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石油是由烷烃、芳香烃以及少量非烃类物质（沥青和树脂等）组成的复杂混合物[1]。在石油的开采、运输、储存以及使用过程中不可避免的存在泄漏和原油落地等问题，对土壤生态环境造成不利影响[2-4]。土壤中蕴含的大量微生物通过产生对石油烃具有降解活性的酶以代谢石油烃，将其矿化为二氧化碳和水[5]，对于石油污染环境的修复发挥着重要作用。石油烃降解功能基因是指微生物产生的对于石油烃具有特定降解作用的酶编码基因[6]，通过对这些功能基因进行测定，可用于分析污染环境中石油烃降解菌的生物多样性，从而判定石油烃污染环境的生物修复潜势[7]。
在好氧条件下，包括芳香烃在内的许多复杂碳氢化合物较易被生物降解。然而，在非表层的石油污染土壤中，厌氧代谢是石油烃生物降解中的主要方式[8, 9]。在厌氧条件下，烷烃降解途径中琥珀酸合酶基因（masD）催化的富马酸加成反应和琥珀酸烷基代谢物的生成是烷烃降解的关键步骤[10]。而多数芳香族化合物（如甲苯、苯酚、甲酚等）在脱芳构化和裂解环之前，在微生物作用下生成中间体苯甲酰辅酶A，其中6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶基因（bamA）开环反应是苯甲酰辅酶A厌氧降解途径中的关键步骤[11]。因此，检测石油烃厌氧降解功能基因masD和bamA是研究土壤石油烃厌氧降解菌赋存情况、评价石油烃厌氧生物降解潜势的重要依据。
实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Quantitative PCR, qPCR）是目前广为采用的基因定量检测技术[12]。在PCR体系中加入荧光探针[13]或荧光染料[14]，随着扩增产物不断积累，相应的荧光信号也不断增强，通过监测荧光信号强度变化，结合标准曲线就可以定量分析未知样品中目的基因拷贝数[15-17]。在利用实时荧光定量PCR技术检测功能基因时，设计合适的扩增引物和确定退火温度是保证方法准确度和灵敏度的关键。
宋本如[18]建立了烷烃和芳烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法，方法可较好的用于两种基因的定量检测。但其扩增效率较低，仅为53.0%和63.6%。Aitken等[10]为研究不同条件下烷烃的活化机制，建立了扩增琥珀酸合酶基因（assA）的实时荧光定量PCR检测方法。Martijn等[19]建立了6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶基因（bamA）的实时荧光定量PCR检测方法，这些方法普遍存在扩增效率较低的问题。
本文通过设计引物及确定合适的退火温度和扩增程序，优化了烷烃和芳烃厌氧降解关键基因masD和bamA的定量检测方法。并利用建立的方法对陕北油井场区土壤中的masD和bamA基因进行了定量检测。研究对于评估污染土壤中石油烃的生物厌氧降解潜势具有重要的理论意义。
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iQ5实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad 公司）；ND-2000微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific）；Mastercycler ep梯度PCR（德国Eppendorf）；DYY-6D电泳仪（北京六一仪器厂）；GeiDoc XR+凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；HR/T16MM小型离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。
土壤基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，中国）；柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）；柱式DNA胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）；T载体PCR产物快速连接试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）；2×Taq PCR Master mix（KT201）（天根生化科技（北京）有限公司，中国）；FastStart Essential DNA Green Master（Roche，瑞士）；DH5α感受态细胞（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）。
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通过查阅文献，获得可扩增（1-甲基烷基）琥珀酸合酶基因（masD）和6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶基因（bamA）的引物序列。引物序列、扩增产物大小、退火温度见表1。
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按照土壤基因组DNA提取试剂盒说明程序提取采自陕北志丹县油井场区的土壤中总DNA，利用表1的masD和bamA引物扩增提取的DNA，PCR扩增体系（25 μL）为：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，10.0 μmol·L−1的上下游引物各0.5 μL，DNA模板3.0 μL，ddH2O 8.5 μL。升温程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火温度为表1中给出的50 ℃和58 ℃，保持30 s，72 ℃延伸30 s，设定35个循环；72 ℃延伸10 min。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的特异性。利用胶回收试剂盒回收特异性亮带，与T载体连接并克隆于DH5α感受态细胞。经过蓝白斑筛选后挑选白色菌落，置于20 mL LB培养基中[21]（10 g蛋白胨、10 g NaCl和5 g酵母浸粉加入超纯水溶解，定容至1 L），30 ℃培养12—16 h，以获得的菌液为模板，通过M13通用引物（M13F：GTAAAACGACGGCCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGACC）进行PCR扩增，利用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定其是否为阳性克隆。最后提取阳性克隆的重组质粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，获得特异性亮带的DNA序列并以此为靶序列进行实时荧光定量PCR引物的设计。
