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细菌耐药性感染日益影响人类健康和经济发展[1-2]。英国卫生部报告显示，若不采取有效措施，到2050年，细菌耐药性将导致全球每年出现1 000万人死亡[3]。耐药基因 (antibiotic resistance genes，ARGs) 是细菌获得耐药表型的关键遗传载体，故被列为全球重要的新兴环境污染物之一[4-6]。
城市水系统中的污水处理系统被证明是ARGs的重要储存库之一，同时也是ARGs污染传播至受纳环境的主要来源[7-8]。在污水处理系统中，ARGs的产生和增殖与污水中选择压密切相关[8-9]。已有研究报道了纳米银[10-11]、纳米铜/氧化铜[12-14]、纳米氧化锌 (nZnO) [15]和纳米零价铁 (nZVI) [16-17]等纳米金属及氧化物对污水处理系统活性污泥中总体ARGs分布与归趋的影响。MILLER等[10]通过实时荧光定量聚合酶链反应 (qPCR) 证明，环境浓度纳米银 (0.01~1.0 mg·L−1) 对厌氧消化器中四环素和磺胺类ARGs的丰度无显著影响。MA等[11]通过宏基因组测序分析发现，经过56 d的纳米银 (0.1~20 mg·L−1) 驯化，活性污泥中绝大多数类型ARGs的分布无明显变化，但可促使氨基糖苷类ARGs (如strA) 和吖啶黄类ARGs (acrB) 分别提高300%、50%。此外，ZHANG等[15]发现，nZnO颗粒导致污泥厌氧消化系统中可移动遗传元件 (mobile genetic elements，MGEs) 绝对丰度增加了354.70%，因此可能会增加ARGs的传播风险。最近两项研究基于相关性分析得出，nZVI主要通过改变ARGs潜在微生物寄主降低氯霉素废水处理系统[16]和厌氧消化系统[17]中ARGs的丰度。需要明确的是，污水处理系统中ARGs根据其形态可分为污泥细胞内ARGs (iARGs) 、污泥细胞外附着态ARGs (aeARGs) 和污水细胞外游离态ARGs (feARGs) [18-19]。ARGs的赋存形态不同，其增殖与传播方式亦不相同[19-20]。iARGs主要通过细胞分裂或水平接合进行增殖，而aeARGs和feARGs主要来源于细胞死亡裂解或主动分泌，并能借助转化和转导机制传播[19，21-22]。然而，金属纳米粒子对污水处理系统中不同形态ARGs增殖与传播能力的影响及其机制尚未探明。
本研究采用抗生素敏感性测验和qPCR考察不同质量浓度nZVI和nZnO暴露对污水处理系统中典型磺胺类耐药菌 (ARB) 浓度和不同形态ARGs丰度的影响，并通过检测细胞膜通透性、ARGs表达水平及典型MGEs (intI1) 分布特征阐明nZVI和nZnO暴露下ARGs的转变机制，有助于揭示金属纳米粒子和细菌耐药性的双重新兴环境污染效应，以期为研发高效控制污水处理系统中耐药污染的策略提供参考。
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活性污泥取自某主体工艺为厌氧/缺氧/好氧-膜生物反应器的污水处理厂。活性污泥混合液挥发性悬浮物浓度 (MLVSS) 为2.2 g·L−1。nZVI和nZnO等试剂购自阿拉丁 (Aladdin，中国) 。试剂级别均为分析纯。
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将活性污泥静置后去上清液，采用质量分数为0.85%的NaCl清洗1次。用量筒量取300 mL活性污泥混合液至500 mL锥形瓶中。参照某污水处理厂进水基质水平添加CH3COONa 171.4 mg·L−1 (相当于COD为200 mg·L−1) 、NH4+-N 20 mg·L−1、NO3−-N 10 mg·L−1和PO43--P 2 mg·L−1。然后，投加适量预先超声分散 (5 min) 的nZVI和nZnO储备液至锥形瓶中，使其最终质量浓度维持为1和50 mg·L−1 (分别代表污水处理厂中环境检出水平和污水生物处理胁迫实验质量浓度) [23-25]。最后，将其置于培养箱 (ZQZY-70BF，中国) 中恒温振荡 (20 °C，150 r·min−1) 反应12 h。运行模式参照某实际污水处理厂采用6 h厌氧+6 h好氧的曝气方式，曝气量控制为500 L·(m3·min)−1。分别于0.5、2、4、6、8、10和12 h取污泥混合液用于ARB浓度数检测及细胞膜完整性检测；同时，取污泥混合液进行离心，获得的污泥沉淀和上清液保存于-20 °C，用于RNA和不同形态DNA提取。
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采用琼脂稀释法[26]检测ARB相对浓度。采用无菌0.85% (质量分数) NaCl溶液10倍梯度稀释活性污泥混合液至适当细菌浓度。取1 mL稀释后的样品涂布于含有磺胺 (终浓度为512 mg·L−1) 的MH琼脂上。抗生素浓度遵循临床和实验室标准协会指南[27]的最低抑制浓度。同时，取1 mL 0.85% (质量分数) 无菌NaCl溶液涂布在无菌MH琼脂平板上用作空白对照。最后，将平板倒置于(36±1) °C生化培养箱培养(48±2) h。选取菌落数为30~300菌落形成单位的平板计数菌落总数。ARB相对浓度为添加抗生素的实验组菌落数与抗生素空白组菌落数 (即异养菌浓度) 的比值。
