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饮用水安全问题对人类健康至关重要[1-2]。近些年饮用水安全方面的挑战涵盖了微生物的方方面面，通常细菌在饮用水管网输配系统(drinking water distribution systems，DWDSs)的生物膜中自然定殖，并形成稳定的微生物生态系统[3-4]，这种稳态环境有利于细菌的生长并能够给其在面对消毒过程时提供一定的庇护作用，进而带来包括致病菌、抗性基因等微生物风险问题[5]。因此，探究长期运行的DWDSs生物膜的细菌群落组成对于控制饮用水微生物风险具有重要意义。
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)会增强细菌宿主对抗生素的抵抗能力[6-7]，细菌产生ARGs通常需要一个稳定的环境，而生物膜恰恰能提供这种“温床”[8-9]，因此长期运行的DWDSs生物膜最终可能导致微生物的ARGs风险。此外，包括磺胺甲恶唑在内的抗生素在临床上的广泛使用，不可避免地导致抗生素污染[10-11]。抗生素不仅会影响细菌的生长过程，还会对ARGs的传播造成影响[12-13]。低剂量的抗生素(0.5 mg·L−1)，如土霉素和磺胺甲恶唑，会加速活性氧的生成并促进ARGs的传播[14]。因此，探究微量抗生素对长期运行的DWDSs生物膜中ARGs的影响十分重要。饮用水处理和消毒被认为是20世纪最伟大的公共卫生成就之一[15]，消毒工艺通常被认为能够抑制微生物的生长以及控制ARGs传播[16]。但同样有研究报道消毒对ARGs的形成存在促进作用[17-20]。因此，探究消毒是否对长期运行的DWDSs生物膜中的ARGs起到有效控制将有助于控制管网微生物风险。此外，消毒过程作为细菌遭受到的一种环境胁迫压力，往往会影响与细菌新陈代谢有关的功能基因[21]。但是关于功能基因与ARGs之间是否存在关系，目前研究报道不多。
因此，本研究的目的是利用模拟不同处理条件下的DWDSs，研究微量磺胺甲恶唑对细菌群落组成和ARGs的影响；通过长期模拟运行探究次氯酸钠消毒对ARGs的控制效果；最后通过相关性分析探讨功能基因与ARGs之间可能存在的关系，探讨消毒过程通过改变细菌的代谢过程从而影响细菌的生长进而控制ARGs传播。
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实验用水来自于中国东部一个饮用水处理厂(drinking water treatment plant，DWTP)。出水经过混凝、沉淀、砂滤处理。该原水的pH为7.89±0.05，浊度为(1.24±0.10) NTU，耗氧量CODMn为(3.00±0.14) mg·L−1，余氯质量浓度为0，异养菌平板计数为(120±5) CFU·mL−1，没有检测到总大肠菌群。
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实验在1.50 m长全新的PE管材(DN 60 mm)中进行。管道进水为每日从DWTP处理后获取的60.0 L砂滤(SF)出水，并通过蠕动泵以1.50 mL·s−1的流速在各管中缓慢流过，运行为期1 a。
共采用9根管道来模拟饮用水管网输配系统(DWDSs)，共设计3种实验条件，各条件有3个平行。条件A1，不使用消毒剂的SF出水作为实验进水；条件A2，在不使用消毒剂的SF出水添加2.00 μg·L−1的磺胺甲恶唑作为实验进水。条件B1，SF出水添加2.00 μg·L−1的磺胺甲恶唑并使用次氯酸钠(NaClO)消毒剂进行消毒作为实验进水。其中，磺胺甲恶唑的添加质量浓度是考虑到了可能发生的磺胺类抗生素污染情况[22]；而以游离氯消毒的出厂水质量浓度一般控制在0.3~0.8 mg·L−1[23-24]，因此，实验模拟管网进水游离氯质量浓度控制在0.50 mg·L−1。
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在模拟的DWDSs运行1 a后，将每根PE管切成3段，每段长约50.0 cm。使用无菌金属刮刀从管段内部采集生物膜，刮刀距离切口至少40.0 cm，以尽量减少污染的风险[25]。使用FastDNA Spin Kits for Soil (MP Biomedicals Co., USA)试剂盒的说明进行DNA提取。用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scienrific., USA)和TBS-380(YPH-Bio., China)分别测量DNA质量浓度和纯度，并进行凝胶测试以验证其完整性(1%琼脂糖凝胶电泳)。每根管道3个DNA样品混合为1个样品，每个条件3个平行共3个DNA样品进行送样。
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Illumina高通量测序是用HiSeq 2000平台进行的。宏基因组序列库由美吉生物公司构建。使用Fastp软件(http://github.com/OpenGene /fastp)对原始fastq文件进行了过滤。使用IDBA-UD/Megahit(https://github.com/voutcn/megahit)和Newbler(https://ngs.csr.uky.edu/Newbler)对序列进行多重混合拼接组装。使用Prodigal对拼接结果中的contigs进行基因预测。使用CD-HIT软件(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)构建非冗余基因集。
