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长荡湖流域地处太湖流域上游，是太湖重要水系。流域总面积2 161.46 km2，地势西高东低；流域内水系发达，流向复杂，主要流向为自西向东。由于大规模的农业耕作、淡水养殖以及快速城镇化，导致长荡湖流域氮、磷污染严重。据报道目前长荡湖流域水质恶化，水体受富营养化和蓝藻水华暴发的影响，进而威胁太湖流域生态安全[1-3]。而研究表明入湖河流是湖泊的主要污染来源[4-5]。如黄明雨[6]研究发现洱海入湖河流的氮磷输入是洱海氮磷的重要来源。谢培等[7]基于EFDC模型模拟不同调水方案下千岛湖上游入流和湖周入流CODMn变化对湖内CODMn的影响，发现上游入流是影响千岛湖湖内CODMn的主要因素。因此对长荡湖入湖河流的水生态环境现状进行全面调查研究是十分必要的。
微生物在维持水生态系统的功能和健康中起着至关重要的作用，它既是全球生物地球化学循环的主要驱动者，也是水生态系统中污染物的主要分解者[8]。由于微生物的存在，水中复杂且难降解的有机污染物才得以分解[9]，水生态系统才能良性循环。早期微生物检测技术主要是分离培养法，但此种方法存在培养难度大、周期长等缺陷。为弥补传统培养方法的不足，现代分子生物学技术应运而生，常见的分子生物学方法有高通量测序技术、实时荧光定量PCR和宏基因组测序技术等[10-12]。相比第一代DNA测序技术，高通量测序技术在读取样本数量、测序范围和准确性等方面有绝对优势[13]，因此被广泛应用于环境样品的16S rRNA、真菌的ITS区和功能基因的分析中[14]。作为水生态系统重要组成部分，微生物的群落结构与多样性受水体理化性质和外部环境因素的共同影响。张烨以南太湖流域长兴港和西苕溪为研究对象，发现季节变化是引起微生物群落多样性差异的主要因素，且微生物群落特征受水体理化因子影响，如入湖河流中水杆菌属(Aquabacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)与NH4+-N呈正相关、DO呈负相关[15]。刘峰等[16]利用高通量测序技术和典范对应分析(CCA)发现汾河与黄河微生物群落组成具有一定的差异，不同环境因子对不同微生物的影响程度不同，pH和溶解氧是汾河入黄口微生物群落结构的主要影响因子。SHANG等[17]基于16S rRNA高通量测序技术发现温度、pH和DO的快速变化可能是影响呼伦湖季节性细菌多样性变化趋势的主要因素。因此研究水体中微生物群落与环境因子的响应关系，对保护水体、维护水生生态系统平衡具有重要意义。
目前长荡湖流域的研究主要聚焦于长荡湖湖体的水质变化、浮游动物和底栖动物的群落结构特征以及沉积物污染风险等[3，18-21]。如王礼权等[18]采用非度量多维尺度变换(NMDS)和冗余分析等方法探讨了长荡湖浮游植物群落结构组成特征及其与环境因子的关系。巫丹等[19]则利用正定矩阵因子(PMF)模型和主成分分析多元线性回归(PCA-MLR)模型对湖泊重金属污染来源进行解析，并评估了长荡湖沉积物重金属的风险等级。但鲜有研究关注长荡湖入湖河流的微生物群落结构特征及与环境因子的关系。鉴于丰水期水中微生物多样性较高且雨量充沛；同时渔业养殖、农业生产活动强，对入湖河流水质造成较大冲击，且较其他季节的污染更为严重[22-23]。因此本研究基于2021年6月长荡湖入湖河流的采样数据，分析入湖河流的微生物群落结构特征以及与环境因子的关系，以期为长荡湖及其入湖河流污染防治和生态修复提供参考。
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在综合考虑长荡湖的主要入湖河流和污染源类型等因素的基础上，在入湖河流中布设11个采样点。于2021年6月(丰水期)进行水样采集。采样点根据沿岸污染源类型，分为农村生活污染、农业面源污染和渔业养殖污染3种类型。采样点的具体位置信息见表1和图1。
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使用有机玻璃采水器采集距水面0.5 m的水样，每个采样点采集1 L水样，保存于已消毒灭菌并用样本底水充分清洗的聚乙烯取样瓶中，并在4 ℃条件下运回实验室。其中500 mL水样用于理化因子测定，500 mL在实验室无菌环境下使用0.45 μm滤膜过滤后放入冻封管并置于-20 ℃冰箱冷冻保存，之后送至公司进行微生物基因测序。
测定的理化因子包括总有机碳(TOC)、总氮(TN)、总磷(TP)、水温(WT)、pH值及溶解氧(DO)。总有机碳(TOC)采用燃烧氧化-非分散红外吸收法；总氮(TN)采用碱性过硫酸钾-紫外分光光度法；总磷(TP)采用钼酸铵分光光度法；采用YSI多参数水质分析仪(YSI PRO1020 美国)现场测定水温(WT)、pH值和DO。
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使用PowerWater DNA试剂盒(MOBIO, USA)提取基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA。使用正向引物341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和反向引物806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')对V3-V4可变区进行PCR扩增。扩增程序：95 °C预变性3 min，27个循环(95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s)，最后72 °C延伸10 min(PCR仪: GeneAmp® 9700，Applied Biosystems, USA)。
使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。测序采用 Illumina MiSeq PE300 高通量测序平台进行测序。利用Uparse软件(7.0.1001版)进行序列分析，将相似性不低于97%的序列分配到同一个OTU进行物种注释。PCR及测序均由上海凌恩生物科技公司完成。
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基于Microsoft Excel处理的原始实验数据；使用Origin 2018软件绘制物种丰度柱状图，微生物多样性指数使用QIIME软件(1.7.0版)计算。利用R.v3.3.4软件进行ANOSIM分析(相似性分析)，用于确定不同分组下微生物相对丰度的差异。依托微生信在线平台绘制Circos图分析不同污染类型的入湖河流中微生物群落结构组成。在Canoco for Windows 5.0软件中使用冗余分析确定微生物群落与理化因子的响应关系。
