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伴随着我国城镇化进程的加快，市政污水的处理需求在快速上升。由于我国现代化建设起步较晚，污水排放管网建设多采用合流制[1]，致使管道除了承接生活污水之外，还容纳了工业废水及雨水等[2]。当前我国市政污水总体呈现出有机污染物含量低、水质水量变化大、污染物成分复杂等特点[3]，导致在污水处理中，生物脱氮的实际效果不佳，出水水质不达标。污水中的大量氮源若不能达到排放标准就进入自然水体，势必加剧河道和湖泊水体的富营养化[4]。因此，解决低碳氮比市政污水含碳量不足的问题，是提高市政污水处理高效脱氮的重要方向。
常规的生物脱氮主要由氨化作用、硝化作用和反硝化作用3个部分完成。根据氮的存在形态，功能微生物菌群在特定微环境下相互协作，共同完成脱氮过程[5]。当前生物脱氮多采用悬浮生长系统为主的缺氧/好氧、厌氧/缺氧/好氧、序批式活性污泥法、氧化沟等传统工艺。但这些传统生物脱氮工艺存在多种缺点，例如：因活性污泥在水中的形态多为絮体状，导致反应装置的水力停留时间和污泥停留时间难以控制；污泥内的自养菌生长周期长，易随出水流出；活性污泥抗环境胁迫能力较差等[6-8]。
为克服上述缺点，以填料为载体的悬浮生长系统正在被广泛采用。其中代表性工艺包括生物接触氧化、生物转盘、及生物滤池等[6,9]。不过，常规填料上附着的活性生物膜厚度一般不超过2 mm。受传质阻力和水力冲击的作用，生物膜较易脱落，因而影响水处理效能。近来有研究在单一反应器中引入改性玄武岩纤维(modified basalt fiber, MBF)做填料。这种新型生物载体可快速吸附活性污泥，形成一种有别于传统生物膜的微生物聚集体(生物巢)[10]。通常，生物巢尺寸可达10 cm以上。其生物量虽然巨大，但并不影响传质和生物活性，因而可实现不同类型污/废水的高效脱氮除碳[11]。相对于传统填料，新型改性玄武岩纤维更适合做生物载体。其能够富集大量的功能微生物菌群，尤其是生长缓慢的氨氧化细菌、亚硝酸盐氧化菌以及异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrifying aerobic denitrifying, HN-AD)菌等[12-13]。尽管从材料改性的角度可以优化功能微生物的富集，但功能微生物的生长通常受到生理条件如C/N比的限制。在传统的生物脱氮过程中，生物反硝化需要大量的有机碳源作为电子供体。而我国的市政污水的碳氮比普遍较低，导致反硝化菌生长受到抑制。为了降低出水中含氮污染物的浓度，现有工艺通常通过外加碳源来提高污水的碳氮比。不过，使用外加碳源一方面会增加污水厂的运行成本，另一方面由于实际废水进水的水质水量具有较大的波动性，碳源投加量难以精确控制[14]。
在此背景下，解决市政污水中碳源有效利用的问题就成了当前污水处理领域的研究热点之一。考虑到在偏中性和碱性环境中NO3−/NO2−电对的氧化还原电位高于Fe(II)/Fe(III)，研究人员尝试在复杂菌群中投加铁氧化物介导种间电子传递，以实现有机底物氧化与硝酸盐还原的耦合。纳米级铁氧化物如赤铁矿(α-Fe2O3)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3)、磁铁矿(Fe3O4)作为半导体和导体材料具有良好的生物亲和性。微生物可以利用这些纳米材料作为电子介体实现电子传递[15]。据报道Geobacter sulfurreducens可以氧化乙酸盐但不能还原NO3−，而Thiobacillus denitrificans能够还原NO3−但不能氧化乙酸盐。两者的共培养并不能实现有机物氧化和硝酸盐还原的耦合发生，但当添加α-Fe2O3或Fe3O4纳米颗粒时共培养体系能成功实现共代谢[16]。此外，研究还发现氢自养反硝化菌的外膜细胞色素对α-Fe2O3具有高度亲和性，借助α-Fe2O3可加速电子向胞内硝酸盐还原酶的传递，从而促进反硝化的进行[17]。因此，铁氧化物介导的种间电子传递为菌群共代谢提供了一种有效途径[18]。此外，对于一些具有跨膜电子转移能力的反硝化菌，进入细胞内部的α-Fe2O3有可能在周质空间直接介导NADH(还原性辅酶I)等电子供体与硝酸盐还原酶之间的电子传递。因此，这种胞内电子传递促进机制也为碳源有效利用提供了新的途径。但是，目前尚未有关于投加铁氧化物以解决市政污水碳源不足问题的研究报道。
为此，本研究选用MBF作为生物载体，在生物接触氧化池中培养生物巢，借助于生物巢独特的好氧-缺氧-厌氧微环境，富集各种与氮转化相关的功能微生物。同时，在池体中投加纳米氧化铁(α-Fe2O3)，考察其介导种间或胞内电子转移机制对脱氮效能的刺激作用，并解析氮转化的代谢通路。本研究旨在探索α-Fe2O3介导下碳源有效利用的可行性及潜在的机制，为提高低碳氮比市政污水的高效脱氮提供一种新的策略。
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本实验所选用的种泥均采自镇江市某污水处理厂中的好氧生化池。在曝气条件下培养种泥，每日静置30 min后的上清液用等体积培养液替换。培养液的主要成分包括5 g·L−1的胰蛋白胨、10 g·L−1的酵母菌浸出物和10 g·L−1的NaCl。培养7 d后检测污泥的MLSS和MLVSS，测得MLSS含量为4 000 mg·L−1、MLVSS含量为2 211 mg·L−1、VSS/SS为0.552 8。随后将上述污泥接种到反应器中，同时保存部分污泥(−80 ℃冰箱)中用于微生物群落检测。在通入实际污水之前，反应器的出水COD和总氮(TN)需连续稳定7 d，使用模拟污水培养反应器的运行水质稳定状况如图1所示。
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本实验所选用的低C/N(1.83±0.51)市政污水取自镇江某市政污水处理厂的夏季进水，进水有机碳源的质量浓度过低，C/N比已经接近1:1，远低于正常生物脱氮所需要的C/N，且进水水质含量受天气影响有较大的波动。实验所用污水的水质质量浓度的变化见图2。
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本实验选用纳米α-Fe2O3作为外加铁源。该α-Fe2O3(罗恩试剂)外观形貌主要呈球形，尺寸在20 nm。活性污泥MLSS与纳米氧化铁按3:1的质量比投加入反应器中。
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本研究所设计的反应器为小型生物接触氧化池。设计反应器池体高70 cm，直径30 cm，池体容积设计为25 L。池体顶部设置溢流堰，底部设置排泥口，整体为亚克力板构造而成。在池体底部设有环状曝气管，自下至上给反应器提供曝气功能。反应器进水口设置于池体右下侧、略高于并紧贴于曝气环。出水口设置于反应器溢流堰的左上方。每个反应器培养3座生物巢。相邻生物巢间距为5 cm，放置位置须高于底部曝气环10 cm。反应器设计水力停留时间为12 h，包括换水沉淀1 h和曝气运行11 h，以连续流的形式运行，控制流量泵的流速为35 mL·min−1。具体反应装置示意图如图3所示。
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实验分为对照组和实验组。对照组直接将25 L活性污泥加入反应器中，而实验组除加入25 L活性污泥外，还混入33.3 α-Fe2O3。2组反应器同步运行。2组反应器均悬挂MBF(纤维长15 cm，单丝直径13 μm)填料，通过吸附活性污泥以形成稳定的生物巢。待反应器稳定后，持续运行36 d。每天定时采集进水和出水并进行水质检测。实验期间，反应器内的水温控制在25~30 ℃，溶解氧(DO)维持在3~5 mg·L−1，进水pH维持在7.0~7.5。反应器运行过程中每天采集进出水水样。统计数据采用中位数进行分析。
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进出水中的BOD使用BOD检测仪(Lovibond BD600)检测。TN、NH4+、NO2−、NO3−和COD分别使用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(GB 11894-89)、纳氏试剂分光光度法(GB 7479-87)、盐酸萘乙二胺分子吸收分光光度法(GB 7493-87)、盐酸紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)和快速消解分光光度法(HJ/T 399-2007)进行检测。
实验结束后，对两座反应器的泥样进行宏基因组测序，以探究反应器中的微生物群落组成。采用CTAB法提取样本的DNA，利用Agilent 5400依次检测样本的DNA浓度、完整性和纯度。随后取用检测合格的样品，用Covaris超声波破碎仪将样品的DNA链打断，制备长度在350 bp左右的DNA片段，再对DNA片段进行修饰、加尾、接头、纯化、PCR扩增等[19-21]。最后，在Illumina NovaSeq高通量测序平台(深圳微科盟科技集团有限公司)上对样品DNA进行宏基因组测序，从而得到样品的宏基因组数据。最后基于RAST和KEGG数据库上对氮转化和生物电子转移相关的功能基因进行注释。