微生物群落组成分析利用NR数据库进行比对(参数blastp；E≤10−5)，并通过NR库对应的分类学信息数据库获得物种注释结果，然后使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的丰度。功能基因与京都基因与基因组百科全书(KEGG)的基因数据库进行比对(参数blastp；E≤10−5)，再根据对应的基因丰度总和计算该功能类别的丰度。抗生素抗性基因(ARGs)与抗性基因数据库(CARD)进行比对(参数blastp；E≤10−5)，将目标基因与其耐药功能注释信息结合，获得注释结果。以上基因丰度是用TPM(trans per million)，即基因丰度以该基因通过基因长度标准化后的基因丰度在该样本中所有基因长度标准化后的基因丰度总和中占比的百万倍表示。
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1)微生物群落组成。如图1(a)所示，当在DWDSs的进水中加入磺胺甲恶唑时，由TPM计算的生物膜中门分类水平微生物群落的总丰度仅改变了0.09%。丰度前十的门分别为放线菌门、变形菌门、浮霉菌门、拟杆菌门、酸酐菌门、疣微菌门、蓝藻门、厚壁菌门、芽单胞菌门以及硝化螺旋菌门。在不添加消毒剂的情况下，放线菌门和变形菌门的细菌在条件A1和A2的生物膜中占主导地位，丰度总和占总细菌的比例分别为83.1%和83.7%。许多研究表明，这2个门类是不同管道生物膜中的主要的细菌类型[26-27]。而他们在B1中仅占比24.5%，因此，消毒可以明显降低放线菌门与变形菌门的细菌在细菌群落中的比例。但同时，浮霉菌门细菌无论是占比(58.1%)还是相对丰度(TPM=70 099.6)，均远远高于未消毒条件A1和A2，表明浮霉菌门具有较强的抗次氯酸钠消毒能力。厚壁菌门的细菌在3种条件(A1、A2、B1)中的丰度依次为6 839.6、6 607.8和6 802.1 TPM，消毒剂的加入并没有显著影响其丰度变化，因此，厚壁菌门的细菌也具有一定的抗消毒能力，这一结果与之前的研究结果类似[26]。
种水平上未消毒条件下(A1、A2)的优势种中(图1(b))，酸微菌Acidimicrobium sp.BACL27 MAG-120823-bin4在加入磺胺甲恶唑后其相对丰度值由64 879.8 TPM(A1)升高至80 593.3 TPM(A2)，相应地其相对丰度占比由7.52%上升至9.34%。因此，微量磺胺甲恶唑对生物膜中该物种丰度产生影响。而消毒条件下(B1)，酸微菌Acidimicrobium sp.BACL27 MAG-120823-bin4丰度仅占B1条件生物膜中所有细菌的0.07%，酸微菌属于放线菌门，而该条件下丰度前10的细菌均属于浮霉菌门(图1(c))。因此，消毒可以很好的控制包括酸微菌在内的放线菌门细菌生长，而浮霉菌门的细菌能够更好地适应消毒环境，对消毒表现出一定的抗性。
2)物种的相似性与差异性。A1与A2条件下的群落物种不仅在丰度上差异很小，在物种种类相似程度也很高，相同的物种占到了总物种的97%以上(图2(a))。因此，添加磺胺甲恶唑对微生物群落组成的改变非常小。这一结果与之前的一项研究类似，即磺胺甲恶唑在环境相关质量浓度(< 4 μg·L−1)下没有明显影响河流沉积物中的细菌群落组成[28]。但消毒剂的加入改变了群落的组成，物种数量由12 330种下降至8 374种，因此，次氯酸钠消毒在水处理中确实对微生物生长能够起到一定的控制效果。
如图2(b)所示，在群落的差异性物种中，消毒条件B1与其他2种条件表现出的显著差异性物种均为浮霉菌纲细菌，包括Zavarzinella formosa，Planctomycetaceae bacterium SCGC AG-212-F19，Gemmata_obscuriglobus，Gemmata sp.IIL30，Singulisphaera acidiphila，Gemmata sp.SH-PL17，Schlesneria paludicola，这进一步证实浮霉菌纲细菌抗次氯酸钠消毒能力强。根据研究表明，浮霉菌在面对臭氧的胁迫时也体现了强适应能力，凭借出芽繁殖的方式保障细菌的正常繁殖生长[29]。而其余物种均属于放线菌与变形门细菌，这些物种在A1、A2中生长良好，但一旦长期暴露在次氯酸钠消毒条件中，则会遭到抑制。因此，次氯酸钠消毒对于放线菌与变形门类细菌控制有效[30]，但对于浮霉菌几乎没有控制效果。
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1)群落的抗性基因。与群落组成类似，添加2 μg·L−1磺胺甲恶唑对生物膜上抗性基因丰度影响不明显(图3(a))。在生物膜细菌群落的抗性基因中，Saur_rpoC_DAP、macB、mfd、aminocoumarin resistant alaS、Mtub_katG_INH、mtrA、oleC、Mtub_ropB_RIF、Ecol_ropB_RIF、patA是主要的ARGs类型(图3(a))。在同样添加磺胺甲恶唑的管道中，采取次氯酸钠消毒使得ARGs总量下降了91.9%，这表明消毒对于抗性基因有很好的控制效果。在差异性基因中，消毒条件中丰度占比较高的抗性基因分别是macB、bcrA、patA、mdtB与drrA(图3(b))。而携带抗性基因的细菌主要是Acidimicrobium sp. BACL27 MAG-120823-bin4、Actinobacteria bacterium BACL15 MAG-120619-bin91、alpha proteobacterium HIMB114、Actinobacteria bacterium BACL2 MAG-120802-bin41、actinobacterium SCGC AAA027-L06(图3(c))。这些细菌在各条件中的丰度也处于一个较高的水平，因此，产生抗性基因的一个原因可能是细菌本身能很好的适应生存环境。这一点在携带差异性基因的物种上也有很好的体现，例如未消毒条件中携带差异性抗性基因(macB、patA)的细菌Acidimicrobium sp.BACL27 MAG-120823-bin4和Actinobacteria bacterium BACL15 MAG-120619-bin91在消毒后数量明显下降(图1(b))，该2种抗药基因消毒后同样下降明显。同时，抗性基因与物种的相关性分析也进一步表明物种与抗性基因在不同条件下的变化存在很好的相关性(R2 > 0.8)( 图3(d))。因此，以上结果说明消毒对抗性基因的控制效果很大程度体现在对细菌的控制上。