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取5 mL污泥混合液离心 (4 °C、4 000 r·min−1) 处理5 min，保留污泥沉淀，并将上清液转移至新的离心管中。采用离子交换树脂法[28]提取污泥沉淀中的细胞外附着态DNA (aeDNA) 。首先，向污泥沉淀加入适量离子交换树脂 (70 g·g−1 MLVSS) ，补充磷酸盐缓冲液至5 mL；置于4 °C磁力水浴槽内以600 r·min−1处理8 h后，并于4 °C、以10 000 r·min−1离心5 min；取上清液过0.22 μm滤膜，即得aeDNA粗提取液。接着，取污泥沉淀，采用十二烷基硫酸钠 (SDS) -高盐法提取胞内DNA (iDNA) [29]。向污泥沉淀中加入810 μL iDNA抽提液和2 μL蛋白酶K (20 mg·mL−1标准品) ，并于37 °C、以225 r·min−1水平振荡30 min；加入60 μL 20% (质量分数) SDS，置于65 °C水浴锅中水浴2 h；室温离心 (10 000 r·min−1、10 min) 后，取上清液转移至新的2 mL离心管中；向剩余沉淀加入180 μL iDNA抽提缓冲液和20 μL 20% (质量分数) SDS，重复上述处理2次；合并3次处理获得的上清液，即为iDNA粗提取液。最后，采用苯酚-氯仿法[30]进一步纯化aeDNA和iDNA粗提取液。采用超微量分光光度计 (Nanodrop 2 000，美国) 测定DNA浓度与纯度[31-32]。纯化后aeDNA和iDNA样品保存于-20 °C冰箱。采用0.22 μm滤膜过滤上述污泥混合液离心获得的上清液。取4 mL滤液至50 mL离心管中，采用乙醇沉淀法[33]分离游离态DNA (feDNA) 。首先，向离心管中添加2 mL醋酸铵 (终浓度7.5 mol·L−1) 和12 mL 4 °C预冷无水乙醇，颠倒混匀后于冰上静置1 h。接着，于4 °C、以14 000 r·min−1离心30 min后，小心移除上清液；加入1 mL 4 °C预冷的70% (体积分数) 乙醇，并将乙醇与沉淀混合液转移到一个新的2 mL离心管中；重复此操作1次，使feDNA完全转移至2 mL离心管中。最后，将上述DNA悬浮液离心 (4 °C、14 000 r·min−1、10 min) 后，用70% (体积分数) 乙醇洗涤，并将feDNA沉淀悬浮于50 μL无菌无酶水中。利用PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen，中国) 和多功能酶标仪 (BioTek，美国) 测定feDNA 浓度。
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通过TRIzol试剂 (Invitrogen，中国) 抽提活性污泥中的RNA。取2 mL活性污泥离心 (4 °C、8 000 r·min−1、5 min) 后弃上清液，加入1 mL TRIzol试剂涡旋后，室温静置1 h。于4 °C、12 000 r·min−1离心10 min，将上清液转移至新离心管；加入0.2 mL氯仿后，室温静置2 min。将上述混合液离心 (4 °C、12 000 r·min−1、5 min) 后，取0.5 mL上层水相至新离心管；加入0.5 mL异丙醇，于−20 °C放置20 min。离心 (4 °C、12 000 r·min−1、20 min) 后弃上清液，加入1 mL 75% (体积分数) 预冷 (4 °C) 乙醇；颠倒混匀后离心 (4 °C、8 000 r·min−1、5 min) 后弃上清液，并于室温风干。最后，加入30 μL无RNA酶去离子水溶解RNA沉淀。采用超微量分光光度计 (Nanodrop 2 000，美国) 测定RNA初始浓度及纯度。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒 (Takara，中国) 对RNA进行反转录。先将2 μL RNA和2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser及适量RNase Free ddH2O (总体积10 μL) 添至200 μL PCR反应管1内，吸打混匀。置于PCR仪 (Eppendorf，德国) 中42 °C反应2 min后，将混合液转至反应管2中。再加入4 μL 5×PrimeScript®Buffer2、1 μL PrimeScript®RT Enzyme MixI、4 μL RNase Free ddH2O和1 μL RT Primer Mix，吸打混匀后将PCR反应管2置于PCR仪，于37 °C下反应15 min。最后在85 °C反应5 s进行反转录，生成cDNA于−20 °C保存。
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采用qPCR定量分析污水处理系统典型磺胺类ARGs (sul1和sul2) 和intI1的丰度和表达水平。反应体系 (20 μL) 为：10 μL SuperReal PreMix Plus (TIANGEN，中国) ，0.6 μL正引物和反引物，2 μL DNA模板和6.8 μL ddH2O。反应条件为：95 °C预变性 1~2 min，95 °C变性 30 s，退火30 s，72 °C延伸 30 s，共40个循环。sul1、sul2、intI1和16S rDNA的引物序列和退火温度参见文献[34-36]。所有样品一式3份。
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采用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits (Invitrogen，中国) 检测细菌细胞膜完整性。取0.5 mL污泥混合液离心 (4 °C、8 000 r·min−1、5 min) 弃上清液后，加入1 mL质量分数为0.85%的NaCl缓冲液，于10 000 r·min−1下离心15 min。污泥沉淀重悬于适量0.85% (质量分数) NaCl缓冲液 (OD600约为0.05) 后，取100 μL上述污泥混合液与等体积染料，吸打混匀后室温孵育15 min。采用多功能荧光酶标仪 (BioTek，美国) 测定样品的荧光值。激发波长设置为485 nm，发射波长为530 nm和630 nm。所有样品一式3份。
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ARGs相对丰度为单位质量 (ng) DNA中ARGs拷贝数与16S rDNA拷贝数之比。所有图形均使用Origin 20.0进行绘制。图中误差棒表示2次或3次实验数据的标准差。