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利用Allele ID6软件根据实时荧光定量PCR引物设计原则，设计扩增masD和bamA基因的引物。具体设计原则包括：扩增产物长度在80—150 bp，最大不超过300 bp；上、下游引物Tm值相差较小，不超过2 ℃；避免模板二级结构，上、下游引物长度为18—24 bp；引物G+C含量在45%—55％之间；引物中碱基均匀并随机分布。遵循以上原则设计出实时荧光定量PCR引物masD-f2/masD-r2和bamA-f2/bamA-r2，见表2。
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实时荧光定量PCR（20 μL）反应体系：10.0 μL的FastStart Essential DNA Green Master，上、下游引物各0.4 μL，4.2 μL RNase-Free Water，5.0 μL DNA模板，同时设置一组只加RNase-Free Water的阴性对照。
为了确定最适引物浓度和退火温度，分别向各个体系中加入0.2、0.4、0.8 μL的实时荧光定量PCR引物，使体系内引物终浓度分别为0.1、0.2、0.4 μmol·L−1。引物的退火温度分别设置为52、57、61 ℃。实时荧光定量PCR的反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，退火温度保持15 s，72 ℃延伸10 s，共设40个循环。熔解曲线程序：以0.5 ℃·s−1由55 ℃升至95 ℃，每个温度下保持5 s。
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用微量分光光度计测定质粒DNA的浓度（ng·µL−1），根据下式换算为copy·µL−1。将已知浓度的质粒进行8次10倍梯度稀释[22]，即18 µL稀释液加入2 µL质粒稀释后，进行连续8次的梯度稀释。本研究中masD选取108—104 copy·µL−1质粒DNA共5个梯度进行标准曲线的绘制；bamA选取1010—105 copy·µL−1质粒DNA共6个梯度进行标准曲线的绘制。公式：每µL初始重组质粒中的基因绝对拷贝数(CN)：
其中，X为阳性质粒浓度（ng·µL−1）；T载体长为2773 bp；b为masD和bamA片段，分别长389 bp和354 bp；每对碱基的平均分子量是650 Da；阿弗加德罗常数为6.02×1023 mol−1。
利用循环阈值（Ct）与起始模板拷贝数的对数存在反比例线性关系建立标准曲线[23]，作为土壤样品中masD和bamA降解基因定量的依据。
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根据质粒DNA测序结果，利用Allele ID6软件自行设计了实时荧光定量PCR引物并优化退火温度，设计的荧光定量PCR引物序列、扩增产物大小、退火温度见表2。
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利用文献中的的masD和bamA降解基因引物（表1）对土壤总DNA进行扩增，扩增产物分别为389 bp（masD）和354 bp（bamA），产物片段较大（图1A、B）。而实时荧光定量PCR要求扩增产物不超过300 bp，本文根据质粒DNA的测序结果重新设计合成的masD和bamA降解基因的荧光定量PCR引物（表2），对masD和bamA降解基因扩增，所得产物大小为98 bp（masD）和195 bp（bamA）（图1C、D），且只有一条亮带，说明产物特异性良好，因此本文设计的引物和优化后的的反应条件与文献相比，更适合用于masD和bamA降解基因的定量检测。
在不同引物浓度下对石油烃降解基因masD和bamA进行扩增，所得实时荧光定量PCR熔解曲线如图2所示，纵坐标为荧光强度对温度的负倒数。当引物终浓度分别为0.1、0.2、0.4 μmol·L−1时，3组熔解曲线均未出现杂峰，说明设计的引物特异性好。以产生Ct值的平均值最小和Ct值标准偏差综合指数最小为依据对引物浓度进行选择。通过比较Ct值的平均值和Ct标准偏差值，当引物终浓度为0.2 μmol·L−1时，Ct值的平均值最小且Ct值标准偏差综合指数最小（表3）。最终确定引物最适浓度为0.2 μmol·L−1。
引物最适浓度确定为0.2 μmol·L−1时，石油烃厌氧关键降解基因masD和bamA在不同退火温度下的实时荧光定量PCR熔解曲线如图3所示。当退火温度分别为52、57、61 ℃时，masD和bamA降解基因的熔解曲线未出现非特异性扩增杂峰，引物显示出很高的特异性。最佳温度选择和最佳浓度选择依据的标准相同，通过比较Ct值的平均值和Ct标准偏差值，当masD基因退火温度为61 ℃、bamA基因退火温度为57 ℃时，Ct值的平均值最小且Ct值标准偏差综合指数最小。因此经优化后，最终确定体系中引物终浓度为0.2 μmol·L−1，引物masD-f/masD-r和bamA-f/bamA-r退火温度分别为61 ℃和57 ℃（表4）。
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如图4所示，masD降解基因的标准曲线是Ct=-3.383lgC+39.022，相关系数R2=1.000，扩增效率E=97.5%；bamA降解基因的标准曲线是Ct=-4.283lgC+50.520，相关系数R2=0.993，扩增效率E=71.2%。文献报道测定masD和bamA方法中的扩增效率分别为53.0%和63.6%[18]，该方法与文献报道方法相比，提高了7.6%—44.5%。本文通过设计扩增引物并优化扩增条件，使扩增效率显著提高，提高了方法的灵敏度和准确性。
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如图5所示，降解基因masD和bamA同一浓度梯度下的两条扩增曲线几乎重合，组内变异系数除bamA降解基因1010浓度梯度外均小于1%(表5)，说明利用所设计的引物对两种基因进行实时荧光定量PCR检测时，方法的重复性好，可保证不同样品间检测结果的可靠性和稳定性[24]。