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长荡湖入湖河流中污染物浓度与污染类型存在一定关联。如表2所示，农业面源污染的入湖河流中总氮浓度范围为2.71~2.83 mg·L−1，平均浓度为2.77 mg·L−1。总磷浓度范围为0.10~0.12 mg·L−1，平均浓度为0.11 mg·L−1。而农村生活污染和渔业养殖污染的入湖河流中总氮、总磷的平均浓度分别约为1.66、0.96 mg·L−1和0.09、0.04 mg·L−1。由此可见，相比农村生活污染和渔业养殖污染，农业面源污染贡献了更多的有机污染物，特别是含氮污染物。农业面源污染的入湖河流中W150和W151的总氮浓度超过地表水V类水质标准(≤2.0 mg·L−1)。其总氮浓度高的原因是该区为我国重要的商品粮基地，而农业生产需要施加化肥且丰水期是农业生产的关键时期，因此，富氮的农业尾水排入河流，致使周边河流总氮浓度维持在较高的浓度范围。农村生活污染的入湖河流中W153、W154、W155的TOC和TN浓度普遍较高，这是其周边生活着农村居民，大量生活污水被直接排入河中，造成河流有机物及氮素的积累。除W164外，渔业养殖污染的入湖河流中其余点位的总氮、总磷浓度均维持在较低的浓度水平。3种污染类型的入湖河流中WT总体范围为(26.25±1.75) ℃；pH维持在7.93±0.21，呈弱碱性；DO浓度范围处于(6.22±1.67) mg·L−1。
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1) 门分类水平微生物群落结构。长荡湖入湖河流的微生物群落在门分类水平上具有较高的多样性。11个采样点中共检测出46种已知微生物菌门，入湖河流微生物在门分类水平上组成如图2所示，其中相对丰度排在10名之后的菌门和其他未知物种归为others。
3种污染类型的入湖河流中优势菌门种类相同，主要包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。但不同污染类型的入湖河流中优势菌门相对丰度却有所差别。如农业面源污染入湖河流中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度为81.09%±1.37%，远高于农村生活污染(31.05%±4.68%)和渔业养殖污染(24.49%±5.98%)。这是因为变形菌门(Proteobacteria)与氮循环有关[24-25]，与氮循环密切相关的硝化细菌主要分散在变形菌门(Proteobacteria)的亚群中[26-27]。而农业面源污染的入湖河流中总氮浓度远高于其余污染类型，可见总氮对变形菌门(Proteobacteria)的生长有促进作用。农村生活污染和渔业养殖污染的入湖河流中放线菌门(Actinobacteria)相对丰度范围分别为40.19%±2.37%和38.43%±4.58%，高于农业面源污染(12.26%±0.25%)。因为农业面源污染的入湖河流DO平均浓度为5.13 mg·L−1，低于农村生活污染(6.56 mg·L−1)和渔业养殖污染(7.04 mg·L−1)。表明低DO浓度不利于放线菌门(Actinobacteria)生长。这与李明等[28]的研究结论相似，即厌氧环境能抑制放线菌门(Actinobacteria)的生长。农村生活污染、农业面源污染和渔业养殖污染的入湖河流中拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度依次为11.89%±2.48%、3.19%±1.13%、8.83%±4.89%。据报道总氮和碱解氮对拟杆菌门菌群丰度起抑制作用[28]，而农业面源污染的入湖河流中总氮浓度偏高。这与前人研究结论一致[29]。
Circos图可以更直观地展现不同污染类型的入湖河流中门分类水平微生物群落组成情况。如图3所示，变形菌门(Proteobacteria)作为长荡湖入湖河流中第一大优势菌门，其在农业面源污染的入湖河流中平均占比最高；而放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和蓝细菌门(Cyanobacteria)在农业面源污染的入湖河流中平均占比最低。再次证明入湖河流中菌门的相对丰度与污染源类型相关。
2) 属分类水平微生物群落结构。长荡湖入湖河流属分类水平微生物群落结构组成如图4所示，其中相对丰度排在15名之后的菌属和其他未知物种归为others。11个采样点共检测出617种微生物菌属；但所有采样点均有未能确定其分类学地位的菌属。入湖河流中相对丰度前5的菌属依次为：hgcI clade (6.10%~31.11%)、CL500-29 marine group(3.89%~22.64%)、Acinetobacter(0.15%~19.99%)、Comamonadaceae-Unclassified(0.66%~10.94%)和Hydrogenophaga(0.07%~22.60%)。
不同污染类型的入湖河流中优势菌属种类相似，但相对丰度不同。hgcI clade在农村生活污染和渔业养殖污染的入湖河流中平均占比分别为21.55%、18.28%，高于农业面源污染(6.43%)；相同地，CL500-29 marine group在农村生活污染、渔业养殖污染和农业面源污染的入湖河流中占比依次为12.80%、19.25%、4.23%，说明农村生活污染和渔业养殖污染的入湖河流更适合hgcI clade、CL500-29 marine group的生长。反之，hgcI clade、CL500-29 marine group能利用营养物质促进自身生长繁殖，进而改善水质[30]。研究表明hgcI clade相对丰度随温度升高而明显增大，且与水质变好有关[31-32]；CL500-29 marine group能够利用含碳有机物改善水质[33]。因此农业面源污染的入湖河流TOC平均浓度(3.10 mg·L−1)低于农村生活污染(5.02 mg·L−1)和渔业养殖污染(3.83 mg·L−1)。农业面源污染的入湖河流中Hydrogenophaga的相对丰度显著高于农村生活污染和渔业养殖污染。XING等[34]研究发现Hydrogenophaga是一种兼性自养菌，能在没有或有残留可生物降解有机物的污水中保持优势地位。所以在农业面源污染的入湖河流中，Hydrogenophaga相对丰度反而更高。
进一步采用ANOSIM分析探究不同污染类型的入湖河流中各采样点微生物的相对丰度差异。结果表明，组间差异大于组内差异，且不同污染类型的入湖河流点位的微生物群落结构存在显著差异(p = 0.002，R = 0.579)，证明微生物群落结构与污染源类型相关。
3) 微生物群落Alpha多样性分析。长荡湖入湖河流中微生物群落Alpha多样性分析结果见表3。
