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二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

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胡晓旭, 许彤, 陈旸升, 谢群慧, 郝艳芬, 王楚, 程劼, 王璞, 张庆华, 徐丽, 赵斌. 二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1067-1076. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804
引用本文: 胡晓旭, 许彤, 陈旸升, 谢群慧, 郝艳芬, 王楚, 程劼, 王璞, 张庆华, 徐丽, 赵斌. 二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1067-1076. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804
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HU Xiaoxu, XU Tong, CHEN Yangsheng, XIE Qunhui, HAO Yanfen, WANG Chu, CHEN Jie, WANG Pu, ZHANG Qinghua, XU Li, ZHAO Bin. Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1067-1076. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804
Citation: HU Xiaoxu, XU Tong, CHEN Yangsheng, XIE Qunhui, HAO Yanfen, WANG Chu, CHEN Jie, WANG Pu, ZHANG Qinghua, XU Li, ZHAO Bin. Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1067-1076. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804
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二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

  • 1.

    中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京，100085

  • 2.

    中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京，100081

  • 3.

    江汉大学持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室，环境与健康学院，武汉，430056

  • 4.

    中国科学院大学，北京，100049

    • 通讯作者: Tel：010-62842865，E-mail：lixu@rcees.ac.cn; 
  • 基金项目:
    国家重点研发计划（2017YFC1600301）和国家自然科学基金（22076216, 21836004）资助.

Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs

  • 1.

    State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100085, China

  • 2.

    Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081, China

  • 3.

    Hubei Key Laboratory of Environmental and Health Effects of Persistent Toxic Substances, Institute of Environment and Health, Jianghan University, Wuhan, 430056, China

  • 4.

    University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100049, China

    • Corresponding author: XU Li, lixu@rcees.ac.cn ; 
  • Fund Project: National Key Research and Development Program of China (2017YFC1600301) and the National Natural Science Foundation of China （22076216, 21836004）

摘要

  • 摘要: 旨在研究食用被PCDD/Fs污染的饲料对奶牛血液代谢组的影响。选择飞灰作为PCDD/Fs的载体，暴露期间将30 g飞灰与40 kg奶牛饲料均匀混合，使用配制的污染饲料饲喂奶牛，连续饲喂38 d后采集血液。采用液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术对血液进行代谢组学分析，并且结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）对代谢轮廓进行模式识别分析并筛选差异代谢产物。共鉴定差异代谢物50个，主要为氨基酸、胆酸、磷脂与脂肪酸类成分。将差异代谢物进行通路分析并注释，涉及19条代谢通路，主要与氨基酸、脂肪酸及胆碱代谢相关。PCDD/Fs暴露干扰了奶牛的脂肪酸代谢、氨基酸代谢、磷脂代谢、胆汁酸代谢，可作为PCDD/Fs暴露的靶标代谢通路供进一步的研究。
    Abstract: The aim of this study was to explore the influence of PCDD/Fs pollution on the blood metabolism of cows. Fly ash was selected as the carrier of PCDD/Fs, 30 g of fly ash and 40 kg of cow feed were homogeneously mixed during exposure, the prepared polluted feed is used for feeding cows, and blood is collected after continuous feeding for 38 days. Using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) technology to analyze blood metabolism, principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were combined to conduct pattern recognition analysis on metabolic profiles and screen differential metabolites. A total of 50 different metabolites were identified, mainly amino acids, bile acids, phospholipids, and fatty acids. Differential metabolites were subjected to pathway analysis and noted. There were 19 metabolic pathways involved, mainly related to the metabolism of amino acids, fatty acids and choline. In summary, the results showed that PCDD/Fs exposure interfered with fatty acid metabolism, amino acid metabolism, phospholipid metabolism and bile acid metabolism of cows, and it could be used as the target metabolic pathway of PCDD/Fs exposure for further research

  • 重金属铬(Cr)及其化合物是我国工业用地中最常见的重金属污染物之一。土壤中铬的化合价主要有三价和六价，其他二价、四价和五价的铬化合物性质极其不稳定[1-2]。Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)具有完全不同的化学性质和生物毒性。Cr(Ⅲ)易水解形成沉淀吸附于土壤矿物和有机质中，毒性较低；而Cr(Ⅵ)具有剧毒性、强致癌和易迁移等特点[3]，被列为我国当前亟需治理的重金属污染物之一[4]。

    化学修复是Cr(Ⅵ)污染土最常用的修复技术之一，具有效果好、速度快、成本低和二次污染小等特点[5-6]。硫酸亚铁(FeSO4)和多硫化钙(CaSx)是修复Cr(Ⅵ)污染土常用的药剂，已在Cr(Ⅵ)污染修复方面得到大量应用[7-9]。任学昌等[7]采用FeSO4联合多种固化剂修复铬污染土壤，土壤中Cr(Ⅵ)浸出浓度可由527 mg·L−1降至1.5 mg·L−1。CHRYSOCHOOU等[9]采用CaS5修复电镀污染场地Cr(Ⅵ)污染土，实验结果表明：CaS5可显著降低污染土中的Cr(Ⅵ)质量浓度，当CaS5/Cr(Ⅵ)摩尔比为2时，60 d养护龄期的稳定土中Cr(Ⅵ)的浸出浓度低于1 mg·L−1。事实上，化学修复并不是完全去除污染物，而是将重金属污染物的价态或形态改变后稳定于土壤基质中，降低重金属向周围环境运移的能力。多孔介质溶质运移理论表明，土体的渗透系数是衡量重金属污染物运移的首要指标[10]。邵俐等[11]对复合重金属铜镉污染底泥进行固化处理，研究了不同污染物掺量对渗透系数及污染物渗出总量的影响。冯亚松[12]通过柔性壁渗透实验测试复合镍锌污染土和固化土的渗透系数，并进一步分析渗透液中重金属浓度和pH随渗透液体积的变化规律。由此可见，重金属污染土的渗透系数及渗出液中重金属浓度是评估污染土修复有效性和重金属运移特征的重要指标。

    然而，前人的研究主要采用浸出实验和消解实验来评价Cr(Ⅵ)污染土的修复效果，有关Cr(Ⅵ)污染土修复后对环境的实际影响研究较少；此外，仅用散状土进行实验研究并不能很好地模拟污染场地土层的实际力学特性及重金属运移特征。本研究以某铁合金场地为研究背景，拟采用不同投加摩尔比的FeSO4和CaSx对Cr(Ⅵ)污染土壤进行修复处理，制备压实试样，通过渗透淋滤实验研究不同还原剂对Cr(Ⅵ)污染土渗透淋滤特性的影响规律，评估FeSO4和CaSx修复Cr(Ⅵ)污染土的实际效果；拟基于BCR形态提取法和X射线衍射法，从微观的角度对比分析不同还原剂掺量对土壤中物理化学反应产物的影响。本研究结果可为Cr(Ⅵ)污染土的化学稳定修复及安全再利用提供参考。

