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漆酶是一类含铜多酚氧化酶，广泛存在于真菌、细菌和部分植物中，其特征在于铜氧还原蛋白结构中含有4个铜离子[1]。依据电磁学特征，T1和T2型2个铜均为单电子受体，呈现顺磁性；而T3型铜含有2个铜离子，为双电子受体，呈现反磁性。T2和T3铜位点构成三核铜簇中心，与T1铜相互连通，参与漆酶的催化氧化过程。漆酶可以利用分子氧为唯一的电子受体，氧化各种酚类、芳香族化合物及其胺类化合物[2-3]。因此，漆酶是一种优良的绿色生物催化剂，广泛应用于生物传感、医药加工、有机合成、及废水处理等工程应用领域[4]。然而，游离漆酶对环境条件表现出极高的敏感性，这意味着漆酶在自然条件下(pH、温度等)的稳定性相对较差[5-6]。漆酶的低稳定性和高生产成本导致漆酶在实际工业应用中受到限制。而且，游离漆酶在复杂环境中极易变性，回收十分困难。提高漆酶的稳定性和可重复使用性是漆酶相关研究的一个重要方向[7]，因此，酶的固定化是备受关注的一项关键技术。
漆酶的固定化是将游离漆酶嫁接到不溶性载体基质上[8-10]。吸附法是指漆酶通过分子间作用力(离子键、氢键和范德华力等)吸附到载体的表面和孔隙内部[11]。吸附法制备条件相对简单，但吸附力相对较弱，易于漆酶脱落渗漏，从而降低固定化酶活性。吸附载体多样易得，如生物炭[6]、金属有机骨架材料[12]或蒙脱石[13]等。包埋法是指将漆酶固定在半透性聚合物膜或多面体结构中。常见的包埋材料包括天然凝胶(如明胶、壳聚糖珠等)以及合成凝胶(如聚丙烯酰胺和海藻酸盐珠等)，其中海藻酸盐珠由于其无毒温和的凝胶特性[14]最为常见。包埋法的特殊固定方式是漆酶被包裹在高聚物基质中，因此可以有效地防止漆酶的流失和机械损伤，使得包埋后的酶不易漏出，也不会引起酶结构的变化。提高了固定化酶的稳定性。包埋法形成的固定化酶颗粒较小，底物和产物容易扩散到颗粒内部，有利于酶促反应的进行。但可能会造成漆酶与底物的接触效率低和孔扩散受到限制。
碳基材料因其物理强度高和热稳定性优良等特点，被视为一种有前途的固定化载体。生物炭是通过限氧裂解生物质废弃物而来的一类富碳颗粒，被视为廉价的、且环境友好的炭质材料[15]。由于生物质的可再生性，大量低廉的生物质废弃物可为生物炭的规模化生产提供原料。LIU 等[16]针对生物炭的经济性进行了分析，指出水稻秸秆炭和甘蔗渣炭的价格分别为0.79美元·kg−1和0.93 美元·kg−1。据国际生物炭协会(International Biochar Initiative, IBI)调查，全球生物炭价格在0.08~13.48美元·kg−1[17]。碳纳米管(CNT)是同轴圆管状的石墨烯材料，具有超轻重量、高机械强度以及化学稳定性等独特的性质。它因能应用在高性能材料和电化学传感器等领域而备受关注[19]。只是CNT生产成本高，其价格从5美元·g−1到75美元·g−1不等[18]，这限制了CNT的技术应用。生物炭和CNT均具有较强的机械强度、可观的比表面积、以及易于功能化等优点，可作为固定化漆酶的碳基载体[20-22]。ZHANG 等[21]利用CNT固定化漆酶去除刚果红，研究发现漆酶-碳纳米管可在前30 min内快速吸附和降解刚果红。在漆酶-碳纳米管体系下，75%刚果红被去除时所需时间仅仅是CNT体系下的50%。
雌二醇(E2)属于典型的环境激素、广泛分布在水体环境中。它能通过干扰或破坏生物体内原生激素的合成、转运、分解等过程，使生物体无法正常代谢。据报道，E2在0.1ng·L−1 的质量浓度水平内就能表现出生物学效应[23]。E2在食物链中的积累可能会导致对人和动物的生长问题、生殖健康问题、低出生率及高肿瘤率等不良影响[23-24]。因此，利用固定化漆酶高效处理水体中E2的研究具有重要实际应用意义。本研究旨在比较性研究生物炭和CNT固定化漆酶的性能及去除水体E2的效果及机制，本研究选用木炭(WB)、竹炭(BB)和CNT作为碳基载体，通过吸附法和包埋法固定游离漆酶，对比游离漆酶和固定化漆酶的活性、稳定性、和可重复使用性；研究WB、BB和CNT固定化漆酶去除E2的效果，以及循环利用率；同时，探究金属离子浓度效应对于吸附法和包埋法固定化漆酶去除水体E2的影响。
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实验选取来源于杂色栓菌(Trametes versicolor)的真菌漆酶(Laccase, 500 U·g−1)、E2(17β-estradiol, >98%)、一水柠檬酸、二水柠檬酸钠、2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、WB(粒径<300目)、BB(粒径<300目)、CNT等购置于阿拉丁试剂(上海)有限公司。
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通过吸附法固定漆酶，以柠檬酸-柠檬酸钠为缓冲对作为背景液，配制50 mg·L−1漆酶溶液，分别将100 mL漆酶溶液与100 mg WB、BB、CNT进行充分混合，25 °C下于摇床中振荡12 h。待吸附固定后，进行固液分离，通过0.22 μm滤膜得到的三种固定化漆酶材料，放置于4 °C冰箱中待用。利用吸附法固载漆酶于WB上，简写为AWB-L(Adsorption Wood Biochar-Laccase)。其他依次简写为ABB-L和ACNT-L。
通过包埋法固定漆酶，将100 mL的3%氯化钙溶液与100 mg的WB、BB、CNT进行充分混合，超声30 min后，在25 °C保存24 h，使3种炭质材料与Ca2+充分进行接触。待炭质材料表面充分吸附Ca2+后，进行固液分离，通过0.22 μm滤膜得到3种炭质材料，在60 °C下烘干。其次将100 mL漆酶溶液(50 mg·L−1)与100 mg富Ca2+离子的3种炭质材料充分混合。在摇床中振荡8 h后，取20 mL质量分数0.5%的海藻酸钠溶液缓慢滴入漆酶-炭质材料的混合体系，置于摇床中继续振荡4 h。最后，当转化的海藻酸钙包埋住游离漆酶固载于3种炭质材料上，进行固液分离，通过0.22 μm滤膜获得3种包埋法固定化漆酶材料。放置于4 °C冰箱中待用。利用包埋法固载漆酶于WB简写为EWB-L(Embedding Wood Biochar-Laccase)，其他依次简写为EBB-L和ECNT-L。
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使用扫描电子显微镜(SEM, S-4800, Hitachi, Japan)表征固定化前后WB、BB、CNT的微观尺度形貌结构。通过傅里叶红外光谱(FTIR, Varian 640-IR, USA)在400~4000 cm−1内分析固定化前后WB、BB、CNT的官能团。