长荡湖入湖河流采集的水体样本中，Coverage指数均在0.97以上，说明本次测序深度基本覆盖样品中的物种。3种污染类型入湖河流中Ace指数最高的是农村生活污染(5 590.5±1 147.5)，最低的是农业面源污染(3 969.5±164.5)；农村生活污染的入湖河流中Chao1指数最高(5 329.0±1 086.0)，Chao1指数最低的是农业面源污染(3 906.0±219.0)。说明丰水期农村生活污染的入湖河流中微生物群落的丰富度最高，而农业面源污染的入湖河流中微生物群落丰富度最低。这与ZHANG等[35]研究结论一致。即不同的外部污染输入与细菌群落呈显著相关，如农业污染会导致norank_p_Aminicenantes相对丰度升高。农村生活污染的入湖河流中Shannon指数平均值最高，约为8.464，其次为渔业养殖污染(7.756)，农业面源污染(6.704)。Simpson指数与Shannon指数反映的结论一致。整体上，丰水期长荡湖入湖河流的微生物群落丰富度与多样性呈现农村生活污染>渔业养殖污染>农业面源污染的规律。
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1) 入湖河流优势门分类水平微生物群落与理化因子响应分析。长荡湖入湖河流中相对丰度前10的优势菌门与7个理化因子(DO、pH、WT、TOC、TN、TP和TN/TP)的冗余分析结果如图5所示。pH、TP与长荡湖入湖河流的优势菌门呈显著相关(p<0.05)，DO、WT、TOC、TN及TN/TP与长荡湖入湖河流优势菌门的相关性不显著(p>0.05)。
长荡湖入湖河流中DO与Actinobacteria、Cyanobacteria、Verrucomicrobiota等菌门呈正相关，说明DO能促进Actinobacteria、Cyanobacteria、Verrucomicrobiota等菌门的生长[36-37]。同样地，Cyanobacteria也可通过光合作用产生氧气，增加水中溶解氧[38]。而DO与Proteobacteria呈显著负相关，表明随着DO浓度升高，Proteobacteria丰度反而降低，这与李亚莉等[39]研究结论一致。入湖河流中pH与Actinobacteria呈显著正相关，与Proteobacteria呈显著负相关。入湖河流中WT、TOC与Proteobacteria呈显著负相关，但与其余菌门呈一定程度的正相关。这与邹沈娟等[40]研究结论一致，即变形菌门与WT、TOC显著负相关。但刘泽岸和孙琳[41]却有不同的观点，其以浐灞河生态区为研究对象，发现Proteobacteria与WT呈正相关。原因是本文和邹沈娟等[40]研究文章中水样属于同一时间采集，而刘泽岸和孙琳[41]的研究文章中水样分别在夏、冬两季各采集一次。夏、冬两季水样的WT差距较大；同时微生物有适宜的生长温度范围，过高或过低均会降低微生物的丰度[42]。因此造成了不同研究人员研究发现Proteobacteria与WT呈现出相关性不一致的现象。微生物的生长除了WT、pH等影响因素外，营养因素N、P至关重要，许多研究也发现营养因素与微生物群落结构有较大的相关性。如张雅洁等[43]以北海湖为研究对象，发现在TN浓度为0.83~1.67 mg·L−1，TP浓度为0.04~0.11 mg·L−1时，营养盐浓度增加，能显著增加蓝细菌的丰度。薛银刚等[44]研究发现营养盐在微囊藻属的有害增殖过程中起着重要的作用，是推动微囊藻水华暴发的主要因素。但在本研究中，入湖河流中TN、TP和TN/TP除与Proteobacteria呈显著正相关，与其它菌门均呈一定程度的负相关。李先会等[45]研究发现在满足微生物生长需要的条件下，增加微生物生长所需底物(如TN、TP)浓度反而会抑制微生物生长。对比发现，长荡湖入湖河流中TN浓度为0.64~2.83 mg·L−1，TP浓度为0.03~0.12 mg·L−1；高于北海湖TN、TP浓度水平。所以在较高TN、TP浓度的环境下，微生物生长反而受到抑制。而入湖河流中TN、TP和TN/TP与Proteobacteria呈显著正相关，说明Proteobacteria对TN、TP的耐受性较强。
2) 入湖河流优势属分类水平微生物与环境因子响应分析。长荡湖入湖河流中相对丰度前15的优势菌属与7个理化因子(DO、pH、WT、TOC、TN、TP和TN/TP)的冗余分析结果如图6所示。DO、pH与长荡湖入湖河流的优势菌属呈显著相关(P<0.05)，WT、TOC、TN、TP和TN/TP与长荡湖入湖河流的优势菌属相关性不显著(P>0.05)。
长荡湖入湖河流中DO、pH与Hydrogenophaga、Acinetobacter、Limnohabitans等菌属呈一定程度的负相关。Acinetobacter属于专性需氧型细菌，能在有氧条件下将氨转化为硝酸[37]。但本研究显示随着DO浓度升高，Acinetobacter生长反而受到抑制。分析可能是受其它环境因子影响或其它优势菌属争夺DO，抑制了Acinetobacter生长。Limnohabitans喜欢非酸性的环境，在溶解氧浓度较低的环境下，生长速率快，生存能力强[46]；而长荡湖入湖河流中较多的氮磷等营养物质为Limnohabitans提供了良好的生存条件且水体偏碱性，因此DO升高反而抑制Limnohabitans繁殖。长荡湖入湖河流中WT、TOC与Hydrogenophaga、Acinetobacter、Comamonadaceae_Unclassified、Limnohabitans及Arenimonas呈一定程度的负相关，与CL500-29 marine group、Candidatus Aquirestis、hgcI clade等菌属呈正相关。研究表明温度能影响微生物的活性且不同微生物的生长适宜温度并不相同[47-48]，所以当WT处于24.5~28 ℃内，WT偏低有利于Hydrogenophaga、Acinetobacter、Comamonadaceae_Unclassified、Limnohabitans及Arenimonas的繁殖，WT偏高则适宜CL500-29 marine group、Candidatus Aquirestis、hgcI clade等菌属生长。长荡湖入湖河流中TN、TP及TN/TP与Hydrogenophaga、Acinetobacter、Comamonadaceae_Unclassified及Limnohabitans等菌属呈一定程度的正相关，与CL500-29 marine group、Candidatus Aquirestis、hgcI clade等菌属呈负相关。说明长荡湖入湖河流中TN、TP浓度早已超出CL500-29 marine group、Candidatus Aquirestis及hgcI clade等菌属生长所需浓度，因此随着入湖河流中氮磷浓度升高，这些菌属的生长反而受到抑制[45]。
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1) 高通量测序结果表明，丰水期长荡湖入湖河流11个采样点共检测出微生物群落46门，617属。在门、属分类水平上，入湖河流各采样点的微生物群落中优势菌门、菌属种类相似，但相对丰度却有所差别。进一步采用ANOSIM分析，结果表明长荡湖入湖河流微生物群落与污染源类型相关。
