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石油是由烷烃、芳香烃以及少量非烃类物质（沥青和树脂等）组成的复杂混合物[1]。在石油的开采、运输、储存以及使用过程中不可避免的存在泄漏和原油落地等问题，对土壤生态环境造成不利影响[2-4]。土壤中蕴含的大量微生物通过产生对石油烃具有降解活性的酶以代谢石油烃，将其矿化为二氧化碳和水[5]，对于石油污染环境的修复发挥着重要作用。石油烃降解功能基因是指微生物产生的对于石油烃具有特定降解作用的酶编码基因[6]，通过对这些功能基因进行测定，可用于分析污染环境中石油烃降解菌的生物多样性，从而判定石油烃污染环境的生物修复潜势[7]。
在好氧条件下，包括芳香烃在内的许多复杂碳氢化合物较易被生物降解。然而，在非表层的石油污染土壤中，厌氧代谢是石油烃生物降解中的主要方式[8, 9]。在厌氧条件下，烷烃降解途径中琥珀酸合酶基因（masD）催化的富马酸加成反应和琥珀酸烷基代谢物的生成是烷烃降解的关键步骤[10]。而多数芳香族化合物（如甲苯、苯酚、甲酚等）在脱芳构化和裂解环之前，在微生物作用下生成中间体苯甲酰辅酶A，其中6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶基因（bamA）开环反应是苯甲酰辅酶A厌氧降解途径中的关键步骤[11]。因此，检测石油烃厌氧降解功能基因masD和bamA是研究土壤石油烃厌氧降解菌赋存情况、评价石油烃厌氧生物降解潜势的重要依据。
实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Quantitative PCR, qPCR）是目前广为采用的基因定量检测技术[12]。在PCR体系中加入荧光探针[13]或荧光染料[14]，随着扩增产物不断积累，相应的荧光信号也不断增强，通过监测荧光信号强度变化，结合标准曲线就可以定量分析未知样品中目的基因拷贝数[15-17]。在利用实时荧光定量PCR技术检测功能基因时，设计合适的扩增引物和确定退火温度是保证方法准确度和灵敏度的关键。
宋本如[18]建立了烷烃和芳烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法，方法可较好的用于两种基因的定量检测。但其扩增效率较低，仅为53.0%和63.6%。Aitken等[10]为研究不同条件下烷烃的活化机制，建立了扩增琥珀酸合酶基因（assA）的实时荧光定量PCR检测方法。Martijn等[19]建立了6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶基因（bamA）的实时荧光定量PCR检测方法，这些方法普遍存在扩增效率较低的问题。
本文通过设计引物及确定合适的退火温度和扩增程序，优化了烷烃和芳烃厌氧降解关键基因masD和bamA的定量检测方法。并利用建立的方法对陕北油井场区土壤中的masD和bamA基因进行了定量检测。研究对于评估污染土壤中石油烃的生物厌氧降解潜势具有重要的理论意义。
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iQ5实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad 公司）；ND-2000微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific）；Mastercycler ep梯度PCR（德国Eppendorf）；DYY-6D电泳仪（北京六一仪器厂）；GeiDoc XR+凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；HR/T16MM小型离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。
土壤基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，中国）；柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）；柱式DNA胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）；T载体PCR产物快速连接试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）；2×Taq PCR Master mix（KT201）（天根生化科技（北京）有限公司，中国）；FastStart Essential DNA Green Master（Roche，瑞士）；DH5α感受态细胞（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）。
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通过查阅文献，获得可扩增（1-甲基烷基）琥珀酸合酶基因（masD）和6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶基因（bamA）的引物序列。引物序列、扩增产物大小、退火温度见表1。
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按照土壤基因组DNA提取试剂盒说明程序提取采自陕北志丹县油井场区的土壤中总DNA，利用表1的masD和bamA引物扩增提取的DNA，PCR扩增体系（25 μL）为：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，10.0 μmol·L−1的上下游引物各0.5 μL，DNA模板3.0 μL，ddH2O 8.5 μL。升温程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火温度为表1中给出的50 ℃和58 ℃，保持30 s，72 ℃延伸30 s，设定35个循环；72 ℃延伸10 min。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的特异性。利用胶回收试剂盒回收特异性亮带，与T载体连接并克隆于DH5α感受态细胞。经过蓝白斑筛选后挑选白色菌落，置于20 mL LB培养基中[21]（10 g蛋白胨、10 g NaCl和5 g酵母浸粉加入超纯水溶解，定容至1 L），30 ℃培养12—16 h，以获得的菌液为模板，通过M13通用引物（M13F：GTAAAACGACGGCCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGACC）进行PCR扩增，利用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定其是否为阳性克隆。最后提取阳性克隆的重组质粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，获得特异性亮带的DNA序列并以此为靶序列进行实时荧光定量PCR引物的设计。