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利用所建立的实时定量荧光PCR方法定量检测了陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA降解基因的拷贝数，结果如表6所示，5个地区石油污染土壤的masD和bamA降解基因拷贝数分别在2.69×102—7.52×103 copy·g−1 土及1.00×104—3.60×105 copy·g−1 土之间，土壤中bamA降解基因的拷贝数大于masD降解基因，两种基因拷贝数与土壤中石油烃含量无相关关系。在5个地区污染土壤中均可检测到两种控制石油烃厌氧降解的关键基因，说明在石油污染土壤中蕴含着可对石油烃进行厌氧降解代谢的微生物，有可能通过厌氧修复的方式对石油污染土壤进行修复治理。
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本论文通过设计检测石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的定量扩增引物，并优化反应条件和扩增程序，建立了利用实时荧光定量PCR技术对烷烃厌氧降解基因masD和芳香烃厌氧降解基因bamA进行定量检测的方法。与文献报道的方法相比，优化后的方法具有更好的重复性、灵敏度和扩增效率。利用建立的方法对陕北石油开采区污染土壤进行定量检测的结果表明，石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因，说明在石油污染土壤中蕴含着可对石油烃厌氧代谢的微生物，在对石油污染土壤进行修复时，有望通过厌氧生物降解的方式对污染土壤进行修复治理。
石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法与应用
Real-time quantitative PCR for determination of petroleum hydrocarbon anaerobic degradation key genes masD and bamA
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摘要: masD和bamA是控制石油烃厌氧降解的关键基因，利用实时荧光定量PCR技术检测masD和bamA基因具有简便快速和易操作等优点。但目前所用方法存在扩增效率低，方法灵敏度较差的问题。本文根据引物设计原则，利用Allele ID6软件重新设计了扩增masD和bamA的实时荧光定量PCR引物，将质粒DNA进行8次10倍梯度稀释后构建实时荧光定量PCR标准曲线。优化后的体系（20 μL）为：FastStart Essential DNA Green Master 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，RNase-Free Water 4.2 μL，5.0 μL DNA 模板。利用新设计的引物扩增masD和bamA基因的最适退火温度分别为61 ℃和57 ℃。优化后的检测方法扩增效率提高至97.5%和71.2%，比文献报道的方法提高了7.6%—44.5%，具有更高的重复性和灵敏度。利用设计的引物对陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA基因进行定量检测结果表明，石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因，所测定的土壤中bamA降解基因的拷贝数远高于masD降解基因。Abstract: The masD and bamA are key genes controlling the anaerobic degradation of petroleum hydrocarbons. Real-time quantitative PCR (qPCR) is the common gene detection method which has the advantages of simple, fast and easy operation. In this study, according to the primer design principle, the qPCR primers for amplifying masD and bamA were designed using Allele ID6 software. The obtained primers have uniform base distribution, appropriate amplification length, minor difference of Tm values between forward and reverse primers, as well as single peak in the fusion curve of amplification products, indicating that the primers had good specificity. The plasmid DNA was diluted 8 times with 10 fold gradient to construct the qPCR standard curve. 20 μL of optimized system included 10.0 μL of Faststart essential DNA green master, 4.2 μL RNase-Free Water, 5.0 μL DNA template, 0.4 μL of upstream and downstream primers, respectively. The optimum annealing temperatures for amplification of masD and bamA genes were 61 ℃ and 57 ℃, respectively. Compared with the literatures, the amplification efficiency of this optimized method enhanced by 7.6%—44.5%, indicating the method has higher repeatability and sensitivity. This optimized method can be used to quantitatively detect the masD and bamA genes in the petroleum-contaminated soils collected from five regions in northern of Shaanxi province of China. The results indicated that the anaerobic degradation genes of masD and bamA were ubiquitous in the petroleum-contaminated soils, and the gene copy numbers of bamA was much higher than that of masD in the oil-polluted soils.