2) 据微生物群落Alpha多样性分析结果显示，3种污染类型的长荡湖入湖河流中微生物群落多样性和丰富度呈现农村生活污染>渔业养殖污染>农业面源污染的规律。
3) 冗余分析表明，pH、TP与长荡湖入湖河流的优势菌门呈显著相关(P<0.05)；DO、pH与长荡湖入湖河流的优势菌属呈显著相关(P<0.05)，且同一种理化因子与不同菌门、菌属的相关性不同。
丰水期长荡湖入湖河流微生物群落结构特征及影响因素
Characteristics of microbial community structure and influencing factors in rivers entering Changdang Lake during the wet season
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摘要: 为探究长荡湖入湖河流微生物群落结构特征及与环境因子的响应关系，在综合考虑主要入湖河流和污染源类型等因素的基础上进行分组，分析入湖河流中溶解氧(DO)、pH、氮磷比(TN/TP)、水温(WT)、总有机碳(TOC)、总氮(TN)和总磷(TP)共7个理化因子的分布特征。基于16S rRNA高通量测序技术并结合Circos、ANOSIM和冗余分析(RDA)等方法分析微生物群落结构特征的差异以及微生物群落与理化因子的关系。结果表明：不同污染类型的长荡湖入湖河流中优势菌门、菌属种类相似，但相对丰度却有所差别。优势菌门包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)；优势菌属包含hgcI clade、CL500-29 marine group、Acinetobacter、Comamonadaceae-Unclassified和Hydrogenophaga。ANOSIM分析表明长荡湖入湖河流微生物群落结构特征与污染源类型相关。冗余分析(RDA)结果显示pH、TP与长荡湖入湖河流的优势菌门呈显著相关(P<0.05)；DO、pH与长荡湖入湖河流的优势菌属呈显著相关(P<0.05)。入湖河流的微生物群落在门、属分类水平上具有较高多样性且与污染源类型和理化因子相关，这为长荡湖入湖河流污染防治和生态修复提供了数据支撑。Abstract: To understand the structural characteristics of microbial communities in rivers entering Changdang Lake and the response relationship with environmental factors, this study classified these communities based on the comprehensive assessment of the primary rivers flowing into Changdang Lake and the types of pollutant sources. The distribution characteristics of seven physicochemical indices were analyzed in rivers entering Changdang Lake, including dissolved oxygen (DO), pH, ratio of total nitrogen to total phosphorus (TN/TP), water temperature (WT), total organic carbon (TOC), total nitrogen (TN) and total phosphorus (TP). The differences in the structural characteristics of microbial communities and the relationship between microbial communities and physicochemical factors were analyzed based on 16S rRNA high-throughput sequencing technology with Circos, ANOSIM and redundancy analysis (RDA). The results showed that the dominant phyla and genera of microorganisms in rivers entering Changdang Lake with various pollution types were similar, though the relative abundance differed. The dominant phyla included Proteobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes; the dominant genera included hgcI clade, CL500-29 marine group, Acinetobacter, Comamonadaceae-Unclassified and Hydrogenophaga. ANOSIM analyses showed that the microbial community structure characteristics of rivers entering Changdang Lake were related to the type of pollution source. The results of redundancy analysis (RDA) showed that pH and TP were significantly associated with the dominant phylum of bacteria in rivers entering Changdang Lake (P<0.05); DO and pH were extremely associated with the dominant genus of bacteria in rivers entering Changdang Lake (P<0.05). The microbial communities in rivers entering the Changdang Lake were highly diverse at the phylum and genus levels and were correlated with type of pollution sources and physicochemical factors, which provided basis for the pollution prevention and ecological restoration of rivers entering the Changdang Lake.
