄色表示引入疏水性基团,分子的RBA值增大;灰色代表引入疏水性基团,分子的RBA值降低。氢键供体场中,蓝色代表增加氢键供体,分子的RBA值增大。氢键受体场中,紫色代表增加氢键受体,分子的RBA值增大;红色代表减少氢键受体,分子的RBA值增大。
使用该模型得到所检测的13种雌激素的RBA预测值如表2。从表2数据可知,在预测己烯雌酚、17β-雌二醇、17α-乙炔雌二醇等RBA值较高的天然雌激素时,模型预测结果较不理想,因此该模型不适用于预测RBA值较高的天然雌激素,对RBA值较低的部分植物雌激素有一定预测能力。为了使评估所用数据更为可靠,具有RBA实验值的雌激素使用实验值;无RBA实验值的雌激素使用CoMSIA预测值,因为CoMFA模型的总体预测能力略低于CoMSIA模型,β-谷甾醇的CoMSIA预测值出现了不符合常理的负值,因此使用CoMFA预测值。
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在代表我国东北地区、华北地区、华中地区、华东地区、东南地区、西南地区的鸡饲料以及鸡肉样品中均有不同程度检出天然雌激素以及植物雌激素(图4)。其中植物雌激素在鸡饲料和鸡肉中检出率较高,为69%和84%;天然雌激素在鸡饲料和鸡肉中检出率较低,为53%和50%,合成雌激素在鸡饲料和鸡肉中均未检出。利用饲料和肉中植物雌激素浓度计算得出,植物雌激素从鸡饲料到鸡肉中的生物富集系数(Biocon Centration Factor,BCF)为0.98—19.7。
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从《2020中国卫生健康统计年鉴》中的城乡居民膳食结构以及城乡居民每人每日食物摄入量得到鸡肉的每日摄入量数据为89.7 g;参照标准人定义(体重63 kg,年龄18—45岁,从事轻体力劳动的成年男性),算出各雌激素每日暴露量如表3[21]。
一般来说,雌激素作用效应是由其浓度和雌激素效力决定的,这可以用雌激素当量(Estrogen equivalence quotient, EEQ)反映[22],计算公式如下:
其中,
RBAi 表示某个雌激素的相对结合亲和力,Ci 是鸡肉中该雌激素的浓度。各雌激素对总雌激素效应的贡献如图5。由图5可以看到,鸡饲料和鸡肉中植物雌激素所贡献的雌激素效应总量都与天然雌激素相当,因此植物雌激素的雌激素效应不可忽视。
鸡肉中雌激素风险指数的计算,参照食品中化学物质风险评估的原则和方法,计算公式如下:
其中,
RI 为环境雌激素的风险指数,E 为环境雌激素的每日暴露量,ADI 为环境雌激素的每日容许摄入量。若RI≤1 ,则说明该雌激素的暴露风险在可接受范围内;若RI>1 ,则说明该雌激素有健康风险。欧洲食品安全局(EPSA)以及世界卫生组织(WHO)给出了部分雌激素的日容许摄入量(Acceptable daily intake, ADI),17β-雌二醇为0.05 μg·kg−1·d−1,双酚A为50 μg·kg−1·d−1。其他未给出ADI的物质可通过使用EEQ转化为雌二醇当量进行估算。
通过计算得出各物质雌激素风险指数(Risk index, RI)如表4所示。由表4数据可见,东北地区的己烯雌酚和西南地区的香芹酚RI>1,值得引起重视;其余大部分地区的鸡肉可以安全食用。
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本文以logRBA表征生物活性,对雌激素进行了3D-QSAR计算,得到具有较好预测能力的CoMFA(q2=0.721,r2=0.925)和CoMSIA(q2=0.824,r2=0.961)模型,并以此模型预测出了部分雌激素的RBA。
对代表我国东北地区、华北地区、华中地区、华东地区、东南地区、西南地区的鸡饲料以及鸡肉样品中的雌激素含量进行了检测。结果显示,植物雌激素在鸡饲料和鸡肉中检出率较高,为69%和84%;天然雌激素在鸡饲料和肌肉中检出率较低,为53%和50%,合成雌激素在鸡饲料和鸡肉中均未检出。同时通过计算得出植物雌激素从鸡饲料到鸡肉中的平均残留率为71.4%。
通过计算鸡肉中雌激素的每日暴露量以及使用雌激素的日容许摄入量,对全国范围内各地区鸡肉进行了雌激素风险评估。结果显示鸡饲料和鸡肉中植物雌激素所贡献的雌激素效应都与天然雌激素相当,因此植物雌激素的雌激素效应不可忽视。其中香芹酚、己烯雌酚、17α-乙炔雌二醇的EEQ最高,值得引起重视。各地区鸡肉的雌激素风险指数显示,东北地区的己烯雌酚和西南地区的香芹酚RI>1,值得引起重视;其余大部分地区的鸡肉可以安全食用。
雌激素的3D-QSAR模型构建及其在饲料与鸡肉中含量的测定以及对人体的影响