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利用Allele ID6软件根据实时荧光定量PCR引物设计原则，设计扩增masD和bamA基因的引物。具体设计原则包括：扩增产物长度在80—150 bp，最大不超过300 bp；上、下游引物Tm值相差较小，不超过2 ℃；避免模板二级结构，上、下游引物长度为18—24 bp；引物G+C含量在45%—55％之间；引物中碱基均匀并随机分布。遵循以上原则设计出实时荧光定量PCR引物masD-f2/masD-r2和bamA-f2/bamA-r2，见表2。
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实时荧光定量PCR（20 μL）反应体系：10.0 μL的FastStart Essential DNA Green Master，上、下游引物各0.4 μL，4.2 μL RNase-Free Water，5.0 μL DNA模板，同时设置一组只加RNase-Free Water的阴性对照。
为了确定最适引物浓度和退火温度，分别向各个体系中加入0.2、0.4、0.8 μL的实时荧光定量PCR引物，使体系内引物终浓度分别为0.1、0.2、0.4 μmol·L−1。引物的退火温度分别设置为52、57、61 ℃。实时荧光定量PCR的反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，退火温度保持15 s，72 ℃延伸10 s，共设40个循环。熔解曲线程序：以0.5 ℃·s−1由55 ℃升至95 ℃，每个温度下保持5 s。
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用微量分光光度计测定质粒DNA的浓度（ng·µL−1），根据下式换算为copy·µL−1。将已知浓度的质粒进行8次10倍梯度稀释[22]，即18 µL稀释液加入2 µL质粒稀释后，进行连续8次的梯度稀释。本研究中masD选取108—104 copy·µL−1质粒DNA共5个梯度进行标准曲线的绘制；bamA选取1010—105 copy·µL−1质粒DNA共6个梯度进行标准曲线的绘制。公式：每µL初始重组质粒中的基因绝对拷贝数(CN)：
其中，X为阳性质粒浓度（ng·µL−1）；T载体长为2773 bp；b为masD和bamA片段，分别长389 bp和354 bp；每对碱基的平均分子量是650 Da；阿弗加德罗常数为6.02×1023 mol−1。
利用循环阈值（Ct）与起始模板拷贝数的对数存在反比例线性关系建立标准曲线[23]，作为土壤样品中masD和bamA降解基因定量的依据。
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根据质粒DNA测序结果，利用Allele ID6软件自行设计了实时荧光定量PCR引物并优化退火温度，设计的荧光定量PCR引物序列、扩增产物大小、退火温度见表2。
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利用文献中的的masD和bamA降解基因引物（表1）对土壤总DNA进行扩增，扩增产物分别为389 bp（masD）和354 bp（bamA），产物片段较大（图1A、B）。而实时荧光定量PCR要求扩增产物不超过300 bp，本文根据质粒DNA的测序结果重新设计合成的masD和bamA降解基因的荧光定量PCR引物（表2），对masD和bamA降解基因扩增，所得产物大小为98 bp（masD）和195 bp（bamA）（图1C、D），且只有一条亮带，说明产物特异性良好，因此本文设计的引物和优化后的的反应条件与文献相比，更适合用于masD和bamA降解基因的定量检测。
在不同引物浓度下对石油烃降解基因masD和bamA进行扩增，所得实时荧光定量PCR熔解曲线如图2所示，纵坐标为荧光强度对温度的负倒数。当引物终浓度分别为0.1、0.2、0.4 μmol·L−1时，3组熔解曲线均未出现杂峰，说明设计的引物特异性好。以产生Ct值的平均值最小和Ct值标准偏差综合指数最小为依据对引物浓度进行选择。通过比较Ct值的平均值和Ct标准偏差值，当引物终浓度为0.2 μmol·L−1时，Ct值的平均值最小且Ct值标准偏差综合指数最小（表3）。最终确定引物最适浓度为0.2 μmol·L−1。
引物最适浓度确定为0.2 μmol·L−1时，石油烃厌氧关键降解基因masD和bamA在不同退火温度下的实时荧光定量PCR熔解曲线如图3所示。当退火温度分别为52、57、61 ℃时，masD和bamA降解基因的熔解曲线未出现非特异性扩增杂峰，引物显示出很高的特异性。最佳温度选择和最佳浓度选择依据的标准相同，通过比较Ct值的平均值和Ct标准偏差值，当masD基因退火温度为61 ℃、bamA基因退火温度为57 ℃时，Ct值的平均值最小且Ct值标准偏差综合指数最小。因此经优化后，最终确定体系中引物终浓度为0.2 μmol·L−1，引物masD-f/masD-r和bamA-f/bamA-r退火温度分别为61 ℃和57 ℃（表4）。
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如图4所示，masD降解基因的标准曲线是Ct=-3.383lgC+39.022，相关系数R2=1.000，扩增效率E=97.5%；bamA降解基因的标准曲线是Ct=-4.283lgC+50.520，相关系数R2=0.993，扩增效率E=71.2%。文献报道测定masD和bamA方法中的扩增效率分别为53.0%和63.6%[18]，该方法与文献报道方法相比，提高了7.6%—44.5%。本文通过设计扩增引物并优化扩增条件，使扩增效率显著提高，提高了方法的灵敏度和准确性。
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如图5所示，降解基因masD和bamA同一浓度梯度下的两条扩增曲线几乎重合，组内变异系数除bamA降解基因1010浓度梯度外均小于1%(表5)，说明利用所设计的引物对两种基因进行实时荧光定量PCR检测时，方法的重复性好，可保证不同样品间检测结果的可靠性和稳定性[24]。
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利用所建立的实时定量荧光PCR方法定量检测了陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA降解基因的拷贝数，结果如表6所示，5个地区石油污染土壤的masD和bamA降解基因拷贝数分别在2.69×102—7.52×103 copy·g−1 土及1.00×104—3.60×105 copy·g−1 土之间，土壤中bamA降解基因的拷贝数大于masD降解基因，两种基因拷贝数与土壤中石油烃含量无相关关系。在5个地区污染土壤中均可检测到两种控制石油烃厌氧降解的关键基因，说明在石油污染土壤中蕴含着可对石油烃进行厌氧降解代谢的微生物，有可能通过厌氧修复的方式对石油污染土壤进行修复治理。