另取样品，用PBS缓冲溶液反复清洗3次并去除上清液，再用25%戊二醛溶液固定样品并置于4 ℃冰箱中12 h，随后再次使用PBS缓冲溶液清洗样品，并依次使用浓度为50%、60%、70%、80%和100%的乙醇稀释液对样品进行5次脱水处理备用[22]。最后将样品放置于硅片上，置于真空冷冻干燥箱内干燥，喷金处理后在透射电镜(TEM)上扫描拍摄，以观察样品形态及纳米Fe2O3的聚集位置。
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待反应器通入实际污水之后，开始测量2组反应器的进出水水质。本实验所使用的污水水质波动较大，在反应器运行后期进水中有机氮的质量浓度升高(图2)，总氮的进水质量浓度由30~40 mg·L−1提升至50~60 mg·L−1，反应器的出水总氮质量浓度也随之升高。整体而言，对照组的平均总氮出水质量浓度为(34.22±9.17) mg·L−1，实验组的平均出水质量浓度则为(29.63±8.14) mg·L−1(图4(a))；对照组的平均总氮去除率保持在(21.85±11.35)%左右，而实验组的平均总氮去除率则达到了(32.21到了平均总率保持。相比于对照组，实验组的总氮去除率提高了10% 左右，说明投加α-Fe2O3可以提高总氮的去除率。
实验所用污水的进水COD值在暴雨天低至40~50 mg·L−1，日常维持在80 mg·L−1，最高能达到130~150 mg·L−1(图2)。而反应器的平均出水COD值明显降低，且波动幅度减小。从COD的平均去除率来看，对照组的平均去除率为(49.84±19.37)%，而实验组的平均去除率则为(53.33±17.5)%(图4(b))。从出水COD值来看，对照组的出水COD值为(35.35±16.34) mg·L−1，实验组则为(32.43±8.17) mg·L−1。实验组的出水COD值基本低于《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A标准的出水指标。
整体而言，实验组中单位COD的脱氮量TN/COD约为0.370，明显高于对照组TN/COD的0.234，脱氮效率提高了58%(图4(c))。这一结果证明了在实际污水的处理中，纳米氧化铁的添加能够有效提高单位COD的利用效率。
此外，在对2组反应器出水总氮组成进行检测时发现，实验组出水中有机氮的质量浓度要低于对照组。这也证明相较于对照组，α-Fe2O3能够诱导池体内的大量微生物将进水中的有机氮化成氨氮。所以结果表现为出水时实验组总氮质量浓度低于对照组，同时氨氮又高于对照组的现象，因此，即使实验组的出水氨氮质量浓度要高于对照组，也不能说明实验组的脱氮效果差。其中，对照组的出水氨氮质量浓度为(3.03±2.49) mg·L−1，而实验组的出水氨氮质量浓度则为(5.89±2.66) mg·L−1，到25 d后因水质波动分别提升至(9.83±2.82) mg·L−1和(17.27±3.86) mg·L−1(图5(a))。
该市政污水的硝态氮及亚硝态氮的质量浓度很低，平均进水质量浓度仅为0.49 mg·L−1及0.03 mg·L−1(图2)。但因为进水有机碳源不足，导致反硝化作用不充分，2组反应器的出水中硝酸盐及亚硝酸盐质量浓度均有上升。整体而言，对照组的出水硝酸盐质量浓度平均为(19.14±5.77) mg·L−1，高于实验组的(11.50±5.38) mg·L−1(图5(b))；对照组的出水亚硝态氮质量浓度平均为(2.05±1.13) mg·L−1，高于实验组的(1.70±0.86) mg·L−1(图5(c))。这证明添加了α-Fe2O3的实验组在碳源不足的污水中的反硝化能力要强于对照组。结果证明添加α-Fe2O3能够提高实际市政污水处理中的生物脱氮效率。
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原始泥样的MLSS含量为4 000 mg·L−1，MLVSS为2 211 mg·L−1，VSS/SS为0.552，显示本实验所用污泥活性较高[23]。如表1所示，2组反应器经过约40 d的培养后，对照组的污泥MLSS含量为4 125 mg·L−1，MLVSS为2 253 mg·L−1以及VSS/SS为0.553。这一结果显示，对照组的污泥生物质与原始泥样相比没有明显变化。而实验组因为额外投加了α-Fe2O3，MLSS和MLVSS含量分别显著提升至5 239 mg·L−1和2 599 mg·L−1，同时VSS/SS降至0.496，显示污泥生物质存在明显变化。其中实验组的MLSS含量仅比对照组的含量增加了1 114 mg·L−1，低于投入反应器中1 333.3 mg·L−1的α-Fe2O3，说明α-Fe2O3会随着反应器的出水少量流失。同时实验组的MLVSS比对照组高了316 mg·L−1。这说明α-Fe2O3可能具有诱导胞外聚合物分泌的能力。
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通过宏基因组对2组反应器中的微生物群落进行门和属水平上的分类并进行功能结构分析。依据宏基因组学的物种丰度聚类分析测序结果显示，2组反应器的活性污泥中总共包含42个菌门，其中未被定义的菌门分别占对照组和实验组中总菌门的25.28%和23.54%。在门水平上，在对照组和实验组反应器中占比均超过1%的有Proteobacteria (51.64%；53.69%)、Actinobacteria (11.62%；15.13%)、Nitrospirae (6.19%；2.23%)、Bacteroidetes (1.65%；2%)和Firmicutes (1.04%；1.62%) (图6(a))。其中，在2组反应器中占比较高的Proteobacteria (变形菌门)和Actinobacteria (放线菌门)是优势菌门，二者在不同反应器中占比均超过了10%。变形菌门中含有大量可以分别在好氧和厌氧的环境中生存的硝化以及反硝化菌属 [24-25]。这2个菌门在实验组中的占比均高于对照组，说明投加α-Fe2O3可以刺激反硝化菌的生长。剩余的优势菌门Nitrospirae (硝化螺旋菌门)、Bacteroidetes (拟杆菌门)和Firmicutes (厚壁菌门)中同样包含大量与氮代谢相关菌属，说明反应器的微生物群落有利于去除含氮污染物。
而属水平上的分类显示，2组反应器中未被定义的菌属分别占对照组和实验组中总菌属的29.8%和27.19%。在对照组和实验组反应器中占比均超过1 %的属分别有Thauera (17.34%；11.85%)、Nitrospira (6.19%；2.23%)、Alicycliphilus (3.62%；2.14%)、Candidatus_Accumulibacter (2.89%；3.9%)、Mycolicibacterium (2.84%；1.83%)、Pseudomonas (2.52%；2.93%)、Micropruina (2.48%；5.78%)、Dechloromonas (2.42%；2.68%)、Casimicrobium (2.11%；5.11%)、Afipia (1.79%；1.57%)、Diaphorobacter (1.71%；1.44%)、Sphaerotilus (1.31%；6.37%)(图6(b))。其中，优势菌属Thauera、Pseudomonas以及Dechloromonas是具有异养硝化-好氧反硝化功能的菌属，能在有氧条件下将不同形态的氮转化为氮气[26-28]。此外，一些HN-AD菌被证明具有尿素水解酶[29]，可以将有机氨转化为氨氮。这可能是实验组反应器内氨氮质量浓度高于对照组的原因。Nitrospira是典型的亚硝酸盐氧化菌[30]。Alicycliphilus具有多样性的代谢机制，可利用硝酸盐等作为电子受体，参与污水处理中的反硝化过程[31]。Candidatus_Accumulibacter是典型的反硝化聚磷菌，在缺氧条件下以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体实现反硝化和聚磷[32]。Mycolicibacterium是一种革兰氏阳性菌，具有脲酶和硝酸盐还原活性[33]。Casimicrobium是市政污水处理厂一种常见的好氧菌，却能将硝酸盐还原为唯一产物亚硝酸盐[34]。Sphaerotilus是一种铁基好氧菌，能够以以Fe2+为电子供体实现自养反硝化[35]，其相对丰度在实验组中增加进一步证实了α-Fe2O3参与了反硝化菌的呼吸过程。Micropruina是一种聚糖元菌，在厌氧条件下可以将糖、氨基酸等同化成末端发酵产物如乳酸盐、乙酸盐、乙醇、丙酮酸盐等(作为内源性碳)[36]。Afipia属主要参与大多数有机底物如葡萄糖、果糖、蔗糖等的氧化[37]。总之，氨氮的转化和去除是HN-AD菌、硝化菌、反硝化菌共同作用的结果。