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ABTS向ABTS+自由基的转化用于测定漆酶的活性。一个游离酶活性单位定义为每分钟催化 1 μmol ABTS 所需的游离酶量。具体而言，取0.3 mL 1 mmol·L−1 ABTS与2.7 mL漆酶溶液充分混合，使用紫外-可见分光光度计(Ultraviolet spectrophotometer, UV-Vis)于420 nm 处测量其吸光度的增加量，2 min内的吸光度变化，每隔15 s记录1次。根据测定的吸光度，计算漆酶的酶活，计算公式如式(1)所示。
其中：K代表酶活，U·g−1；∆A为ABTS+在一段时间内的吸光度变化值；Vt为反应体系的总体积，L；ε为表ABTS+的摩尔消光系数，36 000 L·(mol·cm)−1；∆T 为反应时间，min；m 为酶的质量，g。
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在25 °C下，将50 mg·L−1游离漆酶和40 mg固定化漆酶分别放入40 mL柠檬酸-柠檬酸钠溶液(pH=5)中，并分别在24、48、72、96、120 h时，测定其剩余活性。研究了固定化漆酶在25 °C下长达25 d的储存稳定性，并以120 h为间隔测定剩余活性。通过ABTS作为底物，研究了固定化漆酶的重复使用性，进行了5个重复循环。
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在pH=5条件下，将40 mg WB、BB、CNT以及固定化材料加入至40 mL的E2(50 mg·L−1)溶液中，利用0.22 μm过滤器分别在20、40、60、90、120、240、480 min从反应体系中取出0.5 mL液体置于2 mL玻璃小瓶，并加入0.5 mL甲醇溶液淬灭漆酶反应活性。所有样品均一式三份，利用高效液相色谱仪(HPLC, 安捷伦1260)，定量液相剩余E2的质量浓度。反应480 min后，进行固液分离，重新加入40 mL E2(50 mg·L−1)溶液。该步骤循环重复5次，每次所取出的液体经过0.22 μm的过滤器制样、保存。所有样品均一式三份，利用HPLC定定液相剩余E2的质量浓度。
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以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲背景液(pH=5)，分别配制0.5、1.0、5.0 mmol·L−1的硝酸钾(KNO3)和一水硝酸锰(MnNO3()2·H2O)。在K+和Mn2+离子存在条件下，分别利用40 mg吸附和包埋法固定化漆酶降解 40 mL质量浓度为 50 mg·L−1 E2溶液。分别在20、40、60、90、120、240、480 min进行取样。所有样品均一式三份，利用HPLC测定液相剩余E2的质量浓度。
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由于游离漆酶的活性受pH影响极大，因此测定了不同pH条件下的漆酶活性。如图1(a)所示，在pH=2~8的条件下，游离漆酶的活性分别为303.75、381.05、384.65、413.58、119.31、36.24、5.80 U·g−1。pH的变化可以决定漆酶中氨基酸的电离状态，从而影响其结构和活性[4]。游离漆酶的活性随着pH的提高，逐渐增加。在pH=5时游离漆酶活性最佳。随着pH继续升高，漆酶的活性出现急剧下降现象。当pH=7时，游离漆酶的活性降低至36.24 U·g−1，仅为最高酶活的8.76%。在碱性水体环境中漆酶完全丧失了其活性。这可能是由于氢氧根阴离子与漆酶活性位点的 T2/T3 铜结合而引起的抑制，从而中断了从 T1 到 T2/T3 铜位点的内部电子转移[25-26]。漆酶的 T1/T2 和T3活性位点协同作用，通过传递电子来促进漆酶催化氧化反应的进行。这些活性位点在固定化漆酶结构中保持了其原有的生物活性，使得固定化的漆酶可以有效地催化氧化反应。此外，在pH =5时游离漆酶储存的稳定性。结果表明：24、48、72、96、120 h时，游离漆酶剩余的相对活性分别为70.40%、72.78%、61.92%、55.85%、46.78%(图1(b))。可以发现，随着时间的增加，游离漆酶的活性逐渐下降。这可能是因为在长时间静置的游离漆酶中，酶活性位点的构象变化导致酶活性降低[27-28]。游离漆酶作为一种水溶性蛋白，难以在有机废水处理过程中进行回收，造成浪费。而且，漆酶的稳定性弱和成本高限制了其在环境修复领域的应用。因此，研究适当的固定化方法将游离漆酶固载，提高漆酶的循环利用率以及固定化漆酶的功能效应非常必要。
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通过吸附和包埋方式将漆酶固定在WB、BB和CNT上，利用扫描电镜观察固定前后的微观形态结构。如图2(a)~(c)所示，WB、BB结构表面存有排列有序的孔状结构，这是由于木质纤维素在炭化过程中炭相的转化所致。而CNT有着细长的管状结构并容易团聚成不规则的球体。图2(d)~(i)是固化漆酶后的扫描电镜图，在图中没有观察到表面形貌的显着变化。这可能是由于漆酶蛋白(60~90 kDa)的小尺寸相当于小于 5 nm 的粒径。这个尺寸很难被放大 10 μm 的显微照片捕捉到[21,29]。 然而，在酶固定化后，AWB-L、EWB-L等表面似乎更光滑，这可能是由于WB、BB、和CNT表面有酶涂层所致[22]。有研究表明，利用磁性生物炭固定漆酶后，生物炭的表面因有酶涂层变得更为光滑[30]。
本研究利用FTIR分析了漆酶固定化前后WB、BB和CNT的结构变化。如图3所示，在3 420~3 450 cm−1处观察到的峰为—OH 伸缩振动[29]。2 924 cm−1处的峰归因于烷基引起的不对称 C—H 和对称 C—H 振动[31]。1 626~1 641 cm−1处的吸收峰可能与生物炭中羧基的C＝O键和漆酶蛋白中存在的酰胺键的伸缩振动有关[32]。1 148 cm−1处的峰对应于二级酰胺结构的C—O—C伸缩振动[33]。1 050 cm−1和1 071 cm−1处的峰代表生物炭中芳环的 C—H 键[34]。而 1 026 cm−1处则代表着 C—O 基团的伸缩振动[22,34]。与WB和BB相比，CNT固载漆酶后的以上官能团的振动峰均有所增强，这是由于漆酶负载后增加了官能团的在CNT上的量。例如， WB和BB负载漆酶后，—OH峰强有所降低；而CNT负载漆酶后—OH峰则增强，CNT固载漆酶的峰强增加。包埋法负载在WB上的C＝O和C—H官能团有明显增加。另外，780 cm−1附近的峰变多，进一步证明漆酶成功固定在WB和BB和CNT上[35]。