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受控生态生保系统(controlled ecological life support system，CELSS)通过对大气控制、温湿度控制、食物供应、水再循环和废物处理等技术整合，可保障航天员在地外环境中健康生活和有效工作，是未来地外星球基地长期稳定运行的必要保证[1]。CELSS依据地球生态圈的基本原理，在有限的密闭空间内构建了“人-植物-微生物-环境”自循环式闭路生态系统[1]。其中，植物作为关键功能部件，能够为航天员提供新鲜食物和氧气、吸收二氧化碳和净化水质。在CELSS中，通常选择小麦作为主要的粮食作物，不可避免地会产生大量的植物不可食部分，这部分固废的积累不仅会造成占用舱体空间、发酵腐败等安全卫生问题，还会造成大量资源(如水分、碳元素、氮元素、无机盐等)的浪费。如何高效处理并回收利用这类固体废物，维持CELSS中较高的物质循环利用率与闭合度，已成为CELSS中迫切需要解决的问题。
针对CELSS中小麦秸秆等固废资源化处理问题，美国和俄罗斯等国采用焚烧[2]和湿式氧化[3]等物化技术进行处理。物化技术稳定可靠、反应速率快，但存在着对设备要求高、能耗高、对系统瞬时冲击负荷大、产生氮氧化物而限制元素循环等缺点。生化处理技术则具有能耗低、反应过程温和以及能够有效实现各元素再生循环等优势。CHYNOWETH等[4]采用干式厌氧发酵工艺处理水稻秸秆、废纸和狗粮(模拟成员粪便)混合物，运行时间为23 d，有机物降解率达到了81.2%；并提出针对固废的预处理、后处理(沼渣好氧堆肥)和营养液植物栽培等方面的研究应作为未来研究的方向之一。欧洲太空局采用湿式厌氧消化工艺[5]将反应控制在水解酸化阶段而抑制产甲烷阶段，将有机底物转化为VFAs、氨氮和CO2用于后续的藻类系统和硝化系统使用。WHITAKER等[6]研制了固体高温好氧反应器用于处理志愿者产生的废物，包括粪便、厕纸、食物残渣和卫生废水等，操作温度为55~70 ℃，总固体降解率可达到74%。TIKHOMIROV等[7]通过蘑菇(真菌)培养和蚯蚓等腐生动物对植物不可食部分进行好氧堆肥处理，得到了类土壤基质并用于作物栽培。上述生化处理技术虽可一定程度上实现固废的稳定减容和资源回收，但也面临着设备尺寸较大、反应周期较长或仍需后续的好氧发酵等无害化处理的局限。而好氧堆肥技术作为无害化和资源化的处理方式，对碳氮等养分有较好的保全，可将固废转化为腐殖质，施用后能对植物生长起到促进作用，符合CELSS中物质循环再生的要求，因而受到广泛关注和研究。好氧堆肥技术是通过多种微生物的协同作用来完成物料的降解，因此，微生物的配比是影响好氧堆肥过程的关键因素[8]。有研究[9]表明，堆肥中接种微生物菌剂能使堆温快速升高，有效杀灭堆肥物料中的病原菌和杂草种子，显著促进堆肥腐熟，提高堆肥质量。另外，在CELSS内，由于微生物受到严格的控制和防护，其主要来自航天员体表和体内，种类及数量都无法满足堆肥启动要求。因此，添加一定的功能菌剂对于启动堆肥反应、促进堆肥腐熟和缩短堆制周期至关重要。目前，以微生物菌剂接种用于禽畜粪便和市政污泥相关方面的研究较多[9-10]，通常添加秸秆、木屑等物质起到平衡含水率、调节C/N和通气性等作用[11]，市面上也有多种针对这类固废的商业菌剂。然而，针对农业固废小麦秸秆降解处理的商用菌剂并不常见，且对于菌剂接种用于小麦秸秆堆肥降解效果的研究较少。
为实现CELSS中小麦秸秆等固废的资源化处理，提高系统物质闭合度，本研究以小麦秸秆为主要处理对象，添加厨余垃圾作为调整物料C/N比的营养调节剂，选取3种商业菌剂开展小试反应器强制通风好氧堆肥试验，探究接种菌剂对小麦秸秆好氧堆肥一次发酵阶段降解效果的影响；考察堆肥过程中各项参数变化，分析比较3种菌剂对小麦秸秆的处理效果，探讨不同菌剂在小麦秸秆好氧堆肥各个阶段的降解作用，以期为筛选研制高效降解小麦秸秆的微生物菌剂提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验原料
小麦秸秆购自江苏某农场，经机械粉碎后选取粒径为0.3~0.5 cm的麦秸待用；厨余垃圾取自某单位食堂，将其中的骨头、卫生纸、塑料袋、玉米棒芯等拣出，用粉碎机将厨余垃圾粉碎至浆糊状。堆肥所用物料的基本性质见表1。
表 1 堆肥原料的理化性质Table 1. Physical and chemical properties of the composting materials堆肥原料 含水率/% 全碳含量/% 全氮含量/% C/N比 小麦秸秆 10.11±0.01 41.54±0.38 0.93±0.03 44.67 厨余垃圾 81.09±0.11 52.64±0.46 3.69±0.08 14.27 | Show Table
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1.2 微生物菌剂
针对小麦秸秆特性，选用3种适用于秸秆腐熟的商业菌剂，代号分别为QD、DH、VT。其中，QD菌剂呈液体状，有效活菌数≥109 CFU·mL−1，主要为乳酸菌、木霉菌和芽孢杆菌等；DH菌剂呈固体粉末状，有效活菌数≥5×108 CFU·g−1，主要为枯草芽孢杆菌、米根霉、毕赤酵母菌和戊糖片球菌等；VT菌剂呈固体粉末状，有效活菌数≥5×108 CFU·g−1，主要为酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌等。
1.3 实验装置