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本论文通过设计检测石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的定量扩增引物，并优化反应条件和扩增程序，建立了利用实时荧光定量PCR技术对烷烃厌氧降解基因masD和芳香烃厌氧降解基因bamA进行定量检测的方法。与文献报道的方法相比，优化后的方法具有更好的重复性、灵敏度和扩增效率。利用建立的方法对陕北石油开采区污染土壤进行定量检测的结果表明，石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因，说明在石油污染土壤中蕴含着可对石油烃厌氧代谢的微生物，在对石油污染土壤进行修复时，有望通过厌氧生物降解的方式对污染土壤进行修复治理。
石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法与应用
Real-time quantitative PCR for determination of petroleum hydrocarbon anaerobic degradation key genes masD and bamA
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摘要: masD和bamA是控制石油烃厌氧降解的关键基因，利用实时荧光定量PCR技术检测masD和bamA基因具有简便快速和易操作等优点。但目前所用方法存在扩增效率低，方法灵敏度较差的问题。本文根据引物设计原则，利用Allele ID6软件重新设计了扩增masD和bamA的实时荧光定量PCR引物，将质粒DNA进行8次10倍梯度稀释后构建实时荧光定量PCR标准曲线。优化后的体系（20 μL）为：FastStart Essential DNA Green Master 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，RNase-Free Water 4.2 μL，5.0 μL DNA 模板。利用新设计的引物扩增masD和bamA基因的最适退火温度分别为61 ℃和57 ℃。优化后的检测方法扩增效率提高至97.5%和71.2%，比文献报道的方法提高了7.6%—44.5%，具有更高的重复性和灵敏度。利用设计的引物对陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA基因进行定量检测结果表明，石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因，所测定的土壤中bamA降解基因的拷贝数远高于masD降解基因。Abstract: The masD and bamA are key genes controlling the anaerobic degradation of petroleum hydrocarbons. Real-time quantitative PCR (qPCR) is the common gene detection method which has the advantages of simple, fast and easy operation. In this study, according to the primer design principle, the qPCR primers for amplifying masD and bamA were designed using Allele ID6 software. The obtained primers have uniform base distribution, appropriate amplification length, minor difference of Tm values between forward and reverse primers, as well as single peak in the fusion curve of amplification products, indicating that the primers had good specificity. The plasmid DNA was diluted 8 times with 10 fold gradient to construct the qPCR standard curve. 20 μL of optimized system included 10.0 μL of Faststart essential DNA green master, 4.2 μL RNase-Free Water, 5.0 μL DNA template, 0.4 μL of upstream and downstream primers, respectively. The optimum annealing temperatures for amplification of masD and bamA genes were 61 ℃ and 57 ℃, respectively. Compared with the literatures, the amplification efficiency of this optimized method enhanced by 7.6%—44.5%, indicating the method has higher repeatability and sensitivity. This optimized method can be used to quantitatively detect the masD and bamA genes in the petroleum-contaminated soils collected from five regions in northern of Shaanxi province of China. The results indicated that the anaerobic degradation genes of masD and bamA were ubiquitous in the petroleum-contaminated soils, and the gene copy numbers of bamA was much higher than that of masD in the oil-polluted soils.