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通过对比2组反应器中与氮转化相关基因，可以分析α-Fe2O3对生物脱氮的影响。首先探究了能够影响氨化过程的功能基因，研究发现检出的实验组氨化功能基因簇ureA、ureB和ureC的表达量均高于对照组[38]，分别为对照组的1.58，1.89和1.03倍。此外，实验组中还检出了对照组中所没有的功能基因gdh[39](图7(a))。这说明在功能基因的层面上，α-Fe2O3确实能够诱导微生物更高效进行氨化反应。这进一步印证了对照组反应器中氨氮质量浓度较高的现象。在能够影响硝化过程功能基因中，功能基因amoB、amoC、hao、nxrA和nxrB的表达量实验组均高于对照组[40]，分别为对照组的1.36、1.19、1.29、1.05和1.31倍，证明添加α-Fe2O3确实可以提高微生物的硝化潜能(图7(b))。而在影响反硝化过程的功能基因中，除narI和nirK外，实验组的narG、narH、napA、napB、nirS、norC、norB和nosZ的相对表达量均高于对照组[41]，分别为对照组的1.05、1.31、1.59、2.09、1.04、2.23、1.68、1.19倍(图7(c))。功能基因相对丰度的差异表明，添加α-Fe2O3可正向调控氮转化功能基因的表达。本研究显示在单一池体的曝气条件下，生物巢可以实现同步硝化和反硝化。
此外，本研究对跟电子转移蛋白相关的编码基因进行了研究，共检索到4个编码跨膜电子转移蛋白的功能基因，分别是mtrA、mtrB、mtrC和macA[42]。与对照组相比，实验组的4个功能基因的表达量均受到了抑制，分别为对照组的67.89%、47.59%、63.56%和58.23% (图8)。这意味着投加α-Fe2O3后细胞已不需要更多的跨膜电子转移蛋白参与电子向胞外的传输，从而导致电子转运蛋白表达量减少。
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如上所述，实验组中跨膜电子转移相关基因的表达量要普遍低于对照组，这意味着更多的电子参与胞内含氮化合物尤其是硝酸盐的还原或反硝化过程。这导致了α-Fe2O3存在的情况下，消耗单位COD可以有利于去除更多的TN。外膜上电子转移蛋白表达的下调间接表明α-Fe2O3在胞内参与了电子传递与含氮化合物的转化[43-44]。此外，TEM表征结果(图9)表明，实验组中的细胞内存在大量黑色颗粒物，而未投加α-Fe2O3的对照组中则没有颗粒物的堆积。这一现象进一步证明了α-Fe2O3能够进入胞内参与电子传递(即介导了NADH等电子供体与硝酸盐还原酶之间的电子传递)，保证了更多电子(或碳源)被用于反硝化过程。这解释了在α-Fe2O3存在下消耗单位COD可以去除更多TN的原因。
综上所述，α-Fe2O3一方面能够显著提高氮转化相关基因的表达水平，提高系统内氮转化的效率；另一方面能够下调微生物周质空间和外膜上电子转移蛋白的表达，减少了跨膜的电子转移，将更多的电子留存在胞内进行硝酸盐呼吸，实现碳源的有效利用。基于出水水质、微生物群落结构、功能基因结构及其表达水平，本研究推测性地提出了α-Fe2O3介导下反硝化菌胞内的氮代谢通路(图10)。
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本研究依据外加铁源对生物脱氮性能的影响，探索性地将α-Fe2O3材料和MBF生物巢联系起来，成功构建出一种能够显著提高MBF生物巢反应器内单位COD利用效率的新工艺。具体结论如下。
1)实际污水实验中，对照组和实验组反应器对总氮的去除率分别为(21.85±11.35)%和(32.21±11.35)%，单位COD的脱氮效率(TN/COD)则分别为0.234和0.370，实验组比对照组的脱氮效率高出58%，说明α-Fe2O3能够提高MBF生物巢反应器对实际市政废水的脱氮效果。
2)宏基因组测序结果表明，α-Fe2O3的投加提高了氮转化相关基因的表达量，同时能够抑制周质与外膜上电子转移蛋白相关基因的表达。这说明α-Fe2O3能够参与胞内电子转移，促使更多电子参与胞内硝酸盐呼吸作用。
纳米Fe2O3强化MBF生物巢脱氮的机制
Augmentation of nitrogen removal by MBF bio-nests supplemented with nano-Fe2O3
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摘要: 针对我国市政污水C/N比偏低的问题，本研究旨在探讨纳米氧化铁在MBF生物巢反应器中对低C/N比市政污水处理的强化脱氮效果及其机理。将纳米氧化铁添加到MBF生物巢反应器中，处理实际低C/N比市政污水，通过监测脱氮效率和碳源利用情况，结合微生物群落结构和功能基因表达量的分析，评价其处理效果。结果表明，纳米氧化铁的加入可显著提高反应器的脱氮效率，脱氮率提升了58%。微生物群落结构分析结果表明，纳米氧化铁影响了特定脱氮微生物的相对丰度。功能基因表达量分析结果表明，纳米氧化铁下调了微生物外膜上电子转移蛋白的表达，减少了种间电子传递，从而提高了胞内电子的有效利用率。以上结果表明，纳米氧化铁通过调节微生物群落结构和功能基因表达，可提高碳源的利用效率，进而实现对低C/N比市政污水的有效脱氮，可为市政污水处理提供技术途径参考。Abstract: Addressing the issue of low C/N ratio in municipal wastewater in China, this study aims to investigate the enhanced nitrogen removal efficacy and its mechanism of nano-iron oxide in an MBF bio-nest reactor treating municipal wastewater with low C/N ratio. As nano-iron oxide was added to the MBF bio-nest treating actual municipal wastewater with low C/N ratio, the nitrogen removal efficiency and carbon source utilization were monitored, and the microbial community structure and functional gene expression levels were also analyzed, then the performance on treating wastewater with low C/N ratio was evaluated. The results showed that addition of nano-iron oxide significantly increased the nitrogen removal efficiency of the reactor by 58%. Microbial community structure analysis revealed that nano-iron oxide affected the relative abundance of specific nitrogen-removing microorganisms. Functional gene expression analysis found that nano-iron oxide downregulated the expression of electron transfer proteins on the outer membrane of microorganisms, reducing interspecies electron transfer and thereby enhancing the effective utilization of electrons within the cells. Above results indicated that nano-iron oxide increased the efficiency of carbon source utilization and effectively removed nitrogen from municipal wastewater with low C/N ratio through regulating microbial community structure and functional gene expression. This provides a new technical approach for municipal wastewater treatment.