本实验采用的堆肥装置如图1所示，主要由带盖塑料桶(桶有效容积为19 L，桶外壁包裹有2层保温棉，桶顶部放置有温度计，桶底部设置有物料托盘)、温度控制系统和通气系统3部分组成。
1.4 实验方法
有别于陆地生态系统，CELSS内没有自然界广泛分布的细菌、放线菌和真菌等微生物，因此，为启动堆肥反应和促进底物腐熟，接种一定的有益菌群是必须的。本实验主要考察不同菌剂对小麦秸秆堆肥过程中一次发酵阶段的降解处理效果，故未设不加菌剂的对照组实验。
实验共分为3组，分别为QD组、DH组和VT组。每组均用小麦秸秆和厨余垃圾按二者干基质量比为4:1的比例均匀混合，混合物料的C/N比控制在30∶1，并调节混合物料的水分含量在65%。接种菌剂时按物料总重的0.5%添加，即QD菌剂接种100 mL，DH菌剂和VT菌剂各接种52 g。每组混合均匀的物料等分装入3个堆肥桶内，每个堆肥桶内均含物料3.50 kg，每组设置3个重复实验。通风量设置为1 L·min−1，持续通风至堆肥结束，堆肥周期设定为30 d。
堆肥开始后分别于第1、5、9、14、19、24和29 d取样，取样前需翻堆，使物料混合均匀。采样时按照5点采样法的原则分别在堆体的上、中、下层采集鲜样共30 g，混合均匀后置于−20 ℃冰箱保存，用于各项指标的测定。
1.5 分析方法
温度采用温度计测定。将温度计插入物料中间及周围3点20 cm处测定温度，取4点温度的平均值作为最终结果，温度每隔24 h测定1次；含水率采用烘干法[12]测定。
浸提液理化性质测定。将5 g鲜样与蒸馏水按质量比1∶10混合并振荡120 min，然后在10 000 r·min−1下离心5 min，过0.45 μm滤膜后，将滤液用塑料小瓶贮存于4 ℃冰箱待用。pH用便携式pH计测定；电导率(EC)用便携式电导率仪测定；在465 nm(E4)和665 nm(E6)下的波长用紫外分光光度计[13]测定。
VS含量和C/N比分别采用灼烧法和元素分析仪法[13]测定。
2. 结果与讨论
2.1 菌剂处理下物料温度的变化特性
3种菌剂处理下物料的温度变化如图2所示。堆肥前3 d，物料中易降解的有机物如可溶性小分子有机物、多糖和脂类等开始降解，该阶段嗜温菌的活性较强，热量快速累积，温度迅速上升至50 ℃以上。3~10 d为高温期，可溶性的中间产物被继续分解转化，耐高温的放线菌数量增加，物料中有机物如淀粉、蛋白质、半纤维素和纤维素等逐步分解。QD、DH和VT处理下的最高温度分别达到了58.2、54.7和53.7 ℃，高温期分别维持了9、6和6 d。第10天后，堆体温度逐渐下降，嗜温细菌和真菌变得活跃，对残留的较难分解的有机物(如木质素)进行分解，物料表面变得疏松且颜色逐渐变为黑褐色，开始形成了腐殖酸等物质[14]。堆肥过程中分别于第5、9、14、19、24和29天对物料进行翻堆，翻堆后物料重新混合均匀，堆体温度稍有上升[15]。最终3组处理下物料的温度均稳定在31 ℃左右，与伴热带温度(发酵环境温度)趋于一致。
图 2 不同堆肥处理物料温度的变化Figure 2. Changes of temperature with different microbial agents during composting3种菌剂处理下的物料均经历了升温、高温和降温期。在高温期维持时间的长短方面表现为QD>DH>VT，只有QD组堆体的高温期维持时间超过了7 d。在温度峰值的高低方面表现为QD>DH>VT，只有QD组堆体的最高温度超过了55 ℃，满足堆肥无害化的要求[16]。综合3组物料温度的变化情况可知，QD菌剂在堆肥过程中能使堆体温度达到55 ℃以上，在高温期持续时间较长，这说明QD菌剂中的微生物可能更多为嗜温菌和高温菌，在升温和高温期的活性更强，对堆体在前期热量的迅速增长和积累有良好的促进作用。
2.2 菌剂处理下物料含水率的变化特性
3种菌剂处理下物料含水率的变化如图3所示。堆肥物料的含水率过高或过低都会影响堆肥的质量，含水率过高会导致堆体局部厌氧，过低会导致微生物活性下降[14]。由图3可知，3组处理下物料含水率总体上均呈现先上升后下降的变化趋势。在升温-高温期物料温度迅速上升，微生物活动剧烈，物料中的有机物被强烈分解，微生物代谢产水的速率大于水分蒸发的速率，导致物料的含水率上升。QD、DH和VT处理下物料的含水率分别在第9、14和9 d达到了最高值，分别为(75.6±1.14)%、(78.9±0.93)%和(79.5±1.55)%。10 d之后，物料的温度下降，微生物活动逐渐减弱，再加上持续的通气及翻堆，物料中的水分被持续带走，微生物代谢产水的速率小于水分蒸发的速率，物料含水率逐渐降低。最终，3组处理下物料的含水率分别降至(59.73±0.13)%、(56.61±2.19)%和(57.42±0.93)%，而有机肥料腐熟的标准要求堆体含水率低于30%[16]，这说明3组物料均达到了初步腐熟，完成了好氧堆肥的一次发酵阶段。后续仍需要进行二次发酵，即温度维持在中温，使物料进一步稳定，最终达到深度腐熟。
图 3 不同堆肥处理物料含水率的变化Figure 3. Changes of water content with different microbial agents during composting2.3 菌剂处理下物料浸提液理化性质的变化特性
3组处理下物料浸提液理化性质的变化如图4所示。EC可以表征有机废物发酵产品中的可溶性盐含量；pH可以反映堆体所处的酸碱性环境；E4/E6可表征堆肥过程中腐殖酸的缩合度和芳构化程度[17]。由图4(a)和图4(b)可知，堆肥前期EC逐渐上升，这是由于堆体中可被微生物直接利用的物质较多，物料中易降解的物质如糖类、脂肪等被断链降解产生了VFAs和大量的无机盐离子，如