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近年来，畜禽养殖过程中产生的大量粪污引起了严重的环境污染，已严重阻碍了畜禽养殖业的可持续发展[1-2]。未经处理的畜禽粪污富含致病菌且成分不稳定，在储存过程中会释放大量甲硫醇、氨气、硫化氢和丙烯醛等10多种恶臭有毒还原性气体，严重危及人畜健康[3-4]。然而，畜禽粪污作为一种富含氮、磷、钾等营养物质的有机固体废物，又是可用于促进农作物生长的重要肥料资源[5-6]。堆肥技术主要是通过微生物对畜禽粪污中不稳定的有机物质进行降解，生成稳定的腐殖质类物质，从而将其转化为高价值有机肥料，实现畜禽粪污的资源化利用[7-8]。畜禽粪污堆肥处理不仅可以解决环境污染问题，而且所得的肥料有助于改善土壤环境、提高土壤肥力，对实现畜禽业及农业可持续发展具有重要意义[9]。
好氧堆肥法可有效地脱臭及灭菌，有利于肥料的养分保持，是我国畜禽粪便处理的主要方式。然而，现有的好氧堆肥反应器在堆肥过程中存在非自动化、物料腐熟度差异大、控温困难、氮损失严重等缺陷，限制了好氧堆肥反应器的广泛应用[10-12]。因此，加快低成本、环保型、高效自动化堆肥反应器的开发，对促进畜禽粪污肥料化应用尤为重要。
本研究采用可调控式新型高温好氧堆肥器，以谷壳(粉)作为堆肥辅料，分析鸡粪谷壳在堆肥过程中的理化性质，并利用吸收塔将堆肥过程中释放的氨气转化为磷酸铵镁(MAP)，再添加至鸡粪谷壳有机肥料中，从而生产出优质商品有机缓释肥料。
1. 材料与方法
1.1 供试原料
鸡粪和谷壳原料化学特性见表1。堆肥菌种为自筛选获得的以嗜热好氧纤维素分解菌为主体的堆肥混合菌群，主要包括真菌、放线菌、耐热芽孢杆菌等菌种，活菌总数每克大于20×108个。
表 1 鸡粪和谷壳的化学特性Table 1. Chemical properties of chicken manure and rice chaff供试原料 碳/% 氮/% 碳氮比 含水量/% pH 鸡粪 18.87±0.95 1.51±0.14 12.49±0.32 40.34±1.24 8.82±0.52 谷壳 41.00±2.34 <0.30 >136 10.23±0.58 — | Show Table
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1.2 实验装置
新型高温好氧堆肥器主要由控制面板、发酵罐、空压机通风系统、气体吸收塔等4个部分组成(图1)。其中，控制面板用于控制堆肥器内物料的温度及发酵罐的搅拌频率，同时显示堆肥器湿度。发酵罐总容积设计为75 L，根据《搅拌与混合设备设计选用手册》[13]中反应罐有效容积计算，有效容积为50 L。发酵桶为圆柱体桶装结构(Ф60 cm×40 cm)，采用旋转式搅拌。空压机通风系统采用入功率0.37 W、输出转速5~25 r·min−1。气体吸收塔的容积为188 L，塔内装有Ф25 mm的塑料阶梯环填料，用于吸收堆肥发酵过程逸出的氨气，以镁盐沉淀剂转化为磷酸铵镁(MAP)。塔式发酵罐的容量为30 L，运行物料容量为20 L，罐体内部用聚氨酯作保温层，罐体采用全封闭式，发酵产生的废气经处理系统处理后，直接排除罐外。采用涡轮上翻搅拌及液压驱动，以保证罐体内腐熟物满载荷运行。
图 1 新型高温好氧堆肥器设计图及实体图Figure 1. Illustration and stereogram of new high-temperature aerobic composting device1.3 堆肥和取样
本实验采用鸡粪和谷壳粉按C/N=25混合，再用去离子水调节混合物料水分含量至60%，并搅拌混匀得堆肥物料，最后添加菌剂于堆肥反应器中进行发酵反应。塔式发酵罐进行的实验堆料高度定为50 cm，物料重20 kg，堆肥时间40 d。新型堆肥器处理物料50 kg，每48 h自动搅拌1次，每次5 min，总堆肥时间为40 d。采用五点取样法采集堆肥样品，分别采集了第0、1、2、5、7、9、11、34、39、40 d的样品，每份取样50 g装于自封袋中密封，并于4 ℃条件下保存。
1.4 肥料有效性的盆栽实验
1)鸡粪谷壳有机肥料有效性评估。取12个花盆(25 cm×20 cm)，分为空白组、化肥组(尿素46% TN)和鸡粪谷壳有机肥(以下简称“有机肥”)组，每组4盆，每盆约3 kg土壤，种植15粒空心菜种子。空白组不添加肥料；化肥组在土壤中添加3.88 g尿素(与有机肥组等量的含氮量计算得出)；有机肥组在土壤中添加鸡粪谷壳经新型堆肥器堆肥40 d后产生的100 g肥料(1.86 g TN、3.27 g TP、1.57 g TK)。花盆置于户外种植，每日浇水1次，每7 d进行1次大水量灌溉，发芽后栽培30 d采收。