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铁是一种生物必须的营养元素，直接影响浮游植物的光合作用和碳水化合物形成，由于高含氧量和无机态铁的低溶解性，铁通常是制约HNLC海区（High nutrition low chlorophyll）初级生产力的关键微量元素[1-2]。大规模海洋施铁实验表明，水生态系统中生物可利用铁的增加可以显著提高浮游植物的生物量和光合作用率，从而提高初级生产力，并促使浮游植物的群落结构发生变化[3-7]。以往研究表明，光自养微生物对碳循环和全球气候起关键作用[8-9]。初级生产力的提高，深刻地影响着全球尺度的二氧化碳固定，对温室气体的控制具有重要意义。
水生态系统中，99%溶解性铁（dissolved iron，DFe）与有机配体结合。尽管大部分有机络合态铁不能直接被藻类利用，但通过一些地球化学转化过程，可转变为生物可利用铁[10-11]。Blazevic等[12]研究发现，海洋中腐殖酸结合态铁可以发生光还原反应，进而提高铁的生物可利用性。沼泽性河流是海洋DFe的重要来源[13]。沼泽性河流中大量存在的溶解性有机碳（DOC, dissolved organic carbon）与铁离子形成有机络合物，使水中保持较高浓度DFe。有机质中羧基和酚羟基是与铁络合的主要官能团。泥炭源中的酚酸类物质，含有稳定的芳香环结构。部分酚酸与铁有较高的配合能力，这类物质的存在保护了长距离迁移的DFe，保证了陆源DFe向水生态系统的有效输出[14]。
泥炭沼泽中存在多种类型酚酸，前人在金川泥炭中检测出了9种酚酸，包括对-羟基苯甲酸、丁香酸、香草酸、阿魏酸、对-香豆酸、没食子酸、原儿茶酸和咖啡酸，许多泥炭沼泽中都有这些酚酸的存在[14]。研究证实，酚酸等有机质可以和铁形成较为稳定的配合物，使其可以在淡水运输过程中迁移更长的距离[15]。其中，具有儿茶酚或者没食子酰基结构的原儿茶酸、没食子酸以及咖啡酸可以和Fe（Ⅱ）形成较为稳定的络合物，使得Fe（Ⅱ）在极易被氧化的碱性条件下也可以保存较长时间。而咖啡酸、没食子酸、原儿茶酸以及龙胆酸还对Fe（Ⅲ）有着明显的还原作用，同样有助于这两种铁形态之间的平衡[16]。
植物或微生物分泌代谢物质对环境中其他植物或微生物体产生不利或有利的影响，这种作用称为化感作用。在化感作用过程中分泌的物质即被称为化感物质，自然界的化感物质种类非常丰富，主要包括酚酸类、苯醌类、倍半萜类、黄酮类等几大类物质[17]。迄今发现的化感物质几乎都是植物的次生代谢物质，分子量较小，结构简单，其中酚酸类物质是一类重要的次生代谢产物，也是研究较多，被证实是化感活性较强的一类物质[18]。酚酸具有一定生物毒性。目前对于酚酸抑藻的机制还不十分清楚，其抑制作用可能通过多种方式实现。研究表明，酚酸与蛋白质分子易遵循疏水键-氢键多点键合理论结合。在酚酸存在的情况下，藻细胞的胞外磷酸酶活性受到抑制，碱性磷酸酶活性的抑制使藻利用磷的能力下降。酚酸与细胞膜蛋白的结合，会破坏生物体细胞膜结构，使植物多酚物质进一步穿过细胞膜，进入细胞体内，从而改变微生物细胞酶活性，减少藻类对外源性蛋白质的利用，并通过对细胞外酶的抑制达到抑藻的目的[19]。另外，如果酚酸进入细胞体后，通过与金属离子发生络合反应，形成沉淀而破坏微生物的正常新陈代谢也是植物多酚抑藻的原因所在[20]。尽管酚酸存在生物毒性，但适量前提下，对藻类生长有积极作用[21]。泥炭源典型酚酸与铁的络合物是否对藻类利用铁有显著影响尚待进一步研究。因此，探究酚-铁配合物络合稳定性及其生物可利用性有助于进一步了解生物对铁的吸收，更好地理解全球铁碳耦合循环。
铜绿微囊藻（microcystic aeruginosa） 是中国湖泊、水库及其他水域生态系统水体富营养化蓝藻水华的代表性藻类。本文铜绿微囊藻为培养对象，利用泥炭源典型酚酸及泥炭溶解有机质（DOM）开展了一系列培养试验，以期了解泥炭沼泽源酚酸以及酚-铁络合物对铜绿微囊藻生长的影响。
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 实验材料
试验所用铜绿微囊藻藻源，由中国科学院水生生物研究所提供，采用BG-11培养基培养。
4种酚酸的配制：以1.7 g·L−1的浓度配制BG-11培养基，然后将对羟基苯甲酸、对香豆酸、水杨酸、咖啡酸加入，分别配制4份浓度为0.24 g·L−1的酚酸溶液。用0.22 μm滤膜在超净台中过滤，并用紫外光照射30 min，消除微生物的影响，现配现用。
藻种培养条件：实验前5天，将铜绿微囊藻进行扩大培养。光照强度4000 lx；光暗比24 h∶0 h；温度（25±1）°C；每天摇动培养瓶5次，使藻类生长进入对数生长期。进入对数增长期后，取铜绿微囊藻各300 mL加入到1 L锥形瓶，再加入BG-11培养基100 mL进行驯化培养。
1.2 实验设计
1.2.1 单一酚酸对铜绿微囊藻的抑制作用
由于对羟基苯甲酸和对香豆酸在泥炭中含量相对较高，水杨酸和咖啡酸和铁离子可以络合，实验选择这4种酚酸进行实验。
使用细胞计数仪确定当前藻液浓度，并根据藻液浓度取一定量的处于对数生长期的藻液加入250 mL锥形瓶内，其中分别添加稀释了不同倍数的酚酸溶液，最后用培养基补足，使得锥形瓶内的液体总体积达到150 mL。每个锥形瓶内藻的初始密度为105 cell·mL−1，酚酸的最终浓度梯度分别为0、10、20、40、60、80 mg·L−1，每组3个平行，置于光照培养箱内。培养温度为（20±1）℃，光照强度为4000 lx，24 h光照，每天震荡3—5次。
1.2.2 酚络合态铁对铜绿微囊藻生长的影响
选用水杨酸和咖啡酸与铁形成络合物，探究酚铁对藻类生长的影响。实验选择的酚酸浓度为5×10−5 mol·L−1，铁浓度为1×10−6 mol·L−1，在此条件下酚酸浓度为铁浓度的50倍，可以有效保护体系中的二价铁。此外，由于泥炭沼泽中也普遍存在草酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸等无苯环的小分子有机酸，所以实验选择草酸、柠檬酸、乙酸作为干扰物质加入到酚铁体系中进行藻类的培养实验。