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漆酶的稳定性是决定生物催化剂稳健性的重要因素，可通过探究固漆酶固定化后酶活性的时间变化，探究不同固定方式的漆酶的稳定性。本研究在25 °C下储存120 h来评估固定化漆酶的稳定性，每24 h测定其相对剩余活性。吸附法固定化漆酶的稳定性如图4(a)所示。可见，120 h后AWB-L和ABB-L的活性仍分别保留了85.82%和88.51%剩余活性，而ACNT-L更加表现出其优越的固载性能，可保留96.60%固载的漆酶。此前研究报道固定在磁性纳米颗粒上的漆酶能保存71.2%的活性[36]，而固定在氨基功能化纳米颗粒上的漆酶仅表现出64.7%的活性[37]。经过包埋法固定化后(图4(c))，EWB-L、EBB-L和ECNT-L的相对剩余活性在120 h后分别为82.02%、85.07%和94.54%。这表现出在WB、BB和CNT上包埋法极大提高了游离漆酶的稳定性，防止了漆酶在水相中流失。碳基材料固定化漆酶的优越性可能关乎其刚性多孔结构，能起到高效贮存漆酶作用。
另一方面，漆酶固定后，它的重复使用性也是决定生物催化系统在工业规模上的潜在应用的重要参数。本研究以ABTS作为底物，在5次循环过程中检查固定化漆酶的可重复使用性。研究结果表明，吸附法固定化漆酶经历 5次循环后(图4(b))，AWB-L和ABB-L的剩余酶活 仅剩初始酶活的27.81%和26.62%；而ACNT-L也仅存37.99%的剩余活性。这可能是由于吸附负载过程漆酶与载体活性位点之间的结合力不强。经过多次反应和水洗后，大量漆酶从固定载体表面脱落，导致相对酶活性下降[38]。相比于吸附法，包埋法的损失率要小于吸附法的损失率。因为包埋法固定化漆酶主要利用了聚合物和载体共同包裹住漆酶，而不是利用吸附的弱作用力固定化漆酶[39]，此结果与其他研究研究结果类似。WANG 等[6]利用十六烷基三甲基溴化铵-氢氧化钾(CTAB-KOH)改性生物炭，并通过吸附法固定漆酶，他们发现固定化漆酶在6次循环后失去了约 55% 的活性。而另一项研究中，将漆酶吸附固定在稻草生物炭上，其固定化率达到66%，而且固定化酶在经过6次循环的稳定性操作，能够保留40%的初始活性[40]。ZHANG 等[22]通过吸附、沉淀和交联将漆酶稳定地固定在纳米磁性生物炭(L-MBC)上，固定量达到2.25 U·mg−1，经过30 d储存，L-MBC活性还保持在64.40%。由此可知，吸附法虽然操作方法易行，但其固定化漆酶的稳定性和可重复使用性相对较弱。包埋法固定化漆酶不仅更有利于酶的稳定性，而且提高了固定化漆酶的重复利用率，从而有效降低漆酶在污水处理中的应用成本。
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通过吸附法和包埋法使漆酶固定在WB、BB和CNT上，从而研究固定化漆酶对E2的去除。经过8 h反应，3种碳基材料对E2的吸附量遵循CNT>BB>WB，其吸附量分别达到17.23、13.01和11.32 mg·L−1。这可能是由于CNT的比表面积大所致[41]。如图5(a)所示，AWB-L的E2去除量增加到21.46 mg·L−1；ABB-L的E2去除量增加到23.83 mg·L−1。ACNT-L对E2去除最高，在8 h内对于E2去除量为27.38 mg·L−1。另外，包埋法固定化漆酶对于E2的去除效果如图5c。在8 h内，EWB-L对E2去除量增加到42.04 mg·L−1；EBB-L对E2去除量增加到43.60 mg·L−1；ECNT-L对于E2去除量达到43.93 mg·L−1。固定化漆酶对水中E2的去除效果更好，是因为固定化漆酶不仅可以吸附水体E2，而且可以通过漆酶的催化氧化降解E2[42]。另外，有研究表明，包埋法固定化漆酶去除E2的效果显著高于吸附法，可能由于漆酶吸附于载体的作用力较弱，循环利用过程中漆酶也易于再次脱落，漆酶的负载率会不断降低。对于包埋法而言，由于酶蛋白分子相对较大，漆酶易于被限制在包埋空间内，且漆酶的分子结构也不会发生改变[43-44]。而分子质量较小的污染物则可以畅通进入漆酶空间内, 当污染物分子接近该空间时, 被固定化的漆酶将参与污染物的催化氧化过程[14]。SHAO等[45]通过空心介孔碳纳米球(HMCs)固定了游离的漆酶, 发现漆酶的固定化效果极为稳定, HMCs材料上漆酶的最大载量达到835 mg·g−1。固定化漆酶对盐酸四环素和盐酸环丙沙星的去除率分别为99.40%和96.90%。
对比5个连续批次(每批次8 h)循环对E2(50 mg·L−1)的去除量的变化。如图5(b)所示， 经过5次循环后，吸附法制备的3种固定化漆酶对E2的去除率逐渐降低。AWB-L对E2的去除率由39.66%降低至15.38%；对于ABB-L，5次循环后E2的去除率也由47.44%降至19.76%；5次循环后ACNT-L对E2的去除率由54.50%降低至34.84%。这是因为固定在载体上的漆酶发生脱落，或漆酶结构发生变化导致酶活性下降，进而影响了E2的去除效率[46]。包埋法固定化漆酶去除E2的循环实验结果如图5(d)所示，对于EWB-L，5次循环后E2的去除率由88.84%降低至56.06%；EBB-L对E2的去除率由86.66%降低至57.08%；对于ECNT-L，5次循环后E2的去除率由86.76%降低至59.66%。经过多次循环后，利用包埋法固定化漆酶的去除能力也会随着循环次数的增加而逐渐减弱，因为经过多次使用，导致包埋结构遭到破坏，从而导漆酶脱落所致[47]。在5次循环后，利用包埋法固定化漆酶去除E2效果高于吸附法，可能归因于藻酸盐基质提供的保护性微环境[48]。相对于吸附法，包埋法固定漆酶对E2的效果更好，循环使用的去除率也较高。其中，吸附法WB和BB固定漆酶对E2的去除率要低于CNT固定漆酶的去除率。然而，包埋法CNT与生物炭固载漆酶对E2的去除率和循环效率都很相似，因此，包埋法生物炭固载漆酶可以代替高成本的CNT固载漆酶，也能达到相同的去除E2的效果。
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漆酶的活性通常会受到废水或者其他环境中存在的金属离子的影响，随金属离子和酶的不同而变化。例如，Mn2+可刺激肉孢子丝菌中的漆酶但抑制来自Leptographium qinlingensis的漆酶[49,50]。所以为了进一步了解固定化漆酶的实际应用效果，考察2种金属离子(K+和Mn2+)对固定化漆酶去除E2的影响。
1) K+离子的影响。图6描述在0.5、1和5 mmol·L−1 K+浓度下，漆酶固定化前后炭质材料去除E2随时间变化的关系曲线。研究发现在前100 min内E2的质量浓度迅速下降，随后保持一定平衡。随着K+浓度由0.5 mmol·L−1增加到1 mmol·L−1时，固定化漆酶对于E2的去除无太大的变化现象。但是当K+浓度达到5 mmol·L−1时，E2的去除率明显降低。金属离子的抑制作用主要是通过干扰漆酶催化反应过程中电子传递以及可能影响漆酶的活性，从而导致固定化漆酶对E2的去除量降低。同样冯义平等[51]发现Na+、K+、Cd2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+ 在10.0 mmol·L−1浓度水平下显著抑制漆酶活性。这些金属离子能够与漆酶结构中游离的半胱氨酸结合，形成失活的蛋白加合物，并因此导致漆酶失活。从而影响漆酶催化去除溴代阻燃剂四溴双酚 A。另外发现在K+离子影响下，包埋法固定化漆酶去除E2受到抑制的效果低于吸附法。一方面可能由于漆酶对载体的吸附亲和力差，导致容易脱落[52]；另一方面可能由于藻酸盐包埋保护漆酶一定程度上免受溶液中金属离子的影响[53]。