2)群落功能基因。微生物群落的功能基因包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、脂质代谢、信号转导、复制和修复以及翻译等(图4(a))。除信号转导外，部分功能基因的占比在加入磺胺甲恶唑后略有上升。而NaClO消毒使这些功能基因明显减少，这一结果与以前的研究结果一致[31]。
另外，对不同功能基因贡献度靠前的细菌与携带耐药性基因的细菌几乎一致(图4(b))。在A1、A2与B1群落的功能基因组成中，碳水化合物代谢类的功能基因占比分别为13.8%、13.9%和15.8%，在消毒处理后细菌的碳水化合物代谢基因水平出现了上升，说明面对消毒带来的环境胁迫压力时，生物膜中细菌可以通过调整碳水化合物相关过程的代谢来进行响应；与此类似的还有辅助因子与维生素相关的代谢，群落在面临消毒时同样出现了上调的现象，A1、A2和B1条件下该功能基因占比分别为5.47%、5.45%和6.75%。与此同时，功能基因与物种的相关性分析同样说明不同条件下物种丰度与功能基因变化表现出很好的相关性 (R2>0.8)(图4(c))。因此，细菌抗性基因的变化极有可能是与功能基因的变化趋势一致。
3)群落功能基因与抗性基因之间的关系。对丰度前十的群落功能基因在KEGG二级通路上与抗性基因进行相关性网络分析后，我们发现抗性基因与每一大类的功能基因之间存在不同程度的正相关性(图5(a))。在对显著性差异的ARGs与KEGG三级通路的功能基因进一步分析后，发现存在显著性差异的抗性基因与功能基因((图3(d)与(图4(d))之间仍然存在相似结果，即每一种抗性基因均与各种的功能基因有着不同程度的正相关关系(图5(b))。这一结果表明次氯酸钠是通过改变物种并影响其功能基因进而改变抗性基因的丰度。很多研究中都报道了功能基因对于耐药性基因的形成存在影响，例如中心碳代谢功能影响结核分枝杆菌的耐药性[32]，群体感应影响耐药性基因的产生[33]。与此同时，当环境压力改变细菌群落组成时[34]，物种功能基因往往也会进行改变[35]。因此，当次氯酸钠消毒显著引起生物膜群落变化时，群落中微生物的功能基因也发生了相应的变化，最终也会影响其耐药性基因的形成。
在图5(b)中，抗性基因oleC是唯一与ABC转运蛋白功能基因呈正相关关系。细菌在某些应激条件下产生细菌素和微毒素会对周围物种产生一定的抗菌活性以便自身生存，而ABC转运蛋白能够帮助细菌通过免疫蛋白或者转运等方式保护自己[36]。在A1、A2中oleC主要存在于放线菌门的细菌中，在添加磺胺后oleC的丰度占比上升了0.14%(图3(b))，但放线菌门的细菌的丰度却出现了下降(图1(a))。因此，磺胺甲恶唑可能作为外源性刺激物质造成ABC转运蛋白功能水平的上升，进而赋予携带oleC抗性基因物种更强的生存优势并最终使得oleC抗性基因保持更高的丰度水平，同时研究证明由oleC的抗生素抗性效果源自ABC-转运体的外排转运系统[37]。但由于放线菌门的细菌并不能适应长期的消毒，导致其细菌丰度下降，进而使得功能基因与抗性基因也出现相同的趋势。因此，oleC抗性基因的产生与细菌功能基因的关系紧密。除oleC外，其他抗性基因均与各类功能基因存在正相关性，包括氨基酸生物合成，碳代谢，嘌呤代谢，嘧啶代谢，氧化磷酸化，群体感应以及氨基酸-tRNA的生物合成等。早先的研究证明了不同的输配水系统条件所施加的选择压力影响群落结构以及功能特性和代谢潜力水平的变化[38]，因此，当群落处于长期消毒时，群落的组成发生变化，上述类型的功能基因与抗性基因也随之变化。
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1) 2 μg·L−1磺胺甲恶唑的添加对生物膜细菌群落结构组成无明显影响，次氯酸钠消毒对不同细菌包括变形菌门和放线菌门有很好的控制效果，但浮霉菌门与厚壁菌门细菌表现出很强的抗次氯酸钠消毒能力。
2)在未消毒条件中丰度前10的抗性基因(包括Saur_rpoC_DAP、macB、mfd、aminocoumarin resistant alaS、Mtub_katG_INH、mtrA、oleC、Mtub_ropB_RIF、Ecol_ropB_RIF、patA)在次氯酸钠消毒后含量下降明显，ARGs总量下降了91.9%，同时携带差异性抗性基因(macB、patA)的细菌在消毒后数量也出现明显下降，因此，次氯酸钠消毒通过控制携带抗性基因物种从而有效控制抗性基因传播。
3)抗性基因的形成与细菌功能代谢变化有关。组间显著性差异的功能基因(包括氨基酸生物合成、碳代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、氧化磷酸化、群体感应以及氨基酸-tRNA的生物合成)与组间显著性差异的抗性基因存在良好的正相关关系。因此，长期消毒改变了细菌群落组成及其功能，并最终影响抗性基因传播。
微量磺胺甲恶唑对饮用水管网生物膜群落及抗性基因的影响与控制
Influence of micro-sulfamethoxazole on the biofilm bacterial communities and antibiotic resistance genes in drinking water distribution systems and its control