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nZVI和nZnO暴露已被证明能有效抑制鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、拟杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、硫假单胞菌等ARB生长[37-39]。然而，nZVI和nZnO暴露对污水处理系统中ARB的影响尚未可知。因此，将活性污泥暴露于不同浓度 (1和50 mg·L−1) nZVI和nZnO，于不同时间 (0.5、2、4、6、8、10和12 h) 进行取样检测。如图1所示，不同浓度nZVI和nZnO暴露下污泥中磺胺类ARB的相对浓度为0.65%~21.04%，且经nZVI和nZnO暴露后有所下降。具体而言，经过4 h nZVI和nZnO暴露后ARB相对浓度的水平出现大幅上升，至5.65%~18.34%，随后下降至初始水平并保持稳定。对比nZVI和nZnO暴露组与对照组数据发现，ARB变化可能主要由异养菌浓度的波动所致。进一步分析不同浓度nZVI和nZnO对ARB的影响发现，在0~6 h (除4 h)，1 mg·L−1 nZVI暴露下ARB相对浓度明显高于50 mg·L−1 nZVI；而在8~12 h，50 mg·L−1 nZVI 暴露下的ARB相对浓度逐渐超过1 mg·L−1 nZVI。这可能是因为nZVI在好氧处理阶段 (6~12 h) 更易于氧化，从而降低了对ARB的抑制作用[40]。此外，1 mg·L−1 nZnO在暴露期间对ARB无明显影响，而50 mg·L−1 nZnO在暴露期 (除4 h外) 会明显抑制ARB增殖。
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nZVI和nZnO暴露下3种不同形态ARGs的分布情况如图2所示。污泥中aeARGs和iARGs的相对丰度分别为3.34×10−2~2.83×10−1 copies·copies−1 16S rDNA和2.31×10−2~9.12×10−2 copies·copies−1 16S rDNA，且在暴露于nZVI和nZnO (除6 h外) 后持续降低。经过12 h nZVI和nZnO暴露，磺胺类aeARGs和iARGs的相对丰度分别降低了32.02%~71.69%和5.29%~20.55%。显然，nZVI和nZnO暴露对aeARGs分布的扰动作用明显强于iARGs。需要指出的是，nZVI和nZnO暴露后sul1相对丰度削减率低于对照组0.25%~16.21% (除1 mg·L−1 nZnO外) ，而sul2相对丰度的则高于对照组1.51%~15.47%。这说明纳米金属及其氧化物暴露对aeARGs和iARGs的削减能力可能取决于ARGs的类型。污泥厌氧消化过程中添加nZVI[17，41-42]或nZnO[43]有利于提高sul1、sul2、tetX和gryA的相对丰度，但同时会削减tetM、ermX、ermf和tet36的相对丰度。此外，相较对照组而言，nZVI和nZnO暴露12 h后的iARGs相对丰度下降了6.42%~10.47%，而aeARGs仅在1 mg·L−1 nZVI和nZnO暴露组分别下降5.31%和11.15%。进一步对比发现，50 mg·L−1 nZVI暴露下aeARGs丰度的削减比例比1 mg·L−1 nZVI低5.51%~33.15%；相反，50 mg·L−1 nZVI暴露下iARGs丰度的削减幅度明显高于1 mg·L−1 nZVI (图2(a)~(b)) 。此外，50 mg·L−1 nZnO暴露对aeARGs和iARGs相对丰度的削减比例均小于1 mg·L−1 nZnO暴露 (图2(a)~(d)) 。
由图2(e)和(f)可知，nZVI和nZnO暴露后feARGs相对丰度为1.53×10−2~3.32×10−1 copies·copies−1 16S rDNA，且随暴露时间增加逐渐降低。此外，与对照组相比，nZVI和nZnO暴露明显促进了feARGs的增殖。在河水[44]或海水[45]中添加nZnO已被证明有利于sul1富集。进一步对比不同浓度nZVI和nZnO暴露下feARGs的变化可知，nZVI暴露对feARGs的影响呈现低促高抑规律；而50 mg·L−1 nZnO暴露会持续刺激feARGs增殖 (图2(e)~(f)) 。这可能是由于50 mg·L−1 nZnO能导致ARB大量裂解 (图1) ，进而使iARGs释放，转变成feARGs。
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1) ARGs可移动性。磺胺类ARGs的动态转变通常与可移动遗传元件——intI1密切相关[19，46]。因此，重点探究了nZVI和nZnO暴露下intI1的分布特征。如图3所示，nZVI和nZnO暴露12 h后，胞外附着态、胞内和胞外游离态intI1的相对丰度分别降低了37.70%~67.65%、34.06%~60.30%和16.01%~68.87%。然而，nZVI和nZnO暴露12 h后intI1的相对丰度高于对照组。同时，胞外附着态sul1的相对丰度与intI1相对丰度呈现显著相关性 (图4) 。这说明nZVI和nZnO胁迫可能通过富集intI1促进sul1增殖。在粪便堆肥过程中，nZVI和nZnO暴露下intI1与ARGs具有明显的正相关性[42]。
2) 细胞膜通透性。nZVI和nZnO暴露下污泥中细菌的活细胞比例如图5所示。在4 h时，污泥细菌活细胞比例发生急剧下降 (50.22%~55.30%) ，这在一定程度上解释了同时段发生的污泥aeARGs丰度增加的现象 (图2 (a)~(b) ) 。值得注意的是，在8~12 h暴露期间 (好氧阶段) ，1 mg·L−1 nZVI使污泥中细菌的活细胞比例分别降低了22.38%~28.00%，而50 mg·L−1 nZVI暴露组活细胞比例无明显变化。这可能是因为nZVI在有氧状态下更易于氧化，从而失去了抑菌能力[40]。