2) Mn2+的影响。将Mn2+与固定化后的漆酶在E2溶液中共同反应8 h后(图7)。当Mn2+浓度由0.5 mmol·L−1增加到1 mmol·L−1时，对于E2的去除几乎没有影响。使用吸附法和包埋法固定化漆酶后，E2的剩余质量浓度分别为28 mg·L−1和10 mg·L−1。然而当Mn2+浓度达到5 mmol·L−1时，对E2的去除出现抑制作用。这可能是由于水溶液中的漆酶带负电荷，与金属阳离子之间由于静电引力而吸附在一起，而且金属阳离子价态越高，相互之间静电力作用越强，从而导致漆酶的活性降低[54]。WAGNER 等[55]研究在pH=5.0、Mn2+浓度高达1.0 mmol·L−1的情况下，对苯酚的去除有明显抑制效果。有研究[56]表明，包括Mn(II)在内的某些金属离子与含氧配体相互作用，例如存在于酶上的羧基。这些相互作用可能会改变酶对底物的亲和力。
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通过吸附法和包埋法制备WB、BB和CNT的固定化漆酶，系统地探究了固定化漆酶的活性和稳定性，固定化漆酶去除E2效果以及金属离子对去除效果的影响，为固定化漆酶技术在绿色化学应用研究提供了新的视角。得出如下结论。
1)对比WB、BB、CNT 3种炭质载体吸附法固定漆酶，发现CNT固定漆酶的稳定性、可重复使用性以及对E2的去除效果都高于WB和BB，这可能是因为CNT具有丰富的纳米孔隙结构所致。
2)包埋法固定的漆酶的稳定性、可重复使用性和E2的去除效果均高于吸附法固定化漆酶。WB、BB、CNT 3种炭质载体包埋法固定漆酶的稳定性、可重复使用性、及对E2去除效率差别不大。因此，生物炭可以作为替代CNT的炭质载体通过包埋法固定游离漆酶，减少固定化成本。
3)固定化漆酶的活性和去除E2的效率受金属离子种类的影响，K+和Mn2+离子的抑制固定化漆酶的活性和E2的去除效率。
生物炭和碳纳米管固定化漆酶去除水体雌二醇
Removal of β-estradiol in wastewater using laccase immobilized by biochar and carbon nano tube
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摘要: 漆酶是一类具有高效的催化氧化能力的含铜多酚的氧化酶，而固定化漆酶技术在有机废水处理领域受到了越来越多的关注。通过比较吸附法和包埋法利用木炭(WB)、竹炭(BB)和碳纳米管(CNT)固定游离漆酶去除水体雌二醇(E2)。在25 °C 、pH=5条件下，固定化漆酶经120 h 贮存仍保留80%的活性。经过5次循环研究，固载的漆酶仍保留了27%~58%的剩余活性。结合扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱，证实了漆酶成功地负载在碳基材料上。仅在 8 h内，50 mg·L−1 E2通过吸附法制备的WB、BB、CNT固定化漆酶去除了42.92%、47.66%、43.92%，而包埋法制备的WB、BB、CNT固定化漆酶分别去除84.08%、87.20%、87.86%。结果表明，包埋法固定化漆酶对E2的去除效率更优，这是由于包埋固载在生物炭和CNT的漆酶更为稳定。此外，K+和Mn2+离子可能通过干扰漆酶的电子传递过程影响漆酶的活性，从而抑制E2的去除。本研究旨在为固定化漆酶在有机废水处理的实际应用提供指导。Abstract: Laccase is a class of Cu-containing polyphenol oxidase with high catalytic oxidation ability. The immobilized laccase technique has attracted an increasing attention in organic wastewater treatment. In this study, wood- and bamboo-derived biochars (WB and BB) or carbon nano tube (CNT) were used to immobilize laccase by the adsorption and embedding methods for the removal of β-estradiol (E2) in aqueous environment. At 25 °C and pH=5, 80% activity of the immobilized laccase on WB, BB, and CNT was preserved after 120 h storage. After 5 cycles, the residual activity of the immobilized laccase was 27%~58%. Combined with scanning electron microscopy and Fourier transform infrared spectroscopy, it was confirmed that laccase was successfully loaded on carbon-based materials. Within only 8 h, 42.92%, 47.66%, and 43.92% of 50 mg·L−1 E2 were removed by WB-, BB-, and CNT-immobilized laccases using the adsorption method, while 84.08%, 87.2%, and 87.86% of 50 mg·L−1 E2 were removed by WB-, BB-, and CNT-immobilized laccases using the embedding method. The results showed that the immobilized laccase using the embedding method had a better removal efficiency for E2 due to its stronger stability onto biochars and CNT. In addition, K+ and Mn2+ ions could interfere with electron transfer of laccases, then affect the activity of laccases, diminish E2 removal. The aim of this work can provide a guidance for designing immobilized laccase for organic wastewater treatment.