3D-QSAR predicts the endocrine disrupting effect of estrogen and measures and evaluates the effect of estrogen in chicken feed and chicken on the human body
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摘要: 雌激素对人体有显著的内分泌干扰效应。本文以雌激素受体相对亲和力(relative binding affinity, RBA)作为生物活性,对雌激素进行了三维定量构效关系(3D-QSAR)计算,得到具有较好预测能力的CoMFA(交叉验证相关系数q2=0.721,非交叉验证相关系数r2=0.925)和CoMSIA(q2=0.824,r2=0.961)模型。并对国内各地区鸡肉进行了雌激素含量检测与雌激素效应评估。植物雌激素在鸡饲料和鸡肉中检出率为69%和84%;天然雌激素在鸡饲料和鸡肉中检出率为53%和50%。检测及评估结果显示绝大部分鸡肉可以安全食用,但鸡肉中含有的己烯雌酚、17α-乙炔雌二醇以及香芹酚所具有的雌激素效应值得引起重视。Abstract: Estrogen has a significant endocrine disrupting effect on the human body. In this paper, the relative binding affinity (RBA) was used as the biological activity, and the three-dimensional quantitative structure-activity relationship (3D-QSAR) calculation of estrogen was carried out. CoMFA (q2=0.721, r2=0.925) and CoMSIA (q2=0.824, r2=0.961) models with good predictive ability are obtained. The detection rates of phytoestrogens in chicken feed and chicken were 69% and 84%; the detection rates of natural estrogens in chicken feed and chicken were 53% and 50%. The results show that most chickens are safe to eat, but the estrogenic effects of diethylstilbestrol, 17α-ethinyl estradiol and carvacrol in chicken are worthy of attention.
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Key words:
- Estrogen /
- phytoestrogens /
- 3D-QSAR /
- hormonal effects /
- evaluation
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聚糖菌(glycogen accumulating organisms, GAOs)是强化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal,EBPR)系统中一类重要的功能微生物,基于它们在好氧阶段合成糖原的特征,MINO等[1]将其命名为GAOs。聚磷菌(polyphosphate accumulating organisms,PAOs)是EBPR系统参与除磷的主要功能微生物。很多报道指出,GAOs在低磷等特定条件下会在EBPR系统中大量增殖,造成除磷效果的恶化[2-3]。有研究表明,GAOs与PAOs竞争进水有机质,但不参与磷酸盐的去除,从而造成EBPR系统性能的恶化[4-5]。GAOs对于实际EBPR系统的影响尚处于模糊阶段,而在正常运行的EBPR污水厂中可同时监测到GAOs和PAOs,因此,有研究者认为适量的GAO可能是有效进行EBPR的好迹象。寻求GAOs快速富集的手段不仅可以完善聚糖菌功能基因及代谢机理的研究,同时可为GAOs的开发利用提供依据。