HCO−3 NO−3 NH+4 
图 4 不同堆肥处理物料浸提液理化性质的变化Figure 4. Changes of physicochemical properties of the composting extracts with different microbial agents during composting2.4 菌剂处理下物料VS含量的变化特性
VS含量的变化反映了堆肥过程中物料有机物的降解速度和效率。3组处理下物料的VS含量变化如图5所示。由图5可知，3组处理下物料的VS含量均表现为逐渐降低的趋势，物料的初始VS含量(干基)为90%左右。在升温-高温期时，物料的温度迅速上升，微生物生命活动旺盛，物料中易降解的有机物被大量分解，碳元素主要以CO2的形式被释放，物料的VS含量迅速下降。在降温期时，物料的温度下降，此时物料内的有机物主要为难降解的木质纤维素等，有机物的降解速率变小。最终，QD、DH和VT处理下物料的VS含量分别稳定在(71.96±0.89)%、(65.84±1.19)%和(68.16±0.93)%。
3种菌剂处理下物料VS含量的减少情况如表2所示。3组处理下物料中有机物的降解效率表现为DH>VT>QD；QD、DH和VT处理下物料VS的减少量分别为(18.87±0.89)%、(24.48±1.60)%和(22.08±0.72)%。升温-高温期时，QD、DH和VT处理下物料的VS减少含量分别为(15.04±0.42)%、(10.99±1.28)%和(15.54±0.71)%，分别占VS减少总量的79.7%、45.2%和70.4%。VS含量的减少情况表明，QD和VT处理下物料中有机物的降解主要发生在升温-高温期，而DH处理下物料有机物的降解主要发生在降温期。这是因为，QD和VT菌剂中的乳酸菌和酵母菌等对糖类等物质有较强的利用能力，而DH菌剂中的枯草芽孢杆菌和米根霉能分泌纤维素酶从而对物料中的木质纤维素有着较好的降解作用[21]，这说明3种菌剂对物料中有机物降解效果的差异性与菌剂中微生物的组成配比密不可分。
表 2 堆肥前后VS含量的减少情况Table 2. Reduction of VS content before and after composting% 处理组 初始VS含量 终点VS含量 升温-高温期VS减少量 VS减少总量 QD 90.83±0.18 71.96±0.89 15.04±0.42 18.87±0.89 DH 90.12±0.44 65.84±1.19 10.99±1.28 24.48±1.60 VT 90.24±0.26 68.16±0.93 15.54±0.71 22.08±0.72 | Show TableDownLoad:
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2.5 菌剂处理下物料C/N比的变化特性
C/N比的变化可以反映堆肥过程中物料有机物矿质化和腐殖化的进程[22]。有研究[23]表明，适合微生物生长的物料C/N比范围为25∶1~30∶1。3组处理下物料C/N比的变化如图6所示，可见，3组物料的C/N比均呈现下降的趋势，变化曲线的斜率随堆肥过程的持续而逐渐降低，这与VS含量的变化情况一致。物料的初始C/N比均在30∶1左右，是适宜微生物生长的环境。堆肥前10 d堆体温度上升，微生物迅速生长繁殖。其中，易分解的含C有机物被微生物分解吸收利用，并通过呼吸作用变为CO2等气体排出堆肥系统，因而C含量逐渐变低。N素被微生物利用会以NH3的形式散失，但其下降幅度低于有机物总干物质的下降幅度，故干物质中全N含量会相对增加[22]，总体则表现为C/N比迅速降低。10 d之后，物料的温度降低，微生物生命活动减弱，物料达到初步稳定腐熟，C/N比下降趋势变缓并趋于稳定。3组处理下物料的C/N比均由初始的30∶1降至12∶1以下，分别为11.71±0.16、11.67±0.20和11.45±0.16，终点C/N比与初始C/N比的比值分别为0.39、0.38和0.37，尽管满足堆肥腐熟时终点C/N比与初始C/N比的比值不超过0.5的要求[24]，然而在实际应用中应该参照其他指标，如生物活性和植物毒性等，对堆肥的腐熟程度进行综合评价。
3. 结论
1) QD菌剂可以提高堆肥温度至58.2 ℃，堆体的高温期为9 d，满足堆肥无害化要求；DH菌剂可以促进物料中有机物的降解，降解率可达24.48%；3种菌剂对堆肥中腐殖质的形成和积累均有一定的促进作用。
2) 3组处理下的堆体进入降温期后均开始形成腐殖质，物料达到初步腐熟，即完成了一次发酵。后续仍需要进行二次发酵处理，使堆体达到完全腐熟，即可作为土壤改良剂或有机肥施用。
3)微生物配比不同是导致小麦秸秆好氧堆肥降解效果存在差异的重要因素。后续需分析堆肥过程中的微生物种群，进一步明确功能菌群和功能基因，考察微生物在小麦秸秆堆腐过程中的作用机理。
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图 1 长荡湖入湖河流采样点位分布
Figure 1. Distribution of sampling sites in rivers entering Changdang Lake
图 2 长荡湖入湖河流门分类水平微生物群落相对丰度图
Figure 2. Relative abundance of microbial communities of rivers entering Changdang Lake at the phylum level