    1.   材料与方法

    1.1   实验原料

    1) 实验用土。实验用土取自湖南某铁合金铬渣场地，粉质黏土广泛分布于场区，场地原有金属铬湿法冶炼生产线，长期生产过程产生的铬渣随意堆放于铬渣场，导致场区周边粉质黏土层Cr(Ⅵ)严重污染。为保证实验用土中Cr(Ⅵ)分布均匀且污染浓度恒定，实验用土取自该场地上游无污染的粉质黏土，人工制备Cr(Ⅵ)污染土。实验前将土在60 ℃下烘干24 h至恒重，粉碎过1 mm筛备用。粉质黏土主要物理力学特性指标见表1，土的物理力学实验方法参考《土工试验方法标准》 (GB/T50123－2019) [13]，击实实验采用轻型击实法。原始土样中Cr(Ⅵ)质量浓度为12 mg·kg−1，在第一类用地管制值以下，为未污染土[14]。

    表 1  实验用土壤基本物理力学参数
    Table 1.  Basic physical and mechanical parameters of soil
    天然含水率/%天然干密度/(g·cm−3)最优含水率/%液限/%塑限/%比重
    6.111.5420.537.322.42.72
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    2) 铬污染土制备。向烘干土样中加入重铬酸钾(K2Cr2O7)至Cr(Ⅵ)的质量浓度为200 mg·kg−1。其中，200 mg·kg−1为污染场地Cr(Ⅵ)平均浓度。再向污染土中均匀喷洒去离子水使土的含水率为20.5%，拌合均匀后密封，在 (20±2) ℃、湿度95%下养护7 d，使K2Cr2O7与土壤充分反应。

    3) 实验试剂。重铬酸钾(K2Cr2O7)、盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)、过氧化氢(H2O2)、硫酸亚铁(FeSO4)、质量分数为50%的多硫化钙(CaSx)等。以上材料除特殊说明外均为分析纯。实验过程中所用水均为去离子水。

    1.2   土样制备

    按照目标干密度 (根据场地粉质黏土层干密度选定) 称取含一定质量添加药剂的养护土样填入不锈钢筒状模具中，利用电子万能试验机，以位移控制法压制试样。保持0.2 mm·min−1的垂直加载速率，将散状土样均匀压实至设计位置，在恒体积条件下静置0.5 h，防止试样回弹。最后，卸载后得到直径为50 mm、高度为5 mm、初始干密度为1.5 g·cm−3的压实试样，具体试样如图1所示。

    图 1  土样制备
    Figure 1.  Preparation of soil sample
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    1.3   实验方法

    1) 土壤修复实验。设计修复药剂不同投加摩尔比，开展污染土壤修复实验，实验具体方案见表2。将称量好的还原剂加入Cr(Ⅵ)污染土中，充分拌和至混合物无明显颜色差异，然后利用NJ-160台式电动搅拌机强化搅拌5 min，以提高其均匀性。搅拌结束后，将混合均匀的土样转移至容器中并用保鲜膜覆盖防止水分蒸发，在恒温条件下养护7 d。

    表 2  土壤修复实验方案与反应机理
    Table 2.  Stirring test designs and reaction mechanism between Cr(Ⅵ) and reductants
    序号还原剂种类还原剂与Cr(Ⅵ)摩尔比反应机理参考文献
    1FeSO416Fe2++Cr2O72-+14H+=2Cr3++6Fe3++7H2OxFe3++(1-x)Cr3++3H2O→(Fex,Cr1－x)(OH)3+3H+[15-16]
    22
    33
    44
    55
    6CaSx13CaS5+Cr2O72-+8H+=2Cr(OH)3+15S+3Ca2++H2O[5,16-18]
    72
    83
    94
    105
    11无———
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    2) 渗透淋滤实验。渗透淋滤实验装置示意图如图2所示。实验过程中定期收集渗出液并测量体积，根据达西定律计算渗透系数，渗透系数计算公式如式1所示。根据计算得到的污染土和修复土的渗透系数，以及测定的渗出液中重金属离子浓度，进一步分析渗出液中金属浓度随渗出液体积的变化规律。

    图 2  渗透淋滤实验装置示意图
    Figure 2.  Permeability test device
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    K=ΔQ⋅LA⋅Δh⋅Δt (1)

    式中：K为渗透系数，cm·s−1；ΔQ为一定时间内出流水量，mL；L为土样高度，cm；Δh为水头差，cm；A为土样横截面积，cm2；Δt为渗流时间，s。

    1.4   测试方法

    采用二苯碳酰二肼分光光度法测定土样渗出液中Cr(Ⅵ)浓度；采用XRD实验来判定修复前后Cr(Ⅵ)污染土的物相组成，XRD表征条件：CuKa靶，电压为40 kV，电流为40 mA，扫描速度为 2 °·min−1，光源波长为1.54 nm，角度为5°~90°；铬赋存形态采用改进BCR方法[19]。

    2.   结果与讨论

    2.1   还原剂掺量对渗透系数的影响

    FeSO4和CaSx修复Cr(Ⅵ)污染粉质黏土的渗透系数随投加摩尔比变化的曲线如图3所示。由图可以看出，使用CaSx修复后的土样渗透系数明显低于使用FeSO4修复后土样的渗透系数，且使用CaSx修复后土样的渗透系数小于原污染土 (FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比为0) 。

    图 3  修复后土样的渗透系数
    Figure 3.  The hydraulic conductivityof soil samples after remediation
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    原污染土的渗透系数为4.25×10−7 cm·s−1，FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比由1增加到5时，土样的渗透系数分别为6.78×10−7、1.04×10−6、1.13×10−6、7.95×10−7、3.73×10−7 cm·s−1，FeSO4修复Cr(Ⅵ)污染粉质黏土渗透系数随摩尔比的增加呈先增大后减小，在摩尔比为3时渗透系数最大。由表2反应机理式可知，FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比为3时，Fe2+和Cr2O72-反应刚好能完全反应生成Cr3+和Fe3+。在FeSO4加入量较少时，Fe3+和Cr3+反应生成的(Fex,Cr1－x)(OH)3是难溶于水的金属化合物，但由于土壤环境为酸性，反应会向减少沉淀的方向进行；在FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比超过3时，Fe2+投入过量，可生成大量Fe(OH)3沉淀，土壤的渗透系数降低。此外，通常将渗透系数小于1×10−6 cm·s−1作为土壤修复的控制标准之一[12]，见图3虚线。通过对比Cr(Ⅵ)污染土修复前后渗透系数变化，可以发现：FeSO4处理后的污染土的渗透系数在FeSO4/ Cr(Ⅵ)摩尔比为2和3时要略高于该控制标准，而FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比为1、4和5的土样渗透系数明显低于该控制标准。