GAOs对于碳源利用的特殊性为高C/P有机废水的处理提供了新的思路和理论支撑。近年来,由于GAOs在有机废水中可以较高效率生产聚β-羟基烷酸脂(poly-β-hydroxyalkanoates,PHAs)[6-7],并在反硝化过程中发挥重要作用,故受到了广泛关注[8]。因此,稳定聚糖菌模型的建立方法是后续GAOs研究的必要条件。目前,富集GAOs的方法主要有使用低P/C配水及梯度降低进水磷酸盐的浓度[9]。这2种构建GAOs体系的方式也存在一定弊端:一是驯化时间相对较长;二是有可能GAOs的富集比例达不到预期,影响后续实验内容[10]。因此,建立一种快速高效富集GAOs的方式对于GAOs功能特性的研究十分重要。由于微生物群落结构的组成对于活性污泥体系处理废水具有重要意义,更丰富的群落结构可增强系统抗冲击负荷能力,确保出水的水质指标达标,特定菌群的存在也可能与系统功能菌群存在相互作用,同样也会影响活性污泥的处理效果,所以GAOs富集过程的群落组成进行分析是必要的。
本研究通过厌氧末排水及限制进水磷酸盐浓度的策略,在序批式反应器(sequencing batch reactor,SBR)中快速高效地富集了GAOs,通过宏基因组方法,分析了驯化过程中的群落演替特征、糖原代谢相关基因丰度变化,并进一步验证了该策略的可行性和有效性。
1. 材料及方法
1.1 实验装置与运行方式
采用厌氧-好氧交替运行的SBR工艺,反应器有效容积为11 L,径高比为1/4,体积交换率约为68%。采用进水-厌氧搅拌-沉降排水-好氧曝气-闲置的特殊运行方式,以6 h为一个完整周期,每天运行4个周期。每个周期包含厌氧搅拌1.5 h,好氧曝气4 h,沉降时间随着运行实际状况从40 min逐渐调整至15 min。由可编程控制器PLC控制全周期的运行,采用潜水泵控制进水,电动搅拌器控制搅拌速率,好氧时微孔曝气头输送空气。
1.2 接种污泥及进水水质
接种污泥来自天津市津沽污水处理厂二沉池,为回流污泥。接种时呈黑色细砂状,过筛(筛孔0.25 mm)后接种至上述反应器。由人工配水模拟实际废水,水中各种成分的质量浓度如下:反应器进水以乙酸钠为唯一进水碳源,维持在400~440 mg·L−1;以氯化铵为氮源,N-NH4Cl控制在40 mg·L−1;以磷酸二氢钾为磷源,P-KH2PO4控制在5 mg·L−1左右;其他营养盐有MgSO4·7H2O 50 mg·L−1、KCl 20 mg·L−1、CaCl2 20 mg·L−1、FeSO4·7H2O 0.1 mg·L−1、CuSO4·5H2O 0.1 mg·L−1、MnSO4 0.1 mg·L−1。
1.3 取样频率及分析方法
根据实际运行状况,选取了第4、16、20、39、43天共5个时间点进行完整单周期指标的测定。测定了厌氧运行过程中第0、5、15、30、60、90分钟及好氧运行过程中第60、120、180、240分钟的水样指标及胞内储存物指标。
乙酸钠采用高效液相色谱法[11]测定,正磷酸盐采用钼酸铵分光光度法测定,污泥浓度(MLSS)采用称量法[12]测定,污泥沉降比SV30采用国标法测定,PHA采用气相色谱法[13]测定,胞内糖原的测定通过先去除EPS再用热碱裂解和乙醇提取,最后用硫酸-蒽酮法[14]测定。
扫描电镜样品预处理:取0.5 mL厌氧末污泥混合液于离心管中,1 500 r·min−1,4 ℃离心30 min,弃上清,加入5~10倍体积的2.5%戊二醛固定24 h左右,4 ℃条件下储存并避光。用磷酸缓冲液洗3次,弃上清;乙醇溶液梯度脱水,分别用30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇依次脱水10~15 min,最后用无水乙醇脱水2次,每次10~15 min,弃上清,转移到1.5 mL离心管中,放置到真空冷冻干燥机干燥12 h以上。
1.4 高通量测序及数据分析
测序样本选择每个取样周期的厌氧90 min,每次取样量5 mL,连续3个周期取样,记为3个平行的生物学重复样本,作为GAOs体系物种丰度鉴定的样本。测序的污泥样本放入超低温冰箱 (−80 ℃)暂存。测序工作委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
测序流程可以概括为样本DNA提取和检测、文库构建和检测、测序和质控、信息学分析。经检测合格的文库采用 Illumina PE150 完成测序工作。测序获得的原始数据(raw data)去除接头信息,低质量碱基和未测出的碱基等干扰数据,获取用于后续分析的有效数据(clean data)。使用 MEGAHIT 组装软件进行组装分析(assembly analysis),完成后进行基因丰度分析、物种注释等信息学分析。通过DIAMOND软件将genes 与各功能数据库中的细菌、真菌、古菌和病毒序列进行比对。比对结果经过过滤后获得该序列的物种信息。采用 MetaGeneMark对各样本的 Scaftigs(≥500 bp)进行开放阅读框(open reading frame,ORF) 预测,去除冗余结果后进行功能基因聚类分析。
1.5 统计学处理