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餐厨垃圾是指餐馆、饭店、单位食堂等的饮食剩余物，以及后厨的果蔬、肉食、油脂、面点等的加工过程废弃物。近年来，我国的餐厨垃圾产生量每年以超过10%的速度持续增长[1-2]。若不经妥善处理，餐厨垃圾会腐烂变质，进而污染土壤和水体，同时散发恶臭气体、传播疾病，危害人群健康[3]。传统的餐厨垃圾处理方式如填埋、焚烧等处理过程中可能会导致渗滤液中的高浓度有机污染物进入土壤和地下水，再加上填埋产生的甲烷、焚烧产生的二噁英等也可能进入空气，因此，传统的处理方式存在二次污染的可能[4]。利用厌氧发酵等生化方法对餐厨垃圾进行无害化和资源化利用是绿色有效的[5]。将餐厨垃圾固液分离后，固相经一定的处理可制得生物蛋白，液相经过定向生物转化、高效分离加以利用。该过程可获得的产品包括乳酸、乙醇、丁醇、己酸、氢气、沼气等。这些产物为增值化学品，具有较高的利用价值[6]。
乳酸是三大有机酸之一，已广泛应用于酿酒、医药、食品、化妆品、卷烟、制革等领域。此外，乳酸还是一种重要的生物基平台化合物，可作为生产原料制造其他化学品，如聚乳酸、丙烯酸、丙酸、2,3-戊二酮、丙酮酸、丙烯、乳酸酯(绿色环保溶剂)、乳酸盐等[7]，具有广阔的应用前景。以乳酸为主要原料聚合生成的聚乳酸，是一种新型的生物降解材料，为重要的塑料替代品。随着各国对抗塑料污染、鼓励开发生物降解塑料等政策的实施，聚乳酸市场需求快速增长，并成为乳酸的第一大应用领域。以乳酸为原料制造聚乳酸，其市场占比约为37.5%。
由于化学法生产乳酸往往产生DL-乳酸的外消旋混合物，因此，目前在工业上应用较多的是发酵法，约占乳酸生产的90%以上[8]。但微生物发酵生产乳酸存在3个主要瓶颈：一是适应复杂底物的优势乳酸工程菌的选育；二是发酵底物和营养物质的高成本；三是下游工艺(分离和纯化步骤)的复杂和高成本。
餐厨垃圾有机物含量高，含有丰富的氮、磷及微量元素，是很好的生物发酵培养基。在利用餐厨垃圾进行乳酸发酵前往往需要先经过预处理过程，以便于微生物更好地利用底物。生物发酵产乳酸的流程图如图1所示。
本文从餐厨垃圾乳酸发酵技术的高产菌株选育、与其他废物协同发酵及缓解产物抑制的原位分离耦合发酵3个方面，对国内外相关研究进行综述，并梳理餐厨垃圾乳酸发酵领域的新进展，以期为解决该领域存在的瓶颈问题、促进其产业化提供参考。
1. 乳酸发酵用微生物
1.1 细菌
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是最常见且在工业中使用最多的细菌，为革兰氏阳性菌，是无芽孢的球菌或棒状菌。LAB利用单糖或二糖来发酵产乳酸，其适宜的生长温度为5~45 ℃，pH为5.5~6.5。氨基酸、核苷酸、矿物质、维生素、脂肪、碳水化合物等均可作为其营养来源[9]。另外，LAB分布广泛，种类众多，从各种物质中分离和筛选出的野生型LAB是获得可发酵和遗传稳定菌株的最主要来源，已有多种菌株用于乳酸生产中[10]。然而，受自身和发酵环境所限制，野生乳酸菌的发酵能力也有限，因此，分离得到高产量的野生乳酸菌是LAB研究的主要内容。
乳酸发酵可分为同型发酵、异型发酵和双岐发酵3种途径，其反应式分别如式(1)~(3)所示。
stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2) stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (3) 同型发酵是通过糖酵解途径(embden meyerhof pathway，EMP)得到乳酸，该过程产物纯度高，糖产乳酸的理论转化率为100%。然而，由于该过程存在微生物的其他生理活动，如细胞生长、蛋白质合成等，故实际转化率会低于理论转化率。一般认为，实际转化率达到80%以上者，即为同型乳酸发酵。异型发酵和双岐发酵途径的理论转化率仅为50%。
从环境中分离得到乳酸菌是相对快捷的方法。WANG等[11]利用自行分离得到能耐高温的TY50乳酸菌，可在温度为45 ℃，pH为5.5~6.0的条件下发酵餐厨垃圾产乳酸。该课题组还利用TD46乳酸菌对餐厨垃圾进行不灭菌发酵，产生的乳酸浓度比未接种乳酸菌的对照组提高了75.1%[12]。KWAN等[13]先用泡盛曲霉或米曲霉对餐厨垃圾进行水解，之后利用干酪乳杆菌(Shirota)对餐厨垃圾发酵产乳酸，乳酸产率可达0.27 g·g−1(以单位干重餐厨垃圾的乳酸产量计)。
芽孢杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧菌，也可用于生产乳酸。PLEISSNER等[14]利用食品废物和烘焙废物的混合物制乳酸，将用真菌酶水解后再进行脱脂的产物作为凝结芽孢杆菌生产乳酸的氮源，效果较好，并降低了成本。SAKAI等[15]分离出一种地衣芽孢杆菌TY7，在50 ℃下对餐厨垃圾进行不灭菌发酵，可产生40 g·L−1的L-乳酸，其光学纯度为97％，生产率为2.5 g·(L·h)−1。该课题组还利用嗜热芽孢杆菌，在55 ℃、pH为5.5的情况下发酵5 d，积累了86 g·L−1的乳酸，光学纯度为97%[16]。高温发酵环境会使该芽孢杆菌在与餐厨垃圾中土著菌群的竞争中处于优势，又由于其对pH相对敏感，故利用该芽孢杆菌发酵的关键就是控制温度的同时也要控制pH，以保证产生高质量的L-乳酸。
1.2 真菌
真菌也可用以生产乳酸。与细菌相比，部分真菌可直接利用淀粉等大分子底物，而不需先进行糖化。其中，米根霉的相关应用较多，它对营养需求相对较低，对环境的适应性很强，可利用底物很广。此外，米根霉丝状结构富含蛋白质，发酵后的残渣可作为粗蛋白原料再利用。液态发酵时，米根霉易沉降，有利于后续菌液分离。然而，菌丝体的形态和氧气供应会影响乳酸的生产率[10]。周群等[17]采用米根霉AS3.819对厨余垃圾进行不灭菌发酵，研究了pH对乳酸生产的影响。该研究发现，发酵液中还原糖浓度呈先上升后下降的趋势，pH为8时乳酸产量最大，达到60 g·L−1，60 h内乳酸的产生速率为1 g·(L·h)−1。L-乳酸为主要的异构体产物，其乳酸光学纯度可达99%。利用真菌来进行餐厨垃圾乳酸发酵的研究相对较少，所能利用的菌种也较为局限，因此，在分离、筛选高效真菌菌株方面还有很多内容可研究。以上内容提到的细菌和真菌产乳酸的研究成果汇总见表1。
表 1 以餐厨垃圾为底物利用细菌及真菌进行乳酸发酵的成果Table 1. Summary of recent studies of lactic acid fermentation with bacteria and fungi on food waste底物 菌种 预处理 发酵模式 温度/℃ pH 光学纯度 乳酸产量/(g·L−1) 产率/(g·g−1) 生产率/(g·(L·h)−1) 参考文献 餐厨垃圾 乳酸菌TY50 — 不灭菌 45 5.5~6.0 — 36.29 0.44 1.01 [11] 餐厨垃圾 乳杆菌TD46 — 不灭菌 30 5.5~6.0 — 28.85 0.39 0.60 [12] 餐厨垃圾 干酪乳杆菌Shirota 真菌水解 批式 37 6.0 — 93.2 0.93 1.55 [13] 餐厅废物+烘焙废物 凝结芽孢杆菌 真菌水解、提取脂质 — 52 — — 37 — — [14] 餐厨垃圾 地衣芽孢杆菌 TY7 加酶糖化 不灭菌 50 7.0 97% 40 — 2.5 [15] 餐厨垃圾 凝结芽孢杆菌 加酶糖化 不灭菌 55 6.5 97% 86 — 1.36 [16] 餐厨垃圾 米根霉AS3.819 — 不灭菌 34 8 99% 60 — 1 [17] | Show Table