3) ARGs转录水平。转录可能是病原菌调控ARGs丰度水平以抵御抗生素攻击的方式之一[47-48]。由图6可知，nZVI和nZnO暴露会显著改变sul1和sul2的表达水平。如1 mg·L−1 nZVI与nZnO暴露4 h后sul1表达水平分别是对照组的1.30和1.62倍，而50 mg·L−1 nZVI和nZnO暴露导致sul1表达水平急剧下降为对照组的0.66和0.73倍。此外，nZVI和nZnO对sul1和sul2表达水平的影响会随时间发生波动。再者，nZVI和nZnO对sul1表达水平的扰动幅度也明显高于sul2。因此，nZVI和nZnO暴露能调控污泥中细菌内ARGs的转录过程，且因ARGs类型不同而迥异。
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nZVI和nZnO暴露有效降低了污水处理系统中磺胺类ARB相对浓度，且nZVI表现出更强的削减效果。nZVI和nZnO暴露可有效削减磺胺类aeARGs和feARGs的相对丰度，对iARGs的影响较小。nZVI和nZnO暴露可能通过诱导污泥中的intI1增殖、改变细胞膜通透性和调节细菌转录水平加剧ARGs的传播与扩散风险。典型纳米金属对污水处理系统中ARB和不同形态ARGs消长的影响及其机制可为制定有效调控和全面削减污水处理系统中耐药污染策略提供参考。
纳米金属对污水处理系统中磺胺耐药基因和耐药菌的影响及其机理
Effects and mechanisms of metallic nanoparticles on the fate of sulfanilamide antibiotic resistance genes and resistant bacteria in wastewater treatment system
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摘要: 细菌耐药性和纳米材料污染为新兴环境问题。细菌耐药性遗传载体——耐药基因 (ARGs) 广泛存在于污水处理系统中，且已被证明与金属纳米材料密切相关。采用实时荧光定量PCR技术，探究了纳米零价铁 (nZVI) 和纳米氧化锌 (nZnO) 对污水处理系统中磺胺类耐药菌 (ARB) 和ARGs的分布特征的影响。结果表明，50 mg·L−1 nZVI和nZnO暴露均有利于削减磺胺ARB浓度数。与对照组相比，nZVI和nZnO暴露后污泥中sul1丰度增加了0.25%~16.21%，而sul2出现明显削减 (1.51%~15.47%) 。此外，50 mg·L−1 nZVI会导致游离态胞外ARGs大幅削减。nZVI和nZnO暴露通过富集污水处理系统中的intI1、改变细胞膜通透性和调节细菌转录能力促进sul1的增殖。本研究结果阐明了典型纳米金属对污水处理系统中ARB和不同形态ARGs消长的影响及其机制，可为制定有效调控和全面削减污水处理系统中耐药污染策略提供参考。
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关键词:
- 耐药基因(ARGs) /
- 耐药菌(ARB) /
- 纳米零价铁(nZVI) /
- 纳米氧化锌(nZnO) /
- 污水处理系统
Abstract: Antibiotic resistance and nanomaterials contaminants are important emerging environmental issues worldwide. Antibiotic resistance vectors—antibiotic resistance genes (ARGs) widely exist in wastewater treatment systems and have been proved to be closely related to metal nanoparticles. The influences of nano zero valent iron (nZVI) and nano zinc oxide (nZnO) on the distribution of antibiotic resistant bacteria (ARB) and different forms of ARGs in wastewater treatment system were investigated by quantitative real-time PCR. The results showed that 50 mg·L−1 nZVI and nZnO exposure was beneficial to the reduction of ARB concentration. Compared with the control group, the abundance of sul1 in the sludge after exposure to nZVI and nZnO increased by 0.25%~16.21%, while sul2 decreased significantly (1.51%~15.47%). In addition, 50 mg·L−1 nZVI led to a significant reduction in free extracellular ARGs. nZVI and nZnO exposure can promote the proliferation of sul1 by enriching intI1, changing the permeability of cell membrane and regulating the transcription ability of bacteria. The present study was helpful for clarifying the effects and mechanisms of metal nanoparticles on the fate of ARB and different forms of ARGs in the wastewater treatment system, which may lay the foundation for effective regulation and mitigation strategies of antibiotic resistance in the wastewater treatment system. -