使用SPSS 17.0软件进行数据处理,以P<0.05为具有统计学意义的差异。利用方差分析对实验中的标准曲线进行统计学推断,确定其准确性。单个周期的功能基因分析采用时间为单一影响因子的单因素方差分析。
2. 结果与讨论
2.1 SBR快速启动及运行特性
自污泥接种后,通过43 d左右的驯化,反应器的乙酸盐、正磷酸盐、胞内糖原、PHA等指标单周期变化稳定,表现为典型的GAOs代谢特征。反应器驯化初期和基本稳定时的单周期运行情况如图1所示。驯化初期活性污泥浓度(MLSS)约为3 000 mg·L−1,SV30为(31±2)%,SVI为(110±3) mL·g−1,COD去除率低,相比于糖原代谢,磷酸盐代谢更加明显。运行第4 天,厌氧期磷酸盐释放量仅为1.658 mg·L−1(见图1(a))。由此可见,接种污泥中存在部分PAOs,但接种污泥中PAOs的比例较低或者其活性受到了进水中低浓度磷酸盐的限制;厌氧结束后,大部分正磷酸盐随出水排出,微生物可利用的磷酸盐迅速降低。故在好氧1 h后,反应器中的磷酸盐就已经被基本消耗完。反应器厌氧释放磷好氧吸磷的特性符合PAOs的典型特征。厌氧前5 min对乙酸的消耗最快,15 min后趋于稳定,厌氧期乙酸盐的去除率仅为42%。厌氧期磷酸盐的迅速释放和乙酸的迅速吸收并不同步,主要可能有两方面原因:一是接种污泥中PAOs并不占优势,乙酸的吸收主要由其他菌种完成;二是上一周期末反应器内残留的硝态氮可能在厌氧初期发生了反硝化作用,反应器中的反硝化细菌在缺氧条件下利用乙酸盐作为电子供体,硝酸盐氮为电子受体,生成了氮气,造成了乙酸的迅速消耗。而对于胞内糖原来说变化并不显著,未表现出GAOs所具有的典型厌氧消耗糖原、好氧糖原合成的特征。由此可见,GAOs或者说聚糖代谢的模式在驯化初期并不占主导。乙酸为有机质时,PHB和PHV为主要PHA产物[15]。本研究中PH2MV的含量极低,故以PHB和PHV之和为PHA进行讨论,驯化初期PHB基本维持在0.06~0.07 g·g−1。
稳定期时,污泥浓度为约4 700 mg ·L−1,厌氧乙酸盐去除率可达100%(见图1(b)~(c))。该稳态期厌氧末乙酸盐的吸收速率有明显提升,可达到2.45 mg· (L·min)−1。反应器整体的胞内糖原含量在驯化约43 d后有了较大程度的增加,从0.06~0.07 g·g−1增加到0.8~0.13 g·g−1,糖原表现为厌氧消耗好氧合成,为典型的GAOs代谢特征。PHA的变化也验证了GAOs代谢的特征,厌氧乙酸吸收的同时PHB迅速增多,厌氧前30 min的PHB合成速率是PHV合成速率的5倍左右,且厌氧末PHB占PHA的80.68%。这种对于PHB的偏好性与乙酸为单碳源有直接关系[16]。厌氧期磷酸盐的释放量(以P计)仅为0.399 mg·L−1,由此可见,以聚磷分解供能的代谢途径已受到明显抑制。对稳定期单周期厌氧的胞内储存物与液相中有机物的转换进行计算,并与典型的PAOs、GAOs等模型进行对比后的结果如表1所示。考虑到进水初期水质的不均匀性等原因,故该指标的计算以5 min为起点;在厌氧60 min后可检测到部分乙酸盐,但90 min时已无法测到,故以厌氧60 min为计算终点。这样可保证在这55 min里GAOs的胞内合成和胞外有机物吸收是同时进行的,从而便于准确反映GAOs的代谢特征。与已报道的GAOs、PAOs及PAO-GAM模型进行比对,本研究中厌氧磷酸盐释放/VFA吸收、糖原降解/VFA吸收、PHA(包含PHB和PHV)合成/VFA吸收的结果更符合GAOs模型或者是糖原积累代谢(glycogen accumulating metabolism,GAM)的代谢模式。
表 1 本研究中的厌氧生化转化指标与PAOs和GAOs模型的比较Table 1. Comparison of the anaerobic biochemical transformations indicators from this paper with the metabolic models for acetate uptake by PAOs and GAOs模型类型 P/VFA Gly/VFA PHB/VFA PHV/VFA PHA/VFA PAO模型[17] 0.50 0.50 1.33 0.00 1.33 GAO模型[18] 0.00 1.12 1.36 0.46 1.85 PAO-GAM[19] 0.08 1.08 1.74 0.28 2.02 本研究(43 d) 0.003 1.036 1.950 0.518 2.468 注:P/VFA为厌氧磷酸盐释放(以P计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比;Gly/VFA为厌氧糖原消耗(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比;PHB/VFA为厌氧PHB合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比;PHV/VFA为厌氧PHV合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比;PHA/VFA为厌氧PHA合成(以C计)与厌氧VFA吸收(以C计)的摩尔比。 2.2 聚糖菌体系群落结构分析