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1.3 基因工程菌
为满足商业的要求，可利用基因工程技术改造发酵用乳酸菌株，以使其光学纯度更高、营养物质需求更少、乳酸产量和生产率更高，并达到提高其底物特异性、消除质粒及抗生素标记[10]等目的。
雷森林[18]利用基因工程的方法改造并研究了毕赤酵母对餐厨垃圾的发酵作用，分别克隆了凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因、米曲霉的淀粉酶基因、黑曲霉的糖化酶基因，然后将这3种基因同时表达在1株毕赤酵母中。利用此菌株，在不外加商业淀粉酶的情况下，最高乳酸产量是16.8 g·L−1，为理论产值的48%。常被用于改造的菌种中，有乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌、米根霉及一些藻类等[19]。将菌种本不具备的相关基因通过基因工程的手段进行表达，可减少所用相关酶的量，从而降低成本。但目前基因工程菌种对工业生产条件和环境的适应能力不强，这也限制了其大规模应用。因此，工程菌的进一步研究方向为改善微生物的代谢能力，提高工程菌的产酸效率，尽量降低副产物，增加工程菌对环境的适应性及对副产物的耐受性，从而进一步降低发酵成本。
1.4 混合菌
单一菌种会受到自身条件及发酵过程中的底物、产物的限制，因此，利用混合菌共发酵来提高底物利用率和乳酸产率也逐渐被关注。KIM等[20]利用以乳酸杆菌为主要菌种的土著混合菌对餐厨垃圾进行乳酸发酵时发现，在50 ℃时发酵效果最好，当水力停留时间为1 d时，乳酸质量浓度可达40 g·L−1。陈佳奇[21]将几种确定的菌种进行混合发酵研究，发现可利用解淀粉芽孢杆菌和德氏乳杆菌对餐厨垃圾进行底物不灭菌混合发酵，当发酵温度为45 ℃、接种间隔为1.5 h、初始发酵pH为6.5时，乳酸产率最高，可达0.351 g·g−1(以每克总固质量所产乳酸质量计)。
餐厨垃圾中含各种各样的土著菌种，如产酶菌、乳酸菌等。利用土著菌群进行发酵亦可取得较好效果。ZHANG等[22]利用餐厨垃圾中的土著菌群进行发酵，并研究了乳酸的纯度和微生物菌群。结果表明：L-乳酸是主要异构体产物，且pH在酸性或碱性条件下光学纯度比中性更高；菌群中乳酸菌和梭菌属占主要部分。WANG等[23]利用分离出的2种野生乳酸菌株TH165和TD175对餐厨垃圾进行发酵，可产生33.80 g·L−1的乳酸，比不接种的对照组高36.9%。黄林丽等[24]分别以调酸发酵和泡菜水发酵菌种作为混合菌种，在灭菌和未灭菌的情况下分别进行餐厨垃圾的发酵。结果表明，未灭菌组的乳酸含量均高于灭菌组，且金黄色葡萄球菌和沙门氏菌没被检出。TASHIRO等[25]使用海洋动物资源堆肥中的微生物群对餐厨垃圾进行分批发酵。通过设置一系列温度梯度进行发酵研究发现，在50 ℃时乳酸产量为34.5 g·L−1。
用产酶菌代替酶制剂，可大大降低原料的预处理成本[26]，特别是将糖化酶的生产、酶解糖化和乳酸发酵在同一反应器内进行。该过程可节省反应器体积，降低购酶费用和投资成本，是一个新的发展方向。例如，可利用一些糖化酶生产菌与乳酸生产菌混合培养，直接转化淀粉等碳水化合物生产乳酸，如黑曲霉(糖化酶生产菌)和米根霉(乳酸生产菌)同为好氧菌，有望能在同一反应器中混合培养产乳酸，可增加底物糖的浓度，实现同步糖化发酵，从而增加发酵效率。
虽然混合菌进行发酵效果更好，但需要考虑各菌种的最适生长条件、功能及协同性，需开发具有共生作用和协同作用的酶生产菌和乳酸生产菌。因此，选择合适的菌种搭配、进行不同菌群的发酵过程研究是当前使用混合菌发酵的重点。
2. 餐厨垃圾与其他生物质废物混合发酵
利用单一餐厨垃圾为底物时，虽然其营养丰富，但所含淀粉和葡萄糖等极易降解，碳源消耗速度较快，乳酸迅速生成积累使发酵系统易酸化而发生产物抑制进而影响乳酸产量。因此，将餐厨垃圾与木质纤维素、活性污泥等生物质废物进行混合发酵，有利于发酵底物营养元素的优势互补，并缓解餐厨垃圾易酸化的问题。
2.1 餐厨垃圾与木质纤维类废物的混合发酵
利用木质纤维素类废物发酵产乳酸需外加氮源和生长因子(如酵母膏)，而且木质纤维素本身结构复杂，不易被微生物降解，其预处理成本较高。将餐厨垃圾与木质纤维类废物混合发酵，可调节底物碳氮比，使底物营养均衡，也可延缓系统的酸化，从而促进乳酸发酵过程。
ZHENG等[27]分别将苦参药渣(含纤维素28.3%、半纤维素23.6%、木质素14.6%)与餐厨垃圾以不同混合比(以干重计)(0∶1，1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶0)混合后，接入种子培养液，再加入酶制剂，并在35 ℃、140 r·min−1的恒温摇床中进行乳酸发酵。结果表明，混合物料共发酵生成的乳酸浓度均比仅餐厨垃圾或仅苦参药渣发酵的乳酸浓度高；当苦参药渣与餐厨垃圾质量比为1∶1.5时，得到的L-乳酸浓度最高，可达48.4 g·L−1，说明物料之间具有明显协同效应。此混合比条件下的糖酸转化率为0.904 g·g−1，分别是相同质量单独原料分别产乳酸量的6倍(苦参药渣)或1.8倍(餐厨垃圾)以上。WANG等[28]同样研究了两种原料的协同作用，将碱预处理后的苦参残渣与餐厨垃圾以1∶1.5的比例混合，并进行同步糖化发酵，获得乳酸浓度可达67.5 g·L−1。同时还发现，将碱预处理液间隔24 h添加到发酵体系并调节pH，可提高乳酸产量；特别是当碱预处理液回用50%的乳酸产量时，比不回用的对照组增加了34.3%。这是由于碱预处理液的间歇式添加使得发酵体系pH更稳定，可减轻餐厨垃圾酸化；又因为碱预处理液中含有某些抑制性物质，抑制了产乙醇酵母的生长但不影响乳酸菌生长和代谢，使得更多的可发酵糖转化为乳酸。而餐厨垃圾为整个体系提供了丰富的氮源，从而降低了药渣发酵的额外氮源添加量。
汪群慧等[29]将菌糠添加到餐厨垃圾中发酵产乳酸。菌糠是栽培并采收食用菇后的剩余培养基或培养料，含有氨基酸、微量元素及水解效率高的微生物等。当10 g菌糠与50 g餐厨垃圾共发酵时，乳酸产率(以每克底物(干重)产乳酸的质量计)为0.30 g·g−1，比仅用餐厨垃圾时的产率提高了2.33倍。后续还需研究餐厨垃圾与菌糠在不同混合比条件下的共发酵系统中碳氮营养互补、多组分协同降解的机理，探究菌糠中所含高木质纤维素物料、pH调理性物料(石灰粉或石膏粉等)对缓解系统酸化的作用，以及菌糠中多种微量元素(如Zn、Se、Mn和Fe等)、生物活性物质(纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等)对餐厨垃圾-菌糠共发酵产乳酸的促进作用。菌糠中含有很多细菌和真菌，当它与餐厨垃圾共发酵时，存在与乳酸发酵菌群竞争底物的问题。同时，氧化乳酸的微生物、底物投加方式、发酵系统温度和pH调控方式等必将影响该发酵过程核心功能微生物群落的变化。如何抑制与乳酸菌竞争的菌群，从而保证产乳酸发酵菌群的优势生长，是餐厨垃圾-菌糠混合发酵系统成功构建的关键。
2.2 餐厨垃圾与活性污泥混合发酵
我国餐厨垃圾的碳氮比(C/N)一般为10~30，而活性污泥的C/N较低，约为6~16[30]。由于污泥中微生物种类多，故将二者进行混合发酵并进行组分性质互补研究。XUE等[31]以活性污泥和餐厨垃圾为混合底物，利用混合微生物菌群进行阴极电发酵产乳酸，在阴极上施加了−100 mV电压来刺激发酵过程，得到乳酸生产率为0.657 8 g·(L·h)−1，比没有外部电压的另一组提高了4.73倍。这可能是由于施加电压增加了某些微生物的生命活动或者酶活。