氟污染是一个全球性问题，特别是在发展中国家[1]，其中钢铁冶金、铝电解、铅锌冶炼、铜冶炼、光伏产业、锂离子电池等冶金行业是氟污染的主要来源[2]。过量摄入氟化物将会对人体产生有害影响，阻碍儿童生长发育[3]。我国对地表水体及生活饮用水中的氟化物质量浓度有严格的限值，也不断强化关于氟化物排放的管控。目前，水体中氟化物的去除技术主要有沉淀絮凝法、膜处理法、离子交换法、吸附法[4-7]，其中吸附法具有产生无害废物数量少、材料成本低、操作简便等优点，被认为是最有前途的除氟方法。
生物炭具有较大的比表面积，表面含有丰富的含氧官能团，且相对廉价，可作为新型吸附材料用于环境修复领域[8-9]。近年来，已有关于不同生物质来源(改性)生物炭除氟应用的研究报道。汤家喜等[10]利用花生壳、玉米秸秆制备的生物炭，最大吸附容量为1.18 mg·g−1；邱会华等[11]制备的氢氧化钾活化的荷叶基生物炭，最大吸附容量为0.85 mg·g−1；张涛等[12]制备了铁改性猪粪生物炭，最大吸附容量为4.4 mg·g−1；徐凌云等[13]制备了铝负载酒糟生物炭，最大吸附容量为18.05 mg·g−1；FENG等[14]利用城市污水处理厂污泥合成的改性污泥生物炭最大吸附容量高达30.49 mg·g−1。显然，不同原料衍生的生物炭吸附除氟能力不尽相同，其中由于污泥含有更高含量的亲氟矿物，其衍生的污泥生物炭对氟的吸附能力最强。但是，未经改性的污泥生物炭直接除氟效果并不理想，一般需要通过铝、铁等金属的负载以提高其吸附性能。近年来发现镧[15]、铈[16]、钇[17]等稀土金属有更好的亲氟性，可用于氟化物的去除，但是单独使用成本较高，如与铁或铝复合使用，有望发挥协同作用并降低成本。另外，我国污泥产量巨大，据统计2021年我国含水率80%的城市污泥产量已超过6 000×104 t[18]。当前污泥的主流处置方式包括干化焚烧、污泥堆肥和卫生填埋，都可能产生二次污染，对环境造成巨大的风险[19-20]。因此，研发基于污泥生物炭的复合改性除氟材料，拓展污泥资源化利用途径，实现以废治废，具有较好的开发前景。
本研究以南通市政污泥为原料，通过缺氧热解-醋酸钾活化-铝铈改性工艺，制备了铝铈改性污泥生物炭(Al/Ce-CSBC)，运用SEM、EDS、BET、XRD及XPS等技术对材料吸附前后的表面形态和结构特征进行了表征和分析，探究了Al/Ce-CSBC对模拟废水中氟离子的吸附行为和吸附机理，以期为污泥生物炭在除氟的资源化利用研究提供参考。
1. 实验部分
1.1 材料与试剂
干化污泥来自南通市某污水处理厂，在90 ℃鼓风干燥箱中干燥12 h后，粉碎过50目筛备用。所用试剂包括六水合氯化铝(AlCl3·6H2O)、七水合氯化铈(CeCl3·7H2O)、氟化钠(NaF)、醋酸钾(CH3COOK)、氢氧化钠(NaOH)等均为分析纯。准确称取2.21 g干燥的氟化钠粉末溶解在1 000 mL去离子水中，配置成氟离子质量浓度为1 g·L−1的储备液，移取适量储备液用去离子水稀释，配成一定初始氟离子质量浓度的含氟模拟废水。
1.2 双金属改性污泥生物炭的制备
污泥的热解制备生物炭。称取5.00 g经干燥的污泥粉末置于坩埚中，用锡纸包裹，放入马弗炉中以10 ℃·min−1的速度升至650 ℃，并保持温度1 h。将热解后的污泥与醋酸钾按质量比1:2的比例混合，再次放入马弗炉中以10 ℃·min−1的速度升至650 ℃热解1 h，离心洗涤3次，并在80~90 ℃下干燥8 h。第1次热解污泥生物炭产物产量为3.21 g，记为SBC；与醋酸钾混合的第2次热解产物产量为4.29 g，记为CSBC。
生物炭的金属改性。将事先称取的1.00 g CSBC加入体积总量为50 mL的氯化铝(0.10 mol·L−1)、氯化铈(0.05 mol·L−1)或两者的等体积混合溶液中，磁力搅拌2 h，用1.00 mol·L−1氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，搅拌12 h。离心洗涤3次，最后在80~90 ℃下干燥8 h得到改性污泥生物炭材料。对铝、铈以及铝铈联合改性的污泥生物炭分别命名为Al-CSBC、Ce-CSBC以及Al/Ce-CSBC，其中Al/Ce-CSBC的产量为1.29 g。
1.3 样品的表征与分析
利用扫描电子显微镜(SEM)(Gemini SEM 300，德国)分析样品的表面形态；利用能谱仪(EDS)分析样品表面的元素；采用比表面积及孔径分析仪(ASAP2460，美国)分析样品的比表面积和孔容孔径；采用X射线粉末衍射仪(XRD)(Ultima IV，日本)分析样品的物相组成及结构；采用X射线光电子能谱仪(XPS)(K-Alpha+，美国)用于确定生物炭表面的成分和价态。
1.4 吸附实验
准确称取0.04 g吸附剂(Al/Ce-CSBC)置于离心管中，加入40 mL 氟离子质量浓度为10 mg·L−1的模拟废水，立刻移至恒温振荡箱中以140 r·min−1的速度振荡20 h，过0.45 μm滤膜后，用氟离子选择电极(PXSJ-216F)测量滤液中氟离子的质量浓度，每次实验重复3次。pH影响实验只改变pH(3.0~10.0)，其余参数不变。吸附等温线实验改变氟离子初始质量浓度(5~100 mg·L−1)，采用Langmuir模型和Freundlich模型对实验数据进行拟合。
吸附动力学实验在盛有2 000 mL氟离子初始质量浓度10 mg·L−1溶液的烧杯中进行，调节并保持溶液pH为6.0，将2.00 g吸附剂加入其中后开始磁力搅拌，至规定时间抽取20 mL混合液过滤，测量滤液中氟离子的质量浓度。采用Lagergren伪一阶、伪二阶模型以及Weber-Morris模型对实验数据进行拟合。