藻类的培养实验分为10组，每组添加的物质如下：A.水杨酸+硫酸亚铁；B.咖啡酸+硫酸亚铁；C.水杨酸+草酸+硫酸亚铁；D.水杨酸+乙酸+硫酸亚铁；E.咖啡酸+草酸+硫酸亚铁；F.咖啡酸+乙酸+硫酸亚铁；G.水杨酸+柠檬酸+硫酸亚铁；H.咖啡酸+柠檬酸+硫酸亚铁；I.不添加酸和铁的对照组；J.只添加铁的对照组。
以上试验均为期15 d，每隔48 h取样1次，记录藻细胞数量的变化，以及藻存活情况的变化和pH值的变化。培养周期结束后分别取10 mL和5 mL样品，测量样品中叶绿素a的含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm（最大光能转化效率）。其中Fv/Fm常用来表征叶绿素PsⅡ（低铁环境藻类光系统Ⅱ）反应中心内禀光能转换效率，反映当时所有的PsⅡ反应中心均处于开放态时最大光量子产量。
1.2.3 生理指标的测定方法：
为测藻细胞存活率及藻细胞数量，使用5-CFDA染色，具体操作方法如下：
（1）用DMSO（二甲基亚砜）5-CFDA稀释至10 mmol·L−1。将99 μL已经配制好的BG-11培养基与1 μL的5-CFDA混合作为A液，摇晃10 s混匀；
（2）将50 μL样品与50 μL A液混匀，用移液枪至少吹打10次；
（3）在25℃条件下将上一步准备好的样品避光放置30 min；
（4）用移液枪将待测样品吹打10次或摇晃，使藻细胞分散，然后用移液枪取20 μL加入计数板内。在计数板插入仪器之前，稳定1 min，使样品在其中稳定下来。
将细胞染色后，使用细胞计数仪计数，并观察细胞的存活状态。
测量样品叶绿素a的含量：
（1）取藻液10 mL，4500 r·min-1离心15 min，去掉上层清液，将样品在4℃冰箱中放置1 d；
（2）取出后迅速加入5 mL的90%热乙醇（80℃）于80℃的热水浴萃取2 min，再用超声处理10 min，放在暗处萃取4 h后，用0.22 μm的滤头过滤。用酶标仪于波长665 nm和750 nm处测吸光值，然后滴加1滴1 mol·L−1的盐酸酸化，于波长665 nm和750 nm处再测吸光值。计算公式为：
Chla乙醇=27.9×[(E665−E750)−A665+A750)]×V乙醇/V样品 其中，Chla乙醇为热乙醇法测定的叶绿素a含量（μg·L−1）；E665是乙醇萃取液于波长665 nm的吸光值；E750是乙醇萃取液于波长750 nm的吸光值；A665为乙醇萃取液酸化后在665 nm处的吸光值；A750为乙醇萃取液在750 nm处的吸光值；V乙醇为乙醇萃取液的体积（mL），V样品为所取样品的体积（mL）。
抑制率计算公式：IR=（1-N/N0×100%）抑制率为负值则有促进效果，抑制率为正则抑制。
1.2.4 泥炭沼泽源酚络合态铁对铜绿微囊藻生长的影响
培养前准备：
（1）提取泥炭中的DOM；
（2）将样品通过H型阳离子柱交换柱，去除样品中存在的金属离子；然后将DOM样品按照<1 KDa，1—3 KDa，>3 KDa分成3份；
（3）将3份样品中加入FeSO4，待稳定一段时间后，取10 mL加入培养基中，加入后Fe的浓度为5×10−6 mol·L−1。
铜绿微囊藻培养实验分为5组，每组3份平行，每组添加的物质如下：A．无添加；B．Fe，浓度为5×10−6 mol·L−1；C．DOM-Fe（<1 KDa），Fe浓度为5×10−6 mol·L−1；D．DOM-Fe（1—3 KDa），Fe浓度为5×10−6 mol·L−1；E．DOM-Fe（>3 KDa），Fe浓度为5×10−6 mol·L−1。
实验均为期15 d，每隔48 h取样1次，记录藻细胞数量的变化，以及藻存活情况的变化。
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 不同酚酸影响微囊藻生长的浓度效应
在微囊藻培养体系中分别加入不同浓度四种酚酸溶液，经过14 d培养和检测，得到微囊藻-酚酸的生长曲线如图1所示。图1中A、B为不同浓度的对羟基苯甲酸和对香豆酸对微囊藻生长情况的影响。可以看出，当酚酸浓度为10 mg·L−1和20 mg·L−1时，微囊藻的生长速率和最终达到的终点浓度明显高于控制组（0）抑制率为-23.5%—18%。从微囊藻浓度上来看，当酚酸浓度为10 mg·L−1和20 mg·L−1时，生长情况比较接近，说明在此浓度下，这两种酚酸对微囊藻的生长有一定的刺激作用。在A、B组中当酚酸浓度超过20 mg·L−1时，藻液浓度和藻的生长速率明显低于控制组；当浓度增加到40 mg·L−1时，这两种酚酸对微囊藻的生长起到了明显的抑制作用，而对羟基苯甲酸的对微囊藻生长的抑制作用更加明显；浓度继续增加到60—80 mg·L−1时，微囊藻前4—5天略有增长，然后基本停止了增长，保持在3×106 cell·mL−1左右。对香豆酸60 mg·L−1组的藻数量略高于80 mg·L−1组。
在C组水杨酸-微囊藻的实验中，水杨酸浓度为10 mg·L−1时，增长的速度与控制组接近，在8—10 d快速增长后，藻数量和控制组趋于一致。而当浓度大于10 mg·L−1时，都出现了明显的抑藻效果，抑制率约为80%。
结合图2中存活率来看（从培养的第4天开始测微囊藻的存活率）当浓度为10 mg·L−1时，微囊藻的存活率都略低于控制组，差值在10%左右浮动，当浓度为20—40 mg·L−1，在开始计数时，藻类的存活率就已不同程度地低于控制组，并且A、C、D存活率在4—14 d整体处于下降的趋势，可以看出，水杨酸对微囊藻的抑制作用最强。
表1是各组样品的Fv/Fm，最大光能转化效率Fv/Fm常用来表征叶绿素PsII反应中心内禀光能转换效率，反映当时所有的PsII反应中心均处于开放态时最大光量子产量。
在非胁迫环境下，植物叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm变化极小，表现出稳定的特点，但在胁迫条件下，该参数明显下降[22]。Fv/Fm可作为植物受环境胁迫的响应指标[23]。控制组的Fv/Fm为0.308。一般情况下，微囊藻的Fv/Fm在0.3左右，当Fv/Fm过低表明藻类受到环境胁迫，PSII中心受到损伤进而降低光合作用效率。由表1可以看出，当水杨酸浓度大于20 mg·L−1时会对微囊藻的光合作用产生明显抑制，当各组酚酸浓度超过60 mg·L−1时，藻类基本停止了光合作用，这和前文中藻类的生物量变化和存活率相吻合。表2是各个组叶绿素含量的均值，数据表明：各组中相对低浓度的酚酸，不仅对藻类数量的增长有促进作用，也促进了叶绿素含量的增加。