ZHANG等[32]研究了pH和温度对餐厨垃圾和活性污泥混合发酵过程的乳酸浓度和光学纯度变化的影响，并通过响应面(response surface methodology，RSM)分析验证多因素交互作用效果。结果表明，随着温度的升高，乳酸生产的最佳pH会降低；在发酵温度为35 ℃、初始底物(以COD计)质量浓度 25.51 g ·L−1时，最佳pH为9；若发酵温度50 ℃、初始底物(以COD计)质量浓度21.01 g·L−1时，最适pH为7。最高速率均为活性污泥和餐厨垃圾共发酵3 d后获得，且产乳酸菌的最佳生存条件与高速率生产条件相一致。
XU等[33]以餐厨垃圾和活性污泥作为底物，利用重复分批发酵方式进行乳酸发酵，乳酸产率可达(以每克有机物(单位体积底物COD)对应产生乳酸的质量计)0.72 g·g−1，乳酸生产率可达0.53 g·(L·h)−1。与分批反应器相比，重复分批反应器中关键水解酶活性得以增加。废活性污泥含有丰富的微生物群落，虽可以提高乳酸发酵过程中的水解酸化作用，但也会不可避免引入消耗乳酸及产生挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)的菌种。因此，在将餐厨垃圾和废活性污泥混合发酵中，需严格控制温度和pH，以避免产生过多的VFA及L-乳酸产量的下降。LI等[34]在餐厨垃圾发酵产乳酸时添加活性污泥，并开发了碱性发酵技术。结果表明，添加污泥及间歇性碱性发酵不仅明显改善了水解步骤，还抑制了乳酸消耗和D-乳酸的产生，L-乳酸产率以每克有机物(以单位体积底物COD对应产生乳酸的质量计)为0.52 g·g −1，光学纯度为100%。
3. 原位分离耦合乳酸发酵
在乳酸发酵过程中，乳酸不断积累会造成体系的pH下降，导致发酵液酸化并使发酵过程减慢、底物利用率低，进而影响乳酸产率及产量。因此，需要采用合适的方法边发酵边将乳酸分离出来(即原位分离乳酸发酵技术)，以降低乳酸的抑制作用，提高发酵效率。表2所示的3种原位分离乳酸发酵技术已受到较多关注和研究。
表 2 常用的原位分离技术及优缺点Table 2. Common in-situ separation techniques and their advantages and disadvantagess方法 优点 缺点 萃取分离 耗能低，选择性好、无细菌污染 萃取剂有一定毒性，其分配系数较低 吸附分离 分离效果好，吸附剂可再生循环利用 部分吸附剂选择性不高，且成本较高 膜分离 可连续进行，效果好 膜易被污染而影响过滤效果 | Show TableDownLoad:
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3.1 原位萃取发酵技术
原位乳酸萃取发酵也称为萃取分离耦合乳酸发酵，即在发酵过程中利用有机溶剂连续萃取发酵产物，以消除乳酸抑制。以液体为萃取剂时，如含有目标产物的原料也是液体，则称为液液萃取。根据萃取剂的不同，又分为溶剂萃取、双水相萃取、超临界流体萃取、液膜萃取等。萃取剂的基本要求即分配系数高，自身消耗少，对发酵体系的毒害影响小。十二烷醇、油醇、叔胺Alamine-336等是常用的萃取剂，萃取剂与细胞直接接触会产生毒害作用。常用的减轻溶剂毒性的方法有：使用膜将溶剂与细胞分开(渗透萃取)；细胞固定化；在固定化载体中包埋豆油等植物油。陈敏等[35]使用三辛胺和油醇混合溶剂，利用固定化细胞方法进行了萃取发酵，经过24 h发酵后，乳酸产量比对照组提高了60%，且可有效提取乳酸，同时对乳酸菌毒性也较小。WASEWAR等[36]研究了反应萃取在原位分离中的使用，比较了辛醇、甲基异丁酮(methylisobutylketone，MIBK)和癸醇的添加对从一种叔胺(Alamine 336)中提取乳酸的效果。结果表明，辛醇的提取效果最好，并且进行半连续操作更便捷，且不消耗额外试剂，不产生大量废物。
相较于传统有机相-水相的溶剂萃取，双水相萃取是全新的替代方法。这两相大多数情况下由水与非挥发性成分组成，可避免挥发性有机成分的使用。除此之外，该萃取方法还具备如下优势：含水量高(70%～90%)适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活；不存在有机溶剂残留问题；易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。这是其他分离技术无法比拟的。KWON等[37]探究了聚合阳离子、聚乙基亚胺(polyethylimine，PEI)和不带电聚合物(羟乙基)纤维素(hydroxyethyl cellulose，HEC)组成的双水相体系萃取乳酸发酵的潜力。在无pH控制的情况下，乳酸乳球菌在PEI/ HEC两相发酵体系中添加质量分数为20 g·L−1的葡萄糖进行分批发酵，与PEI或HEC单相发酵体系相比，乳酸产量和细胞生物膜分别提高了3~4倍，乳酸优先分布到富含PEI的底相中。
萃取剂本身的性质、对乳酸的分配系数及可能的毒性，都是制约其大规模应用于发酵生产的影响因素。为了能将萃取法更多应用于原位发酵提取中，需进一步开发高效、绿色、成本更低的萃取剂。
3.2 原位吸附发酵技术
原位乳酸吸附发酵也称吸附分离耦合乳酸发酵，即利用特定固体吸附剂(如树脂、活性炭等)在发酵过程中通过吸附分离将乳酸从发酵液中移除。BONK等[38]在餐厨垃圾发酵产乳酸的同时，采用活性炭进行原位分离：实验前将活性炭洗涤筛分；实验中直接与发酵液接触；吸附后利用丙酮来进行脱附。该项研究结果表明，即使在含有颗粒物的餐厨垃圾发酵液中，也可以用活性炭进行原位分离，并没有发生明显的孔隙堵塞导致效率下降的情况。该研究实现了更高的产率，并提高了乳酸的纯度。然而，在实际应用中，活性炭和丙酮的循环使用次数还有待进一步研究。
由于活性炭易吸附饱和，不但吸附乳酸还会吸附糖等其他物质，因此，从工业化生产的角度来对比，离子交换树脂法以选择性强、交换(吸附)容量大、操作简单、易于自动化控制等优点具有较强的竞争力。ATAEI等[39]使用Amberlite树脂(IRA-400，Cl−)在自动控制pH的条件下从发酵液中原位分离乳酸。在pH=6.1，温度为37 ℃时生产率最大，使用该原位分离系统发酵38 h后，乳酸的最大质量浓度为37.4 g·L−1，其乳酸生产率是不采用原位分离系统的5倍。GARRETT等[40]使用Amberlite™ IRA-67弱碱树脂进行乳酸提取，将乳酸质量浓度控制在20 g·L−1以内；该系统产率是常规分批补料发酵的1.3倍；对该树脂进行表征，其吸附曲线与Langmuir等温线相吻合，且发酵108 d后，树脂仍具有较好的稳定性，可有效原位分离乳酸。ZHANG等[41]利用凝结芽孢杆菌进行乳酸发酵，利用10种离子交换树脂进行原位分离，发现其中的335树脂效果最好。WANG等[42]利用树脂吸附回收乳酸，发酵液循环回发酵罐，使乳酸产量提高了23％，达到183.4 g·L−1。
吸附剂的高吸附容量有利于产物的及时分离，可明显降低产物抑制作用。开发选择性更好、吸附容量更高、成本更低、寿命更长、机械强度和化学稳定性更好的吸附剂是进一步研究的主要内容。
3.3 原位膜分离发酵技术
将膜组件与常规发酵罐集成在一起，当目标产物达到一定浓度时，及时将其从发酵体系中移除，可减少产物抑制，并使发酵过程保持较高的细胞浓度。应用较多的膜类型有：渗析(扩散排阻)、电渗析(离子排阻)、微滤和超滤(分子排阻)、纳滤等。
JEANTET等[43]研究了生物反应器中乳酸的半连续生产与纳滤膜耦合技术，纳滤膜部分是MSP006239 Prolab 系统配备Nanomax 50 Millipore (R76A) 膜，使用该技术实现的最高生产率为7.1 g·(L·h)−1，乳酸质量浓度为55 g·L−1,发酵44 d后超过99%的膜污染是可逆的，并且通过水冲洗即很容易恢复到初始渗透通量。SIKDER等[44]将纳滤分离和细胞循环发酵产乳酸相结合，发现NF3复合聚酰胺膜可保留94％的糖，乳酸的光学纯度为85.6％。WANG等[45]将中空纤维超滤膜和发酵罐耦合，进行了6批次的发酵，乳酸的产率及细胞密度持续上升，且重复分批发酵的反应稳定性较高，底物可被有效利用，是一种提高产率的有效方法。TALEGHANI等[46]制备了一种纳滤膜TFC-NF，并与另外3种商用纳滤膜进行了膜分离发酵效果比较，结果显示自制膜对目标产物的排斥因子更低。