    使用CaSx修复时，CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比由1增加到5，土样的渗透系数分别为1.83×10−7、1.72×10−8、1.22×10−7、1.39×10−7、1.47×10−7 cm·s−1，实验在摩尔比为2时渗透系数最小，CaSx修复Cr(Ⅵ)污染粉质黏土渗透系数随摩尔比的增加呈先减小后缓慢增大的趋势，这与FeSO4修复后土壤渗透系数的变化相反。由表2反应机理公式可知，在CaS5/Cr(Ⅵ)摩尔比为1.5时，理想状态下，CaS5和Cr2O72-反应刚好能完全反应生成Cr(OH)3和单质S；在CaSx加入量较少时，CaSx和Cr2O72-反应不会生成过多的沉淀物质；在CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比超过2时，随着CaSx投入量的增加，土壤中产生的单质S和Ca2+也随之增加，Ca2+可生成微溶于水的CaSO4，使土壤的渗透系数增大。CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比为2时试样渗透系数最小，可能是由于下述原因。CaSx是含有多种硫化物的混合体系，本实验所用不为纯CaS5，其中含有CaS5及其他杂质，在铬污染土壤修复方面还没有比较完善的反应机理，尚需深入地研究[8,20]。

    对比Cr(Ⅵ)污染土修复前后渗透系数的变化可以发现：CaSx修复的污染土渗透系数均明显低于修复土控制标准1×10−6 cm·s−1，总体比FeSO4处理后的土壤渗透系数要小。此前多见固化土渗透系数的研究，但使用还原剂稳定化后的土壤进行渗透实验的相关研究较少，可由本次实验得出稳定化Cr(Ⅵ)土壤渗透系数随还原剂种类及掺量的变化规律。

    2.2   还原剂掺量对渗出液Cr(Ⅵ)浓度的影响

    原污染土、FeSO4/ Cr(Ⅵ)摩尔比为1到5的修复土样渗出液Cr(Ⅵ)浓度如图4所示。由图可知：随渗出液体积增大，污染土样渗出液中重金属Cr(Ⅵ)浓度不断降低。在实验开始阶段，土样的孔隙水中溶解的Cr(Ⅵ)随渗出液被冲出，浸出液中重金属浓度较大；随着实验的进行，土样中Cr(Ⅵ)的总量逐渐减少，因此由固相 (黏土矿物吸附态) 进入液相 (孔隙水溶解态) 的重金属也逐渐减少，重金属的浓度曲线趋于平缓[12]。原污染土中Cr(Ⅵ)渗出浓度由一开始的21.96 mg·L−1降至9.05 mg·L−1，FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比为1时，Cr(Ⅵ)渗出浓度由1.72 mg·L−1降至0.22 mg·L−1，均大于IV类地下水标准Cr(Ⅵ)浓度限值(0.10 mg·L−1)和III类地下水标准Cr(Ⅵ)浓度限值(0.05 mg·L−1)[21]。当FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比大于3时，渗出液中Cr(Ⅵ)的浓度始终低于III类地下水标准。该现象进一步说明，用FeSO4修复Cr(Ⅵ)污染土的最优摩尔比为3，污染土中大量Cr(Ⅵ)被还原为Cr(Ⅲ)稳定在土壤中，有效减缓了重金属运移过程。

    图 4  FeSO4修复后土样的渗出液中Cr(Ⅵ)浓度
    Figure 4.  Changes of Cr(VI) concentration in exudate of soil after FeSO4 repair
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    图5给出了原污染土、CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比为由1到5的修复土样渗出液Cr(Ⅵ)浓度。由图5可知：当渗出液体积随时间增大时，污染土样渗出液中重金属Cr(Ⅵ)浓度稳定降低。CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比为1时，土中的Cr(Ⅵ)渗出浓度由最初的9.42 mg·L−1降至5.41 mg·L−1，CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比为2时，土中的Cr(Ⅵ)渗出浓度由7.77 mg·L−1降至0.42 mg·L−1，均大于IV类地下水标准Cr(Ⅵ)浓度限度(0.10 mg·L−1)。当CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比大于3时，在实验过程后期，渗出液中Cr(Ⅵ)的浓度会降至低于III类地下水标准Cr(Ⅵ)浓度限值。该现象说明，使用CaSx修复Cr(Ⅵ)污染土，其反应的最优摩尔比与理论值 (1.5，见表2) 存在差异，需视具体反应的情况而定。

    图 5  CaSx修复后土样的渗出液中Cr(Ⅵ)浓度
    Figure 5.  Changes of Cr(Ⅵ) concentration in exudate of soil after CaSx repair
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    由图4和图5可知：随着渗出液体积逐渐增大，修复后土样渗出液中Cr(Ⅵ)浓度逐渐减小。与原Cr(Ⅵ)污染土样渗出液中Cr(Ⅵ)浓度相比，修复后土样渗出液中Cr(Ⅵ)浓度显著降低，而且随着掺入还原剂摩尔比的增加，渗出液中Cr(Ⅵ)浓度进一步降低。总体来说，污染土经修复处理后，孔隙水中Cr(Ⅵ)浓度显著降低。该现象说明：修复土中Cr(Ⅵ)通过渗透作用向周围环境运移达到稳定状态的时间，较未修复时得到了显著缩短。上述现象均说明在土壤修复后，土中Cr(Ⅵ)的化学稳定性得到明显提升、运移性显著降低。其原因是，CaSx和FeSO4与Cr(Ⅵ)通过一系列氧化还原反应、离子交换反应及氢氧化物沉淀反应[22-24]，改变了铬的价态与形态，降低了铬的毒性，将铬稳定于土壤基质中，土样孔隙水中的Cr(Ⅵ)浓度降低，有效减弱了固相重金属向液相环境转化，因此在渗透实验中渗出液重金属浓度明显降低[25]。

    2.3   铬形态分布

    FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比对铬形态分布的影响如图6所示。从图6中可以发现，未修复的Cr(Ⅵ)污染土中弱酸提取态铬质量分数最高，达86%，这是因为采用室内人工配制的Cr(Ⅵ)污染土，污染周期较短，Cr(Ⅵ)主要以弱酸提取态赋存于土壤中[26]，可还原态和可氧化态的铬质量分数次之，分别为6%和7%，残渣态铬最低，质量分数约为1%。随着FeSO4/Cr(Ⅵ)的摩尔比的增加，修复土中弱酸提取态铬质量分数明显降低，可还原态和可氧化态铬质量分数显著增大，残渣态的铬质量分数有细微增加。当摩尔比从0增加到 5时，修复土中弱酸提取态的铬质量分数从86%降低至23%，而可还原态和可氧化态的铬质量分数从6%、7%增加到27%、47%。实验结果表明：FeSO4可促使Cr从活性态向较稳定态转化，提高了修复土中Cr稳定性。

    图 6  FeSO4/Cr(VI)摩尔比对铬形态分布的影响
    Figure 6.  Effect of FeSO4 on chromium speciation in the soil
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    CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比对铬形态分布的影响如图7所示，与FeSO4效果类似。分析其原因，Fe2+将Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)，一方面Cr(Ⅲ)与土壤中的氢氧化物、氧化物及黏土矿物发生离子交换生成Cr(OH)3等沉淀；另一方面Cr(OH)3与Fe3+发生离子交换生成较难溶的沉淀物 (Fex,Cr1－x)(OH)3，且在摩尔比较小时，土壤中的Cr(Ⅲ)主要以Cr(OH)3存在，随着摩尔比的增大，Cr(OH)3会逐步转化成(Fex,Cr1－x)(OH)3[27]，铬逐渐从活性态向稳定态转化，降低了铬的迁移能力。CaSx将Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)，由于CaSx能提高修复土的pH 值，一方面促使Cr(Ⅲ)与土壤中的氢氧化物、氧化物发生离子交换生成Cr(OH)3等沉淀；另一方面CaSx被Cr(Ⅵ)氧化成单质S，部分Cr(Ⅲ)被单质S络合或包裹；此外，CaSx将部分Cr(Ⅵ)还原，生成了Cr(OH)3沉淀，降低了渗出风险[28]。