为进一步验证GAOs在体系中的富集,通过宏基因组方法分析了驯化过程中微生物群落结构的变化。在门水平上(见图2),GAOs和PAOs所在的变形菌门(Proteobacteria)一直保持丰度最高(大于50%),其次分别是拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、酸杆菌门(Acidobacteria)、Candidatus Saccharibacteria、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Candidatus Peregrinibacteria、浮霉菌门(Planctomycetes)等。在驯化过程中变形菌门丰度相对稳定,维持在50.44%~56.36%。变形菌门是细菌中最为广泛的门,又分成5个纲。其中,PAOs和GAOs主要存在于α、β、γ这3个分支中。该分类下也包含了大量与固氮相关的菌,与生态系统中多种元素的循环密不可分。
拟杆菌门主要包含3大类细菌,广泛存在于人和动物肠道、海洋等自然环境中,多数情况下对人体无害。在本实验活性污泥中亦检测到较高比例的这类细菌,其相对丰度逐渐提高,增加了57.53%。绿弯菌门和硝化螺旋菌门的丰度分别增加了7.51%和29.27%。硝化螺旋菌门的明显增加可能跟铵盐作为进水氮源有关。在门水平上说,在整个驯化期间物种丰富度及占比没有显著变化。
在属水平上对驯化中的微生物群落组成进行了分析(见图3)。Thauera(陶厄氏菌属)在接种初期占主导地位,其次包含Candidatus Contendobacter (Ca. Contendobacter)、Nitrospira (硝化螺旋菌属)、Dechloromonas(脱氯单胞菌属)、Candidatus Accumulibacter (Ca. Accumulibacter)、Zoogloea、Candidatus Competibacter (Ca. Competibacter)等菌属。其中,Nitrospira是主要的硝化功能菌属,Ca. Accumulibacter是主要的聚磷菌。由此可见,SBR系统中微生物的生物多样性丰富,为污水生物处理奠定了良好基础。
随着驯化的进行,反应器中相对丰度最高的属由陶厄氏菌属(Thauera)转变为Ca. Contendobacter。Ca. Competibacter的相对丰度也有明显提高。目前,已有报道的GAOs可以分为3类:第1类组成了Competibacteraceae科的大部分;第2类是一类发育地位与Defluviicoccus vanus 相近的细菌(简称Defluviicoccus);第3类是“Candidatus Propionivibrio aalborgensis”(Ca. P. aalborgensis)。从系统发育角度看,Ca. Contendobacter、Ca. Competibacter都属于Competibacteraceae科。Ca. Contendobacter是MCILROY等[20]近年来在实验室规模的反应器中,利用宏基因组技术发现的一类新GAO。系统发育表明其归属于Competibacter-lineage的亚群5。Ca. Competibacter是研究最多,也是最常见的一类GAO,为反硝化聚糖菌研究中的主要对象。GAOs与PAOs间关系的研究也大多是在该菌主导的体系中进行[21-22]。此外,实验中监测到了微量Ca. P. aalborgensis,该菌占丙酸弧菌属(Propionivibrio)的90%左右,在驯化期间占比从总菌种的0.1%增加到了0.2%。它是近年来EBPR系统中新发现的GAO,与Ca. Accumulibacter 有密切的亲缘关系,属于β变形菌纲。组学数据表明它们具备GAOs特有的糖原及PHA代谢的功能基因[23],已被广泛用于GAOs的判别中[24-28]。运行43 d后,Ca. Contendobacter和Ca. Competibacter在系统中的相对丰度分别增加至37.79%和10.03%,总GAOs增加了9.38倍。因此,该运行模式不仅可以高效快速富集GAOs,还可以富集多种GAOs。