电渗析技术也是常用的膜分离技术。BOONTAWAN等[47]研究了电渗析法提取发酵乳酸中乳酸浓度的影响，发现临界浓度为80 g·L−1，溶液中的乳酸浓度最高可达185 g·L−1。GAO等[48]使用连续电渗析发酵法(electrodialysis fermentation，EDF)来生产乳酸，进料葡萄糖浓度为175 g·L−1，发酵持续了350 h以上，乳酸最大生产率为8.18 g·(L·h)−1，转化率为71%，乳酸产量是常规EDF的19.5倍、间歇EDF的9.7倍。WANG等[49]将双极膜电渗析和发酵过程耦合进行连续发酵，乳酸回收率达到69.5%，净产量约为1.32 mol·L−1。
原位膜分离发酵中，体系内的细胞浓度比常规发酵中更高，底物利用更快，在减少产物抑制的情况下能保持一定的底物量，可明显提高乳酸产率。但是，膜生物反应器的生物膜控制及系统运行的监控是必须要考虑的因素，而且膜组件成本较高，且在运行中需要注意膜污染问题及膜组件的更换和清洗，因此，开发新型膜组件以降低成本、延长寿命、提高效率是原位膜分离发酵技术推广应用的关键。
3.4 乳酸镁结晶分离耦合乳酸发酵
在温度高于34.5 ℃时，乳酸镁的溶解度低于乳酸钙[50]。WANG等[51]用镁碱(MgO)为中和剂，利用乳酸镁在水溶液中具有较低溶解度的优势，实现了乳酸镁结晶在线移除(或原位分离)，降低了产物抑制效应，并采用HCl酸化、异戊醇萃取、浓缩萃余液得到MgCl沉淀，再进行热解得到MgO和HCl，实现了重复利用。含乳酸的萃取液用水反萃取，浓缩后得到乳酸产品，萃取液异戊醇回用。该工艺相比于钙盐分离工艺，没有任何固体或液体废物排放，可减少活性炭脱色、阴阳离子交换等工艺，且操作简单，是一种新的原位分离耦合乳酸发酵模式。
4. 餐厨垃圾乳酸发酵的新进展
4.1 开放式发酵体系中各菌群的协同调控
传统的纯物质乳酸发酵一般为原料灭菌后接入乳酸菌，再在无菌条件下进行发酵，称为非开放式发酵模式。而发酵原料不灭菌接入乳酸菌，无需严格的无菌操作即进行乳酸发酵则称为开放式发酵模式。开放式发酵的工艺简单、节能，可降低乳酸生产成本。
本课题组在前期研究中多次验证了餐厨垃圾采用不灭菌的开放式发酵是可行的，且乳酸菌在发酵过程中成为优势菌株，其乳酸产量达到、甚至超过原料灭菌的非开放式发酵[52-53]。SAKAI等[54]也发现，厨余垃圾在不灭菌的开放式乳酸发酵时，间歇调节pH到中性可有效富集产乳酸细菌群。TANAKA等[55]在开放式发酵过程中通过控制pH、抑制土著微生物生长，进而提高了脱脂麦麸产乳酸的光学纯度。邹慧等[56]将嗜淀粉乳杆菌接种到餐厨垃圾中，比较了开放式与非开放式发酵中乳酸的产量及占比。在发酵96 h后，开放式发酵体系中的乳酸产量比非开放式高54%。姜华[57]关注了开放式发酵过程中的乳酸、总糖、可溶性糖及细菌数量变化，认为餐厨垃圾适合作为乳酸发酵的底物，且相比传统非开放式发酵，开放式发酵明显提高了乳酸产量。其原因可能是：土著菌参与了大分子的水解，将其转化成小分子可溶糖，为乳酸菌提供了丰富的底物。张波等[58]通过对温度和pH的调控，提高开放式发酵系统中目标产物-乳酸的光学纯度，使餐厨垃圾在45℃条件下发酵144 h后，获得的乳酸光学纯度达到97%。
在实际乳酸发酵工程应用中常通过延迟添加碱性缓冲剂的办法，使发酵液呈酸性来抑制开放式发酵体系中的杂菌繁殖。如可在发酵开始后8 h左右分批添加碳酸钙，这样可利用发酵初期产生的少量乳酸来抑制杂菌生长。ZHAO等[59]的研究表明，底物不灭菌，仅添加乳酸菌至餐厨垃圾后放置1~3 d，即会生成高浓度的乳酸，从而使pH下降，病原菌类的金黄色葡萄球菌落和大肠杆菌落数比不加乳酸菌的对照组分别减少了99.9%和99.8%。
针对不灭菌的开放式发酵系统，可采用宏基因组、宏转录组学及荧光定量PCR等现代分子生物学手段，定性与定量解析其微生物群落的变化；需确定复杂底物乳酸发酵过程的关键功能菌群，阐明乳酸菌(尤其是L-乳酸菌)、水解酸化菌、真菌等各菌群之间的相互作用和关系(拮抗、协同和共生作用)；需通过复杂底物胞外水解酶、乳酸菌胞内分解代谢关键酶等相关酶活的测定，揭示酶活与系统运行状态之间的动态关联，阐明底物向乳酸转化的机理。
4.2 高细胞密度发酵技术
高细胞密度是一个相对概念，一般认为上限值为150~200 g·L−1，下限值为20~30 g·L−1。然而，对于一些极端微生物或自养微生物，若细胞浓度达到1 g·L−1也可算高细胞密度。广义来讲，凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值均可称为高细胞密度。采用分批补料发酵、细胞循环发酵和固定化细胞发酵等培养技术，均可提高细胞密度(即菌体生物量)，从而提高体积产率。
分批补料发酵是在微生物的分批发酵中，向反应器内补加一定量的底物，从而使培养液中的底物浓度保持在一定范围内，以满足微生物的生长需要。与批式发酵相比，相同量的底物分多次添加，可明显降低底物抑制作用，但添加底物的量、添加次数及添加频率等都是需要考虑的因素。
细胞循环发酵即将上一批次发酵的部分或全部乳酸菌细胞接种于下一批次。与普通的批次发酵或分批补料发酵相比，细胞循环发酵提高了乳酸菌的生物量，降低了设备投资和生产成本，节省了发酵罐清洁和灭菌及种子液培养的时间和成本，也便于下游分离纯化。
固定化细胞发酵是将细胞通过一定的方法约束在一定空间界限内，限制其自由移动，但保留其催化活性。固定化细胞技术可获得更高的细胞浓度，细胞可重复利用，同时在稀释率较高时也不会发生洗脱现象。此外，其单位容积的产率高，发酵液中菌体含量少，有利于产品的分离纯化。陶静等[60]探索了海藻酸钠、琼脂和明胶-戊二醛3种载体，进行固定化乳酸菌发酵实验。结果表明，使用海藻酸钠更为合理，其最佳反应条件为：海藻酸钠浓度2%，接种量15%，凝胶珠直径为2~2.5 mm，氯化钙浓度为5%。目前，固定化细胞技术在乳酸发酵中使用较少，载体也限制了生化反应所需的扩散作用，但其成本低且可操作性好的特点使固定化细胞乳酸发酵引起了业界越来越多的关注。
4.3 生物强化乳酸发酵技术
为提高乳酸产率，添加一些物质来强化生物发酵过程也是一种新思路。之前较多的研究集中在铁材料促进甲烷发酵，而对发酵过程中产生的有机酸的影响关注较少[61]。JIN等[62]探究了纳米零价铁(nanoscale zero-valent iron，NZVI)对餐厨垃圾发酵产VFA的影响，反应48 h后乙酸比例最大，占到了72%，并发现NZVI可提高多种关键酶的活性，改变微生物群落结构。此外，在发酵过程中乳酸产量与NZVI剂量呈正相关。铁材料作为微生物营养元素和高效催化剂，可促进底物水解，还可与有机酸直接反应，达到缓解底物酸化的作用(Fe0 +2H+
⇌ 添加NZVI可促进乳酸产生，而氧化还原电位的调整可能来自于NZVI的电子供应，因此，向微生物群落提供电子也会影响乳酸发酵。施加一定电压以提供电子是一个新的思路。XUE等[31]使用两级电化学系统，发酵反应室连接负电极，通电为之提供负电压，与未通电相比，乳酸的生产率和光学纯度均得到了提高，说明电流提供的电子可能促进了丙酮酸到乳酸的转化。有研究已证实，微生物电解池(microbial electrolysis cells，MEC)可有效缓解VFA带来的酸抑制作用[63]，构建阴极电化学发酵产乳酸系统，在阴极室提高还原力，可使得乳酸产量和产率明显提高。将电化学技术更多地应用到乳酸发酵系统，甚至作为预处理，亦可作为发酵方法研究的重要方向。