2)MAP肥料有效性评估。采用盆栽实验评估新型堆肥系统回收氨气产生MAP的肥效性。盆栽实验设4个处理组：T1为对照组(不施肥)、T2为有机肥组、T3为有机肥+MAP组(有机肥和MAP各占50%)、T4为MAP组。各处理组的TN含量相同，每组3盆验，每盆约3 kg土壤，种植10粒小白菜种子。空白组不添加肥料；其他组每盆按1 kg土壤添加0.5 gTN计算添加肥料的量。待种子发芽后，每盆保留6~8株生长相近的幼苗进行后期分析。
1.5 分析方法
1)气味、色泽及形状评估。采用感官评估法，每次5人对样品进行样品气味、色泽及形状进行评估。其中，气味评估主要包含粪尿味、臭味较淡、臭味较浓、臭味强烈、无臭5个等级；色泽主要包含灰褐色、褐色、黑色3个等级；样品形状主要有块状、粒状及球状3个等级。
2)温度及pH测定。每天测定肥堆上、中、下3个层次的温度，计算平均值并记录室温；将新鲜堆肥样品与水按1:10(质量体积比)比例混合振荡2 h，上清液测定pH。
3)化学成分测定、种子发芽率测定和16sRNA序列分析。总碳、总氮、水分含量、钾含量测定方法参考文献[14]；可溶性糖测定参考文献[15]；种子发芽率(GI)的测定参考文献[16]；16sRNA序列分析参考文献[17]
2. 结果与讨论
2.1 堆肥过程物料表观变化
根据图2和表2可知，随着堆肥化的进程，堆体表观发生了显著的变化。堆体颜色由最初的灰褐色逐渐转变成黑褐色，由局部的黏稠状逐渐转变为疏松且具有一定结构的状态。此外，随着堆肥时间的延长，鸡粪有机肥料的臭气味逐渐消失，最后无臭味(表2)。该现象可能的原因主要是，微生物降解有机物产生的硫化物及叠氮化物等引起的，之后随着微生物逐渐死亡，使得臭气味消失。物料在反应器中连续发酵40 d后，堆体由灰褐色的带有粪尿臭的块状固体堆肥逐渐形成黑色的无臭味的圆球状(如图2)。在堆肥过程中，堆体表观状态的变化，符合典型腐熟堆肥的情况。
图 2 鸡粪谷壳物料在新型高温好氧堆肥器中堆肥过程中形貌图变化Figure 2. Changes of chicken manure and rice chaff morphology during composting in new high-temperature aerobic composting device表 2 物料堆肥期间表观状态的变化Table 2. Changes of apparent state of materials during composting堆肥时间/d 气味 色泽 形状 1 粪尿味 灰褐色 块状 2 臭味较淡 灰褐色 块状 5 臭味较浓 灰褐色 粒状 11 臭味强烈 褐色 粒状 34 臭味较浓 褐色 球状 39 臭味较淡 黑色 球状 40 无臭味 黑色 球状 | Show TableDownLoad:
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2.2 堆肥过程中物料温度、水分及pH的变化
温度是监测堆肥过程性能的主要参数之一。堆肥的热量是微生物通过降解有机物质，在促进自身生长的同时产生的。由图3(a)可知，新型堆肥器和塔式发酵罐中堆体的温度变化趋势主要分为3个阶段。第1阶段为快速升温期，由起始温度升至峰值温度。新型堆肥器和塔式发酵罐中堆体温度均从第5 d开始快速升温，分别在第9、11 d达到峰值温度，其峰值温度分别为63.2 ℃、52.8 ℃。在堆肥前期，好氧微生物可快速分解物料中的可降解有机物并释放能量，使得堆肥温度急剧升高[17-18]。新型堆肥器在堆肥过程中对物料进行了适当的滚筒式翻动，这有利于微生物的扩繁增殖和氧气的传输，从而提高好氧微生物的活性、物料中有机物的降解速率及能量的释放，因此，新型堆肥器中的堆体升温速率高于塔式发酵罐。第2阶段为缓慢降温期，即堆体中峰值温度缓慢下降至略高于室温的时期。新型堆肥器中堆体温度下降速度低于塔式发酵罐中的堆体。新型堆肥器和塔式发酵罐中堆体的降温期分别需要30及25 d左右。堆体中有机物含量不足，微生物活性及释放热量的下降，导致温度逐渐降低。此外，由于新型堆肥器具有较好的保温效果，因此，堆体温度下降速度较慢。新型堆肥器中堆体温度在第7~30 d保持在50 ℃以上，共23 d，符合高温堆肥的要求(GB7959-1987，粪便无害化卫生标准)。第3阶段为腐熟期，堆肥40 d后，新型堆肥器和塔式发酵罐中的堆体温度几乎与室温保持一致，无法继续往下降，因此，可以认定堆肥反应基本结束。
图 3 鸡粪谷壳粉堆肥过程中堆体温度、水分及pH变化Figure 3. Change of temperature (a), moisture (b) and pH (c) in chicken manure and rice chaff during composting由于水分含量的高低与微生物活性和温度密切相关，鸡粪谷壳粉堆肥过程保持在适当的水分含量，可有效提高堆肥的效果。堆肥的最佳初始含水量一般在55%~65%，此含水量能够为微生物提供合适的湿度环境[19-20]。因此，在本实验中，鸡粪谷壳的水分含量控制在60%左右。在鸡粪谷壳粉堆肥过程中，水分含量呈现逐渐下降的趋势。由图3(b)可知，堆肥11 d后，新型堆肥器中的物料水分含量由60%逐渐下降到50%，而塔式发酵罐中物料水分由60%下降到40%，经40 d堆肥之后分别降低至29.24%和26%。堆肥过程中物料水分下降的主要原因是，在微生物分解有机质、消耗水分及堆肥过程中，不间断的通气搅拌导致了水分的损失[21-22]。新型堆肥器中，物料中水分损失速率低于塔式发酵罐。这主要是由于：1)在新型堆肥器中散状的物料经过不间断的通气和搅拌结成圆球状阻碍了水分蒸发，而塔式发酵罐中的原料在堆肥过程中是处于散状的；2)在新型堆肥器是一个相对密闭的装置可有效防止水分蒸发，而塔式发酵罐是自然通风且比表面积较大，因而加速了水分的挥发。