    图 7  CaSx/Cr(VI)摩尔比对铬形态分布的影响
    Figure 7.  Effect of CaSx on chromium speciation in the soil
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    2.4   成分分析

    分别选取渗透实验中最具代表性的2组修复实验： FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比为3和5、CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比为2和5的供试土壤，采用X射线衍射实验对土壤中的物质、元素、相对大颗粒进行物相分析，研究2种还原剂FeSO4和CaSx对Cr(Ⅵ)污染土的微观修复机理。

    通过X射线衍射实验得到FeSO4和CaSx修复后土的衍射曲线如图8和9所示，在衍射角为5°~90°时，修复后土壤中主要存在石英(SiO2)、铬云母(KAl2[Si3AlO10](OH,F)2)和三水合氢氧化铬(Cr(OH)3·3H2O)的衍射峰。由图8中可知，用FeSO4修复后的Cr(Ⅵ)污染土中含有铁元素的衍射峰，当衍射角为35.24°时，FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比为3和5的污染土中，氢氧化铁的衍射强度由1 003增至1 209 s−1，当衍射角为18.20°时，三水合氢氧化铬的衍射强度分别由3 901降至3 227 s−1。在图9中可知，用CaSx修复后的Cr(Ⅵ)污染土中含有硫单质的衍射峰，当衍射角为56.08°时，CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比为2和5的污染土中，单质S的衍射强度由3 452增至4 253 s−1，当衍射角为18.20°时，三水合氢氧化铬的衍射强度分别由4 744降至3 992 s−1，土样的其他主要物相峰值基本不变。以上现象证明了 FeSO4和CaSx在土中发生了一系列物理化学反应，使得土壤中的Cr(Ⅵ)质量分数降低，进一步验证了不同还原剂作用下，六价铬污染粉质黏土的渗透淋滤特性及组成成分变化。

    图 8  FeSO4修复后土壤的XRD图谱
    Figure 8.  XRD map of soil after FeSO4 remediation
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    图 9  CaSx修复后土壤的XRD图谱
    Figure 9.  XRD map of soil after CaSx remediation
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    3.   结论

    1) 试样的渗透系数K随着还原剂的种类和摩尔比的不同有着非线性的关系，FeSO4处理后的土壤渗透系数随着渗透的进行先变大后减小，而CaSx处理后的土壤渗透系数随着渗透的进行先减小后变大。其中，FeSO4/Cr(Ⅵ)摩尔比为3时渗透系数最大；CaSx/Cr(Ⅵ)摩尔比为2时渗透系数最小。

    2) 修复后土中Cr(Ⅵ)的渗出量随着时间的增长持续减小，当FeSO4或CaSx与Cr(Ⅵ)的摩尔比大于3时，最终渗出液质量浓度低于III类地下水标准，FeSO4处理后土壤Cr(Ⅵ)的渗出液质量浓度总体比CaSx处理后的土壤低。

    3) 通过BCR分布提取法和XRD物相分析可知，重金属Cr(Ⅵ)与还原剂发生一系列物理化学反应，改变了修复土中各物质成分及铬的赋存形态。还原剂可促使铬由弱酸提取态向可还原态、可氧化态转化，而对残渣态的铬影响不大。

  • 图 1  叠加离子流图

    Figure 1.  Superimposed ion current map

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    图 2  所有样本PCA散点图

    Figure 2.  PCA scatter plot for all samples

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    图 3  暴露前后正负离子模式下的OPLS-DA图

    Figure 3.  OPLS-DA plots in positive and negative ion modes before and after exposure

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    图 4  代谢通路分析

    Figure 4.  Metabolic pathway analysis

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    图 5  热图分析

    Figure 5.  Heat map analysis

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    图 6  暴露前后吲哚丙烯酸响应比较

    Figure 6.  Comparison of indoleacrylic acid response before and after exposure

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    表 1  样品信息

    Table 1.  Sample information

    样品名称 Name数量 Quantity标记 Sample name
    对照组4D1-D4
    暴露组4B1-B4
    样品名称 Name数量 Quantity标记 Sample name
    对照组4D1-D4
    暴露组4B1-B4
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    表 2  质谱条件

    Table 2.  Mass spectral condition

    模式 Ion mode正离子模式 ESI （+）负离子模式 ESI （−）
    GS15545
    GS25545
    CUR3535
    TEM550550
    ISVF5500−4500
    DP（MS/MS）60−60
    CE（MS/MS）35−35
    CES1515
    模式 Ion mode正离子模式 ESI （+）负离子模式 ESI （−）
    GS15545
    GS25545
    CUR3535
    TEM550550
    ISVF5500−4500
    DP（MS/MS）60−60
    CE（MS/MS）35−35
    CES1515
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    表 3  流动相洗脱程序

    Table 3.  Mobile phase elution procedures

    时间/min Time流动相A/% Mobile phase A流动相B/% Mobile phase B
    0955
    84060
    18397
    21397
    21.1955
    25955
    时间/min Time流动相A/% Mobile phase A流动相B/% Mobile phase B
    0955
    84060
    18397
    21397
    21.1955
    25955
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    表 4  差异代谢物