图 3 长荡湖入湖河流门分类水平微生物群落结构圈图
Figure 3. Circos map of the microbial community in rivers entering Changdang Lake at the phylum level
图 4 长荡湖入湖河流属分类水平微生物群落相对丰度图
Figure 4. Relative abundance of microbial communities in rivers entering Changdang Lake at the genus taxonomic level
图 5 长荡湖入湖河流优势菌门与理化因子间的冗余分析
Figure 5. RDA between dominant bacterial phylum and physicochemical factors in rivers entering Changdang Lake
图 6 长荡湖入湖河流优势菌属与理化因子间的冗余分析
Figure 6. RDA between dominant bacterial genera and physicochemical factors in rivers entering Changdang Lake
表 1 长荡湖入湖河流采样点位置信息
Table 1. Sampling locations in rivers entering Changdang Lake
污染类型 采样点编号 经度 纬度 农村生活污染 W152 119°29′28.67″E 31°37′13.51″N W153 119°29′25.54″E 31°35′1.75″N W154 119°29′9.86″E 31°34′32.47″N W155 119°29′36.09″E 31°32′45.49″N W162 119°35′39.21″E 31°40′28.72″N 农业面源污染 W150 119°31′15.62″E 31°39′31.88″N W151 119°30′30.00″E 31°38′18.13″N 渔业养殖污染 W157 119°33′27.30″E 31°34′43.09″N W159 119°36′34.12″E 31°36′52.48″N W161 119°36′30.18″E 31°39′23.19″N W164 119°32′57.24″E 31°40′17.43″N
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表 2 长荡湖入湖河流水体理化指标
Table 2. Physical-chemical indicators of rivers entering Changdang Lake
污染类型 点位 TOC/(mg·L−1) TN/(mg·L−1) TP/(mg·L−1) WT/( ℃) pH DO/(mg·L−1) TN/TP 农村生活污染 W152 2.70 1.98 0.10 24.7 7.9 6.34 19.80 W153 5.90 1.94 0.10 26.9 8.02 6.77 19.40 W154 6.10 1.88 0.10 26.6 7.97 5.63 18.80 W155 6.30 1.83 0.11 27.4 8.02 6.56 16.64 W162 4.10 0.69 0.03 27.1 8.09 7.49 23.00 农业面源污染 W150 3.20 2.71 0.12 24.9 7.72 4.55 22.58 W151 3.00 2.83 0.10 24.5 7.83 5.71 28.30 渔业养殖污染 W157 4.20 0.70 0.04 27.2 8.14 7.28 17.50 W159 4.00 0.72 0.04 27.6 8.02 6.43 18.00 W161 4.00 0.64 0.04 28 8.01 7.89 16.00 W164 3.10 1.79 0.05 26.2 8.03 6.57 35.80
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表 3 长荡湖入湖河流微生物Alpha多样性指数
Table 3. Alpha diversity index of microorganisms in rivers entering Changdang Lake
污染类型 点位名称 Ace Chao1 Shannon Simpson Coverage 农村生活污染 W152 5897 5619 8.5312 0.0114 0.974 W153 5733 5537 8.3473 0.0129 0.978 W154 6051 5856 8.6283 0.0101 0.977 W155 6738 6415 8.7358 0.0118 0.970 W162 4443 4243 8.0785 0.0166 0.973 农业面源污染 W150 4134 4125 6.5501 0.0572 0.977 W151 3805 3687 6.8585 0.0376 0.983 渔业养殖污染 W157 3698 3619 7.9462 0.0133 0.973 W159 3733 3606 7.4672 0.0249 0.975 W161 3763 3632 7.3288 0.0339 0.978 W164 4997 4849 8.2801 0.0135 0.973
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