由图3(c)可知，新型堆肥器中物料的pH由8.02逐渐增加至8.65，之后下降至8.51，呈现先上升后下降的趋势；而塔式发酵罐中的物料pH也呈现类似的变化，但变化幅度低于新型堆肥器。在新型堆肥器中，堆体温度较高，嗜热微生物代谢蛋白质，导致氨氮的不断产生，最终使得pH持续升高，并且高于塔式发酵罐中的物料pH[23]。而在后期，因物料结构过于致密导致孔隙度过小，不能为微生物提供足够的含氮有机物和O2，造成局部厌氧而导致有机酸积累，最终导致pH降低。
2.3 堆肥时间对种子发芽率(GI)的影响
种子发芽率是评价堆肥腐熟度和植物毒性的重要生物学指标。一般认为，当种子发芽率(GI)达到50%时，病原菌基本被消灭，肥料对植物无毒害影响；如果GI值超过80%则认为堆肥完全腐熟，对植物没有毒性[17]。据图4显示，随着堆肥化的进行，新型堆肥器和塔式发酵罐所得的肥料GI值呈现先增加后保持稳定的趋势。鸡粪谷壳在新型堆肥器处理11 d后，其GI值达到80%左右，可以认为堆肥完全腐熟，之后保持稳定。采用塔式发酵罐堆肥处理24 d后，GI值仅为60%左右，之后保持稳定。表3显示了鸡粪谷壳在新型堆肥器中处理40 d后所得有机肥的主要理化特性，结果显示，鸡粪谷壳有机肥中含有50.53%有机质、1.86%总氮(TN)、3.27%总磷(TP)及1.57%总钾(TK)，且无有害菌群，基本达到中华人民共和国农业行业有机肥料标准(NY525-2012)[14]。
图 4 鸡粪谷壳高温好氧堆肥过程中种子发芽率的变化Figure 4. Change of germination rate seed during high temperature aerobic composting of chicken manure and rice chaff物料在堆肥期间的种子发芽率表 3 鸡粪谷壳有机肥理化指标和国标的对比Table 3. Comparison of physicochemical indexes of chicken manure-rice chaff organic fertilizer with national standard对比项目 有机质/% TN/% TP/% TK/% TNPK/% 水分/% pH 鸡粪谷壳有机肥 50.53±0.12 1.86±0.31 3.27±0.53 1.57±0.12 6.71±0.85 29.24±0.44 8.46±0.11 国标(NY525-2012)[14] ≥45 — — — ≥5.0 ≤30 5.5~8.5 | Show TableDownLoad:
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2.4 堆肥过程中微生物多样性分析
通过高通量测序技术所扩增的16S rDNAV4区域特点，分析了鸡粪谷壳在新型堆肥器中高温好氧发酵过程中3个关键性温度阶段细菌群落多样性变化。图5(a)显示了样品升温期、高温期、降温期在属分类水平上最大丰度排名前10的菌种。在升温期，Olivibacter属、Sphingobacterium属的相对丰富度高于高温期和降温期，这2个菌属均具有降解芳香族化合物功能，可有效降解物料中的纤维素及半纤维素；在进入高温期，随着温度的升高和营养物质的消耗，大量嗜温细菌进入休眠或死亡状态，Oceanisphaera属、Ulvibacter属、Luteimonas属、Paenalcaligenes属等嗜热微生物的相对丰富值逐渐提高，有利于纤维素及木质素等有机物的进一步降解。放线菌的丰度增加为堆肥腐熟度的一个标志[24]，在降温期，Paucisalibacillus属、Sporosarcina属、Corynebacterium属于放线菌门的系列，其相对丰度值逐渐升高，这表明堆肥物料基本上已经腐熟。
在粪污有机肥发酵中，由于大肠杆菌及沙门氏菌易随流水污染水源，从而间接危害人群和畜禽的健康，因此被作为肥料的安全检测指标。由图5(b)可知，在高温阶段，大肠杆菌和沙门沙门氏菌数量最多；随着堆肥的进行，2种菌的数量快速下降。可见，在高温堆肥过程中，大肠杆菌和沙门氏菌逐渐被消灭。随着堆肥的进行，部分不适宜在堆肥中生存的菌群逐渐优胜劣汰；新型堆肥器在堆肥过程中可以杀灭有害微生物，达到畜禽粪污无害化处理，以保证有机肥料的安全性。