    Table 4.  Differential metabolites

    差异代谢物Identification分子式Formula贡献度VIP偏相关系数p（corr）差异倍数Fold changeP value（T−test）P value（U−test）
    Choline胆碱C5H14NO3.730.522.200.190.34
    Enterodiol sulfate硫酸肠二醇C18H22O7S1.550.041.080.911.00
    L−Valine*#L−缬氨酸C5H11NO23.740.716.080.050.03
    Guanidinopropionic acid胍基丙酸C4H9N3O22.270.541.660.160.20
    L−ProlineL−脯氨酸C5H9NO21.630.151.380.730.69
    L−TyrosineL−酪氨酸C9H11NO32.320.342.200.421.00
    L−Isoleucine异亮氨酸C6H13NO22.560.251.690.550.34
    L−LeucineL−亮氨酸C6H13NO21.880.221.480.591.00
    L−PhenylalanineL−苯丙氨酸C9H11NO22.210.31.570.470.89
    Indoleacrylic acid吲哚丙烯酸C11H9NO22.670.291.560.481.00
    Glycocholic acid甘氨胆酸C26H43NO62.5−0.410.700.310.34
    Phytosphingosine植物鞘氨醇C18H39NO35.120.221.170.601.00
    Cholic acid胆酸C24H40O51.210.261.200.530.69
    Undecanoylcholine#十一烷酰胆碱C16H34NO22.270.672.520.070.03
    Chenodeoxyglycocholic acid乙酰脱氧甘氨胆酸C26H43NO51.44−0.310.840.460.89
    LysoPC（14:0/0:0）溶血磷脂酸（14:0）C22H46NO7P2.1−0.690.380.060.20
    LysoPC（16:1/0:0）溶血磷脂酸（16:1）C24H48NO7P2.44−0.490.520.220.34
    LysoPE（20:3/0:0）溶血磷脂酸（20:3）C25H46NO7P1.05−0.670.410.070.20
    LysoPE（18:0/0:0）溶血磷脂酸（18:0）C23H48NO7P4.73−0.650.410.080.20
    LysoPC（20:5/0:0）*#溶血磷脂酸（20:5）C28H48NO7P3.71−0.830.380.010.03
    LysoPC（18:2/0:0）*#溶血磷脂酸（18:2）C26H50NO7P14.1−0.830.410.010.03
    LysoPC（20:4/0:0）溶血磷脂酸（20:4）C28H50NO7P2.31−0.320.750.440.69
    LysoPC（14:1/0:0）溶血磷脂酸（14:1）C22H44NO7P1.100.5511.030.160.34
    LysoPC（22:5/0:0）溶血磷脂酸（22:5）C30H52NO7P1.17−0.220.850.610.89
    LysoPC（0:0/16:0）溶血磷脂酸（16:0）C24H50NO7P26.27−0.530.550.180.49
    LysoPC（18:3/0:0）溶血磷脂酸（18:3）C26H48NO7P5.38−0.510.580.200.69
    LysoPC（20:3/0:0）溶血磷脂酸（20:3）C28H52NO7P2.99−0.480.730.230.34
    LysoPC（P-16:0/0:0）*#溶血磷脂酸（16:0）C24H50NO6P7.46−0.740.660.030.03
    LysoPC（18:1/0:0）溶血磷脂酸（18:1）C26H52NO7P9.09−0.340.660.410.89
    LysoPC（22:4/0:0）溶血磷脂酸（22:4）C30H54NO7P1.450.081.050.861.00
    LysoPC（P-18:1/0:0）溶血磷脂酸（18:1）C26H52NO6P2.38−0.600.750.110.11
    LysoPC（P-18:0/0:0）溶血磷脂酸（18:0）C26H54NO6P1.42−0.340.860.410.49
    LysoPC（20:2/0:0）溶血磷脂酸（20:2）C28H54NO7P1.39−0.360.740.380.69
    LysoPC（18:0/0:0）溶血磷脂酸（18:0）C26H54NO7P14.11−0.450.690.270.69
    LysoPC（20:0/0:0）*#溶血磷脂酸（20:0）C28H58NO7P2.51−0.820.520.010.03
    4-Ethylphenylsulfate4-乙基苯基硫酸盐C8H10O4S2.19−0.281.200.500.34
    （10E,12Z）-9-HODE十八碳二烯酸C18H32O33.40−0.211.530.610.34
    7-HETE7-羟基花生四烯酸C20H32O32.23−0.311.810.451.00
    Dodecanoic acid十二烷酸C12H24O21.02−0.511.370.190.34
    Eicosapentaenoic acid二十碳五烯酸C20H30O22.39−0.351.880.391.00
    Linolenelaidic acid亚油酸C18H30O24.10−0.342.830.420.49
    Palmitoleic acid棕榈酸C16H30O22.45−0.463.810.250.69
    Arachidonic acid花生四烯酸C20H32O27.30−0.412.020.310.20
    Docosapentaenoic acid#二十二碳五烯酸C22H34O22.46−0.541.990.170.03
    Linoleic acid亚油酸C18H32O210.71−0.351.750.390.69
    Dihomo-alpha-linolenic acid亚麻脂酸C20H34O24.31−0.401.510.320.49
    Adrenic acid#肾上腺酸C22H36O22.94−0.532.830.180.03
    Palmitic acid*软脂酸C16H32O24.69−0.731.450.040.11
    Oleic acid油酸C18H34O24.95−0.411.810.310.49
    Hippuric acid*#马尿酸C9H9NO35.980.810.400.010.03
    　　*表示T检验下有显著性差异，#表示Mann-Whitney U检验下有显著性差异
    差异代谢物Identification分子式Formula贡献度VIP偏相关系数p（corr）差异倍数Fold changeP value（T−test）P value（U−test）
    Choline胆碱C5H14NO3.730.522.200.190.34
    Enterodiol sulfate硫酸肠二醇C18H22O7S1.550.041.080.911.00
    L−Valine*#L−缬氨酸C5H11NO23.740.716.080.050.03
    Guanidinopropionic acid胍基丙酸C4H9N3O22.270.541.660.160.20
    L−ProlineL−脯氨酸C5H9NO21.630.151.380.730.69
    L−TyrosineL−酪氨酸C9H11NO32.320.342.200.421.00
    L−Isoleucine异亮氨酸C6H13NO22.560.251.690.550.34
    L−LeucineL−亮氨酸C6H13NO21.880.221.480.591.00
    L−PhenylalanineL−苯丙氨酸C9H11NO22.210.31.570.470.89
    Indoleacrylic acid吲哚丙烯酸C11H9NO22.670.291.560.481.00
    Glycocholic acid甘氨胆酸C26H43NO62.5−0.410.700.310.34
    Phytosphingosine植物鞘氨醇C18H39NO35.120.221.170.601.00
    Cholic acid胆酸C24H40O51.210.261.200.530.69
    Undecanoylcholine#十一烷酰胆碱C16H34NO22.270.672.520.070.03
    Chenodeoxyglycocholic acid乙酰脱氧甘氨胆酸C26H43NO51.44−0.310.840.460.89
    LysoPC（14:0/0:0）溶血磷脂酸（14:0）C22H46NO7P2.1−0.690.380.060.20
    LysoPC（16:1/0:0）溶血磷脂酸（16:1）C24H48NO7P2.44−0.490.520.220.34
    LysoPE（20:3/0:0）溶血磷脂酸（20:3）C25H46NO7P1.05−0.670.410.070.20
    LysoPE（18:0/0:0）溶血磷脂酸（18:0）C23H48NO7P4.73−0.650.410.080.20
    LysoPC（20:5/0:0）*#溶血磷脂酸（20:5）C28H48NO7P3.71−0.830.380.010.03
    LysoPC（18:2/0:0）*#溶血磷脂酸（18:2）C26H50NO7P14.1−0.830.410.010.03
    LysoPC（20:4/0:0）溶血磷脂酸（20:4）C28H50NO7P2.31−0.320.750.440.69
    LysoPC（14:1/0:0）溶血磷脂酸（14:1）C22H44NO7P1.100.5511.030.160.34
    LysoPC（22:5/0:0）溶血磷脂酸（22:5）C30H52NO7P1.17−0.220.850.610.89
    LysoPC（0:0/16:0）溶血磷脂酸（16:0）C24H50NO7P26.27−0.530.550.180.49
    LysoPC（18:3/0:0）溶血磷脂酸（18:3）C26H48NO7P5.38−0.510.580.200.69
    LysoPC（20:3/0:0）溶血磷脂酸（20:3）C28H52NO7P2.99−0.480.730.230.34
    LysoPC（P-16:0/0:0）*#溶血磷脂酸（16:0）C24H50NO6P7.46−0.740.660.030.03
    LysoPC（18:1/0:0）溶血磷脂酸（18:1）C26H52NO7P9.09−0.340.660.410.89
    LysoPC（22:4/0:0）溶血磷脂酸（22:4）C30H54NO7P1.450.081.050.861.00
    LysoPC（P-18:1/0:0）溶血磷脂酸（18:1）C26H52NO6P2.38−0.600.750.110.11
    LysoPC（P-18:0/0:0）溶血磷脂酸（18:0）C26H54NO6P1.42−0.340.860.410.49
    LysoPC（20:2/0:0）溶血磷脂酸（20:2）C28H54NO7P1.39−0.360.740.380.69
    LysoPC（18:0/0:0）溶血磷脂酸（18:0）C26H54NO7P14.11−0.450.690.270.69
    LysoPC（20:0/0:0）*#溶血磷脂酸（20:0）C28H58NO7P2.51−0.820.520.010.03
    4-Ethylphenylsulfate4-乙基苯基硫酸盐C8H10O4S2.19−0.281.200.500.34
    （10E,12Z）-9-HODE十八碳二烯酸C18H32O33.40−0.211.530.610.34
    7-HETE7-羟基花生四烯酸C20H32O32.23−0.311.810.451.00
    Dodecanoic acid十二烷酸C12H24O21.02−0.511.370.190.34
    Eicosapentaenoic acid二十碳五烯酸C20H30O22.39−0.351.880.391.00
    Linolenelaidic acid亚油酸C18H30O24.10−0.342.830.420.49
    Palmitoleic acid棕榈酸C16H30O22.45−0.463.810.250.69
    Arachidonic acid花生四烯酸C20H32O27.30−0.412.020.310.20
    Docosapentaenoic acid#二十二碳五烯酸C22H34O22.46−0.541.990.170.03
    Linoleic acid亚油酸C18H32O210.71−0.351.750.390.69
    Dihomo-alpha-linolenic acid亚麻脂酸C20H34O24.31−0.401.510.320.49
    Adrenic acid#肾上腺酸C22H36O22.94−0.532.830.180.03
    Palmitic acid*软脂酸C16H32O24.69−0.731.450.040.11
    Oleic acid油酸C18H34O24.95−0.411.810.310.49
    Hippuric acid*#马尿酸C9H9NO35.980.810.400.010.03
    　　*表示T检验下有显著性差异，#表示Mann-Whitney U检验下有显著性差异
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    表 5  代谢通路信息