表 1 铜绿微囊藻的Fv/FmTable 1. Fv/Fm of Microcystis aeruginosa对羟基苯甲酸P-hydroxybenzoic acid 对香豆酸P-coumaric acid 水杨酸Salicylic acid 咖啡酸Caffeic acid 010×10−620×10−640×10−660×10−680×10−6 0.3080.3100.2920.3020.0390.000 0.3080.3100.3140.3240.0490.000 0.3080.3090.0230.0140.0000.000 0.3080.3310.2760.3600.0380.000 注：0—80×10−6分别对应添加的4种酚酸浓度，表中数据是在微囊藻培养期结束时测得的Fv/Fm。 Note: 0—80×10−6 respectively correspond to the four added phenolic acid concentrations. The data in the table are the Fv/Fm measured at the end of the Microcystis culture period. | Show Table
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表 2 铜绿微囊藻叶绿素含量（g·L-1）Table 2. Chlorophyll content of Microcystis aeruginosa对羟基苯甲酸P-hydroxybenzoic acid 对香豆酸P-coumaric acid 水杨酸Salicylic acid 咖啡酸Caffeic acid 010×10−620×10−640×10−660×10−680×10−6 0.5681.0141.1380.7750.0000.000 0.5680.7370.8620.5680.0000.000 0.5680.7960.0090.0000.0000.000 0.5682.0932.2011.3590.0000.000 注：0—80×10−6分别对应添加的4种酚酸浓度，表中数据是微囊藻培养期结束时测得的叶绿素含量。 Note: 0—80×10−6 respectively correspond to the four phenolic acid concentrations added. The data in the table is the chlorophyll content measured at the end of the Microcystis culture period. | Show TableDownLoad:
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2.2 酚络合态铁的生物可利用性
根据上述试验结果可以得出，当这4种典型泥炭源酚酸的浓度达10 mg·L−1时，从生物量、存活率以及光合作用强度来说对微囊藻的生长没有明显抑制作用。普遍认为，藻类吸收Fe主要是离子形态，而不是有机络合态Fe[24]。目前，仅观察到在产生铁载体的微生物中存在铁载体复合物的吸收及其在细胞中的还原[25]。已有研究发现，有机络合态铁中铁的释放途径不同。其中包括简单的配体-金属平衡（Ligand-Metal balance），平衡在初级生产者消耗铁后发生变化，促进铁从络合物中分离。另一个途径是基于配体的降解，这也导致了Fe和配体的分离。第三种可能是通过有机态铁的还原，降低配体对铁的亲和力，并导致Fe的释放。这个过程可能是由于络合物的自还原/氧化而发生的，这意味着配体氧化同时也释放产生Fe[26]。尤其是光还原分解对铁的生物利用度有很大影响，这一释放铁途径被称为AHS（aquatic humic substances）机制[12]。
图3是加入不同酸和Fe2+的微囊藻生长曲线。施加和不加Fe2+的对照试验表明，在培养1—9 d，两组生长速度以及生物量大致相同。在第9天后，施加Fe2+组的生长速度放缓，最终的藻密度低于对照组。图3表明在没有配体存在的情况下，加入一定量的铁对微囊藻生长促进作用不明显。同时，观察发现，在藻类指数生长阶段出现了较高的pH值（高达10.5），这与二氧化碳生物需求增加有关。在指数生长结束和平台期开始后，pH值略下降。在藻类生长平缓或生长不良的样品中，pH值无显著变化，pH值大多保持在6—8。
能促进藻类生长的酚酸应当与三价铁有较高的亲和力，与二价铁有较低的亲和力[27]。试验表明，相对其他3种酚酸铁配合物体系，水杨酸铁不能有效地为微囊藻提供生物可利用性铁，这可能与水杨酸的稳定性较强有关[27]。对照表明，用咖啡酸处理的微囊藻生长良好，最高浓度达到2.19×107 cell·mL−1。这可能是咖啡酸中的儿茶酚基结构所引起的，并且有更高的氧化还原潜力，更容易将Fe从配合物中释放。Santana等 [28]的研究也证实了在生物条件下还原络合物的可能性。总体上，酚酸的加入提高了藻类对Fe的生物可利用率。
图2显示藻类存活率从第10天开始明显下降，藻类计数可能包括了死藻，因此选择第11天数据进行显著性分析。结果表明（表3），在0.05的置信水平下，咖啡酸的加入对微囊藻生长有显著促进作用，而水杨酸在0.05的置信水平下，对微囊藻生长无显著促进作用。
图 3 微囊藻生长曲线Figure 3. Microcystis growth curveA.水杨酸+硫酸亚铁 B.咖啡酸+硫酸亚铁 C.水杨酸+草酸+硫酸亚铁 D.水杨酸+乙酸+硫酸亚铁 E.咖啡酸+草酸+硫酸亚铁 F.咖啡酸+乙酸+硫酸亚铁 G.水杨酸+柠檬酸+硫酸亚铁 H.咖啡酸+柠檬酸+硫酸亚铁 1_3.