2.5 鸡粪谷壳有机肥的肥效
图6显示了空心菜经过鸡粪谷壳有机肥、化肥和对照盆栽实验30 d后的生长情况。可以看出，盆栽30 d后，有机肥组的株高明显高于化肥组和对照组。通过对空心菜地上可食部分鲜重的分析发现，对照组及化肥组的平均鲜重分别为2.52和3.26 g，而有机肥组空心菜的平均鲜重为4.36 g，分别比对照组和化肥组增加了42.20%和25.22%。通过图7可知，施加有机肥栽培的空心菜其鲜重和可溶性糖含量均明显高于空白对照组与化肥组，这表明有机肥的施加对空心菜的生长与养分积累起到了促进作用。
图 6 不同肥料条件栽培下30天空心菜生长情况对比Figure 6. Comparison of growth of water spinach for 30 d under different fertilizer conditions
图 7 不同肥料条件栽培下30天空心菜鲜重和可溶性糖含量的对比Figure 7. Comparison of fresh weight and soluble sugar content of water spinach for 30 d under different fertilizer conditions2.6 新型高温好氧堆肥器回收氨气产生MAP的肥效
图8显示了不同施肥条件下小白菜的生长情况，可见，新型高温好氧堆肥器回收氨气产生的MAP对盆栽小白菜株高和湿重的提高均有促进作用。结果显示，经过30 d的生长，小白菜的株高在T3组比T2组提高了120%；T4组的也比T2组的提高了40%左右。经过30 d的生长，T3组小白菜地上部分平均湿重为6.02 g，比T2组(4.18 g)和T4组(5.24 g)分别提高了44.02%和14.89%。MAP具有较好的缓释性，若用MAP代替部分氮肥，能有效减少土壤氮素淋洗的损失，从而减少温室气体(NH3)排放，并能起到有缓解土壤酸化等作用。有报道指出，MAP的氮素淋洗损失显著低于尿素，而且其N2O的释放量能够减少75%以上，可为植株的生长提供更为持久的有效养分[25-27]。
图 8 MAP对小白菜生长情况的影响Figure 8. Effect of magnesium ammonium phosphate (MAP) on growth of Chinese cabbage3. 结论
1)新型高温好氧堆肥装置具有智能化控制功能，同时并配置了磷酸盐吸收装置以回收堆肥过程中释放的氨气，形成的MAP可作为肥料。
2)鸡粪谷壳混合物(C/N=25)在新型堆肥器堆肥处理40 d后，可形成黑色无臭味、无有害菌群、圆球状的有机肥，其养分基本达到我国有机肥料标准(NY525-2012)。
3)鸡粪谷壳有机肥能够缓慢并稳定地释放氮磷钾等植物生长所需的营养元素，有利于空心菜对营养物的吸收；新型堆肥器回收氨气产生的MPA添加至鸡粪谷壳有机肥中，可进一步提高有机肥的整体肥效。
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图 1 利用不同引物对masD（A）和bamA（B）降解基因进行扩增的产物琼脂糖电泳图
Figure 1. The agarose electrophoresis of the amplification products of masD(A)and bamA(B)degradation gene
图 2 引物浓度不同时的masD(A)和bamA(B)降解基因熔解曲线
Figure 2. Melting curves of masD(A)and bamA(B)degradation genes with different primer concentrations
图 3 不同退火温度条件下masD(A)和bamA(B)降解基因的熔解曲线
Figure 3. Melting curves of degraded genes masD(A)and bamA(B)under different annealing temperature conditions
图 4 masD(A)和bamA(B)降解基因的标准曲线
Figure 4. Standard curves of masD(A)and bamA(B)degradation genes
图 5 降解基因masD(A)和bamA(B)的扩增曲线
Figure 5. Amplification curves of degradation genes masD(A)and bamA(B)
表 1 文献报道的masD和bamA降解基因引物
Table 1. Primers of masD and bamA degradation genes reported in literature
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表 2 本文设计的扩增masD和bamA降解基因的荧光定量PCR引物