2. 结果与讨论
2.1 污泥生物炭的特征
图1为SBC、CSBC、Al/Ce-CSBC及吸附后的复合负载改性材料(F-Al/Ce-CSBC)的SEM图像。SBC表面呈现片状和层状结构，经醋酸钾活化后的CSBC表面呈现堆砌的颗粒状结构，经改性后的Al/Ce-CSBC表面呈块状且附着颗粒状结构，吸附后的F-Al/Ce-CSBC与Al/Ce-CSBC表面形态区别不大。图2为SBC和Al/Ce-CSBC的EDS图谱，SBC的表面元素主要为O、C、Ca及Fe，Al/Ce-CSBC的表面元素主要为C、O、Si和Ce。由表1可见，相对于SBC，Al/Ce-CSBC表面C和Ce的含量有所增加，O和Ca的含量有所降低。前者表明Ce的成功负载以及通过醋酸钾活化引入了大量的碳；后者与金属矿物组分的溶解损失有关，其中Ca的损失最严重，其含量从SBC的16.4%降至改性后的0.2%，几乎完全消失。
图 1 SBC、CSBC、Al/Ce-CSBC及F-Al/Ce-CSBC的SEM图像Figure 1. SEM images of SBC, CSBC, Al/Ce-CSBC and F-Al/Ce-CSBC表 1 样品元素含量变化Table 1. Changes in the element content of the samples% 样品 O C Ca Fe Al Si P Mg K Ce SBC 39.9 28.0 16.4 4.0 3.7 3.4 1.1 1.0 0.8 0 Al/Ce-CSBC 35.1 46.8 0.2 1.8 1.7 10.9 0 0.2 0.6 2.3 | Show Table
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从图3(a)、图3(c)和图3(e)的N2吸附/脱附等温线可以看出，3种样品等温线都属于IV类，且具H3型回滞环特征，表明样品内部存在丰富狭缝形介孔。图3((b)、图3(d)和图3(f))的孔径分布结果表明，经醋酸钾活化和复合负载改性后的CSBC及Al/Ce-CSBC材料孔径分布更呈多样化，但尖锐峰向更小孔径方向移动，其平均孔径应减小，这在表2中得到验证。由表2可见，SBC经活化和改性后，平均孔径变小，但孔容和比表面积有所增大。比表面积由原来的25.59 m2·g−1增至活化后的69.78 m2·g−1及改性后的176.36 m2·g−1，平均孔径则相应由13.4 nm降至11.4 nm和6.6 nm。活化和改性均能显著增加比表面积，可能是由于醋酸钾在活化过程中分解产生大量的CO2，以及改性溶液中酸溶解样品中大量的CaCO3，使得生物炭片层开裂，暴露出更多更小孔径的介孔。
图 3 吸附材料的N2吸附/脱附等温线与孔径分布Figure 3. N2 adsorption and desorption isotherms and pore distribution of adsorbents表 2 样品的孔隙结构Table 2. Pore structure of the studied samples样品 BET比表面积/(m2·g−1) 总孔体积/(cm3·g−1) 平均孔径/nm SBC 25.59 0.114 4 13.454 CSBC 69.78 0.144 0 11.395 Al/Ce-CSBC 176.36 0.174 8 6.610 | Show TableDownLoad:
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图4(a)为SBC、CSBC、Al/Ce-CSBC和F-Al/Ce-CSBC的XRD图谱。其中SBC中含有明显的SiO2和CaCO3的衍射峰，CSBC中SiO2和CaCO3的峰强明显下降，表明该矿物组分的部分消溶，可能是醋酸钾活化促进了SiO2和CaCO3在高温的消溶/蚀刻反应，进而形成较小的孔隙和较大的比表面积。改性后的Al/Ce-CSBC中CaCO3的衍射峰则完全消失，可能是改性过程引入的金属盐水解产生强酸，使得残留的CaCO3被进一步完全溶解，形成更小的孔隙和更大的比表面积，这与前述关于Ca元素及孔隙的变化相一致。相对于SBC，CSBC和Al/Ce-CSBC中的SiO2的峰强均有不同程度的降低，表明活化和改性对SiO2也有一定的消溶作用。由Al/Ce-CSBC的XRD图谱可知，改性污泥生物炭有SiO2及少量的Al2SiO5晶体，前者是污泥自有残留，后者应为溶出的硅与改性引入的铝反应的产物，此外并没有出现铝和铈的其他晶体结构，表明改性金属主要以无定形负载于污泥生物炭的表面。除了二氧化硅晶体峰强度有略微降低，吸附氟后材料(F-Al/Ce-CSBC)的XRD图谱与吸附前基本一致，表明材料中的晶体结构稳定，推测其不参与对氟的吸附过程，无定形双金属羟基/氧化物应是主要吸附活性组分。由XPS图谱(图4(b))可知，SBC在346.89 eV处有较强的Ca2p信号，在CSBC相对减少，在Al/Ce-CSBC及F-Al/Ce-CSBC则完全消失，趋势与XRD一致，再次验证了碳酸钙的逐步溶解至完全消失的过程。Al/Ce-CSBC的XPS图谱中74.97 eV和885.72 eV处的峰分别对应Al2p和Ce3d，表明铝和铈的成功负载，这与EDS和XRD的结果一致。
图 4 SBC、CSBC、Al/Ce-CSBC及F-Al/Ce-CSBC的XRD和XPS图谱Figure 4. XRD and XPS patterns of SBC, CSBC, Al/Ce-CSBC and F-Al/Ce-CSBC图5较直观地显示了上述活化和改性过程的物性变化，即活化过程促进污泥生物炭中二氧化硅和碳酸钙晶体部分消溶，同时醋酸钾发生气化反应，产生造孔作用[21]，使得CSBC的比表面积增大(表2)；改性过程铝铈被成功负载，碳酸钙完全消失，形成更多的细小孔径，造孔作用更明显，比表面积增加更显著，而少量二氧化硅溶解后与铝(Ⅲ)形成硅酸铝晶体。