不添加酸和铁的对照组 Fe1_3硫酸亚铁A. Salicylic acid+Ferrous sulfate B. Caffeic acid+Ferrous sulfate C. Salicylic acid+Oxalic acid+Ferrous sulfate D. Salicylic acid+Acetic acid+Ferrous sulfate E. Caffeic acid+Oxalic acid+Ferrous sulfate F. Caffeic acid+Acetic acid+Ferrous sulfate G. Salicylic acid+Citric acid+Ferrous sulfate H. Caffeic acid+Citric acid+Ferrous sulfate 1_3. Control group without acid and iron Fe1_3. Ferrous sulfate表 3 第11天不同试验组微囊藻浓度变化的相关性矩阵Table 3. Correlation matrix of changes in the concentration of Microcystis in different test groups on the 11th day1_3 Fe1_3 A B C D E F G H 1_3 1 0.963 0.971 −0.358 0.474 0.657 0.246 0.461 0.983 0.491 Fe1_3 0.963 1.00 1.000* −0.095 0.221 0.835 −0.022 0.682 0.996 0.707 A 0.971 1.000* 1.00 −0.126 0.251 0.818 0.008 0.659 0.999* 0.685 B −0.358 −0.095 −0.126 1.00 −0.992 0.468 −0.993 0.663 −0.179 0.637 C 0.474 0.221 0.251 −0.992 1.00 −0.352 0.970 −0.563 0.302 −0.534 D 0.657 0.835 0.818 0.468 −0.352 1.00 −0.569 0.972 0.785 0.979 E 0.246 −0.022 0.008 −0.993 0.970 −0.569 1.00 −0.746 0.062 −0.723 F 0.461 0.682 0.659 0.663 0.663 0.972 −0.746 1.00 0.618 0.999* G 0.983 0.996 0.999* −0.179 0.302 0.785 0.062 0.618 1.00 0.645 H 0.491 0.707 0.685 0.637 −0.534 0.979 −0.723 0.999* 0.645 1.00 注：*. 在 0.05 水平（双侧）上显著相关。Notes：*. Significant correlation at 0.05（bilateral） level. | Show TableDownLoad:
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2.3 泥炭沼泽源DOM-Fe的藻类可利用性
许多泥炭源有机质同时含有酚羟基和羧基，具有酚酸性质。但由于泥炭有机质组成复杂多样，现有技术尚不能有效分离不同性质有机化合物。因此，利用不同分子量段有机质与铁的络合物，开展藻类培养试验有助于客观评估泥炭源DOM-Fe的藻类可利用性。利用不同分子量段DOM-Fe，进行培养试验，铜绿微囊藻的生长情况如图4。表4 结果表明，在0.05 的置信水平下，不同组之间差异不具统计显著性，但图4 还是反映出有机态铁对藻类生长的促进趋势.
结果显示（图3和图4），不同分子量结合态Fe均促进了铜绿微囊藻的生长，但影响程度不同。添加Fe后，铜绿微囊藻的生物量和控制组相比均有增加，微囊藻生长得到促进，最终达到107 cell·mL−1。其中，微囊藻在7—11 d增长最快；其次，对比生长终点可以发现不同DOM-Fe促进效果存在差异：E组>D组>C组>B组>A组>无Fe组；第三，添加DOM显著促进了藻的生长。研究表明，相对于Fe3+，藻类更倾向于利用Fe2+[29]。这是由于具有一定还原能力的DOM可以减缓二价铁的氧化[30]，从而提高了藻类对铁的利用率。此外，不同分子量段DOM与Fe的络合稳定常数略有不同，较高分子量的DOM（>3 kD）与Fe的络合稳定常数较小[30]，在光照或者其他条件下容易发生解离，产生易被藻类利用的Fe。而泥炭源低分子量DOM（<1 KD）络合态铁，由于其络合稳定的常数相对较高，在培养体系中更加稳定，相对不易被藻类利用。
图 4 铜绿微囊藻生长曲线A.无添加 B.硫酸亚铁 C.DOM-Fe（<1KD ） D.DOM-Fe（1-3 KD） E.DOM-Fe（> 3KD）Figure 4. Microcystis aeruginosa growth curveA. No addition B. Ferrous sulfate C.DOM-Fe（<1KD） D.DOM-Fe（1-3KD） E.DOM-Fe（>3KD）表 4 第11天不同试验组铜绿微囊藻生长浓度变化的相关性矩阵Table 4. Correlation matrix of growth concentration changes of Microcystis aeruginosa in different test groups on the 11th dayA B C D E A 1 −.751 .350 −.167 .770 B −.751 1 −.881 .776 −.158 C .350 −.881 1 −.982 −.327 D −.167 .776 −.982 1 .500 E .770 −.158 −.327 .500 1 注：*. 在 0.05 水平（双侧）上显著相关. Notes：*. Significant correlation at 0.05（bilateral） level. | Show TableDownLoad:
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3. 结论（Conclusion）
（1）4种酚酸对藻类生长的影响均呈现“低促高抑”的规律。从藻类生物量和叶绿素含量来看，抑藻效果从高到低：水杨酸>对羟基苯甲酸>对香豆酸>咖啡酸；结合藻类的存活率，虽然低浓度酚酸刺激了藻类生物量的增长，但是也对藻类的生存产生了一定的负面影响：在添加10 mg·L−1酚酸的几组样品中，微囊藻的存活率都略低于控制组。
（2）添加酚酸的藻类样品中，当水杨酸浓度达到20 mg·L−1时，Fv/Fm明显降低（0.3降低到0.02左右），而其它3种酚酸浓度达到60 mg·L−1才出现抑制，说明水杨酸抑制作用最强。
（3）不同酚铁络合物的生物可利用性存在差异：相对咖啡酸和水杨酸，水杨酸络合态铁更难被藻类利用，除酚毒性效应外，还与其较高的络合稳定性有关。
（4）泥炭源不同分子段DOM-Fe对藻类生长的促进作用从高到低依次为：>3 KD，1—3 KD，<1 KD。高分子段DOM（>3 kD）与Fe的络合稳定常数最小，在光照或者其他条件下容易发生解离，更易释放Fe而被藻类利用；泥炭源低分子量DOM（<1 KD）络合态铁，因其络合稳定常数相对较高，相对不易被藻类利用。
致谢：感谢中国科学院水生生物研究所的大力支持。
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图 1 利用不同引物对masD（A）和bamA（B）降解基因进行扩增的产物琼脂糖电泳图