本研究中,GAOs成为优势种群有以下原因:一是由于乙酸盐作进水单碳源,而GAOs更偏好于乙酸作为碳源[29-30];二是由于磷酸盐的限制,在进水中磷酸盐浓度较低,厌氧末排水的运行方式去除了液相中大部分磷酸盐,进入好氧曝气阶段后,PAOs可利用的磷酸盐极少,抑制了磷酸盐的吸收和聚磷的胞内合成,从而限制了PAOs的增殖;而GAOs可以充分调动胞内糖原和PHA为其生命活动供能,在系统中迅速增殖,并最终在群落中占主导地位。PAOs在该运行方式下未发生明显增殖,但并未完全消失,在磷酸盐受限的情况下依然可以保持活性。分析其原因,可能是部分PAOs调用胞内糖原进行GAM代谢造成[9, 31]。
Simpson’s diversity 和Shannon-Wiener是2个用来反映样本中微生物多样性的指数,此处用于反映各样本的物种多样性随着富集过程的变化[32]。前者数值越小,表明样品物种多样性越高;后者则相反,数值越大,表明群落物种多样性越高。按照已有的计算公式[32]计算GAOs体系在不同驯化阶段的多样性指数。由Simpson和Shannon指数在驯化过程中的结果(见表2)可知,随着GAOs富集过程的持续进行,体系中物种多样性呈现先升高后降低、最终逐渐稳定的趋势。这与富集过程的变化是一致的,接种污泥接触新的人工合成废水后微生物群落多样性又有了一定程度的提高。由于实验的运行条件更有利于GAOs等微生物的生长,导致系统中生物多样性逐渐降低,并最终趋于稳定。
表 2 GAOs富集过程中属水平群落多样性的变化Table 2. Changes of genus-level community diversity during the enrichment of GAOs多样性指数 第1天 第4天 第16天 第20天 第39天 第43天 Simpson’s diversity 0.990 3 0.988 6 0.991 4 0.993 5 0.992 7 0.993 0 Shannon-Wiener 0.204 0 0.219 7 0.193 9 0.161 3 0.065 5 0.069 6 为深入了解GAOs体系中微生物群落的形态,用扫描电镜对驯化前后的群落进行了高分辨率的形态学观察(见图4)。驯化前期(图4(a)~(b))活性污泥呈现松散的絮状结构,大量胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)的存在影响了单个菌的形态观察。驯化后,菌群形态变化明显,此时菌群分布紧密,有明显的小颗粒状态(图4(c)~(d))。本系统以球菌为主,短杆菌次之(图4(b));此外,图4(d)中球菌趋于两两并列,类似杆菌的形态。由于GAOs为系统优势菌群,电镜中的球菌很可能就是GAOs。电镜照片中丝状菌很少,证明污泥沉降性能好,无明显的污泥膨胀现象,微生物之间的团聚主要依靠胞外聚合物的作用。
2.3 糖原代谢功能基因分析
GAOs是依据其在厌氧好氧交替系统中利用糖原的功能而定义的,胞内糖原是GAOs在系统中增殖的先决条件。对系统中糖原代谢相关的功能基因变化进行了统计和分析(见图5和图6),主要包含糖原的分解合成以及糖原供能过程,糖酵解途径(embden-meyerhof-parnas pathway,EMP)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(entner-doudoroff,ED)途径分别以各自的特征性酶展开讨论。柱状图反映了在驯化期间6个时间节点的特征酶基因的变化趋势,所有的值都以接种污泥进行归一化处理,柱状图的纵坐标表示驯化过程中某特定基因相对于接种污泥的增减程度,纵坐标数值大于1表示该基因随着驯化逐渐增强,反之逐渐减弱。
糖原合成过程中的酶主要包含3种,即葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶(glgC)、糖原合成酶(glgA)和1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE1, glgB),统计学分析表明驯化对(GBE1, glgB)的影响最为显著(P=0.01)。随着驯化的进行,(GBE1, glgB)的功能基因丰度逐渐升高,在20 d达到最高,这与糖原的测定结果一致。统计学结果还表明,驯化对glgA有显著影响(P=0.049),其变化与(GBE1, glgB)一致,但驯化过程对glgC无显著影响(P=0.068)。糖原分解过程主要涉及糖原磷酸化酶(PYG, glgP),统计学分析表明,(PYG, glgP)对驯化过程有显著性响应(P=0.012)。