图 5 污泥生物炭活化改性示意图Figure 5. Schematic diagram of activation and modification process of sludge biochar不同合成阶段和金属改性的材料对F−的吸附容量如图6所示，原始污泥生物炭SBC的吸附容量为5.42 mg·g−1，经醋酸钾活化后得CSBC的吸附容量则下降至2.90 mg·g−1，可能是SBC经活化后，部分有利于除氟的矿物(主要是含Ca矿物)溶解流失所致。CSBC再经金属改性后的吸附容量均有提升，但不同金属/金属组合改性提升程度不同，单一的Ce和Al改性使材料吸附容量分别提升了44%和157%，而Al-Ce联合改性则提升了228%，高于2种单一金属改性材料提升量之和，这表明铝铈双金属改性发挥了协同作用。
2.2 pH对吸附的影响
pH对Al/Ce-CSBC材料的吸附影响如图7所示，在氟离子初始质量浓度为10 mg·L−1，在酸性范围内，吸附容量随着pH的增加逐渐升高，在pH=6.0时达到最高值9.43 mg·g−1，随后随着pH的增加而逐渐降低，pH升至9.0以上，则急剧下降，其除氟率也有类似规律。Al/Ce-CSBC在溶液pH=4.0~9.0内均有75%以上的除氟率，这是由于生物炭的分散作用，将更多的活性位点充分暴露，使得其有更宽的pH适用范围[22]。同时考察了该体系吸附前后的pH变化，其结果见图8(a)。当pH<6.0时，吸附平衡后的pH有所升高，反之则有所降低，表明Al/Ce-CSBC吸附材料具有一定的pH缓冲作用，FENG等[14]研究其他氧化铝材料也有类似结果，认为该缓冲作用由铝盐的两性性质引起，具体表现为固态金属氧化物表面水解羟基化和质子化作用，详见后文机理分析部分。图8(b)为不同pH下Al/Ce-CSBC的Zeta电位变化。由图可见，该材料的零电位点(pHPZC)高达9.5，表明吸附剂在一定的碱性范围仍带正电荷，可能是因为Al/Ce-CSBC的比表面积较大，具有较好分散性，使得其表面正电荷得到较好维持和保护[22]。在pH＜7.0时溶液中含有大量的H+，使得吸附剂表面发生质子化，体系Zeta电位为正值，能够与溶液中的F−发生静电吸附，但过低的pH可能造成吸附剂表面负载的金属氧化物溶解，并有HF的生成，使吸附剂的吸附容量下降。在pH＞7.0时，溶液中的OH−会与F−竞争吸附位点，使吸附容量有所下降。在pH=10.0时，吸附容量和除氟率下降更明显，其原因除了前述的竞争吸附，还由于吸附剂表面此时逆转为荷负电，对溶液中的F−产生强烈的静电排斥作用。
图 7 pH对Al/Ce-CSBC材料吸附性能的影响Figure 7. Effect of pH on adsorption performance of Al/Ce-CSBC
图 8 吸附前后pH的变化及pH对Al/Ce-CSBC 吸附剂Zeta电位的影响Figure 8. Change in pH before and after adsorption and the effect of pH on the zeta potential of Al/Ce-CSBC2.3 吸附动力学
在氟离子初始质量浓度为10 mg·L−1时，Al/Ce-CSBC的吸附容量随吸附时间的变化情况如图9所示。在前期吸附速率较快，10 min内吸附容量达到了8.30 mg·g−1；随后缓慢增加，在5 h时接近平衡状态。
对吸附动力学数据的拟合结果表明，伪二级模型(R2=0.94)比伪一级模型(R2=0.49)更适合描述Al/Ce-CSBC对氟离子的吸附，表明氟化物在Al/Ce-CSBC上的吸附以化学吸附为主。颗粒内扩散模型如图9(b)所示。吸附反应可分为2个阶段，第1阶段，F−通过界面膜扩散从液相水体转移到Al/Ce-CSBC的表面，并与表面大量的吸附位点结合产生快速吸附，这一阶段膜扩散是控制吸附速率的限制步骤；第2阶段，由于大量的F−占据了吸附剂表面的吸附位点，部分F−将渗透到吸附剂内部的孔径中，因此又被称为孔扩散阶段，第2阶段速率有所降低，该图没有通过原点表明颗粒内扩散不是唯一限速步骤[23]。
2.4 吸附等温线分析
在常温且pH=6.0的条件下，Al/Ce-CSBC的吸附容量随氟离子初始质量浓度变化情况如图10所示。2种模型均能较好描述吸附过程，但Freundlich模型(R2=0.97)较Langmuir模型(R2=0.92)拟合程度更好，表明氟化物在Al/Ce-CSBC上的吸附以多层吸附为主，且Al/Ce-CSBC表面上的活性位点不均匀，1/n =0.29 (0＜1/n＜1)也表明吸附等温线类型是理想类型[24]。Langmuir模型中最大吸附容量41.47 mg·g−1，其与实际最大吸附容量45.66 mg·g−1相近。
2.5 吸附机理
图11(a)为Al/Ce-CSBC材料的XPS全谱图，通过吸附前后的比较发现，吸附后的F-Al/Ce-CSBC在684.15 eV处新增了F1s的峰，表明氟离子被成功吸附在Al/Ce-CSBC吸附剂表面。为了研究其吸附机理，进一步分析了Al/Ce-CSBC吸附氟前后的XPS精细光谱(图11(b)~(d))。由图11(b)的O1s图谱中可见，吸附前531.28 eV和532.54 eV处的特征峰分别对应M―O和―OH，吸附后分别移至530.01 eV和531.39 eV，其中羟基氧占总氧的相对比率由吸附前的55.24%降至41.52%，金属氧化物中M―O的含量由吸附前的44.76%升至58.48%，表明―OH参与了与氟离子的交换。这与其他研究[25-26]结果一致。由图11(c)的Al2p图谱可见，74.46和75.17 eV处峰分别对应Al―O和Al―OH，均归属于负载于材料表面的无定形铝氧化物结构，吸附后峰位置分别移至73.10 eV和73.69 eV。这表明铝羟基/氧化物参与了氟离子的吸附[27-28]。吸附前后Ce元素XPS结果如图11(d)所示。Al/Ce-CSBC的Ce3d5/2的4个代表性峰位于882.78、886.30、888.64及899.35 eV，Ce3d3/2的3个代表性峰位于902.32、905.56及917.10 eV，以上7个峰吸附后分别移至881.34、884.50、886.98、898.37、901.83、904.88及915.65 eV，可清楚地观察到向低能方向位移。经计算Ce4+丰度由吸附前的36.51%下降到22.28%，说明F―Ce络合物的形成及电子转移[16, 29]。