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Key words:
- biochars /
- CNT /
- immobilized laccase /
- β-estradiol /
- metal ions
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在我国21世纪初，城市生活垃圾普遍采用填埋的方式进行处置[1]，据2021年中华人民共和国统计局报告显示，截至2020年，我国卫生填埋场共644座。填埋场中的生活垃圾随着时间的推移，趋于稳定并产生大量的老龄垃圾渗滤液。与新鲜垃圾渗滤液相比，老龄垃圾渗滤液具有高氨氮、低C/N、可生化性差和污染物成分更加复杂且毒性强等特点[2-3]。
传统脱氮工艺由于存在能耗和运行成本高的缺点。因此，对于低C/N比和高氨氮的老龄垃圾渗滤液而言，目前亟需探究一种经济且高效的脱氮方法。厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, Anammox)是一种新型高效的生物脱氮技术，与传统脱氮技术相比，该技术具备无需曝气、无需外加碳源、污泥产量少、温室气体排放少和运行成本低等优点。该技术是利用厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidation bacteria, AnAOB)在缺氧或者厌氧环境条件下，利用NO2−-N为电子受体，以NH4+-N为电子供体，最后将两者转化成N2的过程[4-5]。目前由于AnAOB生长速度缓慢，且倍增周期较长，导致Anammox工艺在工程运用中存在启动时间长，AnAOB富集丰度低等难题。目前报道文献中，王朝朝等[6]利用Anammox絮状污泥和厌氧颗粒污泥在UASB反应器中经过140 d成功培养出Anammox颗粒污泥，TN去除负荷为0.26 kg·(m3·d)−1；季军远等[7]以絮状厌氧消化污泥为接种污泥，经过250 d成功启动有效体积为1.4 L的Anammox-UASBA反应器；Wang等[8]将Anammox颗粒污泥接种于UASB反应器，经过178 d启动及稳定运行，NLR高达8.25 kg·(m3·d)−1；李亦舒等[9]探究低DO条件下对Anammox工艺脱氮影响，富集的AnAOB丰度仅为14.3%。
基于此，本研究针对短程硝化处理后的老龄垃圾渗滤液，采用UASB反应器快速启动Anammox用于进一步深度脱氮，分析启动过程中接种污泥形貌变化、微生物群落结构变化和脱氮性能。为此，探究Anammox最佳启动条件，并采用厌氧硝化污泥为接种污泥，在30 L的UASB反应器中，仅用60 d成功启动Anammox。启动成功后以短程硝化处理后的老龄垃圾渗滤液为进水，探究该系统脱氮性能。实现Anammox反应器稳定运行和较强的脱氮性能，为其在老龄垃圾渗滤液工程运用中提供科学的技术参考。
1. 材料与方法
1.1 实验装置
本研究单因素批量实验采用4至6个用锡箔纸包裹的250 mL的具塞锥形瓶，Anammox启动和实际废水脱氮实验在UASB反应器中进行，实验装置如图1所示。该反应器内径为20 cm，高100 cm，有效体积为30 L，反应器内投加Φ=55 mm的聚氨酯生物填料球，投加量为30%。运行工况：利用温控系统将反应器内温度控制在(30±1) ℃，DO为0.3 mg·L−1，初始pH为7.5，MLSS为4 200~4 500 mg·L−1；模拟废水启动阶段Ⅰ，采用人工配水，设置进水蠕动泵流量为10 L·d−1，利用进水蠕动泵将模拟废水从反应器底部输入，内循环蠕动泵转速设置为2 r·min−1，处理后的水从顶部出水口排入出水箱中；实际废水运行阶段Ⅱ，启动成功后，通过逐渐提高老龄垃圾渗滤液的浓度，运行工况与启动阶段一致。
1.2 实验用水
本研究启动阶段采用模拟的垃圾渗滤液为进水，启动成功后以短程硝化处理后的老龄垃圾渗滤液为进水。模拟废水中NH4+-N和NO2−-N由(NH4)2SO4和NaNO2按需添加，其质量浓度分别为50~200 mg·L−1和60~260 mg·L−1。其他主要成分：MgSO4·7H2O、CaCl2、NaHCO3和KH2PO4、微量元素Ⅰ(1 mg·L−1)和微量元素Ⅱ(1 mg·L−1) [10]。
1.3 实验接种污泥
本研究接种污泥为广东省云浮市某养鸭废水处理站两级A/O工艺中厌氧硝化污泥，颜色呈棕红色，MLSS为5 000~6 000 mg·L−1。利用缓冲溶液将厌氧接种污泥清洗3遍，随后采用100目筛网进行筛分，去除杂物，并收集筛网上的颗粒污泥；将颗粒污泥置于装有NH4+和NO2−质量浓度分别为30 mg·L−1和40 mg·L−1的密闭容器中，并添加适量的MgSO4·7H2O、CaCl2、NaHCO3和KH2PO4营养物质、微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ进行纯化培养。纯化培养后的接种污泥中微生物数量为3×108个·mL−1，主要微生物群落包括Proteobacteria、Chloroflexi和Planctomycetes。将纯化后的接种污泥避光储存于实验室4 ℃冰箱中。
1.4 分析项目与方法
水质根据《水和废水监测分析方法》(第四版)[11]中的方法测定。其中NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法测定、NO2−-N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定、NO3−-N采用紫外分光光度法、MLSS采用重量法测定、pH和DO采用便携式水质多参数测定仪(上海SANXIN-SX825)测定。
污泥外貌形态，将样品置于10 mL离心管内，加入2.5%戊二醛固定液进行固定，冷冻干燥好后，将样品镀膜后在扫描电子显微镜(SEM，Zeiss Gemini 300，上海卡尔蔡司)进行观察并拍摄。污泥中EPS特征，采用一种改良的热提法提取污泥的3层EPS[12-13]，并用三维激发发射矩阵(3D-EEM)荧光光谱法测定EPS中有机物变化。采用考马斯亮蓝法和蒽酮—硫酸法分别测定EPS中的多糖和蛋白质[14-15]。
微生物群落多样性，利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA进行定量。对细菌的16S rRNA的V3~V4区，用通用引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)进行PCR扩增，最后采用Illumina MiSeq测序平台完成测序。
2. 结果与讨论
2.1 厌氧氨氧化污泥最佳脱氮条件确定
1)温度对厌氧氨氧化污泥脱氮的影响。有研究[16-17]表明，AnAOB最适的生长温度在15~40 ℃。基于此，探究温度(15、20、25、30、35、40和50 ℃)对Anammox污泥脱氮性能的影响，结果如图2(a)所示。当反应温度为15 ℃和50 ℃时，NH4+-N和NO2−-N的平均去除率分别为56.3%、64.3%和30.8%、67.8%。这是由于低温条件下导致比氨活性(SAA)降低，高温条件下由于细菌细胞裂解，SAA受到抑制[18-20]，导致脱氮效率下降[21-22]，在20、25、30、35和40 ℃下，NH4+-N和NO2−-N的平均去除率分别超过90%和76%。其中30 ℃下的NH4+-N和NO2−-N去除效果最佳，其平均去除率分别超过98%和85%。当反应温度为30 ℃和40 ℃时，TN的去除率最高，平均值分别为91.7%和91.9%。为节省能耗，将最佳反应温度设为(30±1) ℃。