葡萄糖的供能过程主要包括EMP途径和ED途径。葡萄糖激酶(glk)和果糖磷酸激酶(PFK, pfkA)催化的反应是EMP途径的限速步骤,驯化期间其变化趋势相似。前期随着反应器的运行glk和(PFK, pfkA)的相对丰度都呈现上升趋势,第20天左右达到峰值,然后趋于稳定。KDPG醛缩酶(eda)是ED途径的特征酶,因此,该基因的有无及表达对于了解GAOs糖代谢途径具有重要参考意义。柱状图表明,在驯化过程中eda的基因丰度呈先升高后稳定的趋势。统计学分析显示,glk、(PFK, pfkA)和eda的相对丰度变化受驯化过程的显著影响(P=0.019, P=0.011, P=0.003)。
GAOs对于EMP和ED途径的选择一直是研究热点。由于1 mol葡萄糖单位的糖原经EMP和ED途径各净得3 mol和1 mol的ATP,因此,2个途径的选择会直接影响到GAOs的产能水平,进而影响到其有机物的吸收及生长增殖等。有研究表明,Ca. Contenbacter不含ED途径相关功能基因[20],而有的Ca. Competibacter同时包含EMP和ED两种途径,因此,本实验中eda丰度的上调与Ca. Competibacter的增殖相关。
3. 结论
1)在厌氧好氧交替运行的SBR反应器中,利用厌氧末排水及进水磷酸盐限制的策略快速富集到了GAOs,反应器呈现GAOs典型代谢模式。厌氧消耗糖原合成PHA,好氧利用PHA补充糖原。实验中厌氧VFA利用、糖原消耗及PHA合成的化学计量学与典型的GAOs模型有较高一致性。
2)宏基因组测序的结果表明,GAOs在系统中快速富集。从属水平来说,Ca. Contendobacter、Candidatus Competibacter两类GAOs在体系中占主导地位,各占总菌群的7.01%和1.86%,且在该运行条件驯化过程中增殖速度较快。
3)在驯化过程中,糖原合成酶(glgA)和1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE1,glgB)等糖原代谢相关的标志性基因相对丰度随GAOs丰度增加而增加。因此,这2个酶可作为系统中聚糖菌富集的标志物,用以判断GAOs富集的程度;此外,检测到的eda基因及变化表明,实验驯化的GAOs中同时存在EMP和ED途径进行供能。
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表 1 CoMFA和CoMSIA模型的统计参数
Table 1. Statistical parameters of CoMFA and CoMSIA models
模型Models PLS statictics ONCa q2 b Es c r2 d F e P f rp2 g CoMFA 6 0.721 0.450 0.925 64.977 0.000 0.991 CoMSIA 6 0.824 0.323 0.961 113.157 0.000 0.989 Contributions S h E i H j D k A l CoMFA 0.566 0.434 — - — CoMSIA 0.180 0.191 0.164 0.294 0.171 a 最佳主成分数. b 留一法 (LOO) 交叉验证相关系数. c 估计标准误差. d 非交叉验证相关系数. e F检验值. f r2的概率. g 测试集的预测相关系数. h 空间场. i 静电场. j H疏水场. k 氢键供体场. l 氢键受体场. a Optimum number of components. b Leave-one-out (LOO) cross-validated correlation coefficient. c Standard error of estimate. d Noncross-validated correlation coefficient. e F-test value. f Probability of r2. g Predicted correlation coefficient for the test set. h Steric field. i Electrostatic field. j Hydrophobic field. k H-bond donor field. l H-bond acceptor field. 表 2 13种雌激素的RBA实验值与预测值
Table 2. RBA experimental and predicted values of 13 estrogen
物质名称Compounds RBA 实验值Experimental value CoMFA CoMSIA 己烯雌酚 398.107 3.969 4.305 雌酮 7.244 2.034 2.433 17β-雌二醇 100 2.511 2.789 17α-乙炔雌二醇 100 1.98 2.435 雌三醇 9.772 1.878 2.663 双酚A 0.008 1.861 1.871 麝香草酚 — 9.747 3.645 香芹酚 — 4.022 4.133 香豆素 — 8.886 4.569 柚皮素 0.007 9.283 1.179 大豆苷 — 8.886 4.569 金雀异黄酮 0.437 0.368 0.374 豆甾醇 — 0.862 1.057 β-谷甾醇 — 0.484 -0.087 表 3 各地区鸡肉中雌激素每日暴露量(μg·kg−1·d−1)