    Table 5.  Metabolic pathway information

    通路名称Pathways相关代谢物MetabolitesP值-lg10（p）影响Impact
    Aminoacyl-tRNA biosynthesisL-Phenyl`alanine; L-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine; L-Tyrosine; L-Proline4.190.00
    Biosynthesis of unsaturated fatty acidsHexadecanoic acid; （9Z）-Octadecenoic acid; Linoleate; Arachidonate; （5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）-Icosapentaenoic acid3.750.00
    Valine, leucine and isoleucine biosynthesisL-Leucine; L-Isoleucine; L-Valine3.730.00
    Phenylalanine metabolismL-Phenylalanine; Hippurate; L-Tyrosine;3.150.36
    Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesisL-Phenylalanine; L-Tyrosine;2.851.00
    Valine, leucine and isoleucine degradationL-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine1.630.00
    Linoleic acid metabolismLinoleate1.111.00
    Glycerophospholipid metabolism1-Acyl-sn-glycero-3-phosphocholine; Choline0.960.04
    Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesisL-Tyrosine0.870.00
    Primary bile acid biosynthesisCholic acid; Glycocholate0.790.02
    Fatty acid biosynthesisHexadecanoic acid; Dodecanoic acid0.770.01
    Pantothenate and CoA biosynthesisL-Valine0.580.00
    Sphingolipid metabolismPhytosphingosine0.540.00
    Glycine, serine and threonine metabolismCholine0.370.00
    Arachidonic acid metabolismArachidonate0.350.32
    Arginine and proline metabolismL-Proline0.340.08
    Fatty acid elongationHexadecanoic acid0.330.00
    Fatty acid degradationHexadecanoic acid0.330.00
    Tyrosine metabolismL-Tyrosine0.310.14
    Aminoacyl-tRNA biosynthesisL-Phenylalanine; L-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine; L-Tyrosine; L-Proline4.190.00
    Biosynthesis of unsaturated fatty acidsHexadecanoic acid; （9Z）-Octadecenoic acid; Linoleate; Arachidonate; （5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）-Icosapentaenoic acid3.750.00
    通路名称Pathways相关代谢物MetabolitesP值-lg10（p）影响Impact
    Aminoacyl-tRNA biosynthesisL-Phenyl`alanine; L-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine; L-Tyrosine; L-Proline4.190.00
    Biosynthesis of unsaturated fatty acidsHexadecanoic acid; （9Z）-Octadecenoic acid; Linoleate; Arachidonate; （5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）-Icosapentaenoic acid3.750.00
    Valine, leucine and isoleucine biosynthesisL-Leucine; L-Isoleucine; L-Valine3.730.00
    Phenylalanine metabolismL-Phenylalanine; Hippurate; L-Tyrosine;3.150.36
    Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesisL-Phenylalanine; L-Tyrosine;2.851.00
    Valine, leucine and isoleucine degradationL-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine1.630.00
    Linoleic acid metabolismLinoleate1.111.00
    Glycerophospholipid metabolism1-Acyl-sn-glycero-3-phosphocholine; Choline0.960.04
    Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesisL-Tyrosine0.870.00
    Primary bile acid biosynthesisCholic acid; Glycocholate0.790.02
    Fatty acid biosynthesisHexadecanoic acid; Dodecanoic acid0.770.01
    Pantothenate and CoA biosynthesisL-Valine0.580.00
    Sphingolipid metabolismPhytosphingosine0.540.00
    Glycine, serine and threonine metabolismCholine0.370.00
    Arachidonic acid metabolismArachidonate0.350.32
    Arginine and proline metabolismL-Proline0.340.08
    Fatty acid elongationHexadecanoic acid0.330.00
    Fatty acid degradationHexadecanoic acid0.330.00
    Tyrosine metabolismL-Tyrosine0.310.14
    Aminoacyl-tRNA biosynthesisL-Phenylalanine; L-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine; L-Tyrosine; L-Proline4.190.00
    Biosynthesis of unsaturated fatty acidsHexadecanoic acid; （9Z）-Octadecenoic acid; Linoleate; Arachidonate; （5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）-Icosapentaenoic acid3.750.00
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-10-28
  • 录用日期:  2022-03-11
  • 刊出日期:  2023-04-27
胡晓旭, 许彤, 陈旸升, 谢群慧, 郝艳芬, 王楚, 程劼, 王璞, 张庆华, 徐丽, 赵斌. 二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1067-1076. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804
引用本文: 胡晓旭, 许彤, 陈旸升, 谢群慧, 郝艳芬, 王楚, 程劼, 王璞, 张庆华, 徐丽, 赵斌. 二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究[J]. 环境化学, 2023, 42(4): 1067-1076. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804
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HU Xiaoxu, XU Tong, CHEN Yangsheng, XIE Qunhui, HAO Yanfen, WANG Chu, CHEN Jie, WANG Pu, ZHANG Qinghua, XU Li, ZHAO Bin. Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1067-1076. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804
Citation: HU Xiaoxu, XU Tong, CHEN Yangsheng, XIE Qunhui, HAO Yanfen, WANG Chu, CHEN Jie, WANG Pu, ZHANG Qinghua, XU Li, ZHAO Bin. Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(4): 1067-1076. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804
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二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