图 2 影响Anammox污泥脱氮性能的主要因素优化Figure 2. Optimization of the main factors affecting the denitrification performance of anaerobic ammonia oxidation sludge2)初始pH对厌氧氨氧化污泥脱氮的影响。AnAOB的生理pH为6.7~8.3[23]。不同初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)对Anammox污泥脱氮性能的影响如图2(b)所示。初始pH的升高，有利于去除NH4+-N、NO2−-N和TN，当初始pH为7.09.0时，NH4+-N、NO2−-N和TN的去除效果最佳，其平均去除率均超过99%。pH决定了游离氨(free Ammonia, FA)和游离亚硝氨(free nitrogenous ammonia, FNA)的浓度，FA已被证明是Anammox系统中的一种重要抑制剂，低pH会导致FA浓度下降，这有利于AnAOB的活动[24]。然而，有研究表明，Anammox主要受pH影响，而非FA的抑制[25]。极端pH可能会影响质子转移和其他代谢过程 [26]。AnAOB菌在酸性条件下受到抑制，从而降低其脱氮性能。结果表明，进水初始pH为7.0~8.0脱氮效果最佳，故本研究将最佳初始pH设为7.5。
3)碳源投加量对厌氧氨氧化污泥脱氮影响。有机物被认为是影响Anammox脱氮性能的一个重要因素[27]。不同C6H12O6投加量(0、20、40、60和80 mg·L−1)对Anammox脱氮性能的影响结果如图2(c)所示。NH4+-N的去除效果与C6H12O6投加量呈负相关，当C6H12O6投加量为0 mg·L−1和20 mg·L−1时，NH4+-N去除效果最佳，其平均去除率分别为99.5%和96.7%；当C6H12O6投加量为80 mg·L−1时，NH4+-N平均去除率仅为86.4%。其主要原因可能是存在有机碳，异养菌会大量生长繁殖[28]，如反硝化菌，导致AnAOB菌的生长受到抑制，NH4+-N的去除性能下降。相反，NO2−-N去除率与碳源投加量呈正相关，在C6H12O6低投加量(0 mg·L−1和20 mg·L−1)时，其平均去除率仅为54.3%和65.5%。这主要是因为部分NO2−-N在反硝化菌的作用下转化为N2。有研究表明，在COD为100 mg·L−1时，NH4+-N和TN的去除效率均超过90%相比之下，当COD达到约300 mg·L−1时，Anammox仅占TN去除率的69%[29]。在不同C6H12O6投加量(0、20、40、60和80 mg·L−1)下，TN平均去除率分别为74.0%、80.6%、76.6%、70.3%和81.8%。尽管有机物可能会对Anammox产生不利影响，但较低的有机物浓度或合适COD/N可能会支持Anammox和反硝化的共存[30-32]。从NH4+-N、TN的去除效果以及经济考虑，本研究将不外加碳源。
4) NO2−/NH4+对厌氧氨氧化污泥脱氮影响。研究[23]表明AnAOB对铵和亚硝酸盐的亲和常数均小于或等于0.1 mg N·L−1。探究不同NO2−/NH4+(0.75、1.00、1.25、1.50和1.75)对Anammox污泥脱氮性能影响结果如图2(d)所示。NO2−/NH4+比为0.75、1.00、1.25、1.50和1.75对NH4+-N的平均去除率分别为99.4%、99.1%、99.3%、99.5%和98.9%，对NO2−-N的平均去除率分别为100%、100%、98%、87%和88%，对TN的平均去除率分别为99.6%、99.5%、99.7%、93.0%和91.0%。高底物浓度可抑制Anammox活性，尤其是在高NO2−-N浓度[33]。Anammox反应过程如化学式 (1) 所示[34]。理论上每消耗1 mol NH4+，需要1.32 mol NO2−，若NO2−/NH4+高于1.32理论值，则出现NO2−无法完全反应，导致出水存有剩余的NO2−。若NO2−/NH4+低于1.32，反而会出现NH4+过剩，导致出水TN去除率下降。结果表明，NO2−/NH4+太高或太低都会影响其脱氮性能，故本实验将NO2−/NH4+设为1.25~1.50较为合适。
NH+4+1.32NO−2+0.132HCO−3+0.512H+1.02N2+0.26NO−3+CH2O0.5N0.15+2.19H2O (1) 5)接种污泥浓度对厌氧氨氧化污泥脱氮影响。Anammox脱氮性能与接种污泥浓度相关联[35]。基于此，探究不同接种污泥浓度(1 800、2 600、3 400和4 200 mg·L−1)对Anammox污泥脱氮性能影响，结果如图2(e)所示。污泥质量浓度为1 800、2 600、3 400和4 200 mg·L−1，进水NH4+-N质量浓度控制为153.8 mg·L−1，出水质量浓度分别为70.5、44.6、15.8和0 mg·L−1，其平均去除率分别为54.2%、71.0%、89.7%和100%；NO2−-N进水质量浓度为192.3 mg·L−1，出水质量浓度分别为176.2、144.3、69.3和4.6 mg·L−1，平均去除率分别为8.4%、25%、64%和97.6%；TN的去除率分别为32.5%、46.5%、77.5%和98.2%。结果表明，当接种污泥浓度较低时，系统中的微生物含量也随之减小，导致其脱氮效果不佳，而将污泥浓度提高至一定程度，微生物的数量极为丰富，其脱氮性能最佳。结果表明，接种污泥质量浓度为4 200 mg·L−1时，其脱氮效果最佳。
2.2 厌氧氨氧化快速启动及脱氮性能
单因素批量实验结果表明，Anammox最适的运行条件温度为(30±1) ℃、初始pH为7.5、无外加有机碳源、NO2−/NH4+=1.25~1.50和接种MLSS为4 200 mg·L−1。基于此，进行Anammox启动和脱氮性能研究，其中启动阶段Ⅰ指以模拟废水为进水，用于Anammox的快速启动；实际废水运行阶段Ⅱ是指在启动成功后，以短程硝化处理后的老龄垃圾渗滤液为进水，探究UASB反应器脱氮性能的研究。由图3(a)可见，模拟废水启动阶段Ⅰ中当NH4+-N质量浓度由48.5 mg·L−1逐渐提升至211.3 mg·L−1时，平均去除率为99.2%。此外，当提高氮负荷比时，其NH4+-N去除效率轻微下降，随后回升到较高的水平。这表明反应器中的微生物具备较强的抗冲击负荷能力，启动过程中NH4+-N的出水质量浓度均低于6 mg·L−1。从图3(b)可知，当NO2−-N从初始质量浓度由64.7 mg·L−1逐渐提升至247.1 mg·L−1，反应器对NO2−-N同样保持较高的去除效果，NO2−-N出水质量浓度低于10 mg·L−1，平均去除率为97.2%。由图3(c)可见，NO3−-N的积累量随着NH4+-N和NO2−-N浓度的增加而增加，但始终低于0.26，∆NO2−-N/∆NH4+-N平均值为1.26，略低于理论值1.32。这可能是由于反应器中除了AnAOB外，还存在反硝化菌，使得Anammox过程中产生的NO3−-N在反硝化菌的部分反硝化作用下转为NO2−-N，导致∆NO2−-N和∆NO3−-N偏低，从而导致结果比理论值低[34]。由图3(d)可见，当TN的质量浓度由113.1 mg·L−1逐渐升至458.4 mg·L−1时，平均去除率为90%，出水质量浓度低于25 mg·L−1，表明第60天时Anammox成功启动。