Table 3. Daily exposure to estrogen in chicken meat in various regions
物质名称Compounds 东北 华北 华中 华东 西南 东南 己烯雌酚 0.013382 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 雌酮 0.17143 N.D. N.D. N.D. N.D. 0.021743 17β-雌二醇 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 17α-乙炔雌二醇 0.112584 N.D. N.D. N.D. N.D. 0.052181 雌三醇 0.037081 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 双酚A N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 麝香草酚 0.056508 0.033633 0.048733 0.045679 0.052643 0.058782 香芹酚 0.031307 0.633206 0.372618 0.028756 2.245922 0.417594 香豆素 0.175107 0.17087 0.162316 0.167872 0.167255 0.167619 柚皮素 0.04352 0.046175 0.042312 0.042596 0.049038 0.04333 大豆苷 0.002276 N.D. N.D. 0.01428 N.D. 0.006006 金雀异黄酮 0.004643 N.D. 0.004314 0.005906 N.D. 0.004468 豆甾醇 0.340804 N.D. 0.000487 0.138105 0.416443 0.43459 β-谷甾醇 1.193188 N.D. 0.201398 0.355421 1.434338 N.D. N.D.,未检出 N.D., not detected. 表 4 各地区鸡肉中雌激素风险指数(RI)
Table 4. Estrogen risk index (RI) in chicken meat by region
物质名称Compounds 东北 华北 华中 华东 西南 东南 己烯雌酚 1.065483 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 雌酮 0.248368 N.D. N.D. N.D. N.D. 0.031501 17β-雌二醇 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 17α-乙炔雌二醇 0.011258 N.D. N.D. N.D. N.D. 0.005218 雌三醇 0.072472 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 双酚A N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 麝香草酚 0.041194 0.024518 0.035526 0.0333 0.038377 0.042852 香芹酚 0.025879 0.523408 0.308006 0.02377 1.856479 0.345183 香豆素 0.160013 0.156141 0.148325 0.153401 0.152838 0.15317 柚皮素 6.09×10−5 6.46×10−5 5.92×10−5 5.96×10−5 6.87×10−5 6.07×10−5 大豆苷 0.00208 N.D. N.D. 0.013049 N.D. 0.005488 金雀异黄酮 0.000406 N.D. 0.000377 0.000516 N.D. 0.00039 豆甾醇 0.072046 N.D. 0.000103 0.029195 0.088036 0.091872 β-谷甾醇 0.115501 N.D. 0.019495 0.034405 0.138844 N.D. N.D.,未检出 N.D., not detected. -
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