4.4 更高附加值产品的延伸制取
为获得更有价值的产品，将乳酸作为中间产物向其他产物转化的研究亦越来越多。ZHU等[64]进行了接种Ruminococcaceae bacterium CPB6菌将乳酸转化为正己酸的研究，在pH为6.0~6.5、温度为(30±1)℃的条件下，初始乳酸质量浓度为20 g·L−1，分批进行实验，中间补充乳酸，最终产生己酸23.41 g·L−1。己酸在食品、医药及化学工业中用途广泛，是食品添加剂、香水、抗癌药己雷琐辛等的主要原料，也可作为表面活性剂生产中的添加剂。
由于发酵液中的葡萄糖和甘露糖会抑制木糖代谢途径，因此，直接发酵葡萄糖半纤维素水解液生产木糖醇的效率较低。RIVAS等[65]采用先接种乳酸菌、转换葡萄糖和甘露糖为乳酸，然后微滤去除乳酸菌，并接种发酵微生物转化木糖为木糖醇，从而使发酵的效率得以提高。
程琪越[66]将玉米秸秆和淀粉作为底物，接种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 11454)进行同步糖化发酵，生产乳链菌肽和乳酸。若在食品中加入十万分之几到万分之几乳链菌肽，将可抑制引起食物腐败的许多革兰氏阳性菌(包括葡萄球菌、链球菌、微球菌等)生长和繁殖，并生成一种高效、无毒的天然食品防腐剂。该项研究表明，在淀粉质量浓度为40 g·L−1, 糖化酶添加量为100 U·g−1、CaCO3添加量为2.5%、Tween-80添加量为1 mL的条件下，得到的产物乳链菌肽最高效价为2 516.42 IU·mL−1, 乳酸质量浓度为37 g·L−1，达到理论产率的84%。
有些乳酸菌还可产生一种新型的天然抗菌物质-苯乳酸，与乳酸菌产生的细菌素(如乳链球菌素)相比，苯乳酸是小分子物质，其抑菌谱宽、稳定性高，已成为乳酸菌抑菌能力的有效标志之一。作为一种新型生物防腐剂，苯乳酸在乳品工业中具有广阔应用前景。
此外，生物法乳酸脱水制造丙烯酸的成本约为1.1×104元·t−1。而目前丙烯酸售价已经高达1.4×104～1.8×104元·t−1。南京工业大学开发的利用微生物将乳酸脱水制丙烯酸技术的转化率已达到85%[67]。可以通过减少石化原料的消耗、减少有毒中间产物的产生，使乳酸转化成丙烯酸的成本大大降低。
近年来，用木糖渣发酵联产乳酸和聚氨基葡萄糖、生物发酵联产L-乳酸和L-赖氨酸、粗甘油生物发酵联产1,3-丙二醇和乳酸、用玉米芯发酵联产低聚木糖和乳酸等的可行性研究亦有报道，已实现了高附加值产品的生物炼制过程。此外，餐厨垃圾与其他生物质废物混合发酵联产乳酸和有机肥等的研究也获得较好的经济效益和环境效益，可最大限度地实现废物的减量化和资源化。
5. 结语
1)市场对于乳酸和聚乳酸的需求量日益增加。尽管相关研究取得了一定进展，但目前利用餐厨垃圾发酵产乳酸技术仍有一些限制因素。
2)发酵菌种是乳酸生产的主体。可从环境中分离发酵效果好的野生乳酸细菌，或利用已分离得到的效果较好的乳酸细菌作为发酵菌株。再将其接种至餐厨垃圾中，通过相关实验优化对餐厨垃圾这类复杂底物的适应性等，进而获得适宜参与餐厨垃圾发酵的相关菌种。米根霉等真菌因可直接利用淀粉及所产乳酸的高光学纯度而受到较多关注。利用基因工程技术筛选或改造出可产生高效水解酶、生命活动受pH等环境因素影响小、能适应餐厨垃圾复杂底物，并可高效利用糖类、生产更高质量、更高纯度乳酸的菌株，将是乳酸发酵领域急待突破的关键技术。
3)此外，还需开发新的发酵工艺，如将不同菌种混合进行发酵，改变单一菌种发酵的方式或者利用不同配比的底物等，可有效地改善微生物对底物的利用。尤其是利用细胞循环、固定化细胞等高细胞密度发酵技术，可缩小反应器体积，缩短生产周期，减少设备投资，并在一定程度上减少废水量，降低生产成本，提高综合生产效率。
4)各种原位分离耦合乳酸发酵技术可从发酵系统中选择性地分离乳酸，可有效减少产物抑制作用。其中，原位萃取发酵技术重点在选择对微生物无害，且萃取效果好、成本低的萃取剂。在原位吸附发酵技术中，要选择性质稳定、吸附容量大、可回收利用、寿命长的吸附剂，采用负载金属、改变孔隙结构等方法来加强其吸附能力。开发新的膜材料、优化膜分离工艺、改善膜清洗方式等，都有益于解决原位膜分离发酵技术的膜污染堵塞、膜寿命和成本问题。
5)生物炼制被认为是化学炼制的替代方式。餐厨垃圾作为生物质废物的一种，其乳酸衍生物及发酵联产高附加值产品的潜力很大，需继续深入研究，以期更好地实现餐厨垃圾的无害化与资源化利用。
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图 1 通入市政原水前反应器内的进出水水质
Figure 1. Influent and effluent quality of synthetic wastewater before feeding raw municipal wastewater into reactor
图 2 市政废水的每日进水水质变化
Figure 2. Changes in daily influent water quality of municipal wastewater
图 4 总氮、COD值及单位COD的脱氮量的进出水质量浓度
Figure 4. Concentration of TN、COD and nitrogen mass removed per unit of COD in influent and effluent wastewater
图 5 其余氮类污染物的进出水质量浓度
Figure 5. Concentrations of other nitrogen pollutants in the influent and effluent wastewater
图 6 2组反应器中相对丰度前20的优势菌门和优势菌属
Figure 6. Top 20 relative abundances of dominant phyla and genera in two groups of reactors
图 7 反应器中氮转化相关功能基因表达量的热图
Figure 7. Heat map of expression levels of nitrogen conversion related functional genes in bio-nests
图 8 反应器中电子转移功能基因表达量的热图
Figure 8. Heat map of the expression level of electron transfer functional genes in bio-nests
图 9 活性污泥中的微生物电镜照片
Figure 9. Electron microscopy photos of microorganisms in activated sludge
图 10 α-Fe2O3介导的反硝化菌胞内的氮代谢通路
Figure 10. Intracellular nitrogen metabolic pathway of denitrifying bacteria mediated by α-Fe2O3
表 1 原始泥样和反应器中的MLSS和MLVSS及其比值
Table 1. MLSS, MLVSS and their ratios in the raw sludge and reactors
样品 MLSS MLVSS MLSS/MLVSS 原始泥样 4 000 2 211 0.552 对照组 4 125 2 283 0.553 实验组 5 239 2 599 0.496
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