图 3 Anammox快速启动及其脱氮性能Figure 3. Fast start-up and of Anammox and its denitrification performance实际废水运行阶段Ⅱ：启动成功后以短程硝化处理后的老龄垃圾渗滤液为原水，进水NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N和TN的质量浓度分别为150~190、200~250、5~15和375~465 mg·L−1。由于水质与启动期的模拟废水存在差异，微生物受到抑制，导致启动初期的脱氮性能不稳定，运行至第125天时，NH4+-N、NO2−-N和TN的平均去除率分别为81.7%、81.9%和76.2%，平均出水质量浓度分别为31、42.5和99.8 mg·L−1，NO3−-N的平均出水质量浓度为25.7 mg·L−1。结果表明，随着运行时间推移脱氮性能趋向稳定，系统运行至126~150 d时NH4+-N、NO2−-N和TN出水较为稳定且保持较高的脱氮效果，其平均去除率分别为86.9%、85.7%和80.2%，表明该系统运行趋向于稳定。
2.3 接种污泥形貌特征分析
1)生物填料以及接种污泥变化。在图4(a)~(c)中观察到聚氨酯生物填料上的孔隙中附着很多由微生物聚集而成生物膜。这说明聚氨酯生物填料可为AnAOB提供附着场所，可以有效解决运行过程中种泥流失的难题。在图4(d)~(f)中观察到絮状污泥逐渐减少，颗粒污泥逐渐增多。为了更清楚地观察污泥形态，利用显微镜进行观察，在图4(g)~(i)中观察到原始接种污泥中絮状污泥居多，只有少数的颗粒污泥，且颗粒污泥粒径较小，第60 天时，可以明显的观察到颗粒污泥占主导地位，同时污泥颗粒化程度高且形态完整。
图 4 不同时期接种污泥宏观特征Figure 4. Macroscopic characteristics of the inoculation sludge during different periods2)接种污泥表观形貌。为更好地揭示接种污泥颗粒化过程，从UASB反应器中取第0、20、40和60天的污泥样品，观察污泥从开始接种至接种至60 d过程中微生物聚集的情况。由图5(a)可见，原始接种污泥呈现出网状结构，主要是由变形菌门和绿弯菌门形成[36]，这为后期AnAOB的富集提供附着位点。由图5(b)可见，第20天的接种污泥在原本树状结构上聚集了球状颗粒。如图5(c)所示，在第40天的接种污泥表面观察到不规则的花椰菜外观。由图5(d)可见，接种60 d后污泥呈现的花椰菜外观更加明显，花椰菜外观是AnAOB成功富集的特征[37]。这表明反应器在40~60 d内AnAOB成功富集。此外，可观察到细菌被某种分泌物紧密连接，这有利于AnAOB抗冲击负荷和具有较好的沉降性能，可有效地减少接种污泥的流失。
图 5 原始接种污泥与不同接种时期污泥结构扫描电镜图Figure 5. Scanning electron microscopy images of the structure of raw sludge and the inoculated sludge at different operating periods3)接种污泥EPS中蛋白质(PN)和多糖(PS)的变化。EPS是污泥颗粒化的重要物质[38]。基于此，本文探究EPS中PN和PS对Anammox颗粒化的影响。由图6(a)可见，原始接种污泥中PN的含量为0.39 mg·g−1(以每克MLVSS计)，接种至第30天时，提高至4.92 mg·g−1，接种至第60天时，提高至9.42 mg·g−1。而PN含氨基，并带正电荷，导致污泥表面负电荷减少，微生物间的静电斥力降低，细胞表面的疏水性增强，从而使细胞更易于从水相中脱离出来并互相聚集。因此，PN含量的增加可促进污泥颗粒化[39]，表明微生物随着时间推移不断富集，这与SEM的结果一致。接种60 d后，原始接种污泥EPS中PS也由1.10 mg·g−1增加至5.05 mg·g−1，与PN呈现出相同的变化趋势(图6(b))。并且在氮负荷增加的过程中不断分泌更多的EPS，PS通过形成聚合物来促进微生物间的黏附以增强颗粒污泥的稳定性。同时，PS交联形成的水凝胶是维持颗粒污泥稳定的重要因素[40]。PS长主链之间的缠结以及丰富的结合位点桥接形成骨架，增强了微生物之间的黏附，有利于维持颗粒污泥的稳定状态[41]。PN/PS通常可以作为接种污泥稳定性和沉降性能的表征，由图6(d)可知，原始接种污泥PN/PS为0.356，第30天时其值为3.51，第60天时其值为1.87。有研究[42]表明，PN/PS为0.5~5内时，颗粒污泥的稳定性和沉降性随该比值增大而增强。由图6(c)和图6(d)可知，总EPS的分泌量的增加表明AnAOB得以富集。
图 6 不同启动时期接种污泥3层EPS的变化Figure 6. Changes of three-layer EPS in the inoculation sludge at different start-up periods4)污泥EPS的3D-EEM结果。AnAOB分泌特定的EPS，可间接表征AnAOB的生长富集状况[43]。基于此，本文研究不同运行时期接种污泥各层EPS荧光光谱的变化，结果如图7所示。EPS的荧光谱图中主要包含4个特征峰：A峰激发波长/发射波长(Ex/Em)位于230~260 nm/300~330 nm，为酪氨酸蛋白；B峰Ex/Em位于337~400 nm/425~462 nm，为腐殖酸；C峰Ex/Em位于260~280 nm/370~425 nm，为富里酸和D峰Ex/Em位于230~262 nm/335~370 nm，为色氨酸蛋白质[44]。与图7(a)和图7(b)的接种污泥相比较，第30天(图7(e)~(f))和第60天(图7(h)~(i))在LB-EPS和TB-EPS层出现了腐殖酸类有机物 (B峰) ，该有机物是AnAOB中的Candidatus Brocadia分泌的特定物质[45]，表明第30天和60天之后AnAOB得到富集，且第60天时富集程度比第30天时要高。接种第60天的酪氨酸蛋白质(峰A)和色氨酸蛋白质(峰D)荧光强度比接种污泥高，且这2种物质在Anammox污泥的聚集中起重要作用[44]。表明随着污泥接种时间的推移，微生物不断的分泌出更多的胞外聚合物，同时也说明微生物不断的进行生长繁殖，与上节的扫描电镜的结果相一致。
图 7 不同时期接种污泥3层三维荧光变化Figure 7. Three-dimensional fluorescence change of three-layer EPS in the inoculation sludge at different start-up periods2.4 不同时期微生物群落结构变化
1)微生物多样性分析。采用16S rRNA高通量测序技术分析接种污泥在UASB反应器运行过程中微生物群落结构变化情况。由表1可知，覆盖率(coverage)均大于99%。0~30 d反应器中氮负荷由0.075 kg·(m3·d)−1提升至0.153 kg·(m3·d)−1，OTUs数由370降至322，微生物多样性和丰度均呈现较明显的下降趋势，说明大部分不适应环境的微生物被淘汰。30~60 d反应器中氮负荷增加至0.306 kg·(m3·d)−1，OTUs数由322降至312，微生物多样性和丰度呈现出略微下降趋势，表明微生物逐渐适应环境。此外，Simpson指数增大，Shannon指数、Ace指数和Chao1指数有所降低。以上结果表明，随着氮负荷的增加，微生物群落多样性和丰度与原始接种污泥相比有所下降，表明在运行过程中系统不断将不适应环境的微生物进行淘汰，从而使得主要的功能菌逐渐占据主导地位，从而提高系统的脱氮性能。
表 1 Anammox接种污泥Alpha多样性指数Table 1. Alpha diversity index of anaerobic ammonia oxidation inoculation sludge污泥样品 OTUs Shannon Simpson Ace Chao 1 Shannoneven 覆盖率/% 第0天 370 4.401 0.030 370.00 370.00 0.744 100 第30天 322 3.954 0.045 325.88 324.44 0.685 99.9 第60天 312 3.302 0.093 320.63 324.16 0.575 99.9 | Show Table