Table 2. Self-designed fluorescent quantitative PCR primers for masD and bamA degradation genes
引物Primers 引物序列Sequence (5’-3’) 扩增尺寸/ bpAmplicon size 退火温度/℃Annealing temperature masD-f2 GCTGAAGAAAGGCTGCGTTA 98 61 masD-r2 TGATACTTACGGGCAGACCA bamA-f2 TGATATGGTGAAGGCGGTGA 195 57 bamA-r2 GCCGAAACCATGTCGTTGAA
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表 3 引物浓度优化数据
Table 3. Primer concentration optimization data
引物终浓度/(µmol·L−1)Final primer concentration masD bamA Ct平均值Ct Mean Ct标准偏差Ct SD Ct平均值Ct Mean Ct标准偏差Ct SD 0.1 18.47 0.104 28.95 0.799 0.2 13.79 0.069 23.09 0.044 0.4 14.93 0.357 24.45 0.103
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表 4 退火温度优化数据
Table 4. Annealing temperature optimization data
退火温度/℃Annealing temperature masD bamA Ct平均值Ct Mean Ct标准偏差Ct SD Ct平均值Ct Mean Ct标准偏差Ct SD 52 18.95 0.079 27.98 0.619 57 19.42 0.133 25.11 0.105 61 18.91 0.036 26.10 0.153
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表 5 实时荧光定量PCR检测masD和bamA基因的组内重复性试验结果
Table 5. Intra- repeatability of masD and bamA genes detected by real-time fluorescence quantitative PCR
质粒标准品浓度/(copy·μL−1)Plasmid standard concentration masD bamA 组内变异系数Coefficient of variation within groups 组内变异系数Coefficient of variation within groups Ct`x±SD 变异系数/%Coefficient of variation Ct`x±SD 变异系数/%Coefficient of variation 1010 4.44 ±0.29 6.49% 109 8.52 ±0.02 0.19% 108 10.88 ±0.10 0.90% 14.36 ±0.06 0.45% 107 14.43 ±0.04 0.29% 17.21 ±0.11 0.64% 106 17.59 ±0.06 0.35% 21.07 ±0.05 0.26% 105 21.06 ±0.01 0.06% 26.32 ±0.15 0.56% 104 24.48 ±0.05 0.21%
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表 6 陕北油田区污染土壤中masD和bamA降解基因定量结果
Table 6. Quantitative results of masD and bamA degradation genes in five polluted soils in the northern of Shaanxi province
地区Regions 石油烃浓度/(mg·kg−1 土)Petroleum hydrocarbon concentrations masD 拷贝数/(copy·g−1土)masD copy numbers bamA 拷贝数/(copy·g−1土)bamA copy numbers 安塞Ansai 50200 7.52×103 1.00×104 志丹Zhidan 26633 4.40×103 3.05×104 延安Yanan 6661 4.65×102 5.05×104 绥德Suide 5533 2.69×102 3.60×105 定边Dingbian 146500 4.43×102 1.43×105
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