    通讯作者: Tel：010-62842865，E-mail：lixu@rcees.ac.cn; 
  • 1. 中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京，100085
  • 2. 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京，100081
  • 3. 江汉大学持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室，环境与健康学院，武汉，430056
  • 4. 中国科学院大学，北京，100049
  • 收稿日期:  2021-10-28
  • 录用日期:  2022-03-11
  • 网络出版日期:  2023-04-13
基金项目:
国家重点研发计划（2017YFC1600301）和国家自然科学基金（22076216, 21836004）资助.

摘要: 旨在研究食用被PCDD/Fs污染的饲料对奶牛血液代谢组的影响。选择飞灰作为PCDD/Fs的载体，暴露期间将30 g飞灰与40 kg奶牛饲料均匀混合，使用配制的污染饲料饲喂奶牛，连续饲喂38 d后采集血液。采用液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术对血液进行代谢组学分析，并且结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）对代谢轮廓进行模式识别分析并筛选差异代谢产物。共鉴定差异代谢物50个，主要为氨基酸、胆酸、磷脂与脂肪酸类成分。将差异代谢物进行通路分析并注释，涉及19条代谢通路，主要与氨基酸、脂肪酸及胆碱代谢相关。PCDD/Fs暴露干扰了奶牛的脂肪酸代谢、氨基酸代谢、磷脂代谢、胆汁酸代谢，可作为PCDD/Fs暴露的靶标代谢通路供进一步的研究。

English Abstract

    全文HTML

  • 多氯代二苯并-对-二恶英和多氯代二苯并呋喃（PCDD/Fs）是传统的持久性有机污染物（POPs），具有POPs典型的持久性、高毒性、长距离迁移性和生物累积性的特征[1]，能给动物和人类带来严重的健康风险。随着全球工业的快速发展，PCDD/Fs排放源的数量不停增长密度持续增大，农产品也不可避免的受到了影响[2]。从20世纪末到21世纪，PCDD/Fs污染畜禽饲料及农产品等的污染事件频繁发生[2-3]。华北某地区是著名的“钢都”同时也是全国第二大的“奶都”。钢铁厂是PCDD/Fs污染的典型来源，钢铁厂坐落在农田附近又紧挨奶牛养殖场，农田中农作物的生产不可避免的会受到影响。而相当部分的农作物会作为畜禽动物的饲料原料直接进行回收加工，使得PCDD/Fs沿着食物链进行传递。目前关于PCDD/Fs的研究主要集中在环境污染调查和致毒效应探究[4]。并且国际上关于奶牛这种大型哺乳动物的污染物暴露实验极少，多数实验采用纯品添加进饲料进行暴露，无法还原实际污染条件，可能存在夸大PCDD/Fs暴露风险的问题。

    代谢组学是研究生物内源性小分子代谢物整体及其变化规律的学科，以高通量、高灵敏度著称[5]，是继基因组学和蛋白组学新发展起来的学科。近年来代谢组学的发展为毒理学的深入研究提供了新的技术手段和思路。可以通过检测代谢通路上多种代谢物的变化来探究代谢紊乱背后的机制，评价环境污染物暴露所带来的毒性效应[6]，进而推断毒性作用的分子机制，具有快速和高灵敏度等特点。血液作为机体的重要媒介体液，包含了不同组织器官的多种代谢产物[7]。Tian等[8]采用血液代谢组学检测与奶牛热应激有关的生物标志物，共鉴定出41种代谢产物。迄今为止对奶牛血液代谢物的研究主要是对血液中葡萄糖、胆固醇、游离脂肪酸等常规参数的测定，很少有研究探究污染物对奶牛整体代谢的影响。

    本研究通过在饲料中添加飞灰暴露奶牛，探究其对奶牛血液代谢组的影响，筛选差异代谢物，揭示PCDD/Fs暴露的健康效应和在奶牛体内的迁移代谢规律，寻找潜在的生物标志物。

    • 1.   材料与方法 （Materials and methods）

      1.1.   动物喂养实验及采样

    • 场地设置在一个集中式的奶牛养殖场，选择体重约为600 kg，二胎次的荷斯坦奶牛4头进行暴露，洁净饲料饲喂奶牛为对照。由于更换养殖场地可能会导致奶牛出现严重应激反应，影响奶牛食欲和产奶量。因此适应期阶段使用洁净饲料进行饲喂，让奶牛适应环境后开始实验。将飞灰作为PCDD/Fs的载体，每日将30 g飞灰与40 kg洁净饲料充分混匀，暴露量为0.61 pgTEQ·g−1，连续饲喂38 d。于第38天采集血液，离心，收集上层血清，置于−80 ℃冰箱保存，样品信息见表1。

      • 1.2.   样品前处理

    • 样品解冻后，取适量血清（200 μL），加3倍量乙腈（600 μL），涡旋2 min，13000 r·min−1离心10 min，取上清400 μL，氮气吹干。吹干样品后用100 μL 50%乙腈复溶，涡旋60 s，离心10 min（13000 r·min−1 ，4 ℃）。吸取上清2 μL进样。另取所有样品适量，等量混合，为QC样品。检测过程中每4个样品插入一针QC，用于监测仪器与方法的稳定性。

      • 1.3.   LC-MS分析

    • 采用SCIEX Exion LC 联合 X-500R Q-TOF mass spectrometer （AB Sciex, Foster City, CA, USA）液质联用仪按表2中参数进行分析，电喷雾离子源ESI，正负离子扫描模式，扫描范围m/z100-1250。

      所使用色谱柱为Waters Acquity BEH C18 column （2.1 mm×100 mm, 1.7 μm），洗脱程序如表3所示。柱温为35 ℃，流动相为A：水（含0.1%甲酸）；B：乙腈；流速：0.3 mL·min−1；进样体积：2 μL。

      • 1.4.   数据分析及统计分析

    • 通过SCIEX OS Analytics提取原始图谱并进行数据矩阵的转换，主要包括质荷比（m/z）和保留时间（Rt）及峰面积（intensity）等信息。所有数据用总峰面积进行归一化后生成的excel表用于代谢组学分析。为减少偶然误差产生的信号干扰，对QC中RSD≥40%的变量先行在excel中剔除。将excel文件导入SIMCA 14.1软件中进行多元数理统计分析。