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2)门水平物种丰度分析。图8(a)反映了UASB反应器接种第0、30和60天时在门水平上微生物群落结构。结果表明：第0天时，反应器内门水平的微生物主要包括变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和酸杆菌门(Acidobacteria)，其相对丰度分别为29.9%、15.2%、6.40%、6.22%、3.76%、1.77%和1.15%；第30天时，反应器中浮霉菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和酸杆菌门的相对丰度分别提高至12.9%、8.72%、12.7%和1.32%，变形菌门和绿弯菌门分别下降至27.5%和3.05%，在第30天时没有检测到疣微菌门，却检测到Ignavibacteriae，其相对丰度为0.81%；第60天时，浮霉菌门、拟杆菌门和Ignavibacteriae相对丰度分别提高至44.4%、9.95%和1.34%，变形菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度分别降至21.4%、0.36%、2.32%和0.54%。有研究表明，Anammox体系中AnAOB可与上述微生物存在共存现象[46-47]。
反应器运行至第60天时，浮霉菌门成为第一优势菌门，这主要是启动时逐渐提升氮负荷，且无外加有机碳源，使得接种污泥中的变形菌逐渐地失去第一优势菌的地位。而AnAOB为化能自养型细菌，在无有机碳源的环境中更有利其生长繁殖，从而使其在系统中更加具有竞争力。虽然变形菌门失去了第一优势菌门的地位，但其依旧保持较高的丰度，该菌门中含硝化、反硝化细菌，提升反应体系中的脱氮效率。值得注意的是，Ignavibacteriae从未检出到第60天时升至1.34%，该菌属于异养兼性厌氧菌，能将NO3−-N还原为NO2−-N[46]，有利提高系统的脱氮性能，同时可解释Anammox的系统中∆NO2−/∆NH4+和∆NO3−/∆NH4+低于理论值的原因。大部分的丝状菌为绿弯菌门，由于接种污泥中绿弯菌门为第二优势菌门，为后期AnAOB的富集提供附着位点，此外该菌门还参与凋亡细胞的分解和胞外物质的合成[36]。Anammox反应器是一个多种微生物共存的系统，形菌门、厚壁门、绿弯菌门和拟杆菌门等微生物参与脱氮，有利于反应器脱氮和稳定运行。
3)属水平菌群结构分析。在UASB反应器接种第0、30和60天时，属水平上的微生物群落结构变化如图8(b)所示。接种污泥主要以Thauera、Thermomonas、Nitrosomonas、Ohtaekwangia为优势菌。运行60 d后，浮霉菌门中的Candidatus Brocadia成为优势菌，其丰度从反应器启动前未检出提高至42.4%。通常，随着低氮负荷向高氮负荷的提升过程中Candidatus Brocadia可能受高浓度NO2−-N的抑制[48]。但本研究中Candidatus Brocadia可以免受抑制且成为优势菌，表明Anammox启动成功。
同时反应器存在Thauera、Thermomonas、Nitrosomonas、Ohtaekwangia和Ignavibacterium等硝化反硝化菌，Thauera的存在有利于COD和TN的去除[47]，Thermomonas属于热单胞菌，可以有效去除NO3−-N[49]；Nitrosomonas属于AOB菌，该菌利用一部分NH4+-N转化成NO2−-N为AnAOB提供基质；Ohtaekwangia属于硝化细菌门，其丰度由初始2.60%增加至3.32%，该菌丰度增加有利于系统的脱氮[50]，Ignavibacterium属于亚硝化盐还原菌，该菌丰度增加至1.34%，在Anammox系统中经常与AnAOB发挥作用。虽然前3者的丰度有所下降，后两者的丰度上升，但其对该反应器高效脱氮有重要贡献
3. 结论
1)在UASB反应器中成功快速启动Anammox，其最佳运行条件为(30±1) ℃、初始pH为7.5、无需外加碳源、NO2−-N/NH4+-N为1.25~1.50和MLSS为4 200 mg·L−1，历经60 d快速启动成功厌氧氨氧化。
2) UASB反应器启动60 d后，污泥中EPS中PN由0.39 mg·g−1增至9.42 mg·g−1，PS从1.1 mg·g−1增加至5.05 mg·g−1，总EPS由接种前的1.49 mg·g−1增至14.5 mg·g−1，说明氮负荷增加时有利于微生物分泌出更多的胞外聚合物，有利于Anammox颗粒的形成，增强其抗负荷能力，且能减少种泥流失。
3)启动成功的UASB反应器处理老龄垃圾渗滤液，系统运行至126~150 d时NH4+-N、NO2−-N和TN平均去除率均在80%以上，TN去除负荷最高为0.36 kg·(m3·d)−1，可为工程规模的Anammox快速启动用于老龄垃圾渗滤液脱氮提供参考。
4) UASB反应器启动成功后，微生物多样性减少，AnAOB所在的浮霉菌门(Planctomycetes)成为优势菌门，其相对丰度为44.4%，Candidatus Brocadia成为优势菌属，相对丰度提高至42.4%，说明AnAOB成功富集，AnAOB利用NO2−-N为电子受体，以NH4+-N为电子供体实现深度脱氮。同时UASB反应器是一个以硝化反硝化菌为辅，以AnAOB为主的共生系统。
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图 1 pH对游离漆酶活性的影响和游离漆酶随贮存时间的稳定性
Figure 1. The effect of pH on the activity of free laccase and the stability of free laccase with time
图 2 吸附法和包埋法碳基材料固定化漆酶的扫描电镜图
Figure 2. Scanning electron microscope images of immobilized laccase by biochars or CNTs through the adsorption and embedding methods
图 3 吸附法和包埋法碳基材料固定化漆酶的傅里叶红外光谱图
Figure 3. Fourier transform infrared spectra of immobilized laccase by biochars (WB and BB) or CNTs through the adsorption and embedding methods
图 4 吸附法和包埋法WB-、BB-、和CNT-固定化漆酶的稳定性和可重复使用性
Figure 4. The stability and reusability of WB-, BB-, and CNT-immobilized laccase through the adsorption and embedding methods
图 5 吸附法和包埋法WB-、 BB-、和CNT-固定化漆酶对水中E2的去除及其循环效率
Figure 5. E2 removal by WB-, BB-, and CNT-immobilized laccases and its cyclic experiments
图 6 K+对WB-、BB-、CNT-固定化漆酶去除E2的影响
Figure 6. Effect of K+ on the removal of E2 by WB-, BB-, CNT-immobilized laccases
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