Figure 1. The agarose electrophoresis of the amplification products of masD(A)and bamA(B)degradation gene
图 2 引物浓度不同时的masD(A)和bamA(B)降解基因熔解曲线
Figure 2. Melting curves of masD(A)and bamA(B)degradation genes with different primer concentrations
图 3 不同退火温度条件下masD(A)和bamA(B)降解基因的熔解曲线
Figure 3. Melting curves of degraded genes masD(A)and bamA(B)under different annealing temperature conditions
图 4 masD(A)和bamA(B)降解基因的标准曲线
Figure 4. Standard curves of masD(A)and bamA(B)degradation genes
图 5 降解基因masD(A)和bamA(B)的扩增曲线
Figure 5. Amplification curves of degradation genes masD(A)and bamA(B)
表 1 文献报道的masD和bamA降解基因引物
Table 1. Primers of masD and bamA degradation genes reported in literature
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表 2 本文设计的扩增masD和bamA降解基因的荧光定量PCR引物
Table 2. Self-designed fluorescent quantitative PCR primers for masD and bamA degradation genes
引物Primers 引物序列Sequence (5’-3’) 扩增尺寸/ bpAmplicon size 退火温度/℃Annealing temperature masD-f2 GCTGAAGAAAGGCTGCGTTA 98 61 masD-r2 TGATACTTACGGGCAGACCA bamA-f2 TGATATGGTGAAGGCGGTGA 195 57 bamA-r2 GCCGAAACCATGTCGTTGAA
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表 3 引物浓度优化数据
Table 3. Primer concentration optimization data
引物终浓度/(µmol·L−1)Final primer concentration masD bamA Ct平均值Ct Mean Ct标准偏差Ct SD Ct平均值Ct Mean Ct标准偏差Ct SD 0.1 18.47 0.104 28.95 0.799 0.2 13.79 0.069 23.09 0.044 0.4 14.93 0.357 24.45 0.103
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表 4 退火温度优化数据
Table 4. Annealing temperature optimization data
退火温度/℃Annealing temperature masD bamA Ct平均值Ct Mean Ct标准偏差Ct SD Ct平均值Ct Mean Ct标准偏差Ct SD 52 18.95 0.079 27.98 0.619 57 19.42 0.133 25.11 0.105 61 18.91 0.036 26.10 0.153
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表 5 实时荧光定量PCR检测masD和bamA基因的组内重复性试验结果
Table 5. Intra- repeatability of masD and bamA genes detected by real-time fluorescence quantitative PCR
质粒标准品浓度/(copy·μL−1)Plasmid standard concentration masD bamA 组内变异系数Coefficient of variation within groups 组内变异系数Coefficient of variation within groups Ct`x±SD 变异系数/%Coefficient of variation Ct`x±SD 变异系数/%Coefficient of variation 1010 4.44 ±0.29 6.49% 109 8.52 ±0.02 0.19% 108 10.88 ±0.10 0.90% 14.36 ±0.06 0.45% 107 14.43 ±0.04 0.29% 17.21 ±0.11 0.64% 106 17.59 ±0.06 0.35% 21.07 ±0.05 0.26% 105 21.06 ±0.01 0.06% 26.32 ±0.15 0.56% 104 24.48 ±0.05 0.21%
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表 6 陕北油田区污染土壤中masD和bamA降解基因定量结果
Table 6. Quantitative results of masD and bamA degradation genes in five polluted soils in the northern of Shaanxi province
地区Regions 石油烃浓度/(mg·kg−1 土)Petroleum hydrocarbon concentrations masD 拷贝数/(copy·g−1土)masD copy numbers bamA 拷贝数/(copy·g−1土)bamA copy numbers 安塞Ansai 50200 7.52×103 1.00×104 志丹Zhidan 26633 4.40×103 3.05×104 延安Yanan 6661 4.65×102 5.05×104 绥德Suide 5533 2.69×102 3.60×105 定边Dingbian 146500 4.43×102 1.43×105
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