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摘要: 针对饮用水管网系统可能存在的微生物风险问题，采用模拟不同处理条件下的输配水管道系统，通过宏基因组学分析探究微量磺胺甲恶唑以及次氯酸钠消毒对管道中生物膜与抗性基因组成的影响。结果表明，2 μg·L−1磺胺甲恶唑的添加对微生物群落以及抗性基因组成无明显影响，而浮霉菌门细菌表现出很强的抗次氯酸钠消毒能力。在未消毒条件下丰度前十的抗性基因与携带差异性抗性基因的细菌在消毒后丰度均明显有所下降，次氯酸钠消毒使ARGs总量下降了91.9%，因此，次氯酸钠消毒通过控制携带抗性基因物种从而有效控制群落抗性基因的传播。同时，通过组间显著性差异的功能基因与组间显著性差异的抗性基因相关性分析，功能基因的变化情况与抗性基因变化情况一致，因此，长期消毒改变了细菌群落组成及其功能，并最终影响抗性基因传播。这项研究有助于控制长期运行的饮用水管网输配系统中可能存在的包括抗药基因在内的微生物相关风险问题。Abstract: For the microbial risk in the water of drinking water distribution systems (DWDSs), metagenomic analysis was used to investigate the effects of micro-sulfamethoxazole and NaClO disinfection on biofilm bacterial communities and antibiotic resistance genes (ARGs) in the simulated DWDSs under different treatments. The experimental results showed that the bacterial communities and ARGs did not change significantly with addition of 2 μg-L−1 sulfamethoxazole, while the bacteria of Planctomycetes at phylum level showed a strong resistance to NaClO. The abundance of top ten ARGs and the bacteria carrying differential ARGs detected before disinfection both decreased significantly after disinfection. The total abundance of ARGs decreased by 91.9% due to the influence of NaClO. Therefore, the spread of ARGs was controlled by the NaClO disinfection because of its inhibition on the bacterial species carrying ARGs growth. Meanwhile, the correlation analysis between function genes and ARGs with significant differences among groups showed that the changes in function genes were consistent with changes in ARGs. Therefore, long disinfection changed the bacterial communities and their function, which affected the propagation of different ARGs. This study was contributed to the control of possible microbial risk including the ARGs in the water of long-running DWDSs.
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石油开采、运输、炼制及含油污水处理过程中会产生大量的含油固废。根据国务院发布的《全国土壤污染状况调查公报》[1]，在已调查的13个采油区的494个土壤点位中，超标点位占23.6%，主要污染物为石油烃和多环芳烃。据统计，我国每年新增含油污泥约5×106 t，但含油污泥的实际处置率却不到20%；同时，存量含油污泥规模已超1.59×108 t [2]。大量的含油固体废物未能及时处理而随意堆放或掩埋，不仅会占用大量土地资源，而且会对周围的土壤、水体和空气都造成污染。因此，对含油固废进行无害化处置十分必要和迫切。
传统的含油固废处理技术主要包括溶剂萃取法、调质分离法、热洗涤法、焚烧法、热脱附法以及生物处理法等[3-7]。其中，溶剂萃取法萃取剂用量大，处理成本高，存在溶剂损耗问题；调质分离法占地面积大、处理效果受含油固废来源影响大；热洗涤法主要适用于砂石为主的含油固废处理，且污水、污泥量大；焚烧法、热脱附法能耗高、设备投资高；而生物处理法处理周期长、菌种难以培养，对石油烃重度污染土壤/油泥适用性差，实际应用较少。以上技术中，处理后油泥只能用于油田井场内铺路等用途，普遍无法将污染介质处置到第一类建设用地标准。因此，迫切需要一种绿色节能、处理效果彻底的石油烃重度污染土壤/油泥处置技术。
阴燃是自然界中广泛存在的缓慢无焰自持燃烧现象。爱丁堡大学的学者于2005年最先提出将其工程化应用于有机污染介质的治理[8]；其技术原理是，利用热值较高的有机污染物为能源，通过向污染物料中注入空气，在低能状态下点燃引起污染物的自持燃烧，然后利用污染物自身的燃烧热能引发周边污染区域的持续燃烧，从而实现污染物的去除。与传统的含油固废处理技术相比，工程化阴燃技术具有处理能耗低、应用范围广、安全高效、处理灵活、可模块化设计等优点。