    2.   结果与讨论（Results and disscusion）

      2.1.   血液样本代谢谱分析

    • 图1为对照组和暴露组正负离子模式下的叠加离子流图，可以看到保留时间和峰面积重叠较好，图谱几乎完全重合。说明在样本检测序列中，仪器方法稳定，所得数据质量可靠。

      数据经预处理后进行多维统计分析和模式识别，无监督的主成分分析（PCA）结果如图2所示。该数据用于评价样品组内差异情况，点分布越聚集表示代谢组越相似。反之，分布越分散表示差异越大。结果可见, 两组样本间可以明显区分，暴露组样品分布较离散，组内差异较大。暴露组离子流图谱中也可观察到组内色谱峰组成、分布与强度有一定偏差（图1a, b）。对照组平行性较好，图谱基本一致，在PCA中也聚集紧密。以上结果提示污染物的暴露对奶牛血液代谢组产生了显著的影响。

      • 2.2.   多元统计学分析

    • 采用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）使对照组与暴露组差异扩大，筛选差异代谢物。OPLS-DA将分组纳入变量，放大了组间差异，主要用于观测不同组间的差异大小。散点越接近说明两组间差异越小，反之则组间差异越大。图3为两组的OPLS-DA图，暴露组和对照组在正负离子模式下都有较为明显的分离趋势，正离子模式下R2X 0.984 、R2Y 1.000、Q2 0.771 ，负离子模式下R2X 0.950、R2Y 1.000、Q2 0.830， R2Y和Q2的数值均大于0.5，这表明模型预测能力强且可靠。

      • 2.3.   差异代谢物的筛选

    • 在OPLS-DA模型的基础上，根据变量投影重要性指标（VIP值）筛选差异变量（VIP>1），考虑组内差异的影响，降低pcorr标准（|pcorr|>0.4）。对筛选出的代谢物进行鉴定，因为样本量较少，故采用U检验进行补充分析，满足其中一种检验方式（P<0.05），视为差异性代谢物。最终鉴定的结果见表4，共鉴定差异代谢物50个。主要为溶血磷脂类、脂肪酸类，可从脂质代谢异常切入研究。本实验基本呈现出脂肪酸与氨基酸升高，溶血磷脂降低的结果，提示奶牛在二恶英类物质暴露下可能导致脂质代谢的紊乱，如脂肪酸的堆积等，从而进一步影响能量代谢。

      • 2.4.   生物信息学分析和生物标记物筛选

    • 将差异化合物导入MetaboAnalyst 5.0 （http://www.MetaboAnalyst.ca/） 进行通路分析，代谢通路信息见表5，并且形成拓扑图（图4），共涉及到19条通路，主要与氨基酸、脂肪酸、胆汁酸与磷脂相关。热图见图5，颜色越红表示该代谢物响应越高，越蓝表示响应越低，可见溶血磷脂类成分在暴露后响应降低较为明显。

      苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸均为芳香族氨基酸。芳香族氨基酸合成途径中底物均为莽草酸。其中苯丙氨酸与酪氨酸的结构相似，在体内苯丙氨酸可被苯丙氨酸羟化酶催化引入羟基生成酪氨酸[9-13]。色氨酸和苯丙氨酸均为人体无法合成的必需氨基酸，这些氨基酸血清水平的增加可能与分解代谢途径改变有关[14]。苯丙氨酸可转化生成苯丙酮酸，苯丙酮酸大量堆积会导致中枢神经系统受到损伤[15-16]。并且有研究发现动脉粥样硬化患者的心血管疾病发生风险与苯丙氨酸负相关，心绞痛患者发生短暂缺血时体内苯丙氨酸也显著降低[17]。酪氨酸是一种非必须氨基酸，可在肾上腺髓质中合成肾上腺素、去肾上腺素和多巴胺[18]。酪氨酸是黑色素的前体，临床发现炎症性皮肤病与黑色素细胞功能改变密切相关[19]。黑色素生物合成途径的第一步是酪氨酸酶催化，酪氨酸酶活性的降低会导致体内酪氨酸水平的增高[19]。苯丙氨酸、酪氨酸代谢的稳定对机体维持正常生理机能至关重要。本研究发现，与对照组相比暴露组苯丙氨酸、酪氨酸含量均显著上升，说明PCDD/Fs暴露会干扰苯丙氨酸、酪氨酸生物合成的相关代谢通路。

      色氨酸是人体必需的10种氨基酸之一，是构成机体蛋白质的主要成分，能促进T淋巴前体细胞分化为成熟的T淋巴细胞[12]。色氨酸在体内主要有两种代谢途径：甲氧基吲哚途径和犬尿氨酸途径。犬尿氨酸途径是色氨酸非蛋白代谢的主要途径[14]。色氨酸通过犬尿氨酸途径的改变在癌症、阿尔茨海默症和抑郁症等疾病中都有过报道[14, 20-22]。有研究发现体内色氨酸水平降低会抑制T细胞的活化与增殖，使T细胞在G1期停滞，导致机体免疫功能降低[23]。甲氧基吲哚途径中包含了许多具有神经活性物质的代谢物，如5-羟色胺，褪黑素，血清素等[24-25]。有研究表明，皮肤中的血清素可以调节免疫反应，通过控制免疫细胞的凋亡导致慢性特应性皮炎的发生[25]。高苯丙氨酸水平会抑制5-羟色胺脱羧酶的活性，从而降低血清素的生成[26]。本研究中观察到色氨酸响应水平升高可能反映了色氨酸转化途径受到了干扰。在鉴定出的代谢物中，吲哚丙烯酸（Indoleacrylic acid）在暴露后浓度升高（图6），且吲哚丙烯酸为芳香烃受体（AhR）的配体。AhR信号通路与脂肪酸和氨基酸代谢高度相关，脂肪酸的积累是通过AHR-PPARA/G-FATP1信号通路介导的，可能为PCDD/Fs通过AhR影响全身代谢提供依据[9]，也提示我们PCDD/Fs可能通过干扰色氨酸代谢引起免疫和神经系统的损伤。

      亚油酸是生长发育过程中所必需的一种饱和脂肪酸[27]。作为前列腺素的前体，同时也是游离脂肪酸的重要成分，在基因表达调节、细胞的膜构建及细胞信号传导等方面都有至关重要的作用[27-29]。有研究表明亚油酸有助于降低血清胆固醇抑制动脉血栓的形成[30]。也有研究发现亚油酸诱导机体产生大量活性氧物质，引起机体红细胞的急性损伤[31]，亚油酸可通过TLR4-NF-κB通路调控牛乳腺上皮细胞的抗乳腺炎作用，促进IL-1β、IL-6等促炎细胞因子的分泌[32]。本研究发现，暴露组的血清亚油酸响应水平显著降低，提示我们 PCDD/Fs暴露奶牛体内亚油酸代谢紊乱。

    3.   结论（Conclusion）

    • 综上所述，本实验采用代谢组学技术研究了饲喂奶牛含PCDD/Fs的饲料血液代谢组学变化情况，发现PCDD/Fs暴露导致奶牛的脂肪酸代谢、氨基酸代谢、糖代谢均受到影响，从代谢层面揭示了PCDD/Fs的潜在健康风险。本研究共鉴定50个差异代谢物，其中包含AhR内源性配体，为探究PCDD/Fs暴露的健康风险生物标志物提供了重要依据。

    参考文献 (32)

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