图 11 吸附前后Al/Ce-CSBC的XPS分析Figure 11. XPS spectra of Al/Ce-CSBC before and after adsorption基于上述对氟化物吸附过程pH的变化、等温线模型、动力学模型以及XPS表征分析结果，认为Al/Ce-CSBC对氟化物的吸附为物理吸附和化学吸附，其中化学吸附包括离子交换和表面络合占主导作用。改性过程中形成大量带正电荷的金属羟基/氧化物，且以无定形形式非均匀分散于污泥生物炭的表面，产生大量有效吸附位点并处于相对受保护的高分散体系中，使其表现出较高的零电荷点[22]和酸碱缓冲特性[14]。在碱性条件下产生大量的表面羟基和O2−，并带负电荷(式(1)~式(2))；酸性条件下则质子化并带正电荷(式(3))。
≡M++OH−→≡M−OH (1) ≡M−OH+OH−→≡M−O−2+H2O (2) ≡M−OH+H+→≡M−OH+2 (3) 在酸性条件下吸附剂表面的Zeta电位较高，对溶液中氟离子产生较强静电吸引，进一步引起式(4)反应，产物以金属氟化络合物形式结合在吸附剂表面，表现很高的吸附量和吸附能力，但是酸性过低时，氟主要以氟化氢形式存在，兼吸附剂表面金属的溶出，使得吸附容量下降；随着溶液pH的增加，吸附剂表面的Zeta电位降低，静电吸引减弱，超过零电点后吸附剂表面荷负电产生静电排斥，此时吸附以离子交换为主(式(5))。
≡MOH+2+F−→≡M−F+H2O (4) ≡M−OH+F−→≡M−F+OH− (5) 2.6 与其他除氟吸附剂的比较
通过与其他文献报道的吸附剂除氟性能的比较(表3)，本研究使用的Al/Ce-CSBC有明显的相对优势。Al/Ce-CSBC最大吸附容量为41.47 mg·g−1，高于其他材料的吸附量，包括传统活性氧化铝(16.30 mg·g−1)、双金属和三金属复合材料(27~32 mg·g−1)、其他改性生物炭材料(18~28 mg·g−1)以及铝铁改性污泥生物炭材料(30 mg·g−1)。就酸碱适用性而言，Al/Ce-CSBC在较广的范围(pH=4.0~9.0)内均有75%以上的去除率，其他材料(除了三元金属复合材料)则类似传统的活性氧化铝，只能在较窄的酸性范围才有较高的除氟率。因此，铝铈改性污泥生物炭在较广的酸碱范围有较好的强化除氟作用，并可实现污泥的低碳固定和以废治废，在实际废水处理中有潜在应用价值。
表 3 不同吸附剂的氟离子吸附性能对比Table 3. Comparison of fluorine ion adsorption performance of different adsorbents吸附剂 最适pH qm/(mg·g−1) 文献 活性氧化铝 5.0~7.0 16.30 [30] 氢氧化铝基吸附剂 7.7 25.80 [31] Fe-La复合材料 3.8~7.1 27.42 [32] Y-Zr-Al复合材料 7.0 31.00 [17] Mg-Al-La三金属氧化物 4.0~10.0 31.72 [15] Tea-Al-Fe茶渣 4.0~8.0 18.52 [33] La改性柚子皮生物炭 6.5 19.86 [34] ALCS-Fe-Al磁性复合材料 3.0~6.0 30.49 [14] Al/Ce-CSBC 4.0~9.0 41.47 本文 | Show TableDownLoad:
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3. 结论
1)以市政污泥为原料，通过热解-活化-双金属改性成功制备了铝铈负载污泥生物炭Al/Ce-CSBC，活化和改性均可通过造孔和促消溶作用增加材料比表面积和分散性，使负载的无定形金属羟基/氧化物保持吸附活性，材料具较高的等电点和酸碱缓冲性；
2) Al/Ce-CSBC对氟的最大吸附容量达到41.74 mg·g−1，在pH=4.0~9.0内均有较高的除氟率。其吸附动力学符合伪二级模型，吸附等温线符合Freundlich模型，为多层不均质吸附和化学吸附，其吸附机制包括静电吸附、表面络合和离子交换。
3) Al/Ce-CSBC可发挥铝铈双金属协同吸附作用，且在较广的酸碱范围有较好的强化除氟作用。该吸附材料制备简单、廉价，有望实现以废治废和污泥的低碳固定，有潜在的应用价值。
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图 1 nZVI和nZnO暴露下磺胺类ARB浓度的变化
Figure 1. Changes of sulfonamides ARB concentration under nZVI and nZnO exposure
图 2 nZVI和nZnO暴露下ARGs丰度的变化
Figure 2. Changes of ARGs abundance under nZVI and nZnO exposure
图 3 nZVI和nZnO暴露下intI1丰度的变化
Figure 3. Changes of intI1 abundance under nZVI and nZnO exposure
图 4 nZVI和nZnO暴露下胞外附着态sul1和intI1丰度的相关性分析
Figure 4. Correlation analysis of the abundance of absorbed extracellular sul1 and intI1 under nZVI and nZnO exposure
图 5 nZVI和nZnO暴露下活细胞比例的变化
Figure 5. Changes in the proportion of living cells exposed to nZVI and nZnO
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