根据处置场所的不同，工程化阴燃技术可分为原位和异位应用。目前，国外在实验室研究[9-14]的基础上已就原位和异位[15-17]阴燃分别开展了中试甚至大规模污染场地修复实验；而国内对工程化阴燃技术的研究大多还处于对技术可行性、影响因素及燃烧过程探究的实验室研究阶段[18-22]，鲜有中试规模的实验研究报道。本研究采用异位阴燃设备分别对石油烃重度污染土壤和含油污泥进行了中试实验，以研究该技术应用于含油固废处理领域的适用性；同时，探索该技术用于大规模修复工程的运行效果和运行参数。
1. 材料与方法
1.1 实验原料
中试实验1在代号为T1的基础油和润滑油调配厂进行，该厂自2015年起已停止运营。实验对象为场地内3处不同区域的石油烃污染土壤，具体特性见表1。
表 1 中试实验1石油烃污染土壤特性Table 1. Characteristics of petroleum hydrocarbon-contaminated soil of pilot study 1污染土壤来源 土壤质地 污染土壤与地下水位埋深情况 石油烃质量分数/( mg·kg−1) 污染的石油类型 基础油厂区 粉砂 污染土壤位于地表以下5.5~6.0 m（地下水位以下） 6 880~12 844 Ⅰ类基础油 油罐区 砾砂 地面堆土 2 759 成品润滑油 润滑油调配厂区 粉土 污染土壤位于地表以下3.0~3.5 m（地下水位于地表以下3.4 m） 4 146 基础油及成品润滑油 | Show Table
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中试实验2在代号为T2的油田油泥处置场进行。实验对象为场地内4处不同区域的油泥，油泥特性如表2所示。实验中加入介质对油泥进行掺混预处理，介质特性见表3。
表 2 中试实验2油泥特性Table 2. Characteristics of oil sludge of pilot study 2供试物料 含水率/% 石油烃质量分数/(mg·kg−1) #1罐底泥 20.9 159 660 #2罐底泥 21.0 123 583 #1池底泥 35.0 138 500 #2池底泥 32.8 80 340 | Show TableDownLoad:
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表 3 中试实验2掺混介质特性Table 3. Characteristics of blending medium of pilot study 2供试介质 性状 含水率/% 石油烃质量分数/(mg·kg−1) 石英砂 0.8~2 mm颗粒 0 0 粉土 粉状 20~50 0 修复土 粉状 0~0.2 7~99 | Show TableDownLoad:
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1.2 实验装置
阴燃中试装置由预处理系统、阴燃反应器、空气注入系统、尾气处理系统以及电气控制系统5部分组成(图1、图2)。阴燃反应在阴燃反应器中进行，反应器共2台，每台长1.6 m、宽1.6 m、高1.4 m。反应器主要由底部的气室、气室与堆料室之间的支撑格栅、中部的堆料室和顶部的集气罩构成。气室中部设有DN50空气注入管，其两侧分别均布3支U型电加热管。鼓风机连接空气注入管同时给2台反应器供气，同时，2台反应器的集气罩都与气液分离器、活性炭(GAC)罐、引风机、排气筒组成的尾气处理系统相连，以便当其中1套设备装卸料时，另1套设备仍能运行。
鼓风机和集气罩出气管路上均设置在线流量计、压力表，用于监测每个反应器的进、出气风量和压力。活性炭罐前后设取样口，用于尾气中CO、VOCs、H2S体积分数和尾气成分的检测。阴燃反应前后分别对实验物料采样，送第三方实验室检测石油烃质量分数。
1.3 实验方法
阴燃实验前，先对原料进行预处理，将原料与掺混介质按设计比例在搅拌机中搅拌至目测均匀后，从反应器上部投加到堆料室中，至物料堆高达40 cm，再在上面覆盖20 cm干净土壤用于抑制表面明火。加料完成后，在距离反应器四角30 cm×30 cm的4点及反应器正中点位(编号A、B、C、D、E)各安装1支集束热电偶(每支对自下而上0、5、15、30、50 cm料层处点位进行测温)，将信号接入温场采集器。盖上集气罩，启动鼓、引风机并调节风量，开启电加热器；当数据显示阴燃启动后，关闭电加热器，保持空气持续输入以维持阴燃继续进行，反应过程产生的尾气经尾气处理系统处理后排放；反应结束并冷却后打开集气罩进行卸料。
中试实验1以T1场地内石油烃污染土壤为对象，研究不同来源石油烃污染土壤、达西空气通量对阴燃启动、燃烧锋面推进，以及污染土壤中石油烃去除率的的影响。针对部分未能实现自持阴燃的污染土壤添加辅助燃料-芥花油(化学成分主要为不饱和脂肪酸)，以研究添加植物油对于此类物料维持阴燃反应的可行性。具体实验方案见表4。
表 4 中试实验1实验方案Table 4. Experimental plan of pilot study 1编号 污染土来源 土壤质地 污染土添加量/m3 芥花油添加量/L 预热阶段达西空气通量*/(cm·s−1) 阴燃阶段达西空气通量/(cm·s−1) T1-1 基础油厂区 粉砂 1.02 0 0.87~1.09 0.98~1.09 T1-2 基础油厂区 粉砂 1.02 0 0.18~0.22 0.43~1.09 T1-3 基础油厂区 粉砂 1.02 20 0.18~0.22 0.33~0.65 T1-4 油罐区 砾砂 1.02 0 0.18~0.22 0.38~0.43 T1-5 润滑油调配厂区 粉土 1.02 0 0.18~0.37 0.18~0.65 注：*达西空气通量是指垂直于气流方向的单位横截面积上的空气量，cm·s−1。 | Show TableDownLoad:
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中试实验2以T2场地内不同来源油泥为对象，研究不同掺混介质(石英砂、粉土、修复土)、掺混比，以及达西空气通量对阴燃启动、燃烧锋面推进速度，以及油泥中石油烃去除率的影响。具体实验方案见表5。
表 5 中试实验2实验方案Table 5. Experimental plan of pilot study 2编号 油泥来源 掺混介质 油泥∶掺混介质(体积比) 预热阶段达西空气通量/(cm·s−1) 阴燃阶段达西空气通量*/(cm·s−1) T2−1 #1池底泥 石英砂 1∶13 0.18~0.54 0.54~0.98 T2−2 #1池底泥 粉土 1∶13 0.18~0.33 0.65 T2−3 #1池底泥 修复土** 1∶6 0.18~0.27 0.22~0.43 T2−4 #1罐底泥 修复土 1∶8 0.18 0.49~0.81 T2−5 #2池底泥 修复土 1∶4 0.18 0.22~1.09 T2−6 #2罐底泥 修复土 3∶4 0.18~0.33 0.43~1.30 T2−7 #2池底泥 修复土 1∶2 0.18~0.38 0.45~1.30 注∶*达西空气通量是指垂直于气流方向的单位横截面积上的空气量（单位∶cm·s−1）；**修复土是指阴燃治理后的实验物料（掺混石英砂批次的除外），用于后一批次阴燃反应掺料。 | Show TableDownLoad:
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1.4 分析方法
1)尾气分析。CO体积分数监测采用便携式CO检测仪(DX80，南京百世安安全设备有限公司)；VOCs体积分数监测采用Mini RAE3000 VOC检测仪(PGM-7320，南京凯辉荣电子科技有限公司)；H2S体积分数监测采用便携式四合一气体检测仪(PGM-2400，南京硕控自动化科技有限公司)。
2)含油固废中石油烃质量分数分析。中试实验1依据《土壤中总石油烃碳氢化合物检测方法-气相层析仪/火焰离子化侦测器法》(NIEA S703.62B)[23]；中试实验2依据《城市污水处理厂污泥检验方法》(CJ/T 221-2005)[24]。
3)阴燃推进速度表征。阴燃推进速度的快慢采用燃烧锋面自持蔓延速率表征，计算方法见式(1)；含油固废中石油烃去除率计算方法见式(2)。
燃烧锋面自持蔓延速率(m⋅d−1)=相邻热电偶间距相邻热电偶到达燃烧封面所用时间差 (1) 石油烃去除率(%)=(阴燃处理前物料石油烃质量分数-阴燃处理后物料石油烃质量分数)阴燃处理前石油烃质量分数×100% (2) 2. 结果与讨论
2.1 阴燃启动与燃烧锋面自持推进
以处理含油污泥的中试2第1批次实验T2−1为例，对阴燃启动的界定及燃烧锋面自持推进过程进行了分析。阴燃启动与否可结合料层温升及尾气浓度两方面综合判断，而判断燃烧锋面是否自持推进，则应观察外部供能停止后，沿阴燃推进方向的后续料层的温度是否相继出现相近的峰值。由实验T2−1阴燃温度曲线(图3)可看出，当电加热300 min时，热电偶数据显示，0 cm 料层越过峰值温度，5 cm料层温度快速上升至400 ℃[25]。结合尾气中CO、CO2浓度增加，判断阴燃已启动，此时关闭电加热器。在继续通入空气情况下，观察到3、4层阴燃峰值温度相继出现，反应最高温度达520 ℃，证明此时阴燃反应已实现自持推进。经计算，T2−1的燃烧锋面自持蔓延速率为2.67 m·d−1。
为直观体现燃烧锋面的推进过程，对实验T2−1阴燃过程中集束热电偶A、B、C、D、E的温度场分别进行了表征。由图4可看出，各热电偶自0 cm推进至最高料层的过程中均经历了预热升温、阴燃反应和降温3个阶段，但各点位的阴燃时长和燃烧锋面自持蔓延速率不一。这主要应与各热电偶处的污染物种类、浓度、空气流量和压力以及渗透性等因素有关[10,12]。此外，可观察到，阴燃反应主要发生在0~40 cm料层，50 cm料层并未发生阴燃(＜400 ℃)。这是因为，50 cm料层为覆盖净土，无有机污染物，当燃烧锋面从40 cm扩散至50 cm时，阴燃反应逐渐终止。50 cm料层温升主要是由下部料层阴燃放热通过热传导、热辐射和热对流作用导致的。
表6为中试实验2的阴燃结果。7次实验均成功启动及自持推进。其中，阴燃启动用时最短为3 h，峰值温度最高达990 ℃，石英砂预处理组阴燃自持蔓延速率最高，为2.67 m·d−1，掺料为土的其余各批次阴燃平均自持蔓延速率为0.60 m·d−1。
表 6 中试实验2阴燃结果Table 6. Smoldering results of pilot study 2编号 油泥 掺混介质 油泥∶掺混介质(体积比) 阴燃前(混合后)石油烃质量分数/(mg·kg−1) 阴燃残渣中石油烃质量分数/(mg·kg−1) 启动/自持时长/h 峰值温度/℃ 燃烧锋面自持蔓延速率/(m·d−1) T2−1 #1池底泥 石英砂 1∶13 3 360 7 5/21 520 2.67 T2−2 #1池底泥 粉土 1∶13 7 830 7 7/26 549 0.99 T2−3 #1池底泥 修复土 1∶6 13 000 32 7/72 814 0.51 T2−4 #1罐底泥 修复土 1∶8 5 510 22 11/43 520 0.68 T2−5 #2池底泥 修复土 1∶4 16 800 11 3/61 726 0.24 T2−6 #2罐底泥 修复土 3∶4 30 600 93 4/86 858 0.6 T2−7 #2池底泥 修复土 1∶2 25 300 99 6/60 900 0.64 注∶为排除电加热及上部干净土层传热影响，燃烧锋面自持蔓延速率按5~30 cm料层温度数据计算。 | Show TableDownLoad:
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2.2 达西空气通量对阴燃启动及燃烧锋面推进的影响
在中试1中，T1−1实验比对了不同达西空气通量对石油烃污染土壤阴燃反应的影响。如图5(a)所示，当初始达西空气通量维持在0.87~1.09 cm·s−1时，阴燃一直未启动；而将达西空气通量降低至0.25 cm·s−1后，反应温度短时快速上升达到峰值温度，阴燃迅速启动。由此可见，在阴燃启动阶段，空气通量不宜过高，否则会导致污染物燃烧所产生的热量被迅速带走，阴燃反应所释放的热量与热损失传热之间难以实现能量平衡[26-27]。在T1−1实验基础上，中试实验1后续批次及中试实验2各批次实验将初始达西空气通量维持在0.18 cm·s−1，适用的石油烃土壤及油泥均成功启动阴燃。与文献[16, 26]中提出的阴燃所需最低达西空气通量0.5 cm·s−1相比，本实验验证在更低的初始达西空气通量(0.18 cm·s−1)条件下也可成功启动阴燃。
T2−1实验中，当阴燃成功启动后，提高达西空气通量至0.97 cm·s−1，15、30 cm料层温升速率陡增，快速达到阴燃峰值温度(图5(b))。这说明，在一定污染物浓度下，阴燃启动后的燃烧锋面自持蔓延速率随达西空气通量的增大而增大。在该阶段，氧气的传输速率成为反应的决速步骤，增大达西空气通量将使氧含量增加，继而加快氧化反应，提升阴燃锋面的推进速率[26]。因此，通过调节空气通量可对反应进程进行有效控制。
2.3 掺混介质对阴燃处理油泥的影响
1)掺混介质物性对阴燃处理油泥的影响。中试2的T2−1、T2−2实验以#1池底泥为原料，在油泥与介质的体积比为1∶13、初始达西空气通量0.18 cm·s−1的条件下，分别对比了石英砂、粉土为掺混介质的阴燃处理效果。根据表6中所列T2−1、T2−2实验结果，采用石英砂作为掺混介质比采用粉土作为掺混介质阴燃启动用时更短(5 h<7 h)，燃烧锋面自持蔓延速率更快(2.67 m·d−1>0.99 m·d−1)。这可能与石英砂2个方面的性质有关∶1)石英砂的导热性能更好(石英砂导热率10 W·m−1K−1>粉土导热率 1.67 W·m−1K−1)，有利于在阴燃自持蔓延方向混合物料的传热；2)石英砂的加入有利于分散油泥，改善混合物料的渗透性，有利于阴燃反应所需氧气与油泥的更好接触。此外，添加的粉土具有一定含水率，预热阶段粉土中的水分蒸发，可带走阴燃反应部分能量，导致掺混粉土的T2−2实验温升较慢，达到阴燃启动所需温度用时更长，阴燃速率更慢[28]。
值得注意的是，T2−1实验物料的石油烃质量分数和阴燃峰值温度均较T2−2实验低，但仍能实现阴燃更快启动和推进。在对阴燃启动和推进的影响上，掺混介质本身的导热性及对物料渗透性的改善作用似乎比石油烃质量分数更重要。
2)介质掺混比例对阴燃处理油泥的影响。中试2的T2−5、T2−7实验分别以#2池底泥为实验对象，以修复土为掺混介质，考察了油泥与介质不同掺混比下的阴燃处理效果。根据表6，实验T2−7(油泥与介质的体积比为1∶2)比T2−5(油泥与介质的体积比为1∶4)阴燃自持蔓延速率更快(0.64 m·d−1 >0.24 m·d−1)。这是因为，对于修复土这类自身渗透性一般的掺混介质，随着掺混比例的提高，混合物料中石油烃质量分数下降，阴燃自持蔓延速率也随之降低。
以石英砂为掺混介质的阴燃启动和燃烧锋面自持蔓延速率最快，但石英砂成本相对较高。综合上述各实验结果，从降低运行成本和提高阴燃处理效率的角度考虑，1∶2的油泥与修复土体积比更适于工程化应用。
2.4 含油固废阴燃处理效果分析
采用石油烃去除率对含油固废的阴燃处理效果进行了表征。由表7可看出，中试实验1中成功阴燃的各批次实验(含添加芥花油批次)，阴燃前污染土壤石油烃质量分数在2 759~8 301 mg·kg−1，阴燃后残渣石油烃质量分数均未检出；以检出限32.7 mg·kg−1计算，阴燃处理后石油烃去除率大于99.6%。由图6 (石油烃质量分数以对数形式表示)可看出，中试实验2中，不同污染来源、反应前石油烃质量分数在3 360~30 600 mg·kg−1的油泥，阴燃后石油烃去除率均在99.5%以上。阴燃残渣的石油烃质量分数最低达7 mg·kg−1，远低于《含油污泥处理利用控制限值》(DB61/T 1025-2016)[29]中的利用控制限值(≤10 000 mg·kg−1)及《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 36600-2018)[30]中第一类用地筛选值(826 mg·kg−1)。图7是T1−3实验阴燃处理前后物料图，可看出，阴燃处理后实验物料明显比实验前干燥和分散。
表 7 中试实验1阴燃结果Table 7. Smoldering results of pilot study 1编号 污染土来源 污染土壤与地下水位埋深情况 芥花油添加量/L 阴燃前石油烃质量分数(掺混后)/( mg·kg−1) 阴燃残渣中石油烃质量分数/( mg·kg−1) 启动/自持时长/h 峰值温度/℃ 自持阴燃 T1−1 基础油厂区 污染土壤位于地表以下5.5~6.0 m(地下水位以下) 0 12 844 — 56.8/0 — 否 T1−2 基础油厂区 污染土壤位于地表以下5.5~6.0 m(地下水位以下) 0 9 621 — 25.2/0 — 否 T1−3 基础油厂区 污染土壤位于地表以下5.5~6.0 m(地下水位以下) 20 8 301 ND* 22.5/10.7 665 是 T1−4 油罐区 地面堆土 0 2 759 ND 7.9/23.5 528 是 T1−5 润滑油调配厂区 污染土壤位于地表以下3.0~3.5 m(地下水位于地表以下3.4 m) 0 4 146 ND 15.8/10.7 551 是 注：*ND表示未检出。 | Show TableDownLoad:
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图 6 中试2阴燃前后物料石油烃质量分数及去除率图Figure 6. Petroleum hydrocarbon concentration and removal rate of pilot study 2 before and after smoldering2.5 阴燃尾气分析
尾气监测及分析结果显示，阴燃尾气中主要存在CO2、H2O等典型氧化反应气体，NOx、VOCs、SO2、H2S等有害气体组分以及CO、CH4等轻烃组分。尾气中CO、VOCs组分浓度随阴燃反应进程存在较大波动性，但总体表现出随阴燃反应温度升高而浓度增大的特性。由图8可看出，在前期料层接近阴燃峰值温度时，CO、VOCs组分浓度也达到最大值，CO组分甚至会短时超出《危险废物焚烧污染控制标准》(GB 18484-2020)[31]排放限值。这是因为，在阴燃启动初期，物料整体渗透性较低，且进风量较小，导致局部燃烧不完全[28]，生成这类气体。尽管如此，峰值温度时CO/CO2比值普遍在0.10~0.35，这表明阴燃仍然以燃烧更为彻底的氧化反应为主。
图 8 T2−3实验中CO、VOCs浓度与达西空气通量、反应温度对照图Figure 8. CO &VOCs concentrations versus air flux & reaction temperature of T2−3对比活性炭(GAC)罐吸附前后的CO、VOCs体积分数可知，GAC对CO无明显处理效果，对VOCs的处理效果则不尽相同，中试实验1中VOCs经吸附处理后体积分数降低，但中试实验2中VOCs经吸附后体积分数降幅不明显。这应与尾气中的VOCs组分差异及GAC的吸附特性有关。一般来说，分子量较大的非极性或低极性分子能更容易被GAC吸附。因此，基于阴燃尾气特性，尾气处理措施还有待完善。
2.6 阴燃技术适用范围及补充植物油对阴燃过程的影响
中试1 研究了阴燃技术对于T1场地内3类不同来源(基础油厂区、油罐区、润滑油调配厂区)石油烃污染土壤的适用性。由表7可看出，T1−1、T1−2实验均以基础油厂区石油烃污染土壤实验对象，物料石油烃质量分数较高，分别为12 844、9 621 mg·kg−1，但阴燃均未自持进行；而T1−4和T1−5 实验分别以油罐区、润滑油调配厂区污染土壤为实验对象，物料石油烃质量分数较低，分别为2 759、4 146 mg·kg−1，却均成功自持阴燃，峰值温度分别达528、551 ℃，平均燃烧锋面自持蔓延速率分别为0.98、1.07 m·d−1。这是因为，基础油厂区污染土壤位于地下水位以下，含水率较高，因此，在阴燃最初的点火预热阶段水分蒸发用时较长，污染物I类基础油的蒸发损失大，在燃烧锋面到达之前挥发比例高[26]，最终导致无法支持阴燃启动和/或自持蔓延。而油罐区污染土壤为地面堆土，润滑油调配厂区污染土壤大部分位于地下水位之上，两者含水率均不高，且污染组分主要为成品润滑油，挥发性较低，因此，阴燃能够启动及自持。
对于未能阴燃自持的基础油区厂区污染土壤，T1−3实验添加辅助燃料-芥花油对阴燃过程进行了重新考察。加入20 L芥花油后，石油烃质量分数为8 301 mg·kg−1，低于未添加芥花油的T1−1、T1−2实验，但阴燃却得以自持，自持蔓延速率为1.07 m·d−1。这是因为，加入芥花油后，芥花油燃烧产热成为主要热源，可支持阴燃反应的自持推进[26]。使用辅助燃料的目的就是使工程化阴燃技术也可以应用到自身无法自持阴燃的固废物料上，使物料中的目标污染物得到协同去除。有研究者指出，自持阴燃反应适用于如煤焦油、木馏油等低挥发性污染物的处理[32]；对于汽油类有机物和氯代溶剂类挥发性污染物，也有加入植物油成功维持阴燃的报道[33]。这些与本实验观测到的现象都是一致的。
3. 结论
1）含油固废的含水率及挥发性可影响阴燃启动及自持推进。高含水率、挥发性高的含油固废难以启动及维持自持阴燃修复，但通过添加辅助燃料可实现工程化阴燃技术的成功应用。阴燃启动阶段宜采用较低空气通量，启动后增大达西空气通量有助于提升燃烧锋面推进速度。
2）工程化阴燃技术治理含油固废，石油烃去除率可达99.5%以上，含油量最低为7 mg·kg−1或未检出，远低于第一类建设用地标准。
3）不同的掺混介质及掺混比例对阴燃反应的启动用时和阴燃自持蔓延速率有较大影响。以石英砂为掺料，阴燃启动用时最短，阴燃蔓延速率最快；1∶2的油泥/修复土掺比更利于工程化应用需求。
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图 1 群落门水平与种水平组成
Figure 1. The relative abundance of total bacterial communities at phylum level and species level.
图 2 Venn结果和组间显著性差异物种分析
Figure 2. The Venn results and Metastats analysis at species level
图 3 群落抗性基因组成，差异抗性基因以及携带耐药性基因物种
Figure 3. The relative abundance of antibiotic resistance genes(ARGs) of communities，the Metastats analysis on ARGs and the contribution of each species to the different ARGs.
图 4 群落功能基因组成，差异功能基因以及携带功能基因物种
Figure 4. The relative abundance of antibiotic functional genes of communities, the Metastats analysis on KEGG functional genes and the contribution of each species to the different functional genes
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